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EMI1.1
Procédé de préparation d%agents antimicrobien8. -----------------------------------------------
La présente invention a pour objet un procédé de pré- paration de composé* nouveaux doués de propriétés antimicro- biennes. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé visant à préparer par fermentation une composition nouvelle de matière appelée ici *agent antimicrobien M-188", à l'isoler et à le concentrer en partant de solutions bru- tes telles que les bouillons de fermentation, et à le pu- rifier. L'agent peut être sous forme de sels d'addition d'acide.
L'un des buts de la présente invention est de prépa- ner un agent antimicrobien nouveau et utile qui est actif contre diverses bactéries et divers protozoaires comme l'Elmeria tenelle. Un autre but est de préparer des sels d'addition d'acide de cet agent antimicrobien. D'autres
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buts et caractéristiques de l'invention apparaîtront à l'homme de l'art à la lecture de la description qui suit.
On a trouvé qu'en cultivant dans des conditions réglées et sur des milieux de culture appropriés une souche antérieu rement inconnue du microorganisme Streptomyces caeleatia, on obtient une nouvelle composition de matière appelée ici agent antimicrobien M-188. La souche de microorganisme a été isolée d'un échantillon de sol recueilli à Capitol City (Texas). Par ses caractéristiques morphologiques, l'organisme semble s'apparenter le plus étroitement au Streptomyces caelestis, espèce connue. Ainsi qu'on l'in- diquara ci-après, il existe certaines différences entre les propriétés de culture de l'organisme connu et celles de la nouvelle souche.
On a donc considéré celle-ci com- me une souche de Streptomyces caelestis. Une culture de l'organisme vivant a été déposée à la "Northern Utilisa- tion Research and Development Division*, de l'"Agricul- tural Research Service . au Ministère de l'Agriculture des Etats-Unis, à Peoria (Illinois), et a été inscrite sous le n NRRL 2821.
Une étude approfondie de la morphologie et de la physiologie de la nouvelle souche de Streptomyces caelestis montre que l'on peut la distinguer du Streptomyces caelestis tel qu'il est décrit complètement dans le brevet britan- nique n 768.971. On a trouvé que le xylose, l'arabinose, le rhamnose, le dextrose, le galactose, le mannose, le fructose, le sucrose, le lactose, le maltose, le cello- biosa, la dextrine, le raffinose, le glycérol et le succi- nate de sodium sont facilement utilisés par les deux orga- nismes. Le sorbose, le dulcitol, le tartrate de sodium et de potassium et l'amidon soluble ne sont utilisés par
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aucun des deux organismes.
Par contre, le sorbitol, le citrate de sodium et la salicine sont utilisés par la souche M-188 mais non par le Streptomyces caelestis connu.
L'utilisation des divers composés carbonés ci-dessus par la nouvelle souche a été déterminée par le procédé de Pridham et Gottlieb, "Journal of Bacteriology" 56, 107-114 (1948). Par comparaison directe au microscope optique, le mycélium en sporulation et les spores des deux organismes ne peuvent pas être distingués.
D'autres comparaisons directes de cultures sur milieu Pridham contenant diverses sources de carbone montrent que le mycélium aérien en sporulation du Streptomyces caelestis souche M-188 est de couleur bleu verdâtre, alors que celui du Streptomyces caelestis connu a une couleur bleu ciel.
On note les ressemblances et différences suivantes entre la souche M-188 et le Streptomyces caelestis connu :
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EMI4.1
<tb> Milieu <SEP> de <SEP> base <SEP> Caractères <SEP> comparés <SEP> Souche <SEP> M-188 <SEP> S. <SEP> caelestis
<tb>
EMI4.2
--------------- ------------------- ---------------
EMI4.3
<tb> Gélatine <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> bonne <SEP> bonne
<tb> Aérien <SEP> blanc <SEP> nacré <SEP> gris-bleu
<tb> Pigment <SEP> noir <SEP> brunâtre <SEP> brun
<tb> foncé
<tb> Liquéfaction <SEP> négative <SEP> jusqu'à <SEP> la <SEP> profondeur <SEP> du
<tb> pigment
<tb>
<tb> Lait <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> bonne <SEP> bonne
<tb> Coagulation <SEP> aucune <SEP> aucune
<tb> Peptonisation <SEP> aucune <SEP> aucune
<tb> Réduction <SEP> aucune <SEP> aucune
<tb>
<tb> Bouillon <SEP> nutri- <SEP> Croissance <SEP>
assez <SEP> bonne <SEP> à <SEP> bonne
<tb> tif <SEP> au <SEP> D-gluco- <SEP> bonne
<tb> se <SEP> Aérien <SEP> aucun <SEP> aucun
<tb> Pigment <SEP> aucun <SEP> havane
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> hu- <SEP> Croissance <SEP> bonne <SEP> assez <SEP> bonne
<tb> tritif <SEP> à <SEP> bonne
<tb> Aérien <SEP> - <SEP> ivoire <SEP> ou <SEP> na- <SEP> blanc <SEP> rosé
<tb> cré
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> aucun <SEP> havane
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> au <SEP> Croissance <SEP> bonne <SEP> bonne
<tb> D-glucose <SEP> Aérien <SEP> aucun <SEP> gris-bleu,
<tb> .
<SEP> blanc
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> aucun <SEP> havane
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> tyro- <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> bonne <SEP> à <SEP> bonne
<tb> sine <SEP> Waksman <SEP> bonne
<tb> Aérien <SEP> aucun <SEP> aucun
<tb> Pigment <SEP> aucun <SEP> aucun
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> B <SEP> Croissance <SEP> aucune <SEP> aucune
<tb> amidon <SEP> Waksman
<tb>
<tb> Conversion <SEP> de
<tb> nitrate <SEP> en
<tb> nitrite <SEP> négative <SEP> négative
<tb>
Bien que le Streptomyces caelestis connu sporule plus facilement sur des milieux organiques que la souche M-188, il semble que ce soit là une différence de souche à souche.
Il est établi que les deux organismes produisent des agents antimicrobiena séparés et distincts.
On donne ci-dessous une étude taxonomique complète du Streptomyces caelestis souche M-188 sur divers milieux; les indications de couleur en coàe données entre parenthèses se réfèrent au nColor Harmony Manual", 3ème édition, de Jacobsen, Granville et Foss, 1948, Container Corporation of America.
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- Milieu n 1 - Tryptone, glucose, agar-agar à l'extrait de boeuf -
La croissance sur ce milieu est rapide et abondante.
La couleur la plus foncée du substrat au 6ème jour est le brun moutarde (2 pl). Au llème jour, le substrat le plus clair est brun doré, brun tabac (3 pl), les zones les plus foncées et les centres de colonies très peuplées sont de cou- leur clou de girofle (3 ni). Au 18ème jour, ces zones sont respectivement de couleur chameau, sucre d'érable, havane (3 le) et clou de girofle, brun foncé (3 pl).
Le mycélium aérien est abondant, couvrant la surface de colonies de 2 à 3 mm au 3ème jour et dans la portion centra- le d'autres colonies plus grandes. Il est de couleur blanc nacré (b) à gris clair (c), inchangée après 26 jours d'in- cubation. L'examen microscopique du mycélium aérien au 26ème jour ne montre pas de spores.
Des colonies isolées présentent des centres convexes, avec un mycélium aérien confiné sur 1-2 mm au centre. Au bout de 6 et 11 jours, une seule ride ou fissure diamétrale apparaît dans la portion centrale en relief. A mesure que la croissance progresse, les colonies s'étalent à plat avec une croissance de surface de 2-4 mm, le reste s'étalant de façon dense sous la surface d'agar-agar jusqu'à un diamètre total de 7-7,5 mm au 18ème jour. Le mycélium aérien reste confiné aux zones initiales notées au 3ème jour.
Pigment soluble brunâtre au 3ème jour, clou de girofle moyen (3 nl) au 6ème jour devenant chocolat, brun foncé (4 nl) au 18ème jour.
- Milieu n 2 - Peptone, glucose, chlorure de sodium, agar-agar à l'extrait de boeuf -
Croissance très rapide et abondante - substrat moutarde, vieil or (2 le) 6ème jour - portions plus foncées llème jour
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ambre, topaze (3 pe) - brun doré (3 Pg) 18ème jour, avec nouvelle croissance moutarde, vieil or (2 le) dans les colo- nies en extension.
