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La présente invention concerne un procédé de biosynthèse d'un antibiotique nouveau, la pimaricine, à l'aide d'une espèce jusqu'à présent inconnue de Streptomyces. A cet effet, on fait une culture de Streptomyces natalensis nov. spec. dont les propriétés sont décrites ci-après dans des conditions appropri- ées aérobies et on obtient la pimaricine ainsi formée, dont les propriétés sont également données ci-dessous, à partir du bouil-' lon fermenté.
La préparation de l'antibiotique à l'aide du flui- de de culture et/ou du mycélium peut être avantageusement effec- tuée par extraction au moyen d'alcools miscibles à l'eau à un degré limité, par exemple le butanol, ou par traitement au moyen de méthanol (solution méthanolique de chlorure de calcium) puis par concentration de l'extrait suivie de purification à l'aide de solvants.
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Le micro-organisme produisant l'antibiotique en question a été isolé d'un échantillon de sol obtenu à Pieter Laritzburg, province de Natal, Afrique du Sud. C'est un actinomycète du genre Streptomyces dénommé maintenant Streptomyces natalensis.
Ses caractéristiques morphologiques et physiologiques sont les suivantes : Caractéristiques morphologiques. Hyphes ramifiés, tordus irrégu lièrement, souvent pratiquement droits et parallèles dans la zone de développement, d'une épaisseur de 0,3 à 0,7 , généra- lement d'épaisseur uniforme mais présentant parfois des épais- sissements locaux. Hyphes sporulant en ramifications latérales monopodes sur le mycélium aérien. Spores en chaines irréguliè- rement ondulées, plus rarement en chaines enroulées en spirales lâches. Spores séparées les unes des autres par de courtes pièces intermédiaires sans protoplasme, ovales, rondes ou en forme de mandarine, 0,7 - 1,2 x 0,7 - 0,8 .
Caractéristiques de culture (au bout de sept jours à 25 C, sauf indication contraire).
TABLEAU 1 (Les couleurs mentionnées ont' été prises dans "Color Standards and Nomenclature" (1912), de Ridgway. Pour éviter toute équivo- que, la teinte désignée par Ridgway sous le nom de "Buff" est dénommée ci-après "chamois B", par contraste avec le "chamois" simple. La teinte "Buff" correspond à un chamois clair).
Farine d'avoine-agar Bon développement. Mycélium végétatif et revers incolores. Au bout de vingt-huit jours, quelques colonies au fond et au sommet du tube. Revers chamois, un peu plus foncé (Chamois B chaud) au bout de cin- quante-sept jours. Colonie pratiquement plane, colonies séparées légèrement suréle' vées au centre. Mycélium aérien gris-sourie
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pâle , gris-souris clair, poudreux et feu- tré, gris au bout de vint-huit jours, gris sale au bout de cinquante-sept jours.
Odeur terreuse avec odeur supplémentaire surette. Pas de pigment soluble.
Pomme de terre agar Développement modère... Mycélium végéta- tif gris minéral clair à chamois B olive pâle. Revers crème,. chamois B crème à cha- mois au bout de cinquante-sept jours. Colo- nies humides légèrement surélevées, mycé- lium aérien recouvrant en partie la colo- nie. Au bout de sept jours, blanc et feu- tré, au bout de vingt-huit jours, gris sale et recouvrant 30 à 70% de la colonie. Pas de pigment soluble. Odeur terreuse désagré- able.
Pomme de terre Bon développement. Mycélium végétatif humide, surélevé, grumeleux, chamois B rosâtre pâle à chamois B rosâtre, chamois
B olive foncé au bout de vingt-huit jours.
Revers chamois sur les parois:du verre.
Pas de mycélium aérien au bout de sept jours mais assez abondant au bout de vingt- huit jours, blanc au début, puis gris- souris pâle, gris sale au bout de cinquan- te-sept jours. La couleur de la pomme de terre n'est pas altérée au bout de sept jours, mais elle devient brun chamoisé au bout de cinquante-sept jours, comme le fluide se trouvant au fond du tube. Odeur de terre.
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Glucose-agar de Développement modéré. Mycélium végéta,- Sabouraud tif grumeleux, surélevé, chamois B olive comme le revers au bout de sept jours, plus foncé (chamois B olive foncé à chamois
B olive noirâtre) au bout de vingt-huit jours. Revers de couleur argileuse. Mycé- lium aérien d'abord blanc, court et feutré puis gris-souris pâle.
Pas de pigment soluble visible au bout de sept jours mais auburn moyen au bout de cinquante-sept.
Agar d'Emerson Très bon développement. Mycélium végé. tatif chamois B olive. Revers plus sombre (chamois B crème à chamois).
Mycélium aérien court et feutré, blanc. Pas de pigment soluble. Forte odeur de terre.
Amidon-aar Développement modéré. Mycélium végéta-) tif et revers chamois B olive pâle. Colonie légèrement surélevée, recouverte sur sa moitié environ d'un mycélium aérien blanc feutré. Pas de pigment soluble. Forte odeur de terre.
