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Produit antibiotique.
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Lad présente invention se rapports 21 dec IH'.)C "1'-:'::; n'.juv'.- t1: et utiles pour préparer un antibiotique que 1=Â Dfiù:,n;1=1,;r; ; ; , p ,> <#1 O'nog..'ilycine et qui est <J ctu el18nstl ,.iair connu :J'Il lp l1)il :le ttr3cycline. Plus particulisrC::i'l"mt, elle sir rapport"' 31 df3 procèdes particuliers pour le séparer et 1" c ncs,at7 :r a; J;>luti:J,>5 brut'3s, et :1ot:'¯TI;:J.E:nt des bouillons .le f;:;.I.'"lC'.1t 1 ' >.i '::t p.111r le purifier.
Au c , > , i r 5 d e ces s ci e m i 1 5 r * = 1;rin ,Ô e s , un cerf in n'.J.!l1Jl" '{'., r.xw-u.itn du ,l1é:-!r.Joll'>lld de 1:: c2ois.¯ ncrm7.e , 1>:1.c.t'r.i<is , , ;li l'JLJl'J1: .ilGC'G.^.Ci3luiS ont lté i3ol'fs ,,;t; oa = C'c."u;L,:;1.é "!)'!!
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possédaient des propriétés thérapeutiques intéressantes. Parmi
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ces produits on peut mentionner la pnieil-liiiee la streptomycine la graalicidine la tyrocidine la bwci racie, la subtilisez la St'1"ç? t0 t3.r7. ^ii e, . lI r.J;3::I C? ne C Ciî.O'¯'t trc C;ß C i12 e , la 1 'T'c'J1 j% C'? 3.
(oiy+t4t1-a.cyrcline) et .'2'Z'?' S. .'eI'c'-.c3.I2S de ces produits sont 2ï.i:Tc mennent utiles par leur action sur les f3 r S..'" . 5 :? pathogènes.
.DJ'eutres n-lort rillylun(-- T2.ï. z15.
D'*,utres n'ont qu'une utilité limitée pour diverses s exemple à cause de leur toxicité- La chlortétracyclinej l*oxy- tétracycline et la tétracycline son5iJal-"ci,=ili?r-ei#i: ;t utiles par leur large spectre d activité. P=ti:i1 ce,s der.';.iers. la tétra- eycline est un ar-tibiotique à spectre =Tg# c,ci, 1r-=rne de meil- leurs niveaux sanguins et --aoi-ns de réactions Z"3±î=Îlô.SÀl'eS que r= 1=1, <J x< "c é t i <z =r r:' àn e et 3. - ' ; a¯rTCl jîC et 33t en particulier pu; s:.\ble que la =i=' cr%1*é.l:>;a,;;j;el,1=Je dans les ..i12i,e=:x ".Icplins.
Le 21?.t de 1s présente invention, est do procurer des procédés )el'Îo3C'ÉàCWZàî de préparation de tétrscyclina convenant pour les applications ccierciales.
Suivent la présente invention;, dans un procédé à pré- J ... s¯']¯1 1 L2::=#gi:njrei=#e, on cultive une espace de I3 'vl ß VCJ.t: (f;.. 7 >1'> ±..i 1 # " ±'.<- de 1 ' =ùv: à gà:nj,r cin % dans une solution aqueuse î.i.32T,-t:.'?' de c.-.r'-ne <,.>t= oJc-:1.#iu un élément-nutritif azotée dans des o3Oi2àl ulOiXs S.--iD'C12S sub.'.iergées¯, j:sc¯iââ ce aucune é,C'lf,Iîi%É an ti bactérienne appréciable soit donnée cette solution i#"àoi µ? 5n sépare 1?#1>1;Éjj.#:- .;iycine ..1.¯ produire du bouillon de fermentation J .. précipite"- tion a le "lin e. i?ti:::':2"''?:e: obtenue par leprocédé de l3. présenta inven- tion est une subst=nce ¯:'3t '..r -' .:2:L! ¯ le i: 'sT# ,?'3 ':=2 : :Âc3 bactéries à Grar.i-positif et à Gr?.-n-=tif et .-:G2T.''tlbl3 de :3T S!Z-.