Mycélium aérien épars à modéré seulement dans les ré- gions de croissance dense, nacré (2 ba), 6ème jour, devenant jaune (1 ba) llème jour. L'examen microscopique ne montre pas de spores au 27ème jour.
Les colonies isolées, au 6ème jour, présentent des cen- tres bombés, ridés radialement. Au 18ème jour, quelques in- dentations radiales vont jusqu'à 1/2 mm du bord des colonies.
Des colonies isolées de 2,25 mm au 3ème jour atteignent 8-11 mm au 18ème jour. Vue d'en haut, la surface des colonies isolées est moutarde clair (2 le) excepté les centres qui sont de couleur crème (1 1/2 ca).
Un pigment soluble brunâtre très clair, 3-11 jours, devient brun verdâtre clair diffus au 18ème jour.
- Milieu n 3 - Agar-agar nutritif -
Excellente croissance. Mycélium aérien modéré à abon- dant couvrant des colonies de 2,0 mm au 3ème jour mais n'aug- mentant pas à mesure que la croissance s'étend à 4-6 mm, llème jour. Le mycélium aérien est blanc nacré (b) à nacre (2 ba) ou ivoire (2 cb) à mesure que l'incubation progresse.
On n'observe pas de spores à l'examen microscopique aux 11ème, 18ème et 27ème jours.
Colonies bien isolées 6ème à llème jour, 4-6 mm de diamètre, avec rides radiales et une seule fissure diamé- trale plus marquée, confinée principalement à une portion centrale en relief de 2 mm portant du mycélium aérien.
Le reste de la croissance s'étend à plat sur la surface d'agar-agar jusqu'à un bord bien défini. La croissance ne pénètre pas dans l'agar-agar au-delà des limites de la croissance de surface.
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Substrat plus foncé, clou de girofle, brun foncé (3 pi) à brun foncé, café, sépia, phoque (3 pn) aux 6ème à llème jour, devemant clou de girofle (3 ni) au 18ème jour.
Substrat plus clair sous les portions sans mycélium aérien, brun clair, cannelle (3 1g) au llème jour, passant à érable jaune (3 ng) au 18ème jour.
Pigment soluble brun foncé, clou de girofle (3 pl), 6ème jour, brun foncé (4 pl) llème jour et brun moutarde diffus (2 pl) 18ème jour.
- Milieu n* 4 - Agar-agar au glucose -
La croissance sur ce milieu est rapide et abondante.
Il ne se forme aucun mycélium aérien en 27 jours d'incuba- tion, et on n'observe aucun pigment soluble.
Des colonies ternes lisses de 2,0 mm au 3ème jour s'é- talent à plat au 6ème jour à 4-4,5 mm, avec fissures ou in- dentations radiales symétriques ridant la portion centrale en relief. A mesure que la croissance progresse, elle ne s'étale pas en dessous de la surface d'agar-agar comme dans d'autres milieux organiques contenant moins de glucose.
La couleur du substrat dans les centres foncés de colo- nies est moutarde, vieil or (2 le) au 6ème jour, pas de chan- gement par la suite. Substrat plus clair de nouvelle crois- sance en extension, bambou, chamois (2 gc).
- Milieu n 5 - Agar-agar et farine d'avone Carvajal-
Aucune croissance ne se produit sur ce milieu en 27 jour d'incubation.
- Milieu n 6 - Solution de Czapek, dextrose, agar-agar -
La croissance est lente à démarrer avec colonies en pointe d'épingle au 3ème jour, progressant à 7,0 mm.
Colonies isolées au 18ème jour. Mycélium aérien épars de teinte jaune (1 ba) au 6ème jour observé au centre de co- lonies de 1-1,5 mm. Au lième jour, un mycélium aérien
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nacré (2 bc) est placé en un anneau épars autour d'une por- tion centrale non aérienne. D'en haut, ce centre non aérien est moutarde, vieil or (2 le). Au llème jour, le substrat des centres de bande et de colonie est de couleur parchemin (1 1/2 db). Au 18ème jour, la croissance des clonies en surface est d'environ 3,0 mm, le reste s'étalant sous la surface de l'agar-agar jusqu'à 7,0 mm.
Il ne se forme aucun pigment soluble en 27 jours. A l'examen microscopique, on ne trouve pas de spores au bout de 27 jours.
- Milieu n 6c - Solution de Czapek, amidon de maïs, agar- agar -
Au 3ème jour, croissance modérée incolore en bande.
Colonies isolées duveteuses, 1,5-2,0 mm. On ne note aucune hydrolyse. Au 6ème jour, la croissance reste incolore.
Colonies isolées 3,0-3,5 mm. Hydrolyse partielle d'une bande de 2,0 mm, douteuse, croissance plus ou moins dense. au 11ème jour, hydrolyse douteuse, halo trouble autour de la croissance avec petite zone de clarification partielle au-delà. Au 18ème jour, nombreuses colonies présentant un mycélium aérien abondant vert à vert-bleu - spores - colo- nies isolées s'étalant de façon dense dans l'agar-agar à 2,0 mm au-delà de la croissance superficielle. Mesure typique : diamètre de la croissance superficielle 9,0 mm, en dessous de l'agar-agar jusqu'à 11,0 mm, halo trouble jusqu'à 15 mm et hydrolyse faible à modérée jusqu'à 22,0 mm.
Zone de clarification appréciée en comparaison de la portion témoin de l'agar-agar, non en comparaison du halo intérieur trouble.
- Milieu n 7 - Dextrose, asparagine, agar-agr -
La croissance est modérée à bonne sur ce milieu.
Substrat très fortement pigmenté au 6ème jour, parchemin
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(1 1/2 db). Cette couleur reste la plus foncée prise par des portions centrales de colonies isolées. La croissance nouvelle présente un substrat de couleur jaune (1 ba) ou in- colore à mesure qu'on approche du bord de la croissance en extension. Mycélium aérien modéré, jaune (ba) à blanc nacré (b). On ne note pas de pigment soluble ni de spores après 27 jours d'incubation.
- Milieu n 8 - Malate de calcium et agar-agar -
La croissance est excellente et la digestion du malade est bonne ou marquée. Au 3ème jour, les colonies, toutes isolées même en bande très dense, sont composées de mycélium non aérien plat, lamellaire, de 2 mm, estimé à < 95% de la croissance. Le reste des colonies plus petites possèdent un mycélium aérien. Au 6ème jour, on note une légère clari- fication du malate. Toutes les colonies ont maintenant un mycélium aérien jaune (1 ba) à part quelques taches de vert amande (23 ig). On n'a pas noté si les colonies à mycélium aérien vert étaient celles apparues tout d'abord avec un mycélium aérien au 3ème jour. Au 11ème jour, la digestion est marquée à 5-6 ma du bord de la bande et le mycélium aérien précédemment vert est maintenant gris foncé à ardoise.
Au 18ème jour la masse du mycélium aérien est blanc nacré (b) à ivoire clair, coquille d'oeuf (2 ca), et au 27ème jour il y a des colonies nouvelles abondantes à mycélium aérien vert dans la bande.
Examen microscopique du mycélium aérien vert : sporula- tion profuse.
- Milieu n 9 - cultures inclinées d'agar-agar à la L-tyrosine
Aucun pigment soluble n'est formé par les nombreuses colonies isolées qui se développent lentement d'abord mais convenablement à mesure que l'incubation progresse, en 27 jours.
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- Milieu n 10a- agar-agar n 1 à l'amidon de mais -
3ème jour : aucune croissance visible
6ème jour : une colonie llème jour : une colonie
18ème jour : colonie de 9,0 mm avec 5 indentations radiales. Zone d'hydrolyse de 13,0 mm de diamètre.
27ème jour : colonie de 19,0 mm, hydrolyse 34 mm.
- Milieu n 11 - Tryptose, agar-agar et sang -
Croissance non aérienne abondante, terne, sèche, pas d'hymolyse en 18 jours d'incubation. En 3 jours il se pro- duit une forte coloration foncée presque noire du milieu environnant au voisinage de la croissance. On peut trouver des globules rouges intacts par exemen de près.