Glucose-nitrate-agar Bon développement. Colonies rondes, ,humides, grises, légèrement surélevées au centre, d'un diamètre de 2 à 2,5 mm, un peu plus claires que chamois B olive pâle.
Mycélium aérien peu abondant, en points ou en anneaux concentriques, feutré, blanc.
Pas de pigment soluble. Odeur de terre.
Citrate de sodium- Développement très médiocre. Colonies agar rondes, humides, légèrement surélevées au
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centre, d'environ 1 mm de diamètre (plus claires que chamois B olive pâle). Revers chamois B olive pâle. Pas de pigment solu- ble. Pas d'odeur.
Agar nutritif Bon développement. Colonie humide, légèrement surélevée, en très petites touf- fes humides, rugueuses et ternes, avec sil- lons cérébroides peu profonds et peu nets, couleur crème à chamois B crème. Odeur désagréable. Pas de pigment soluble.
Agar de Czapek Très peu de développement. Mycélium (13 jours) végétatif hyalin. Pas de mycélium aérien.
Pas de pigment soluble.
Bacto-agar 2 % Très peu de développement,' invisible avant treize jours. Mycélium végétatif hyalin. Pas de mycélium aérien. Pas de pig ment soluble.
Comme on l'a déjà dit, le microorganisme utilisé selon l'invention pour la préparation de la pimaricine appartient au genre des Streptomyceset est différent de toutes les espèces Streptomyces décrites. En raison des caractéristiques mention- nées en détail ci-dessus il appartient au groupe 1 de ceux dé- crits par Waksman dans le manuel de Bergey (voir également S.A.
Waksman, "The Actinomycetes", 1950, p. 30).
Streptomyces natalensis nov. spec. peut être également classé dans la série "Keo-Ingri" de Baldacci (cf. Symposium Actinomycetales, VI congrès international de microbiologie, Rome, 1953, p. 31). On doit noter que le nom de Streptomyces natalensis nov. spec. n'est pas exclusivement attribué aux acti- nomycètes répondant d'une manière stéréotypée et rigoureuse à la description donnée mais qu'il s'applique également aux sou-
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ches apparentées possédant d'une manière générale les mêmes propriétés spécifiques et produisant de la pimaricine, qui peu- vent être considérées comme des sous-espèces, variétés, races, formes, groupes de types sérologiques ou autres, variantes, phases, produits de mutation spontanée, modifications, etc. de cette espèce.
Il couvre également les produits de mutation de
EMI6.1
Streptomyces natalensis pouvant être obtenus à partir de cette espèce à.l'aide de substances ou de-moyens provoquant la muta- tion,'tels que l'irradiation ou des substances à action toxique.
La pimaricine, antibiotique nouveau, est principalement actif à l'égard des fungi et des levures saprophytes et parasi- tes.
Le tableau II résume les propriétés antibiotiques de la pimaricine pour ce qui concerne les levures et les fungi non- pathogènes pour le corps humain; il s'y trouve indiqué, pour chaque espèce, la quantité d'antibiotique en microgrammes (Ù) par cm3 de milieu nutritif inhibant exactement le développement
Le tableau III mentionne l'inhibition d'un certain nombre de levures et de fungi pathogènes pour l'homme.
TABLEAU II
EMI6.2
<tb> Microorganisme <SEP> d'essai <SEP> Concentration <SEP> de <SEP> la <SEP> pimaricin
<tb>
EMI6.3
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ en y; Icm3
EMI6.4
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> - <SEP> H <SEP> 0,15
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> - <SEP> KLL <SEP> 0,9
<tb>
<tb> Pichia <SEP> membranifaciens <SEP> 2,5
<tb>
<tb> Schwanniomyces <SEP> occidentalis <SEP> 2,5
<tb>
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 1,8
<tb>
<tb> Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> 1,2
<tb>
<tb> Cladosporium <SEP> cucumerinum <SEP> 0,9
<tb>
<tb> Verticillium <SEP> dahliae <SEP> 1,2
<tb>
<tb> Fusarium <SEP> spec. <SEP> 1,2
<tb>
<tb> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> 0,6
<tb>
<tb> Tricho'derma <SEP> spec. <SEP> 1,2
<tb>
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EMI7.1
T.T:
¯U III
EMI7.2
Hicroorganisme d'essai Concentration de la piluaricine
EMI7.3
<tb> en <SEP> /cm3 <SEP> sur <SEP> agar <SEP> de <SEP> Sabouraud
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 12
<tb> (3 <SEP> souches)
<tb>
<tb> Candida <SEP> tropicalis <SEP> (1) <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 12
<tb> (:::, <SEP> souches) <SEP>
<tb>
<tb> Trichosporon <SEP> cutaneum <SEP> (1) <SEP> 12
<tb>
EMI7.4
Pityrosporum spec.