'?"..l?r .18s sels =-Tec 1,5s "1..:.:.WJ si -L's '.'..'auj 'j!.cm li b?'c '?7"" ej?res?on 1: for....!l3 ?' 1"à" CprIIJ'.'; "'-""A -t tî q=.- e n <.i t 1, 1 7flJ -µL 7¯à. C -'.n ?3 # 1 S co -aà 5 * = =i r , u"L ;1't W7..ï.t z'l L f.a7j.¯ ¯ /- . - z7 ' ' J * - 2/> 5 L "..i .. f¯'. .i;m'.'-.1..-t: ..f 1 1 ,- ' ? ?> .- '* '" ;;-fl ... ;:
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présente des pointes d'absorption dans l'ultra-violet à
267m (@ 17, 400) et 355m @ 13, 500) dans l'acide chlorhydrique 0,1 N et présente, lorsqu'elle est mise en suspen- sion dans l'huile minérale une absorption caractéristique dans la région infra-rouge du spectre aux fréquences suivantes, exprimées en cm-1 :
3490, 1672, 1607, 1524, 1259, 1222, 1130,
1065, 1040, 990, 963, 948, 932, 861, 838, 803, 786, 741,739 et 668 , dont le chlorhydrate fond pratiquement à 217 -219 C. en se décomposant, et correspond à la formule empirique
C22H24N2o3.HCI, a un pouvoir rotatoire [Ó]D27= -253 à une concentration de 0,5% dans l'acide chlorhydrique 0,1 N et présente, lorsqu'il est en suspension dans l'huile minérale, une absorption caractéristique dans la région infra-rouge du spectre aux fré- quences suivantes exprimées en cm-1:
3340, 1678, 1623, 1597,
1315, 1248, 1229, 1175, 1140, 1061, 1036, 1002, 964, 949, 864, 823, 796, 781, 743, 719, 692 et 667, et dont le formiate fond pratiquement à 176 -177 C et correspond à la formule empirique C22H24N2O8. HCOOH.
L'Omégamycine exerce une action inhibitrice sur le développement de nombreuses bactéries, comme on le décrira en détail plus loin.
L'Omégamycine est préparée entre autres procédés par la culture dans des conditions particulièrement réglées d'une espèce de microorganismes non décrite jusqu'à présent qu'on a appelée provisoirement Streptomyces BL 567201 et qui a été isolée d'un échantillon de sol. La description de cet organisme est donnée ci- dessous.
L'organisme BL 567. 201 sp. nov. qui produit l'Omégamycine appartient au genre appelé Streptomyces. Le développement de cet organisme est bon sur glycérol-asparagine-extrait de boeuf- agar à 30 C. Sur ce milieu des hyphes aériens gris souris se for- ment, et un pigment vert jsuntre est secrété dans l'agar. Le
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mycélium est compose d'hyphes ramifiés dont les élé.l1ents les plus
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jeunes sont à Gram-positif. Des conidies sont produites sur les hyphes aériens.
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L 'Ol11ég:n.yclne peut être également préparée, entre autres procédés, par culture dents des conditions particulièrement 1'(>.::;lée3: de l'une ou l'autre d'un certain nombre d'espèces de icroor6nis- Bies non décrites jusqu'à présent qui ont ét6 provisoirement p0e- lées Streptoolyees BL 567714, Streptomyces BL 6 03 Str29-Go"lyces BL b 703. , Strepto:llyces 67$040, Streptomyces El, 6710À6; Strepto-nyces 673079. Streptomyces 67&l10, Streptomyces BL 456667 et streptoI!lyces BL 456667A. Tous ces org:niS!116S ont été isolés d-'échantillons de sol. Ils appartiennent tous cI? E l e tf e-itaz... ces. Le .E'4' ..w?î7;W:.¯t>e¯ :. de chacun de ces orgeni 2es sur gl'.1 cos,, D...,,(.!'.- "" et ",' ,'. de ,:,'" ...,' '" ""- d n-'- 1 à "'Z""C "'6 ''.spp.r"gine-extrait deviende-agpr pendant ¯l.:. jours à 32'C exécuta et les résultats ont été notés.