- Milieu n 13 - Tampon de gélatine -
La croissance n'est pas visible au 3ème jour mais elle est bonne au 6ème jour avec mycélium aérien épars, blanc nacré (b) et pigment soluble modéré à abondant, couleur ébè- ne, teck (3 po) en dessous de la pellicule superficielle.
Au 18ème jour, la pellicule est grosse et le pigment soluble brun foncé. La gélatine n'est pas liquéfiée au bout de 27 jours d'incubation.
- Milieu n 14- Coin de pomme de terre -
La croissance est bonne à excellente après un démarrage lent. Au 6ème jour, la majorité est formée de nombreuses colonies sèches, entassées, sans mycélium aérien. Un mycé- lium aérien rare est présent sur une portion supérieure min- ce de la culture inclinée. Les colonies sont ridées au 11ème jour par de nombreuses fissures ou indentations radiales fines. Croissance non aérienne brun adobe, canelle, brun clair (3 lg) au 6ème jour, devenant brun doré, brun tabac (3 pl) à brun foncé, clou de girofle (3 pl) au llème jour.
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Le mycélium aérien rare en haut de la culture est ivoire (2 db). La pomme de terre n'est foncée que modérément au bout de 27 jours d'incubation.
- Milieu n T5 - Bouillon au glucose -
Avec l'inoculum utilisé, toute la croissance sur ce milieu est formée de colonies séparées, placées sous la sur- face, s'accrochant aux côtés et au fond du tube. Au llème jour les colonies des côtés présentent des portions lourdes et légères rayonnant d'un centre dense, typique des rides radiales sur milieux solides favorables. Toute la croissan- ce au fond du tube au 18ème jour. Aucune formation de pel- licule, donc aucun mycélium aérien ni trace de pigment substratal. La croissance est incolore. On n'observe au- cun pigment soluble.
- Milieu n 16 - Solution de Czapek avec dextrose -
Aucune croissance ne se produit en 27 jours d'incubàtion..
- Milieu n 17 - Lait de tournesol -
La croissance est formée d'une pellicule partielle.
Au llème jour, on la note sous la forme de deux grandes colonies ridées. On agite le tube soigneusement pour dis- tribuer la croissance. Au 18ème jour, aucun changement visible ne s'est produit. Au bout de 27 jours, il n'y a pas de coagulation ni de peptonisation. Au 27ème jour le pH final est de 5,7.
- Milieu n 18 - Extrait de levure, maltose et agar-agar -
Croissance abondante et rapide sur ce milieu. Colonies isolées non aériennes. Mycélium aérien modéré dans les ré- gions de croissance dense, blanc nacré (b). On n'observe pas de spores à l'examen microscopique du mycélium aérien aux llème, 18ème et 27ème jours.
Couleur du substrat bambou, chamois (2 gc) au 6ème jour devenant miel, or clair (2 lc) au llème jour et brun
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-doré approximativement (3 pg) au llème jour. Colonies bien isolées, non aériennes, 4-5 mm au 6ème jour, con- vexes avec nombreuses fissures ou rides radiales symétri- ques. Elles atteignent 8,0 mm au llème jour avec portion extérieure s'étalant à plat. Portion centrale en relief fissurée radialement, convergeant vers une petite dépres- sion centrale. La croissance aux bords des colonies ne pénètre pas dans l'agar-agar au-delà de la croissance su- perficielle. On n'observe pas de pigment soluble.
- Milieu n 19 - Purée de tomate, farine d'avoine et agar-agar. -
Croissance rapide et abondante. Mycélium aérien blanc nacré (b) abondant dans les régions de croissance dense au
3ème jour. Colonies isolées typiques de celles décrites pour d'autres milieux organiques. Au 18ème jour, un mycélium aérien apparaît sur des colonies isolées, par ta- ches ou en anneau mince autour d'un centre non aérien en relief, ridé radialement et contourné. Dans les régions de croissance dense, un mycélium aérien apparaît au cen- -tre des colonies dans les portions les plus peuplées. On n'observe aucun changement dans la couleur du milieu en- vironnant. Le mycélium aérien ne prend pas de couleur verte pendant 27 jours d'incubation. L'examen microsco- pique du mycélium aérien après 27 jours ne montre pas de spores.
Grandeur maximale des colonies isolées au 27ème jour : 21,0 mm.
- Morphologie des spores - Milieu de base Pridham et
Gottlieb avec dextrine comme source de carbone -
Des spores mesurant environ 0,8 x 1,0 micron se dé- veloppent en chaînes individuelles qui sont sinueuses, en boucles, enroulements et spirales primitives. On n'observe pas de spirales véritables. Les chaînes appa-
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raissent généralement sous la forme de touffes aux extré- mités de filaments mycéliens ou branches courtes de mycélium, mais occasionnellement sous forme de chaînes in- dividuelles partant d'une branche primaire. Les touffes sont produites par plusieurs chaînée formées par ramifi- cation serrée et sous-ramification du mycélium plutôt qu'en pinceau d'une seule origine.
Les micrographies électroniques montrent que les spores mûrs sont couverte de nombreuses crêtes et épines émoussées. Les jeunes spores sont relativement lisses.
Certains de ceux-ci apparaissent binucléés. La morpholo- gie ovoïde à bascillaire décrite par les mesures données plus haut est confirmée par des micrographies électroni- ques.
Ainsi qu'on l'a dit plus haut, la présente invention comprend encore un procédé visant à cultiver le Strepto- myces caelestis, souche M-188, dans des conditions réglées qui comprennent une température de 24-32 C, en fermentation immergée avec agitation et aération appropriées, sur des milieux constitués par une source d'hydrates de carbone comme le glycérol, l'amidon, la dextrine ou les sucres, glucose, lactose ou sucrose, ou des mélanges de ces sour- ces ; une source d'azote organique telle que l'huile de soja, la liqueur de macération de mais ou la peptone, une source de facteurs de croissance comme la levure, les produits solubles de distillerie ou la mélasse;
des sels minéraux tels que le chlorure de sodium, un tam- pon insoluble pour empêcher l'accumulation d'acide, par exemple le carbonate de calcium, et un agent antimousse non toxique tel qu'une huile végétale. Quand la croissan- ce de l'organisme a donné une quantité satisfaisante de substance antimicrobienne, comme l'indique le titrage
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à l'aide de Bacillus subtilis, on traite toute la culture pour isoler le produit antimicrobien désiré. La quantité de substance active présente dans la phase liquide dépend du pH car le produit antimicrobien est une base faible peu soluble dans l'eau. Aussi, des titrages antibacté- riens effectués sur la liqueur de fermentation filtrée ou centrifugée ne peuvent pas mesurer toute l'activité produite. Il est nécessaire de traiter toute la culture par un acide avant d'effectuer un titrage.
La majorité du produit antimicrobien, dans une bonne fermentation, se retrouvera dans lea solides. Aussi, il est plus effi- cace d'extraire la substance antimicrobienne de toute la culture et non du filtrat ni de la portion liquide. On applique un procédé d'extraction par solvant en tirant parti de la faible solubilité de la substance dans l'eau en milieu alcalin et de la forte solubilité de la substan- ce dans l'eau en milieu acide. Les opérations sont décri- tes plus complètement dans les exemples. Une subatance particulière obtenue de cette façon possède des proprié- tés remarquables et précieuses. Elle possède des carac- téristiques qui la distinguent de substances antimicro- biennes connues et décrites antérieurement.
Pour obtenir un inoculum propre à servir dans des flacons de secoueuse, on peut utiliser la végétation obtenue avec des cultures inclinées sur agar-agar à la tryptone. On peut aussi utiliser ce milieu pour mainte- nir par transfert d'une culture à l'autre des cultures viables appropriées qui donnent le produit antimicrobien.