(1) 12
EMI7.5
<tb> Candida <SEP> parapsilosis <SEP> (1) <SEP> 12
<tb>
EMI7.6
Histoplasma capsulatum 3
EMI7.7
<tb> Sporotrichum <SEP> Schenckii <SEP> 6
<tb>
EMI7.8
Trichophyton sulfuriùum 3 Trichophyton ment agr p phyt es 50
EMI7.9
<tb> (3 <SEP> souches) <SEP>
<tb>
EMI7.10
Trichophyton violaceum 6
EMI7.11
<tb> Trichophyton <SEP> rosaceum <SEP> 12,5
<tb>
<tb> Trichophyton <SEP> Schnleineii <SEP> 6
<tb>
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> 12,5
<tb>
EMI7.12
Trichophyton interdigttale 25 lliicrosporum Janosun, 12,5 E idermo h ton floc:.sum 12,5 Hormodendrum .22Ep.2,ctwu 6 (1) Cette levure n'est pas pathogène mais a été isolée d'une matière médicale.
De ce qui précède, il ressort, entre autres, que la pima- ricine a une action nette et remarquable contre les fungi
EMI7.13
phytopathogènes tels que Verticillium, Olados122 et Fusarimit L'inhibition de Gandida albicans est également très remarquable,
Une autre caractéristique importante est l'effet très légè- rement phytotoxique de la pimaricine, en opposition à la plu- part des antibiotiques fongicides connus jusqu'ici. Ainsi, cet antibiotique nouveau est-il très propre, entre autres, aux applications en agriculture et en horticulture, pour combattre
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les maladies des végétaux, d'autant plus qu'il diffuse aisément et agit systématiquement.
Ainsi, la pimaricine pénètre par exemple dans les semences de pois (Pisum sativum), après être trempées en solution aqueu- se étendue. Ceci est vérifié par le fait que la pimaricine peut être extraite des cotylédons et des germes des semences ainsi traitées.
Les tableaux IV a et IV b montrent en outre une action antiseptique interne. Le mycélium des funi (entre autre d'Ascochyta pisi) est tué dans la graine.
TABLEAU IV a
EMI8.1
<tb> Concentration <SEP> en <SEP> pimaricine <SEP> en <SEP> % <SEP> de <SEP> graines <SEP> avec <SEP> mycélium
<tb>
<tb> parties <SEP> par <SEP> million <SEP> (1) <SEP> (2)
<tb>
<tb>
<tb> 150 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75 <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 37,5 <SEP> 11
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 18,7 <SEP> 25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> non-traité <SEP> 80
<tb>
TABLEAU IV b
EMI8.2
<tb> Concentration <SEP> en <SEP> pimaricine <SEP> % <SEP> de <SEP> plantes <SEP> malades
<tb>
<tb>
<tb> (p.p.m.) <SEP> (1) <SEP> Essai <SEP> I <SEP> Essai <SEP> II
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 150 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75 <SEP> 0 <SEP> 0,7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 37,5 <SEP> 1 <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 18,7 <SEP> 2 <SEP> 3,6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> non-traité <SEP> 15 <SEP> 24
<tb>
(1)
Solution aqueuse dans laquelle les graines ont été trem- pées pendant vingt-quatre heures à 20 C.
(2) Développement du mycélium sur papier-filtre.
Des essais détaillés ont indiqué que la pimaricine à la concentration de 75 p.p.m., qui constitue un fongicide très efficace, ne nuit pas à la germination des graines de pois et
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au développement de la plante (voir tableaux IVc et IVd).
. TABLEAU IV c
EMI9.1
<tb> Concentration <SEP> en <SEP> % <SEP> graines <SEP> germées <SEP> Longueur <SEP> des <SEP> racines
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pimaricine <SEP> p.p.m.(1) <SEP> (2) <SEP> en <SEP> mm <SEP> après <SEP> 3 <SEP> j. <SEP> (2)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> non-traité <SEP> 100 <SEP> 23
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 25 <SEP> 100 <SEP> 24
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 50 <SEP> 100 <SEP> 22
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75 <SEP> 100 <SEP> 22
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 100 <SEP> 100 <SEP> 23
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 125 <SEP> 100 <SEP> .
<SEP> 22
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 150 <SEP> 96 <SEP> 29
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 200 <SEP> 98 <SEP> 14
<tb>
(1) Solution aqueuse dans laquelle les graines ont été trempée; pendant vingt-quatre heures à 20 0.
(2) Graines disposées sur papier-filtre humide.
TABLEAU I V d
EMI9.2
<tb> Graines <SEP> de <SEP> pois <SEP> trempés <SEP> dans <SEP> concentration <SEP> en <SEP> pimaricine
<tb>
<tb> dans <SEP> l'eau <SEP> 75 <SEP> p.p.m. <SEP> (1)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Germination <SEP> (nombre) <SEP> 126 <SEP> 128
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Longueur <SEP> de <SEP> la <SEP> plante
<tb>
<tb> en <SEP> cm <SEP> au <SEP> bout <SEP> de <SEP> deux
<tb>
<tb> mois <SEP> 31,8 <SEP> 33,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> cosses <SEP> par
<tb>
<tb> plante <SEP> 2,8 <SEP> 2,8
<tb>
(1) Solution aqueuse dans laquelle les pois ont été trempés pendant vingt-quatre heures à 20 C.