Les observations faites oour chaque Orb3..}'liçs":C.-' se trouvent dans le tableau ci-dessous.
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0rgznis:=ae Caractéristique et Couleur àn pigment couleur du mycélium sécrété dans l'agaz' BL 567714 Mycéliun aérien abon- Pigment soluble de¯2t et pores blanc ananas
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<tb> à <SEP> perle <SEP> fumée
<tb>
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EL 673033 Mycélium aérien modéré pilent soluble gris clair snanas EL 673035 Colonies incolores pilent soluble Svi1S lTCe.j.L3i.1 aérien ananas BL 673040 Colonies incolores p # in.>;jt soluble sans iycéliui'1 aérien ,I1211è',S EL 6710/p6 Colonies incolores avec PL;';"rl""t soluble :Jjr c 41ii.i A aérien blanc En?m.s
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<tb> très <SEP> rare
<tb>
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BL ô7î?079 Colonies incolores#avec Pillent soluble mycliuf1- aé1'-iêÍl- tr s .sn :':1.?-3
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<tb> rare, <SEP> gris <SEP> ciment
<tb>
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EL 673110 Colonies incolores .t'i:1f:'lt soluble :
1 T.^.41.W .t..L aérien "n- nas très rire, gris cLn11 t
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Le développement de Streptomyces BL 456667 sur glucose- asparagine-agar donne des hyphes gris et un envers chamois.
Le Streptomyces BL 456667A est isolé du Streptomyces
BL 4.56667 qui a été isolé lui-même d'un échantillon de sol.
On prépare ainsi des plaques de glucose-asparagine-agar contenant
0,01% de chlorure de 2,3,5-triphényl-tétrazolium (TTZ), suivant le procédé décrit par Huddleson & Baltzer (Science 112 : 651 (195@) On étale à la surface de l'agar une culture de Streptomyces BL456667 à l'aide de baguettes de verre stériles de façon à obtenir des colonies bien isolées. Les plaques sont incubées à 30-32 C et ob- servées journellement. Après incubation pendant cinq'jours, on observe deux colonies distinctes. Les colonies nommées Streptomyces BL 456667A présentent des hyphes aériens blancs, envers lavande.
Les descriptions de couleurs proviennent du Dictionnaire des Couleurs de Maerz & Paul, Ière édition.
Pour la préparation d'Omégamycine, la Demanderesse ne désire pas se limiter à cet organisme particulier ou à des or- ganismes répondant entièrement à la description donnée ci-dessus, à titre simplement illustratif. Elle désire particulièrement se réserver l'emploi d'organismes qui sont des produits de mutation obtenus à partir de l'organisme décrit par des agents de mutation tels 'que les rayons X, les rayons ultra-violets, les gaz azotés etc.
L'Omégamycine est un agent thérapeutique utile, par exem- ple en médecine humaine ou vétérinaire. L'Omégamycine possède l'a- vantage particulier d'un large spectre d'activité, de niveaux san- guins élevés et d'une basse toxicité. L'Omégamycine possède une résistance extrêmement utile à la dégradation par la chaleur ou par l'eau en milieu acide ou alcalin. Certains métaux et sels d'addi- tion d'acides de tétracycline sont encore plus utiles que la base par leur hygroscopicité moindre et leur plus grande solubilité dans l'eau.
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L'antibiotique, Ompga.nyc3.ne, est actif in vitro contre
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un certain nombre de bactéries à Gram-positif et Gram-négatif .
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Le tableau suivant montre l'activité antibiotique de 1-'Omégamycine (lot 25), de l'Auréomycine i3Cl, de la lerranycine HCl et de la
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tétracycline placées dans une tranchée pratiquée dans une plaque d'agar-infusion de coeur (pH 7,0) :
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SPECTRE DE PLAQUE DE L'OMEGAi.V1YCINE 5m g cm.3
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Zone d5înhibiti-on en. rnm.
Omégamycine Tétracycline Auréomycine Terramycine lot 253 (:Brparée en (.3 mg! ém3) (1 mg! e:n3 ) (5mg/c3i) dechlorantia ciil.o r tétracy-
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<tb> cline
<tb>
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(5 mg! cm3 ) Organisée séa e mg/cm3 ) ;
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<tb> Organisée <SEP> de
<tb>
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Bodenheimcr 6 8 '' 11 9 Prot2us XI3 7 8 8 10 Sh.