Toutefois, dans la pratique générale, il est apparu qu'un procédé plus sûr consistait à entretenir la cultu- re de M=188 dans le sol ou avec lyophilisation. On uti- lise la croissance sur cultures inclinées pour inoculer
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des flacons de secoueuse qui peuvent servir à leur tour à inoculer des cuves de fermentation à l'échelle du la- boratoire. Un autre procédé consiste à utiliser les fla- cons de secoueuse pour inoculer des récipients métalliques appropriés, de préférence en aluminium, contenant un mi- lieu approprié qui sert à inoculer des cuves de fermenta- tion à l'échelle de l'usine pilote ou bien les bacs d'en- semencement de-cuves de fermentation à l'échelle commer- ciale.
En général, la croissance de l'organisme dans des cuves de fermentation variant de 23 litres à 38.000 litres atteint son maximum en 3 à 4 jours, bien qu'aux fins d'ob- tention d'un inoculua l'incubation puisse être de 24 heu- res seulement. On maintient des conditions aérobies dans les cuves de fermentation en refoulant de l'air stérile au fond de la cuve à l'aide d'un dispositif de dispersion.
Le débit d'air refoulé dans le milieu de culture dépend plus ou moins de la grandeur et de la forme de la cuve de fermentation. Un taux d'aération de 0,8-1 volume d'air par volume de culture par minute s'est révélé satisfai sant. Si le milieu de culture mousse d'une fa- çon gênante pendant la fermentation, on peut ajouter des huiles végétales antinousse non toxiques en quantité suf- fisante pour abattre la mousse. Pendant toute la durée de la fermentation, on agite le milieu de culture. Tou- tefois, dans une phase de la préparation de l'inoculum où le rendement d'agent antimicrobien dans l'inoculum lui-même n'a pas une importance essentielle, on réalise une agitation suffisante en faisant}barboter de' l'air à travers le liquide.
Par contre, quand le rendement d'agent antimicrobien est important, on effectue l'agi- tation au moyen de dispositifs agitateurs qui font par- tie des appareils de fermentation. Le degré d'agitation
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dépend de la structure des récipients de fermentation de est diverse grandeur car il/bien connu que les cuves de fermen- tation à l'échelle de l'usine pilote et à l'échelle com- merciale sont conçues pour l'usage général et non pour un processus de fermentation déterminé. L'organisme
Streptomyces caelestis souche M-188 peut produire l'agent antimicrobien désiré en ,quantités satisfaisantes dans di- vers milieux de culture sur un intervalle de température d'au moins 24-32 C et il n'est pas nécessaire de mainte- nir un taux d'aération exact ni un degré précis d'agita- tion mécanique.
Les exemples suivants illustrent la formation, la récupération, la concentration, la purification et l'iden- tification de l'agent antimicrobien M-188 et de ses sels d'addition d'acide. Ces exemples servent simplement d'il- lustration et ne doivent pas être considérés comme limita- tifs.
Exemple 1 Fabrication dans des cuves de fermentation de 23 litres avec un milieu mélasse/peptone
Dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3, on met 150 cm3 d'un milieu d'ensemencement contenant les ingrédients suivants, aux concentrations indiquées :
EMI16.1
<tb> grammes <SEP> par <SEP> litre
<tb>
<tb> glucose <SEP> monohydraté <SEP> 15
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> flocons <SEP> de <SEP> soja <SEP> (soja <SEP> finement <SEP> moulu <SEP> et <SEP> dégraissé) <SEP> 15
<tb>
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5
<tb>
eau du robinet :
pourfaire un litre
On stérilise le flacon et son contenu en le passant à l'autoclave pendant 25-30 minutes à une température de 120 C. Après refroidissement, on inocule le flacon avec
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un morceau de la surface d'une culture sur agar-agar à la tryptone où l'on a cultivé le Streptomyces caelestis souche M-188 pendant au moins 6 jours. On agite le flacon inoculé à 28 C sur une secouause rotative qui a une course de 57 mm et fonctionnel à environ 230 t/mn pendant 48 heures.
On utilise la culture ci-dessus pour inoculer des flacons supplémentaires préparés et stérilisés comme ci-dessus. On inocule chaque flacon avec environ 3 cm3 de la culture de 48 heures. On fait incuber les flacons d'ensemencement et on les agite comme ci-dessus pendant 48 heures.
Dans une petite cuve de fermentation d'une capacité de 23 litres, on met 12 litres d'un milieu comprenant : g/1 glucose monohydraté 10 mélasse 20 peptone 5 huile antimousse 5 eau du robinet ! pour faire un litre.
On stérilise la cuve de fermentation et son contenu en les passant à l'autoclave pendant 75 minutes à 121 C.
Après refroidissement, on inocule aseptiquement la cuve de fermentation avec le contenu de trois des flacons de culture d'ensemencement de deuxième passage décrite ci- dessus. On conduit la culture dans la cuve à 24 C pendant 4 jours et pendant ce temps on agite mécaniquement le bouillon et on fait arriver de l'air stérile dans le fond de la cuve à raison d'environ 0,8 volume d'air par volu- me de bouillon et par minute. Pendant la fermentation, le pH s'abaisse d'environ 6,0 à environ 5,0 et s'élève ensuite à environ 5,5. L'activité biologique maximale est atteinte au bout de 4 jours environ. La présence du produit antimicrobien dans la liqueur est indiquée par
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une zone d'inhibition de 24 mm sur un plateau ensemencé en Bacillus subtilis.
Exemple 2
Fabrication dans des cuves de fermentation de 23 litres aval un milieu .formé de farine de soja et de produits solubles de distillerie séchés.
Dans une cuve de fermentation d'une capacité de 23 litres, on place 12 litres d'un milieu de fermentation qui a la composition suivante : g/1 glucose monohydraté 15 farine de soja 12 chlorure de sodium 5 produits solubles de distillerie séchés, provenant de la fermentation de la mélasse 5 glycérol 2,5 carbonate de calcium 1 eau du robinet : pour faire 1 litre
On ajoute dans la cuve environ 300 cm3 d'huile végétale transestérifiée et on passe la cuve et son con- tenu à l'autoclave à 121 C pendant 75 minutes. Après refroidissement, on inocule aseptiquement la cuve de fer- mentation avec trois flacons de culture d'ensemencement de deuxième passage du type décrit à l'exemple 1.
On conduit la culture pendant 4 jours à 28 C; pendant ce temps, on agite mécaniquement et on fait arriver de .l'air stérile au fond de la cuve à raison d'environ 10 1/mn. Pendant ce temps de croissance, le pH du bouil- lon s'élève lentement d'environ 6,2 à environ 7,4.
L'activité antibactérienne telle qu'on la mesure par un essai sur plateau avec le Bacillus subtilis, atteint un
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maximum au bout de 3 à 4 jours environ. On obtient une zone d'inhibition de 25 mm. Au bout de 4 jours, on re- tire de la cuve le liquide de culture et on le filtre à la trompe en utilisant un adjuvant de filtration. Etant donné la faible solubilité de la substance antibactérien- ne dans l'eau, spécialement aux pH neutres ou légèrement alcalins, il faut traiter aussi bien le tourteau que la phase liquide pour récupérer la matière désirée, de la façon décrite à l'exemple 9.
Exemple 3 Fabrication dans des cuves de fermentation de 23 litres sur un milieu formé de farine de soja et de produite solu- bles de distillerie séchés, avec divers composés utilisés comme source de carbone.
On utilise pour une série de cuves de fermentation de 23 litres le même milieu que dans l'exemple 2, à l'excep- tion de la source d'hydrate de carbone. On prépare deux cuves dont chacune contient 12 litres de milieu, avec chacun des hydrates de carbone suivants :glucose mono- hydraté, sucrose, lactose, amidon, dextrine et glycérol.
On prépare ces 12 cuves de la façon décrite à l'exemple 2, chaque jeu de deux cuves contenant 17,5 g/1 de l'hydra- te de carbone désiré à la place des 15 g de glucose mono- hydraté et des 2,5 g de glycérol. Pour chaque cuve, le processus de fermentation est conduit exactement de la façon indiquée à l'exemple 2.
On prépare le produit antimicrobien avec lea six milieux de culture. L'activité antibactérienne mesurée par un titrage sur plateau avec le Bacillus subtilis, indique qu'aucun milieu n'est nettement supérieur aux au- tres. Les-six milieux donnent das zones d'inhibition variant de 24 à 27 mm, les deux derniers jours de la fer- mentation de 4 jours.