Tous les résultats cités dans les tableaux se rapportent à la race "Eminent", qui est très sensible à Ascochyta pisi.
Des expériences effectuées sur la souris et le rat indi- quent une très faible toxicité.
Pour déterminer la toxicité aiguë de la pimaricine chez le rat blanc, on a administré un produit titrant 985 (Ó/mg à des rats qui ont été sacrifiés au bout de sept jours.
On a obtenu les résultats suivants à l'aide de suspensions
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aqueuses de pimaricine. mg/kg DL50, voie orale 1.500 DL50, voie intramusculaire > 2.000) Valeurs moyennes ) sur 40 rats DL50, voie hypodermique )5.000 ) DL50, voie intrapéritonéale 250
La pimaricine n'exerce .pas d'effet irritant sur la peau et les muqueuses de sorte qu'elle peut également être appliquée @ à l'homme.
A l'état pur, la pimaricine est un composé cristallisé blanc de nature amphotère dont on peut préparer les sels-de la manière habituelle. Elle ne donne pas de réaction ,colorée avec FeCl3 mais elle donne, avec l'acide phosphorique concentré, une coloration rose instable. L'acide chlorhydrique concentré et l'acide sulfurique concentré produisent une coloration bleue ou vert-olive. Cet antibiotique décolore l'eau de brome. Ce fait, ainsi que les spectres des infra-rouges et des ultra-violets (voir ci-après) suggèrent que la pimaricine est un des antibio- tiques dits polyéniques. Sa solubilité dans l'eau est très légère, soit 8 mg dans 100 cm3 d'eau à 20 C.
Elle est plus solu- ble dans les solvants organiques comme les alcools, les glycols, les cétones, en particulier les alcools de 1 à 6 atomes de car- bone comme le butanol normal ainsi que dans les "Cellosolves".
Elle est en outre soluble dans la pyridine, la diméthylformami- de, la diméthylacétamide, l'acide acétique glacial et les hydroxydes alcalins. Elle est pratiquement insoluble dans les hydrocarbures aliphatiques comme le pentane, l'hexane, le cyclo- hexane, etc..
A la température ambiante, la pimaricine est un composé très stable. Une solution aqueuse à 5 mg/100 cm3 conserve sa pleine activité pendant sept jours à pH 7 à 25 C.A pH 2, cette solutiqn perd 50 % de son activité en trois jours à cette même
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température. A pH 10 et à 25 C, elle perd 50 % de son activité en six jours. Aux températures élevées, la solution est moins stable. Ainsi, la solution aqueuse sus-mentionnée de pimaricine, à 90 C, perd, en quinze minutes, à pH 2, 90%, à pH 6,5, 15 et à PE 9, 50 % de son activité. La pimaricine en solution méthanolique est encore stable aux températures plus élevées (25 à 60 C).
L'activité antibiotique de la pimaricine a été essayée microbiologiquement avec Saccharomyces cerevisiae, sou- che hollandaise, à titre de microorganisme d'essai, comparative- m t à une préparation pure normale.
La pimaricine ne manifeste pas de point de fusion mais elle; commence à se décomposer à environ 150 C . Le pouvoir rotatoire spécifique Ó 25D est égal à + 250 (conc. 0,083% dans le métha- nol absolu). Le poids moléculaire de la substance est de 727 environ. Sa formule brute probable est C35H50NO14. L'analyse élémentaire donne les valeurs suivantes : C = 57,77 %, H = 7,27 %, N = 1,95 %, 0 (calculé) = 33,01 %.
Le spectre d'absorption des ultra-violets de la pimaricine est caractérisé par des maxima à 290, 304 et 318 m avec épau- lement à 280 m et minimum à environ 250 m (Conc. = 3.93Ù/cm3 dans le méthanol). Un échantillon de pimaricine pressé sur une plaque de bromure de potassium (conc. = 0,5 %) montre les ab- sorptions suivantes aux infra-rouges (en cm-1): 3460, 2985, 1721, 1637, 1577,1441, 1401, 1381, 1275, 1269, 1238, 1192, 1176, 1136, 1109, 1066, 1006, 988. 948, 887, 855, 844, 803, 794 (pour les valeurs soulignées, l'absorption est de forte à très forte). (Voir diagramme ci-annexé).
Pour préparer la pimaricine, on cultive Streptomyces nata- lensis de manière aérobie en cultures stationnaires ou submer- gées dans un milieu nutritif fluide, dans des conditions stéri- les, en récipients clos, munis de dispositifs d'agitation et dans lesquels, en vue de l'aération, on peut insuffler de l'oxy,-
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gène ou de l'air stériles pendant la culture.
La durée de la culture, la température et les autres condi- tions à satisfaire pour obtenir de bons rendements en pimaricine sont déterminées facilement par l'expérience. Ces conditions sont examinées plus complètement ci-après.