SOIDlei 5 8 10 Il S. zte:ci tidi s 9 11 ' il 13 S. par;tyii'i A 10 12 13 15 S . j3iAll-tJ ±Èl?l 8 11 11 13 !1.. eo ra en e s 5' 6 9 11 Ps.fh1.Ol'BSCel1.S 1 7 9 13 A1 c. fcc:¯l? s 6 11 e <5 - PT'.3rul;a-ris 0 6 il 0 lT . 9llJl Qtae 8 Il l3 lez Neisscria sp. 8 7 il C.xerosis 11 14 Il > 27 B >uy=co 5..i e 10 10 16 >27 B. ce s 10 11 13 1l S.m rcescens 0 2 2 0 1,1. tetr'Jgénu s Il 15 27 >27 s , ii em ei,1 14 11 10 14 S.QvsetGrie 9 Il 10 15 C. 21';Di c::,n s 6 .0' 0 0
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<tb> S <SEP> t <SEP> io <SEP> h. <SEP> au <SEP> r <SEP> eus <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 13 <SEP> 18
<tb>
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E.tJPhS2 7 9 10 13 F. coli 4 7 sil 11 S. p :r typh3.
B 9 ¯ ¯ 11 16 14 .l\.. p11J;U:1l::mi?- e 5 (D 16 14 P s. 2eru ino se. cl 4 9 S. llin.-n rui-1 -8 II 12 13 B.ntllrcis' 7 10 19 ,>, 27 S. 5chott'J.ul1eri 10 12 12 15 B.subtilis 10 9 il 13 B.mycoides 0 13 8 15 20
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L'essai du spectre est effectué de la manière suivante.On place environ 30 cm3 d'un bouillon d'infusion de coeur stérile (Difco) avec 2% d'agar ajouté à titre d'agent de solidification, dans
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ru v,-. s ade Pétri stérile (90 ksi de d-iamètre), et on laisse durcir. On praticue ensuite une tranchée de 8 ins sur 40 dans l'agar à l'aide d'une spatule stérile. On ferme le fond de la tranchée avec une goutte ou deux d'agar fondu.
On fait ensuite une traînée à l'aide d'une petite boucle en partant du bord de la tranchée et en allant vers la, paroi du vase de Pétri, avec une culture en bouillon nutritif de 24 heures de chacune
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des '!Je.c"t6ri'ds d'essai;, préalablement incubée à 37 C. On re:r!l1:;rlj.t :xiii;1.<ce la tranchée d'une solution à 5 iùg/c-,z3 de l;'1a:ntibj.ot:.q1..:.e.
On .=;].#.,ce le vase à 37 C pendarLl 18 à 2.4 heures. On relevé les mesures linéaires de la zone d'inhibition depuis le ba::4 de la ti.z<:i<#li,4e jusqu'au point où 1"org8nisme d'essai v.. se " - y c I'ïr .'..5 le =3où;bî'e b" ,'\,... e'l - la, ".-'1 G.t \rt-:;.i{)r)Y)81, êpres -Le nombre choisi d'heures et :.Îúr,c.cn période in\5 otlée.
>On trouvera ci-dessous un 1."'é21.1;:é des essais 8.'act.ivité autibacterienne fin vitro du chlorhydrate û'.'tiïl'xE?ga2:'iß'L'ïnG' cristallisa et de trois autres antibiotiques. L'essai s'effectue suivant un procédé de dilution en tube et les concentrations minimum de l'antibiotique empêchant complètement le développement des bactéries sont déterminées. On utilise le bouillon d'infusion de coeur comme milieu pour tous les organismes d'essai, sauf indications contraires.