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A l'achèvement de la fermentation de 4 jours, on ré- unit tout le contenu de 11 des 12 cuves et on les filtre à la trompe en utilisant un adjuvant de filtration.
Etant donné la faiule solubilité de la substance antibac- térienne dans l'eau spécialement en milieu légèrement al- calin, il faut traiter aussi bien le tourteau que la phase liquide pour récupérer la matière antimicrobienne active,, de la façon décrite à l'exemple 9.
Exemple 4
Fabrication dans des cuves de 23 litres avec un milieu formé de farine de soja et de liqueur de macération-de mais.
On place dans une cuve de fermentation d'une capaci- té de 23 litres, 12 litres d'un milieu de fermentation de la composition suivante : g/1 glucose monohydraté 30 farine de soja 20 liqueur de macération de mais (poids humide) 10 chlorure de sodium 5 carbonate de calcium 2 huile végétale trnsestérifiée 5 pH ajusté à 6,6-6,8 à l'aide de Na2CO3
On passe la cuve et son contenu à l'autoclave à 121 C pendant 75 minutes. Après refroidissement, on ino- cule aseptiquement la cuve de fermentation avec trois fla- cons de culture d'ensemencement de deuxième passage, de la façon décrite à l'exemple 1.
On cultive l'organisme pendant 4 jours à 28 C et pendant ce temps on agite la culture mécaniquement et on fait arriver de l'air stéri- le dans le fond de chaque cuve à raison d'environ 10 1/un.
Pendant le temps de croissance, le pH du milieu s'élève
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lentement à environ 7,6 lors de la récolte après une baisse initiale à 6,2-6,4. L'activité antibactérienne telle qu'on la mesure par le titrage sur plateau avec le Bacillus subtllia, atteint son maximum le 3ème ou le 4ème jour de ferment ation. Etant donné qu'il n'y a pas de baisse apparente de rendement une fois que le maximum est atteint, on opère la récolte le 4ème jour pour assu- rer une production maximale. Sur le plateau de titrage avec Bacillus subtilis, on obtient des zones d'inhibition de 26 mm.
Exemple 5 Fabrication en cuves de 190 litres avec un milieu de fa- rine de soja, liqueur de macération de mais et levure.
On cultive l'organisme Streptomyces caelestis souche M-188 en culture inclinée sur agar-agar à la tryptone pendant 6 jours à 28 C. On met en suspension la végéta- tion d'une culture dans quelques centimètres cubes d'eau et on inocule deux flacons Erlenmeyer de 500 cm3 conte- nant chacun 150 cm3du milieu d'ensemencement suivant : g/1 glucose monohydraté 15 farine de flocons de soja 15 chlorure de sodium 5 carbonate de calcium 1
On stérilise les flacons contenant 150 cm3 de ce milieu en les passant à l'autoclave pendant 25-30 minu- tes à 120 C. Après refroidissement, on inocule les fla- cons avec la végétation tirée des cultures sur agar-agar ci-dessus. On agite les flacons inoculés pendant 48 heures à 28 C sur une secoueuse rotative qui a une excen- tricité de 57 mm.
Avec tout le contenu de ces flacons, on inocule une bonbonne métallique aérée d'une capacité
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d'environ 12 litres contenant 10 litres du milieu suivant : g/1 farine de soja 10 glucose monohydraté 10 carbonate de calcium 1 huile végétale transestérifiée 5
On stérilise préalablement le récipient et son con- tenu à 120 C pendant 80 Minutes et on refroidit à 28 C.
On fait incuber les bonbonnes aérées pendant 48 heures à 28 C. On fait barboter de l'air à travers le milieu de culture, par un tube placé au fond, à raison d'environ 10 1/mn. On utilise alors tout le contenu de la bonbonne pour inoculer une cuve de fermentation d'une capacité de 190 litres contenant 115 litres du milieu suivant que l'on a préalablement stérilisé à 124*C pen- dant 1 heure et refroidi à 32 C: g/1 amidon 10 farine de soja 20 liqueur de macération de mais (poids humide) 10 levure de bière entière séchée 5 carbonate de calcium 3 huile végétale transestérifiée 30
On maintient sous agitation vigoureuse le milieu inoculé de la cuve de fermentation, à une température de 32 C pendant 4 jours tout en aérant à raison d'un vo- lume par volume de milieu par minute.
A la fin de la fer- mentation, la croissance est souvent si forte qu'il est nécessaire de diluer la culture avec de l'eau pour la re- tirer de la cuve de fermentation.
Les titrages sur culture non traitée n'ont que peu ou pas de valeur pour déterminer l'activité de la culture
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lors de la récolte étant donné l'insolubilité du produit antimicrobien. Quand on traite les cultures de la façon suivante, les titrages deviennent plus utiles. On ajuste
50 cm3 de culture complète au pH 2,0 avec de l'acide chlor- hydrique puis on place cette culture acidifiée sur la se- coueuse rotative pendant 30 minutes. On filtre ensuite sous vide à travers trois couches de papier filtre. Après ajustement au pH 4,0 à l'aide de soude, le filtrat est prêt au titrage. Le titre de la fermentation décrite dans cet exemple est de 225 unités/cm3.
Exemple 6 Fabrication dans des cuves de fermentation de 1900 litres sur un milieu de farine de soja, liqueur de macération de mais et levure.
On prépare un inoculum destiné à la cuve dtensemen- cement par le procédé de la bonbonne aérée décrit à l'exem- ple 5. On utilise tout le contenu de l'une des bonbonnes métalliques de culture pour inoculer une cuve de fermen- tation d' ensemencement d'une capacité de 190 litres con- tenant 115 litres du milieu suivant que l'on a stérilisé à 124 C pendant 1 heure et refroidi à 32 C. g/1 amidon 10 farine de soja 20 liqueur de macération de mais (poids humide) 10 levure de bière entière séchée 5 carbonnate de calcium 3 huile végétale transestérifiée 30 pH à 6,7 à l'aide de Na2CO3
On maintient la cuve d'ensemencement à 32 C pendant 24 heures avec vigoureuse agitation mécanique et en aérant à raison d'un volume d'air par volume de milieu de culture
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par minute.
Au bout de ces 24 heures, on utilise tout le contenu de la cuve de fermentation pour inoculer 1150 litres du même milieu dans une cuve de fermentation d'une capacité de 1900 litres, On maintient le milieu inoculé de la cuve de fermentation sous une vigoureuse agitation mécanique à une température de 32 C pendant 4 jours.
On introduit de l'air stérile pour l'aération du milieu de cult ure à raison de 1 volume par volume de milieu par minute. A la fin du cycle de fermentation, on dilue la culture avec suffisamment d'eau pour qu'elle soit as- sez fluide et puisse être retirée de la cuve par pompage, ce qui permet de commencer l'opération de récupération.
Avant de diluer la culture, on prélève un échantillon pour le titrage et on le traite de la façon décrite à l'exemple 5. Le titre de la matière, dans cette fermen- tation de 1150 litres, est de 375 unités/cm3.
Exemple 7 Fabrication dans des cuves de fermentation de 36.000 litres sur un milieu de farine de soja, liqueur de macéra- tion de mais et levure.
On prépare un inoculum destiné à la cuve de fermen- tation d'ensemencement par le procédé de la bonbonne aérée décrit à l'exemple 5. On utilise tout le contenu de l'une des bonbonnes métalliques de culture pour ino- culer une cuve de fermentation d'ensemencement d'une capacité de 3150 litres contenant 1285 litres du milieu suivant, que l'on a stérilisé à 124 C pendant 1 heure et refroidi à 32 C : g/1 amidon 10 farine de soja 20 liqueur de macération de mais (poids humide) 10
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trois reprises par le chloroforme en utilisant 1,5 litre de chloroforme pour chaque extraction. Après chaque extrac- tion, on laisse reposer le mélange jusqu'à ce que les phases se séparent et on soutire la phase chloroforme.
On réu- nit les trois portions de chloroforme et on les fait pas- ser sur une colonne garnie d'un excès d'adsorbant formé de silicate de magnésium synthétique. Après avoir lavé la colonne avec du chloroforme frais, on élue la substance désirée en faisant passer sur la colonne un mélange à 10% d'éthanol et 90% de chloroforme. En opérant un titrage sur plateau avec le Bacillus subtilis, on voit que 30% de l'activité antimicrobienne sont tirés des 936 mg de solides que l'on obtient en évaporant la solution d'étha- nol et de chloroforme.