Le milieu nutritif peut être composé des substances habi- tuelles; il doit contenir une source de carbone et d'azote orga- nique et/ou minéral fermentescible, la présence supplémentaire de sels minéraux, tels que des phosphates, des sels de potassium et de sodium et des traces de divers métaux étant également désirable. Toutefois, les matières premières utilisées dans la pratique sont souvent suffisamment polluées de ces sels miné- raux pour que des additions supplémentaires soient superflues.
Comme source de carbone, on peut utiliser des hydrates de carbone solubles ou insolubles, comme le glucose, le saccharose, le lactose ou l'amidon. Les alcools de sucres, comme la glycé- rine, conviennent également. La quantité de source de carbone présente dans le milieu peut varier largement selon la nature de l'hydrate de carbone utilisé et la composition du milieu.
Elle est en général d'environ 0,5 à 5 % en poids du milieu.
La source d'azote peut être constituée de substances très variées. On peut mentionner la caséine hydrolysée ou non-hydro- lysée, la liqueur de trempage du mais, la peptone, l'extrait de viande, la farine de soja dégraissée ou non, la farine d'arachi,, de, la farine de poisson, les nitrates. Le choix de la source d'azote dépend habituellement de la composition du milieu, la- quelle est choisie elle-même de manière à obtenir l'antibiotique de la façon la plus économique. On peut mentionner à cet égard que de petites quantités de matières premières azotées telles que l'extrait de levure, les produits solubles des distilleries, les produits solubles de poissons, etc.., améliorent considéra- blement les rendements en pimaricine dans des milieux particu-
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liers.
Egalement, les lipides tels que les huiles grasses, d'origine végétale aussi bien qu'animale (huile de soja, huile de poisson par exemple) sont susceptibles d'améliorer le rende- ment d'une manière substantielle.
La durée de la fermentation dépend dans une grande mesure de la composition du milieu nutritif. Elle varie habituellement entre quarante-huit et cent vingt,heures mais elle peut être poursuivie pendant plus longtemps si on le veut, par exemple jusqu'à quatorze jours, si l'augmentation de rendement en anti- biotique ainsi obtenue justifie la dépense supplémentaire que comporte la prolongation du cycle de fermentation.
La température à laquelle la fermentation est effectuée peut en principe varier entre 15 et 30 C. On donne la préféren- ce à des. températures de 26 à 28 C.
Pour réaliser les conditions optimum de prolifération du microorganisme et de rendement en pimaricine, le pH peut varier en particulier pendant la première phase de la fermentation, entre 5 et 8 par exemple. Après stérilisation, le milieu nutri- tif est de préférence réglé à un pH compris entre 6 et 7. La fermentation est de préférence effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8, car, dans ce cas, on obtient les rendements les plus élevés-.- Le pH peut être maintenu constant au cours de la fer- mentalµion par addition d'un hydroxyde alcalinou d'un acide, à des intervalles réguliers, dans des conditions stériles.
Toute- fois, on utilise habituellement le carbonate de calcium en matière de tampon dans des proportions qui varient entre 0,2 et 1 % e poids du milieu. La quantité d'air que l'on fait passer dans le milieu au cours de la fermentation dans des conditions stériles dépend en grande partie de la forme du récipient, de la vitesse et de la forme des agitateurs. D'une manière généra- le, cette quantité varie entre 0,1 et 4 litres par litre de milieu nutritif et par minute.
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On utilise de préférence, comme matière d'ensemencement du milieu principal de fermentation, des pré-cultures de quarante- huit à soixante-douze heures de Streptomyces natalensis. Pour obtenir de bons rendements et éviter la fluctuation des résul- tats, l'ensemencement est de préférence effectué à l'aide de quantités de culture représentant 1 à 7 % en volume du milieu nutritif contenu dans la cuve principale de fermentation. Il est évident que, dans le cas des cuves de fermentation de gran- des dimensions, on doit effectuer plusieurs stades de pré- culture. Il est toutefois également possible de conserver une portion de la culture, par exemple 10 %, dans la cuve principa- le de fermentation en vue de la production d'une nouvelle cul- ture. La fermentation, dans son ensemble, peut être également effectuée d'une manière continue.
On peut retirer la pimaricine du milieu de culture de plu- sieurs manières. On peut, conformément à l'invention, mettre à profit la solubilité de l'antibiotique dans les solvants organi ques miscibles à l'eau d'une manière limitée, comme le butanol..
On peut, par exemple, appliquer le procédé suivant. Quand on a obtenu une quantité suffisante de milieu actif, on en règle le pH à 10 environ de manière à extraire la substance active du "mycélium", qu'on sépare ensuite par filtration. On peut alors procéder à l'épuisement du milieu, par exemple à l'aide de butanol normal, à un pH compris entre 3 et 10. Si on acidifie le fluide, l'acide utilisé est de préférence l'acide phosphori-' que. Le précipité qui peut se former est séparé et, si nécessai- re, également épuisé. L'extrait est concentré par distillation azéotropique et la substance active brute finit par cristalli- ser. Celle-ci peut être purifiée par précipitation sélective, par exemple au sein d'acide acétique glacial, de pyridine, de diméthylformamide, etc..