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CONCENTRATION D'INHIBITION ENmc cm3
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Organisme Omëgamycine Chlor- (kyté- Chlors1I1-
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<tb> HCl <SEP> tétra- <SEP> tracy- <SEP> phénicol
<tb> cycline <SEP> cline
<tb>
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¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯HC1 HC1
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<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes
<tb>
<tb>
<tb> var.aureus <SEP> 0,15 <SEP> 0,25 <SEP> 0,25 <SEP> 5,0
<tb>
<tb>
<tb> Gaffkya <SEP> tetragena <SEP> 0,03 <SEP> 0,06 <SEP> 0,13 <SEP> 5,0
<tb>
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Streptococcus pyogenes G203 2,5 0,06 0,06 0,63 Streptococcus agalactiae 7077 0,3 0,13 0,13 1,25
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<tb> Streptococcus <SEP> dysgalactiae <SEP> 9926 <SEP> 1,25 <SEP> 0,25 <SEP> 0,13 <SEP> 1,25
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> uberis <SEP> - <SEP> 0,13 <SEP> 0,13 <SEP> 2,5
<tb>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 0,15 <SEP> 0,06 <SEP> 0,06 <SEP> 1,25
<tb>
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Lactobacillus acidophilus 356''0, 6 0,50 1,0 2,
5 Lactobacillus casei #4646*-Y 1,25 0,50 1,0 5,0 Lactobacillus 1eichmannii* 2,5 0,50 1,0 2,5
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<tb> Bacillus <SEP> anthracis <SEP> 0,0375 <SEP> 0,02 <SEP> 0,03 <SEP> 2,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var. <SEP> mycoides <SEP> 0,0375 <SEP> 0,02 <SEP> 0,03 <SEP> 2,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 5,0 <SEP> 1,0 <SEP> 1,0 <SEP> 2,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0,63
<tb>
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C10stridium welchii 601* -.1f 7(- 0, 06 0,06 0,13 >6,25 Clostridiun welchii M *²*.
0,25 0,13 0,25 >6,25 C1ostric1iuL1 sporogenes 8J " 0,125 0, 25 0,.25 6, 25 Clostridium sporogenes 40*** 0, 06 0,06 0,13 6, 25
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<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 2,5 <SEP> 0,39 <SEP> 0,78 <SEP> 1,56
<tb>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 2,5 <SEP> 1,56 <SEP> 1,56 <SEP> 12,5
<tb>
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Shigella sonnei 1,25 0,39 0, ig 1, 56 Klebsiella pneumoniae 2,5 0, 78 0,78 I, 56
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<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> . <SEP> 10,0 <SEP> 12,5 <SEP> 25,0 <SEP> 6,25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 10,0 <SEP> 6,25 <SEP> 1,56 <SEP> 50,0
<tb>
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Neisseria sp. 2,5 . p,19 1,56 .
50,0 Candida albicans 520 >100 100 J>JOO >50
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<tb> *Essai <SEP> dans <SEP> du <SEP> bouillon <SEP> de <SEP> sérum <SEP> à <SEP> 10%
<tb>
<tb> +*Essai <SEP> dans <SEP> du <SEP> bouillon <SEP> de <SEP> jus <SEP> de <SEP> tomates
<tb>
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'* **"Essai dans du bouillon au thioglycollate
On trouvera ci-dessous le procédé d'essai sur plaque de diffusion pour déterminer l'activité de l'Omégamycine.
Milieu de culture
L'agar pour essai de la Streptomycine (avec extrait de levure) est fourni par les Baltimore Biological Laboratories, Baltimore, Maryland, et utilisé suivant les indications de
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1'étiquette. Une préparation appropriée peut être obtenue en met- tant en suspension dans un litre d'eau distillée à un pH final de 6,2 ou 8,0 un mélange dé 1,5 g. d'extrait de boeuf, 3 grammes d'extrait de levure, 6,0 grammes de peptone (par exemple Gelysate) et 15 grammes d'agar. On laisse reposer la suspension pendant
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5 minutes, on la m41ange,jusqu'à ce au'on obtienne une suspension uniforme et on chauffe modérément en agitant. On fait bouillir
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la suspension pendant une ou deux minutes, ou jusqu'à ce que la solution se soit formée.
On répartit ensuite le milieu de culture et on stérilise à 121 C (1 kg/cm2 de pression de vapeur au manomètre pendant 15 minutes).
Incculum
L'organisme d'essai est le Bacillus subtilis American Type Culture Collection 6633. On ajoute une suspension de spores contenant 50. 000.000 de spores viables par cm3 à l'agar d'essai fondu décrit ci-dessus (refroidi à 53 C) pour obtenir un inoculum final à 2%.