La croissance du Staphylococcus aureus dans un bouil- lon est entravée par 2 # g/cm3 de la matière ci-dessus.
Quand on la dissout dans du méthanol acidifié ou dans de l'acide chlorhydrique aqueux O,ln, son spectre d'absorp- tion d'ultra-violet présente un maximum à 279 millimicrons, de grandeur E 1 % cm = 240.
Exemple 9 Récupération de l'agent antimicrobien de la liqueur de fer- mentation et du tourteau de filtration.
On réunit la liqueur de fermentation provenant de 11 cuves de 23 litres et obtenue essentiellement comme dans l'exemple 3 avec six hydrates de carbone différents, on la filtre à la trompe en utilisant un adjuvant de filtra- tion pour obtenir 60 litres de filtrat limpide. On ex- trait le filtrat à trois reprises par le chloroforme en utilisant pour chaque extraction un volume de chloroforme égal à environ 1/10 du volume de la phase aqueuse. Après chaque extraction, on laisse les phases se séparer, on
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levure de bière entière séchée 5 carhonate de calcium 3 huile végétale transestérifiée 10 pH à 6,7 à l'aide de Na2CO3
On maintient la cuve de fermentation d'ensemencement à 32 C pendant 28 heures avec vigoureuse agitation mécani- que et en aérant à raison d'un volume d'air par volume de milieu de culture par minute.
Au bout de ces 28 heures, on utilise tout le contenu de la cuve de fermentation pour ino- culer 22.000 litres du même milieu dans une cuve de fermen- tation d'une capacité de 38.000 litres. On maintient le milieu inoculé de la cuve de fermentation sous agitation mécanique vigoureuse à une température de 32 C pendant 4 jours. On introduit de l'air stérile pour aérer le milieu de culture à raison d'un volume par volume de milieu par minute. A la fin du cycle de fermentation, on dilue la culture avec suffisamment d'eau pour qu'elle soit assez fluide et que l'on puisse la retirer de la cuve par pom- page pour commencer l'opération de récupération.
Avant de diluer la culture, on prélève un échantillon pour le titrage et on le traite de la façon décrite à l'exemple 5.
Le titre de la matière dans cette fermentation de 22.000 litres est de 360 unités/ca3.
Exemple 8 Récupération de l'agent antimicrobien tiré d'une fermen- tation de 12 litres, par un procédé d'extraction au chloro- forme. - On agite avec un adjuvant de filtration la liqueur fermentée tirée d'une cuve de fermentation de 23 litres et préparée essentiellement comme dans l'exemple 1 et en la sépare des solides par filtration à la trompe pour obtenir 7,6 litres de filtrat limpide. On extrait celui-ci à
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conserva la phase chloroforme et s'il existe une couche d'émulsion on la centrifuge pour récupérer le chloroforme.
Les extraits réunis contiennent plus de 80% de l'activité antimicrobienne du filtrat. On extrait le tourteau à deux reprises par des portions de 10 litres d'acétone aqueuse à 50% pour récupérer la majeure partie de l'activité anti- microbienne.
De la même façon, on filtre la liqueur de fermenta- tion globale provenant de six cuves de 23 litres et obte- nue comme dans l'exemple 2, pour obtenir 42 litres de fil- trat limpide que l'on extrait à trois reprises par le chloroforme de la façon décrite plus haut. On extrait à deux reprises le tourteau par des portions de 10 litres d'acétone aqueuse à 50%, de la façon décrite plus haut.
On réunit les extraits au chloroforme des filtrats et on les évapore sous vide jusqu'à siccité. On met le d'eau résidu séché en suspension dans 50 cm3/ et es l'extrait à plusieurs reprises par des portions de 50 cm3 d'éther éthylique. On réunit les extraits à l'éther et on les évapore pour obtenir 4,37 g de solides.
On réunit les extraits à l'acétone aqueuse des tour- teaux et on les concentre jusqu'à 14 litres pour élimi- fier l'acétone. On extrait à trois reprises la solution aqueuse avec 3 ou 4 litres de chloroforme. On réunit les extraits et on les évapore jusqutà obtention d'une poudre sèche que l'on remet en suspension dans 50 cm3 d'eau, puis on extrait à plusieurs reprises par des por- tions d'éther de 50 cm3.
Les extraits à l'éther donnent
6,90 g de solides. -
Etant donné que les titrages effectués sur les deux préparations séchées montrent qu'elles ont des activités similaires, 200-250 unités/mg, et que les chromatogram-
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mes sur papier et les toxicités sont similaires, on réu- nit les deux matières pour les purifier ensuite. On di s- sout chaque préparation dans du méthanol, on mélange les solutions et on les sèche pour obtenir 10 g de solides.
On extrait 4 g de cette matière globale avec plusieurs portions d'eau acidifiée tout au plus jusqu'au pH 2,0.
On réunit les extraits à l'eau acidifiée, soit 180 cm3, on les extrait à l'éther et on jette la phase éther.
On ajuste la phase aqueuse à un pH légèrement alcalin et on l'extrait à l'éther. On évapore l'extrait jusqu'à obtenir 2,0 g de résidu sec titrant 320 unitês/mg.
Exemple 10 Récupération de l'agent antimicrobien tiré de fermenta- tions de 115 litres par un procédé d'extraction au chloro- forme.
On réunit les cultures entières fermentées obtenues dans quatre cuves de 190 litres de{La même façon que dans l'exemple 5, pour obtenir 435 litres. On ajuste la cultu- re globale au pH 2,0 à l'aide d'acide chlorhydrique à 10% et on agite pendant 30 minutes.- On filtre la matière pour obtenir 390 litres de filtrat. On ajuste le filtrat au pH 4,0 avec 10% de solution de soude. On conduit trois extractions avec 1/10 de volume de chloroforme chaque fois. On sépare les deux phases liquides dans une centri- fugeuse. On concentre l'extrait sous pression réduite jusqu'à 2200 cm3. On ajoute au concentré de chloroforme 3 volumes de pentane et on extrait le mélange à trois reprises par 1/8 de volume d'acide acétique aqueux à 5%. On jette la couche de solvant.
On concentre la couche aqueuse acide sous pression réduite jusqu'à envi- ron 1/8 de son volume primitif. On précipite les impu- retés en agitant et en ajustant lentement le pH à 5,3
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à l'aide d'une solution de soude à 10%. Il se forme un résidu gommeux, on le sépare par filtration et on le jet- te. On ajuste le pH de la solution clarifiée à 11 à l'ai- de de soude à 10% pour précipiter l'agent antimicrobien; on recueille celui-ci par filtration et on le lave soigneu- sement avec de l'eau distillée ajustée au pH 9,0. On sè- che la poudre sous vide à 45 C. On récupère 75 g d'agent antimicrobien M-188 qui a un titre de 300 unitéa/ng.
Exemple 11 Récupération de l'agent antimicrobien de fermentations de 115 litres par extraction à l'acétate d'amyle au pH 8,4.
On réunit les cultures entières fermentées obtenues dans des cuves de 190 litres, essentiellement de la façon décrite à l'exemple 5, pour obtenir 225 litres. On ajuste au pH 8,4 la culture globale en utilisant une solution de soude à 10%. On extrait la culture ajustée par 1/5 de volume d'acétate d'amyle. Après séparation de la couche d'acétate d'allyle, on l'extrait avec environ 1/2 volume d'eau distillée, maintenue au pH 2,5 à l'aide d'acide sul- furique. On sépare la phase aqueuse et on l'ajuste au pH 5,5 à l'aide de soude à 10%. On concentre jusqu'à 3 litres sous pression réduite cette solution qui contient le produit antimicrobien. On ajuste le pH du concentré à 8,5-9,0 à l'aide de soude, qui précipita le produit antimicrobien.
On retire le précipité par filtration et on le lave soigneusement à l'eau distillée ajustée au pH 9,0. On sèche le précipité sous vide à 45 C. On ré- cupère 26 g d'agent antimicrobien M-188 qui a un titre de 435 unités/mg.