Dans les fermentations donnant des rendements supérieurs à 700 Ù/cm3, le rendement en pimaricine
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peut être augmenté très sensiblement en procédant à l'épuise-. ment du mycélium, opération dans laquelle il est avantageux d'utiliser, comme véhicule, du méthanol dont on augmente le pouvoir solvant par addition de 1 à 3 % de chlorure de calcium.
Exemple 1 - Préparation de la culture d'ensemencement.-
D'une culture en tube de Streptomyces natalensis nov.spec. par exemple sur farine d'avoine-agar, présentant une bonne sporulation, on transfère de petites quantités de conidies,. dans des conditions stériles, dans des ballons secoués d'une capacité de 2 litres environ, dans lesquels on a introduit 500 cm3 d'un.milieu nutritif fluide ayant la composition sui- vante .
EMI15.1
<tb>
Peptone <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> concentrée <SEP> de <SEP> trempage
<tb>
<tb> du <SEP> maïs <SEP> (50 <SEP> % <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 0,6 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sel <SEP> ordinaire <SEP> 1,0 <SEP> % <SEP>
<tb>
(pH réglé à 7 au moyen d'un hydroxyde alcalin).
Après incubation sous agitation constante à 26 C pendant quarante-huit heures, la culture est prête pour l'ensemencement du milieu principal de fermentation.
Exemple II - Préparation de la culture.-
On transfère dans des conditions stériles 1 litre de la culture d'ensemencement préparée conformément à l'exemple 1 dans un récipient de fermentation muni d'un agitateur et d'un dispositif d'insufflation d'air stérile, ce récipient contenant
15 litres d'un milieu de culture ayant la composition suivantei
EMI15.2
<tb> Glucose <SEP> 3,0%
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> concentrée <SEP> de <SEP> trempage
<tb> du <SEP> mais <SEP> (50 <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 0,2
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> d'ammonium <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,4 <SEP> %
<tb>
<tb> Phosphate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> primaire <SEP> 0,02 <SEP> %
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,
8%
<tb>
<Desc/Clms Page number 16>
On règle le pH de ce milieu de culture à 6,9 au moyen d'un hydroxyde alcalin. Au bout de quarante-huit heures d'incu- bation à 27 C, avec aération et agitation constante, on consta- te que la culture contient 610 microgrammes de pimaricine par centimètre cube.
D'autres milieux, avec lesquels on peut obtenir des rende- ments du même ordre de grandeur, ont la composition suivante :
EMI16.1
<tb> A- <SEP> Farine <SEP> d'arachide <SEP> 2 <SEP> %
<tb>
<tb> Fécule <SEP> de <SEP> pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> 1 <SEP> %
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> concentrée <SEP> de <SEP> trempage
<tb> du <SEP> mais <SEP> (50 <SEP> % <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 2 <SEP> %
<tb>
<tb> Sel <SEP> ordinaire <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb>
<tb> Phosphate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> primaire <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,6 <SEP> %
<tb>
Hydroxyde de potassium jusqu'à pH 6,5.
A l'aide de ce milieu, après ensemencement à4 % et incu- bation et aération pendant 72 heures à 26 C, on a obtenu 590 microgrammes de pimaricine par centimètre cube de fluide de fermentation.
EMI16.2
<tb>
B <SEP> - <SEP> Mélasses <SEP> de <SEP> betterave <SEP> (teneur <SEP> en
<tb> sucre <SEP> environ <SEP> 50 <SEP> %) <SEP> 4,0%
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> trempage <SEP> de <SEP> mais <SEP> concentrée <SEP> 2,0 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb> Lactose <SEP> 1,0 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> sodium, <SEP> 10 <SEP> aq. <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
Hydroxyde de potassium jusqu'à pH 7,1.
On a obtenu à l'aide de ce milieu, après ensemencement à 5% et 120 heures d'incubation et aération à 27 C, 640 micro- grammes de pimaricine par centimètre cube de fluide de fermen- tation.
EMI16.3
Peptone ( Difco") 0 t 5 fi :gjctra4it de viande (IIDifco Il) 0 s5
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
<tb> Glucose <SEP> 1,0%
<tb>
<tb> Sel <SEP> ordinaire <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
A l'aide de ce milieu, après ensemencement à 3% et 148 heures d'incubation et d'aération à 26 C, on a obtenu 535 micro- grammes de pimaricine par centimètre cube de fluide de fermen- tation.
EMI17.2
<tb>
D- <SEP> Farine <SEP> grossière <SEP> de <SEP> soja <SEP> 5,0 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> concentrée <SEP> de <SEP> trempage
<tb>
<tb> du <SEP> mais <SEP> (50 <SEP> % <SEP> de <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Phosphate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> primaire <SEP> 0,02 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Ammonium <SEP> sulphate <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>
A l'aide de ce milieu, après ensemencement à 3 % dans une cuve de 15 litres et fermentation et aération pendant 168 heu- res à. 28 C, on obtient 690 microgrammes de pimaricine par cen-- timètre cube de fluide de fermentation.