Préparation des plaques
On place 21 cm3 de l'agar stérile pour essai prépare comme décrit ci-dessus dans une série de plaques de Petri stériles rases et on laisse solidifier. On répartit ensuite régulièrement 4 cm3 d'agar inoculé sur la surface de la couche de base dans chaaue plaque. On place des plaques d'acierinoxydable percées d'une série de trous sur le milieu lorsqu'il s'est refroidi à la température ordinaire et on place dans les trous les échan- tillons de la matière antibioticue à essayer.
Tampon '
On tamponne au pH 6,2 ou 8,0 suivant le cas pour effectuer les dilutions. Au pH 6,2 on utilise un tampon au citra.te pour préparer les dilutions. On l'obtient en mélangeant 192,12 g. d'acide citrique anhydre avec 106,3 g. d'hydroxyde de sodium dans un litre d'eau distillée et on dilue le mélange à 1/10e de la concentration avec de l'eau distillée. Le pH d.u tampon doit être vérifié par voie potentiométrique, et, si nécessaires réglé au pH 6,2 par addition d'acide citrique ou d'hydroxyde de sodium. Les variations du pH ou de la concentra- tion du tampon modifient fortement les dimensions des zones d'inhibition.
On n'a. pas trouvé nécessaire de stériliser le tam- ,on. La solution-mère est conservée dans du chloroforme ou du
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toluène et de nouvelles solutions de travail sont préparées Quotidiennement* Au pH 8,0 on utilise un tampon au phosphate pour préparer les dilutions. On l'obtient en mélangeant 95 cm3
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de KzHP04 molaire avec 5 cm3 de KH 2 P04 molaire et en diluant le mélange au 1/10e par de l'eau distillée. Le pH du tampon doit être vérifie par voie potentiométrique et si nécessaire, règle au pH 8,0 par l'addition de l'une ou l'autre solution de phosphate.
Les variations du pH ou de la concentra.tion du
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tampon modifient sensiblement les dimensions des zones c.'irhibi- tion. On n'a pas trouvé nécessaire de stériliser le tampon.
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La solution-mère est conservée dans du chloro forme ou du toluène et de nouvelles solutions de travail sont préparées quotidienne- ment.
Essai
Les échantillons inconnus.sont dilués si nécessaire dans le tampon. On utilise trois trous de chaque plaque pour recevoir une même dilution de l'échantillon. Apres, incubation à 32 C les diamètres des zones sont mesurés et on en établit la moyenne.
Le Streptomyce s BL 567201 est différencié d'une
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souche de S. aureoaciens (NRBL 2209Y -obtenue dU\ Northern Régional Eeseereh Laboratory, Peorie., Illinois, '.ou il avait été déposé conne une souche' authentique produisant l'auréomycine, par observation des caractéristioues de développement sur un milieu élj<"c4rol- asparagine-extrait de boeuf-agar et agar Cz.8-pek-Dox contenant le de dextrine.
Les mélanges d'agar -utilisés et les résultats obtenus sont les suivants : Glycéroî-asnaraine-cxtrait de boeuf-agar
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<tb> Glycérol <SEP> 1%
<tb>
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AsDaregine 0,05 Extre.it de boeuf 0, 2j KzHP04' 0, 0 5
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<tb> Aar <SEP> 1,5%
<tb>
<tb> Eau <SEP> stérile <SEP> q.s.