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Exemple 12 Récupération de l'agent antimicrobien d'une fermentation de 115 litres par un traitement acide avant l'extraction à l'acétate d'amyle à un pH alcalin.
On prend 78 litres de culture entière fermentée obte- nue dans une cuve de 190 litres essentiellement de la façon décrite à l'exemple 5, et on ajuste le pH à 2,0 avec de l'acide sulfurique. Après avoir maintenu la culture au pH 2,0 et l'avoir agitée pendant 3 heures, on filtre pour éliminer le mycélium. On ajuste le filtrat au pH 8,3 avec une solution de soude à 10%. On ajoute 1/6 de volu- me d'acétate d'amyle et on agite le mélange pendant 30 minutes. On sépare les deux phases dans une centrifugeu- se. On jette la phase aqueuse qui ne présente pratique- ment aucune activité antimicrobienne. On extrait l'acé- tate d'amyle par environ 1/40 de volume d'eau maintenue au pH 2,5 à l'aide d'acide sulfurique et on sépare les
EMI30.1
#:aass . i aju8te alôr8 la solution aqueuse au pti 9,5 à l'aide de soude tout en agitant vigoureusement.
On filtre la bouillie et on lave soigneusement le tourteau à l'eau distillée au pH 9,0 environ. On sèche les soli- des sous vide à 45 C pour obtenir 10,5 g de produit ti- trant 474 unités/mg.
Exemple 13 Récupération de l'agent antimicrobien d'une fermentation de 1150 litres par extraction à l'acétate d'amyle au pH 8,4.
On réunit les cultures entières fermentées obtenues dans quatre cuves de 1900 litres, essentiellement de la façon décrite à l'exemple 6, pour obtenir 6200 litres de liqueur de fermentation. Le volume total de la culture comprend l'eau nécessaire à la dilution permettant de re- tirer le milieu de la cuve par pompage. On ajuste la cul-
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ture globale au pH 8,4 à l'aide d'une solution de soude à 10% et on extrait avec 1/5 de volume d'acétate d'amyle.
On sépare le s phases et on jette la phase aqueuse. On extrait la phase acétate d'amyle avec environ 1/40 de vo- lume d'eau distillee maintenue au pH 2,5 à l'aide d'acide sulfurique. On sépare la solution aqueuse du produit anti- microbien et on l'ajuste au pH 9,5, ce qui précipite le produit antimicrobien. On sépare le précipité par filtra- tion et on le lave soigneusement avec de l'eau distillée ajustée au pH 9,0 environ. On sèche le précipité à l'air à 50 C. Le produit antimicrobien obtenu pèse 563 g et il a un titre de 325 unités/mg.
Exemple 14 Récupération de l'agent antimicrobien d'une fermentation de 22.000 litre* par un traitement acide avant l'extrac- tion par l'acétate d'amyle à un pH alcalin.
On ajuste au pH 2,0 à l'aide d'acide sulfurique une culture entière fermentée obtenue de la façon décrite à l'exemple 7, et on agite pendant 3 heures pour retirer le produit antiaicrobien du mycélium. On filtre la culture et on ajuste le pH du filtrat à 8,4 à l'aide de soude à 10%. A ce stade, on obtient 26.190 litres de filtrat.
On extrait ce filtrat par 1/8 de volume d'acétate d'amy- le dans un extracteur liquide/liquide, à raison de 114 litres par minute. On extrait la solution d'acétate d'a- myle avec 1/40 de volume d'eau maintenue au pH 2,0 à l'ai- de d'acide sulfurique. On ajuste cet e xtrait aqueux au pH 9,5 pour précipiter le produit antimicrobien. On sépare le produit par filtration et on lave soigneusement à l'eau distillée ajustée au pH 9,0 environ. On sèche le précipité à l'air à 50 C. Le produit antimicrobien obtenu pèse 7,38kg et il a un titre de 482 unités/mg.
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Exemple 15 Purification plus poussée de l'agent antimicrobien par chromatographique sur silicate de magnésium.
On dissout dans 100 cm3 de chloroforme 17 g du produit antimicrobien titrant 395 unités/mg (E1%1 cm pointe 278 m@ 236) obtenu par le procédé de l'exemple 11. On applique cet- te solution à une colonne contenant 500 g de silicate de ma- gnésium comme adsorbant et on commence le développement avec de l'éthanol à 1% dans le chloroforme.
On recueille- des frac- tions de 15cm3 et on les classe comme suit d'après les pointes d'ultra-violet :
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(*) Les impuretés pigmentées sont largement retenues dans ia portion supérieure de la colonne.
Exemple 16 Purification plus poussée de l'agent antimicrobien sur une colon- ne de silicate de magnésium.
On dissout dans 200 cm3 de chloroforme 60 g du produit antimicrobien titrant 395 unités/mg (E1% cm pointe à 278 m
236) obtenu par le procédé de l'exemple 11, et on l'applique
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à une colonne de 120 g de silicate de magnésium. On lave la colonne avec 1% de méthanol dans du chloroforme et on recueil- le les deux fractions suivantes :
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<tb> Fraction <SEP> E1%1 <SEP> cm <SEP> à <SEP> 280 <SEP> m@ <SEP> Titre <SEP> en <SEP> unités/mg <SEP> Poids <SEP> de <SEP> la <SEP> frac,
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<tb> B <SEP> 225 <SEP> 450 <SEP> 2,2
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Exemple 17 Formation du chlorhydrate du M-188
On dissout dans de l'éther diéthylique sec un échantil- lon de la base libre obtenue dans l'exemple 12.
On fait bar- boter de l'acide chlorhydrique gazeux dans l'éther et le chlor- hydrate précipite.
Afin de pouvoir évaluer l'activité de diverses prépara- tions d'agent antimicrobien M-188, on utilise un titrage sur plateau d'agar-agar avec le Bacillus subtilis ATGC-10707 com- me organisme d'essai, et une préparation de M-188 contenant 320 unités/mg. Le procédé de titrage est basé sur celui de D.C. Grove et W.A. Randall, "Assay Methods of Antibiotics and a Laboratory Manuel", édité par Médical Encyclopedia, New York 1955, pages 34, 35 et 38. On utilise un milieu d'agar-agar à l'extrait de levure pour titrages de streptomycine, à raison de 10 cm3par plateau. On dilue la solution d'essai dans un tampon phosphate à 1% au pH 6,0 et on l'ajoute aux plateaux d'acier que l'on fait incuber à 37 C pendant 16-17 heures.
L'intervalle de la courbe de titrage est de 2, 4, 6, 8 et 16 unités/cm3, le chiffre de 4 unités/cm3 servant d'étalon de référence. A un échantillon de 2 g préparé suivant l'exemple 9, on attribue arbitrairement un titre de 320 unités/mg. Tous les titres indiqués aux exemples précédents sont obtenus sur cette base. A ce point de vue, des échantillons de M-188 qui titrent 600 unités/mg sont très purifiés et approchent du titre maximal.
Après avoir cultivé l'organisme pendant 4 jours environ
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et avoir atteint dans la liqueur de fermentation une concen- tration appropriée du produit antimicrobien, on peut séparer la produit des cultures par plusieurs méthodes. Etant donné que le produit est presque insoluble dans l'eau neutre ou al- caline, la majeure partie est en phase solide. Si on le dé- sire, on peut séparer la culture par filtration et traiter le liquide de la façon décrite ci-après, tandis que l'on ex- trait la phase solide par un solvant organique tel que l'acé- tone ou un alcool dans lequel la base est soluble. Ou encore on peut acidifier la liqueur de fermentation et l'agiter jus- qu'à ce que la substance antimicrobienne soit dissoute.
On filtre alors la culture et on traite la phase liquide pour récupérer le produit désiré.