Après traitement, à l'aide d'hydroxyde alcalin étendu, du mycélium préalablement séparé par essorage et agité avec une assez grande quantité d'eau, à pH 10, on a pu trouver, dans le filtrat du mycélium, 20,4 g de pimaricine, Exemple III - Isolement de la pimaricine brute.-
On a réglé à pH 10, au moyen d'hydroxyde de sodium, 4 li- tres de milieu fluide de fermentation complètement fermenté contenant 590 Ù/cm3 de pimaricine et on l'a débarrassé du mycé- lium par filtration à l'aide de Kieselguhr comme adjuvant de filtration (2 %). Le filtrat de culture, dont le volume était de 3,7 litres, d'activité de 570 Ù/cm3, a été acidifié au moyen d'acide phosphorique à pH 3. Le filtrat acidifié a été épuisé successivement au moyen de portions de n-butanol de 750, 350 et 150 cm3.
On a alors lavé l'extrait butanolique à trois reprises au moyen de 120 cm3 d'une solution de borax à 4 %, puis de nou-
<Desc/Clms Page number 18>
veau à deux reprises au moyen de 120 cm3 d'eau. L'extrait buta- nolique contenait alors 1400 Ù/cme de pimaricine. La concentra- tion azéotropique de cet extrait à 100 cm3 a donné 0,64 g de pimaricine pas tout-à-fait pure, à l'état cristallin (activité de 900 /mg). On a obtenu ensuite par évaporation du reste de l'extrait une quantité totale de 1,42 g de pimaricine impure (activité 395 Ù/mg).
Le rendement, rapporté à l'activité totale du fluide complètement fermenté, a été de 48,3 % :Exemple IV- Isolement de la pimaricine brute.-
On a réglé à pH 10,3, à l'aide d'hydroxyde de potassium à 35 %, 15 litres d'un bouillon de culture complètement fermenté contenant 610 Ù/cm3 de pimaricine, puis on en a séparé le mycé- lium par filtration, à l'aide de 50 g de "Hyflo" comme adjuvant de filtration. On a acidifié alors le filtrat à pH 2,8 au moyen d'acide phosphorique.
On a séparé ensuite par filtration le précipité formé, cette fois à l'aide de 10 g de "Eyflo", On a agité alors le précipité pendant une demi-heure avec 100 cm3 de n-butanol. Après repos, on a décanté l'extrait butanolique et on a lavé le dépôt au moyen de 100 cm3 d'eau. On a lavé l'extrait butanolique total, à trois 'reprises au moyen de 10 cm3 d'une solution de borax à 4 %, puis à trois reprises au moyen de 10 cm3 d'eau. On a évaporé ' alors sous vide, à 44 C, jusqu'à 40 cm3. Après refroidissement à 0 C, essorage sous vide et séchage,' on a obtenu 0,51 g de pimaricine cristallisée jaune pâle, d'une activité de 850 Ù/mg. Le filtrat a ensuite été trai, té de la manière décrite dans l'exemple I.
On a obtenu deux fractions, respectivement de 3,21 g (activité 890 /mg) et de 6,8 g (activité 223 Ù/mg). Le rendement total a été de 51,5 %, Exemple V - Isolement de la pimaricine brute. -
On a réglé à pH 10, au moyen d'hydroxyde de potassium à 15 %, 10 litres d'un bouillon de culture complètement fermenté (activité 640 Ù/cm3). On a séparé le mycélium par centrifugeage
<Desc/Clms Page number 19>
et on a réglé le filtrat limpide à pH 6,8 au moyen d'acide chlorhydrique 10 N. On l'a extrait ensuite successivement à l'aide de portions de 2.000, 1.000 et 1.000 cm3 d'alcool iso- amylique.
On a lavé successivement les extraits isoamyliques à trois reprises au moyen de 30.0 cm3 de solution à 4 % de carbona, te de sodium, puis à deux reprises au moyen de 300 cm3 d'eau.
On a soumis à l'évaporation azéotropique l'extrait ainsi traité, jusqu'à 100 cm3. Il's'est séparé 2,62 g de pimaricine cristal- lisée jaune pâle d'une activité de 900 Ù/cm3. Rendement :36,8%.
Exemple VI - Isolement de la pimaricine brute. -
On a réglé à pH 10, au moyen d'hydroxyde de sodium à 20 %,
20 litres d'un bouillon de culture complètement. fermenté de
Streptomyces natalensis (activité 700 /cm3), puis on a séparé le mycélium par filtration à l'aide de "Hyflo" (200 g). On a épuisé successivement le filtrat limpide, au moyen de portions de n-butanol de 4.000, 2.000 et 1.000 cm3. On a lavé à deux reprises le mélange des extraits butanolïques au moyen de 500 cm3 de solution de borax à 4 %, puis à deux reprises au moyen de 500 cm3 d'eau. Après réglage de.l'extrait butanolique ainsi traité à pH 6,8 au moyen d'acide chlorhydrique 10 N, on a sou- mis l'extrait à la concentration azéotropique sous vide jusqu'à un volume de 250 cm3.