<SEP> 100%
<tb>
pH 7,2
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<tb> BL <SEP> 567201 <SEP> Streptomyces
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> aureofaciens
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Développement <SEP> Bon <SEP> Bon
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporulation <SEP> Bon <SEP> Bon
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Vert-jaunâtre <SEP> Pas
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Formation <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> spirales <SEP> Abondante,peu <SEP> enroulées <SEP> Pas
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Gris-souris <SEP> Gris-rosé
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Envers <SEP> Brun <SEP> Olive
<tb>
Dextrine Czapek-Dox
EMI11.2
NaN 3 0, 2 K2HP04 0,1%
EMI11.3
<tb> MgSO <SEP> 0,05%
<tb>
EMI11.4
KC1 , o,05#
EMI11.5
<tb> FeSO, <SEP> trace
<tb> Agar <SEP> 1,
5%
<tb> Eau <SEP> stérile <SEP> q.s' <SEP> 100%
<tb>
pH 7,2
EMI11.6
<tb> BL <SEP> 567201 <SEP> Streptomyces
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> @ <SEP> aureofaciens
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Développement <SEP> Assez <SEP> bon <SEP> à <SEP> bon <SEP> Assez <SEP> bon
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporulation <SEP> Bonne <SEP> Faible
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Pas <SEP> pas
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Formation <SEP> de <SEP> Abondante,peu <SEP> enroulées <SEP> Rares, <SEP> très <SEP> peu <SEP> en-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Spirales <SEP> roulées
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Gris-souris <SEP> Chamois <SEP> à <SEP> gris
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Envers <SEP> Brun <SEP> clair, <SEP> Chamois <SEP> à <SEP> brun
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ,
il
<tb>
Le Streptomyces BL 567201 est encore caractérisé par la production d'un pigment vert-bleuâtre intense lorsqu'il est cultivé en culture submergée dans un milieu contenant 1% de sucrose, 1% de farine de soya, 1% de peptone de soya, 1,5% de
EMI11.7
KH2P04' et 0,5, f de (NH4J2HP04. Le Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209) ne produit pas ce pigment.
Le Streptomyces BL 567201 est encore distingué du Streptomyces aureofaciens par les observations suivantes., reprises dans le tableau.
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
S. <SEP> aureofaciens <SEP> Streptomyces
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Milieu <SEP> NRRL <SEP> 2209 <SEP> BL <SEP> 567201
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> nutritif <SEP> Bon <SEP> développement.La <SEP> pro- <SEP> Bon <SEP> développement.
<tb>
<tb>
<tb> duction <SEP> des <SEP> hyphes <SEP> aériens <SEP> Pas <SEP> de <SEP> mycélium
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> des <SEP> spores <SEP> est <SEP> quelque <SEP> aérien,colonie
<tb>
<tb>
<tb> peu <SEP> limitée <SEP> et <SEP> est <SEP> blanc <SEP> brun <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair.
<tb>
<tb> à <SEP> gris. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Pigment <SEP> soluble
<tb>
<tb>
<tb> paille <SEP> cannelle.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Asparagine- <SEP> Bon <SEP> développement.Mycé- <SEP> Bon <SEP> développement.
<tb>
<tb>
<tb> extrait <SEP> de <SEP> lium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> spores <SEP> a.- <SEP> . <SEP> Mycélium <SEP> aérien
<tb>
<tb>
<tb> viande-dextrose <SEP> bondants. <SEP> gris <SEP> citent <SEP> à <SEP> abondant <SEP> et <SEP> spores
<tb>
<tb>
<tb> agar <SEP> gris <SEP> givr.Pigment <SEP> solu- <SEP> couleur <SEP> mouette.
<tb>
<tb>
<tb> ble <SEP> chamois. <SEP> Pigment <SEP> soluble
<tb>
<tb> couleur <SEP> chamois.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Tranche <SEP> de <SEP> Développement <SEP> en <SEP> relief. <SEP> Développement <SEP> en
<tb>
<tb>
<tb> pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Surface <SEP> à <SEP> nodules. <SEP> Cou- <SEP> relief, <SEP> surface
<tb>
<tb>
<tb> leur <SEP> chamois. <SEP> à <SEP> nodules,couleur
<tb>
<tb>
<tb> beige-écru.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Lait <SEP> de <SEP> tourne- <SEP> Ni <SEP> changement <SEP> significatif <SEP> Alcalin <SEP> et <SEP> pepto-
<tb>
<tb>
<tb> sol <SEP> du <SEP> pH, <SEP> ni <SEP> peptonisation <SEP> nisation. <SEP> Très
<tb>
<tb>
<tb> apnarente <SEP> en <SEP> 15 <SEP> jours <SEP> bon <SEP> développement.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
@
<tb>
Une culture de 1 organisme vivant BL 567201 qui a ét isolé du sol et dénommé streptomyces viridifaciens été déposée isole sol dénomme . ces viridifaciens a été déposée à l'American Type Culture Collection, Washington D.C. et cata.- loguée dans sa collection permanente de microorganismes sous le n ATCC 11989.