Pour récupérer le M-188 d'une solution aqueuse obtenue comme ci-dessus, il est avantageux d'alcaliniser la solution et d'extraire la substance active par un solvant non miscible à l'eau. Divers solvants sont utiles pour l'extraction mais il faut préférer le chloroforme ou l'acétate d'éthyle ou d' amyle. Pour récupérer le M-188 d'une solution dans un solvant organique, on peut évaporer la solution jusqu'à siccité mais il est avantageux d'extraire la substance antimicrobienne dans un acide aqueux dilué en utilisant assez d'acide pour neutraliser la base libre contenue dans le solvant organique et la faire passer en solution dans un volume d'eau relati- vement petit, 'environ 1% du volume initial de la culture. Quand on ajoute un alcali tel qu'une solution de soude à la solution ainsi obtenue, la substance désirée précipite sous forme de base libre.
On peut encore purifier la base libre par chro- matographie bien qu'il soit impossible d'obtenir ainsi une substance complètement homogène. En faisant passer une solu- tion de base M-188 dans le chloroforme sur une colonne de si- licate de magnésium et en éluant la substance active avec du chloroforme contenant environ 1% d'éthanol, on obtient un fractionnement de la matière que l'on peut suivre en observant
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la densité optique à 280 millimicrons.
Le Streptomyces caelestis souche M-188 produit un mélan- ge de substances antibiotiques. Les meilleures préparations contiennent plus d'une matière biologiquement active, comme le révèlent les chromatogrammes sur papier. Deux des substan- ces biologiquement actives qui sont présentes comme impuretés dans les meilleures préparations d'agent antimicrobien M-188 ont été obtenues sous forme de préparations purifiées et on a trouvé que leurs propriétés antibactériennes étaient essentiel- lement identiques à celles du constituant principal. Ainsi, il doit être bien entendu que l'agent antimicrobien ici dé- crit n'a pas besoin d'être pur à 100% pour être actif à 100%.
L'agent antimicrobien M-188 à l'état purifié est une pou- dre blanche amorphe qui est soluble dans l'eau à 25 C à raison de 2,5 mg/cm3 seulement. Elle est très soluble dans la plu- part des solvants organiques tels que le méthanol, l'éthanol, le chloroforme, l'acétate d'éthyle et le benzène. Elle est insoluble dans les hydrocarbures saturés. Elle est facilement soluble dans les acides minéraux aqueux dilués. Le titrage électrométrique dans l'éthanol aqueux à 50% indique un groupe titrable dans lequel pKa - 6,7. Le spectre d'absorption d' ultra-violet de la base libre dans le chloroforme présente un maximum à 279 millimicrons, E1% = 280 et un minimum à 232 Millimicrons, E1% = 29.
Le spectre d'absorption d'infra- rouge du M-188 purifié est indiqué sur le dessin ci-joint.
Quand on détermine un spectre infra-rouge.de l'agent antimicro- bien M-188 sous forme de base libre à l'aide d'une solution à 7% dans le chloroforme en utilisant un spectrophotomètre à double faisceau, on voit les bandes d'absorption suivantes :
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EMI36.1
<tb> Longueur <SEP> d'onde, <SEP> microns <SEP> Fréquence, <SEP> cm-1 <SEP> Intensité
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,88 <SEP> 3472 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,41 <SEP> 2933 <SEP> S
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5,79 <SEP> 1727 <SEP> S
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5,94 <SEP> 1684 <SEP> W
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,12 <SEP> 1634 <SEP> W
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,26 <SEP> 1597 <SEP> s
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,89 <SEP> 1451 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7,11 <SEP> 1406 <SEP> w
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7,36 <SEP> 1359 <SEP> w
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7,
46 <SEP> 1340 <SEP> w
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7,73 <SEP> 1294
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7,85 <SEP> 1274 <SEP> w
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8,00 <SEP> 1250 <SEP> W
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8,60 <SEP> 1163 <SEP> s
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8,95 <SEP> 1117 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9,25 <SEP> 1081
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9,52 <SEP> 1050
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9,75 <SEP> 1026 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9,85 <SEP> 1015 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9,98 <SEP> 1002 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10,22 <SEP> 978
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10,9 <SEP> 917 <SEP> w
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Il,12 <SEP> 899 <SEP> W
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 11,53 <SEP> 868 <SEP> w
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 11,94 <SEP> 838 <SEP> @ <SEP> M
<tb>
S - forte ; M @ moyenne ; W - faible.
La rotation spécifique d'une solution à 1% de la base libre dans le chloroforme est [[alpha]] 25D = -40.
L'analyse élémentaire d'un échantillon représentative de la base libre M-188 montre qu'il contient 60,37% de carbone, 8,21% d'hydrogène, 1,91% d'azote et 29,51% d'oxygène par diffé- rence, ce qui correspond à une formule empirique C38H61NO14
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qui donne théoriquement 60,38% de carbone, 8,13% d'hydrogène, 1,85% d'azote et 29,63% d'oxygène. Ainsi, le poids moléculai- re calculé est 756.
On peut obtenir les sels d'addition d'acide de l'agent antimicrobien M-188 en traitant une solution de la base libre dans l'eau ou dans un solvant organique comme le méthanol, l'acétate d'éthyle ou le chlorure de méthylène, par une quantité équivalente d'une solution aqueuse d'un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide oxalique, l'acide salicylique ou l'aci- de citrique et en évaporant la solution jusqu'à siccité. Ou encore, on peut traiter une solution d'agent antimicrobien M-188 dans un solvant organique par un acide choisi ou une so- lution de celui-ci et précipiter directement de la solution le sel d'addition d'acide correspondant. Comme exemples de ces sels, on citera le chlorhydrate, l'oxalate, le salicylate, le citrate, le benzoate et le sulfate. Pour les usages thé- rapeutiques, le sel choisi doit évidemment être non toxique.
L'invention n'est pas limitée à la préparation de l'a- gent antimicrobien M-188 au moyen de la souche décrite de Streptomyces caelestie. Il est entendu que le procédé de fer- mentation de la présente invention peut aussi porter sur d' autres souches de Streptomyces caelestis productrices de M-188 que l'on obtient en exposant l'organisme indiqué à des agents modificateurs tels que les rayons X, les rayons ultra- violets et des agents chimiques comme la chloréthazine.
L'agent antimicrobien M-188 et ses sels d'addition d'a- cide sont caractérisés par un large spectre antibactérien.
L'activité de cet agent contre des organismes typiques est in- diquée par le tableau suivant :
<Desc/Clms Page number 38>
EMI38.1
<tb> Spectre <SEP> antimicrobien
<tb>
<tb> Concentration <SEP> minimale
<tb> Organisme <SEP> d'inhibition <SEP> après <SEP> 48
<tb> heures. <SEP> g/cm3
<tb>
EMI38.2
Staphylococcun aurs'* 209-P 0,5
EMI38.3
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Treaster <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Wise <SEP> 391 <SEP> 1,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 0,75
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogènes <SEP> 0,25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 2,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> agalaciae <SEP> 0,13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> dysgalactlae <SEP> 0,
25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Enterococcus <SEP> 89 <SEP> 2,0 <SEP> @
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Enterococcus <SEP> 93 <SEP> 2,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Enterococcus <SEP> Blaschke <SEP> 1,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Clostridium <SEP> sporogenes <SEP> 48,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cloatridium <SEP> perfringens <SEP> 64,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Corynebacterium <SEP> species <SEP> 0,25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 0,06
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> il,25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Lactobacillus <SEP> casei <SEP> 0,
5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> >256
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> >256
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Escherichla <SEP> coli <SEP> 128
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumonia <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> ATCC <SEP> 10544 <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> (poule)
<SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 95
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Neisseria <SEP> catarrhalls <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Actinomyces <SEP> bovis <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> >512
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chaetomlum <SEP> globosum <SEP> >512
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> < <SEP> 32
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> >512
<tb>
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On a trouvé que l'agent antimicrobien M-188 était extrê- mement utile dans la lutte contre la sinusite du dindon et la coccidiose. Dans des opérations représentative.:), on a ob- tenu un bon résultat contre la sinusite infectieuse du dindon en injectant directement dans les sinus des dindons infectés 25-50 mg d'agent antimicrobien M-188.
De la même façon, on a trouvé que l'on obtenait un bon résultat contre la cocci- diose en incorporant l'agent antimicrobien M-188 à l'alimen- tation des poules à raison de 0,05-0,10% en poids sur le to- tal de l'alimentation donnée à des poules fortement atteintes par là coccidiose par suite de la présence du protozoaire Elméria tenella.