Il s'est séparé 9,85 g de pimaricine jaune pâle cristallisée, d'activité 913 Ù/mg. Rendement : 60,8%.
Exemple VII - Isolement de la pimaricine brùte du mycélium.-
On a réglé à pH 4,1, au moyen d'acide acétique glacial,
15 litres d'un bouillon de culture complètement fermenté de
Streptomyces natalensis nov. spec. On a ajouté ensuite, à titre d'adjuvant de filtration, 200 g de "Hyflo" et on a agité la solution. On a alors essoré le mycélium à la plus grande siccité possible (poids total 1700 g). On a épuisé 1 g de mycélium sous cet état, pendant une heure, au moyen de 40 cm3 de méthanol, de manière à déterminer le nombre de microgrammes de pimaricine.
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On a étendu l'extrait méthanolique à 100 cm3 et on l'a soumis à la spectrophotométrie. La teneur en pimaricine de cette solu-
EMI20.1
tion méthaiiolique était-de 120 /cm3.
La teneur en pimaricine du mycélium total était de 20,4 g.'
On a épuisé le mycélium essoré pendant une demi-heure à la tem- pérature ambiante à l'aide de 8 iitres de méthanol dans les- quels on avait dissous 2 % de chlorure de calcium. On a étendu l'extrait ainsi obtenu à l'aide d'un litre d'eau et on en a . chassé le méthanol sous vide. On a obtenu ainsi un précipité cristallisé de pimaricine qui, après essorage, lavage à l'eau et séchage sous vide, pesait 14,73 g et dont l'activité était de 900 Ù/mg. Rendement : 65 % de la théorie.
Exemple VIII - Purification de la pimaricine.-
On a dissous 10 g de pimaricine impure (activité 890 /mg) en chauffant doucement, dans 80 cm3 d'acide acétique glacial, puis on a éliminé aussi rapidement que possible les impuretés insolubles par filtration. On a étendu le filtrat limpide de couleur brun-jaune à l'aide de 1500 cm3 d'eau et on a.rêglé le pH de la solution ainsi obtenue à 6,3 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium à 33 %.
Après refroidissement, on a séparé par centrifugeage le précipité cristallisé formé et on l'a lavé à deux reprises au moyen d'une quantité totale de 500 cm3 d'eau, après quoi on a essoré sous pression réduite. On a lavé de nouveau la masse cristallisée, sur filtre, au moyen de 200 cm3 d'eau, puis on l'a séchée sous vide sur anhydride phosphorique. Le poids du produit jaune très pâle ainsi obtenu était de 7,07 g et son activité de 960 Ù/mg.
On a recommandé le traitement ci-dessus à l'aide de 60 cm3 d'acide acétique glacial et 1.000 cm3 d'eau. On a lavé la subs- tancè à trois reprises au moyen de 200 cm3 d'eau. Le produit ainsi obtenu pesait 5,35 g et possédait une activité de 985 Ù/mg.
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Rendement total : 59,8 %.
Exemple IX - Purification de la pimaricine. -
On a chauffé doucement, dans 100 cm3 de diméthyl-formamide
10 g de piuaricine impure d'activité 890 Ù/mg, on a filtré cet- r te solution pour éliminer les impuretés insolubles et on a lavé le filtre au moyen d'une nouvelle quantité de 30 cm3 de dimé- thyl-forrnamide. Au filtrat limpide de couleur brune, on a ajou- té 250 cm3 d'eau, ce qui a précipité l'antibiotique à l'état cristallisé. On a essoré le précipité sous vide et on a lavé de nouveau le filtre au moyen de 100 cm3 d'eau. On a ensuite séché la masse cristallisée, sous vide. Le produit ainsi obte- nu pesai-t 9,24 g.
On a recommencé le traitement ci-dessus et on a obtenu finalement un produit cristallisé jaune pâle, pesant
7,9 g et possédant une activité de 985 Ù/mg. Rendement total : 87,5 %.
Préparation du sel de sodium.- On a mis en suspension, sous agitation mécanique, 2,5 g de pimaricine d'activité 985 Ù/mg dans 20 cm3 de méthanol. On a ajouté ensuite à la suspension une solution de 0,145 g d'hydroxyde de sodium dans 0,3 cm3 d'eau. La pimaricine s'est tout d'abord dissoute, puis s'est séparée au bout de quelques minutes sous forme de sel de sodium .cristallisé.
Au bout d'une nouvelle demi-heure d'agitation et de vingt-quatre heures de repos à 0 C, on a séparé, par filtra- tion à la trompe, la masse cristallisée et on l'a lavée au moyen de 5 cm3 d'éthanol et 10 cm3 d'éther diéthylique. Après séchage sous vide, on a obtenu 2,16 g de sel de sodium cristal- lisé en aiguilles blanches. Activité : 995 Ù/mg, soit 87,3% de l'activité calculée.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.