La présente invention couvre un procédé de culture d'espèces de micro-organismes à 24-30 C dans'des conditions submergées d'agitation et d'aération sur des milieux constitués par de l'eau stérile contenant une source de carbone, une source d'azote une source de substances de développement, des sels minéraux comme le chlorure de sodium, le phosphate de potassium, le sulfate de magnésium, le nitrate de sodium et si on le dsire, un agent tampon comme le carbonate de calciun.
Comme source de carbone dans le milieu nutrifif les hydrates de carbone sont satisfaisants. Les hydrates de carbone suivants peuvent être utilisés :
<Desc/Clms Page number 13>
Amidon ordinaire Xylose Amidon soluble Arabinose
EMI13.1
Sucrose 1- P-,-in o s e
Glucose Fructose
Maltose Lactose
Dextrose Inuline
Glycérol Dextrines
Galactose Xannitol Ces sources de carbone sont introduites dans le milieu
EMI13.2
sous fome rur-iTi4e ov, sous forme de produits concentras. La Quantité de ces sources de carbone 'Jour une production d'auti- biotique oDtimwi vz-rX cons1 6'r-zoblement d'environ 1:4 , à 5 e en poids du poids total du milieu de fermentation.
Les sources appropriées d'azote, pour le procède de
EMI13.3
fermentation, comprenant certaines sources de substances de d4veloppeent et des composas o-rga,n5-cu=s et i?210rw¯'C'.7.(lv. S conte- niant de l'azote et des salières vr-ot4iroiJes en particulier con;- prennent des substances très diverses toiles nue :
Les a11j..,.'.oé'.(;ià.es Le gluten de J1laïs#:yBroJ.,"}"l La cas4izne,#=y-d,1,olYs6e ou non à !.'acide La farine de poisson Le glutanede froment La farine de soya hydrolyse à l'acide Les extraits de viande La peptone Le tourteau de foie Les abats L'urée La levure de bière Les nitrates La. farine de coton
EMI13.4
Les conposes d'am.r,loniuTtl La. lectalbumine Les bouillies de grains de La. tryptone distillerie La farine d'huile délaie?
EMI13.5
La liqueur de macération du mais La farine à 'h1.1iléàcp:'::)J
La licueur de macération du.
La farine de lin froment La farine d'arachide
Le petit lait ou les concentres La. farine de tournesol de petit lait
EMI13.6
Ces ingrédients protéiaues ne doivent -cas être aT>oliuv4s 8. un dep:re de puretp lev; les matières moins Dures oui contiennent des traces de substances de développement et des Quantités considérables a'agents nutritifs minéraux conviennent.
EMI13.7
Il n'est ;vide!1'.:î!ent -cas possible, à cause de la nature brute de nombre de ces .substances azot4es, de spécifier des nroportions d'finies nour la ::atière ajouter. Une guxntit4 variant de 0,1 à 50 en noids sur la base des mati Pres solides corresnonr) a la j7iri7-e utile des substances azotées à. ajouter aux nilieuy dans la nlupart des cas. Des rende'"'1ep.ts r,prtiClù.i0rn:lp.nt r10V'!'S ont obtenus pnr .er1nloi (10 ''1ilieu)" contenant des nr.o'f:E'l):!'-w;
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
de soya ou des peptones de soya, c' est=u-d're des Droduits de dégradation de la fève= du soya, notamment la farine de soya hydrolysée.
Par=ni les sels minéraux utilisas dans le milieu, on compte certains sels de métaux lourds utiles à raison de traces et souvent trouvas dans cette mesure dans les ingrédients naturels bruts du milieu, par exemple dans la lioueur de macéra- tion du mais. Lorsqu'ils ne se trouvent pas naturellement dans d'autres éléments du milieu, ces sels sont ajoutés et augmentent
EMI14.2
le rendement de l'Oméga.mycine.
C'est ainsi qu'on doit introduire assez de manganèse, de cuivre et particulièrement de zinc., pour que les quantités.présentes, tant à titre d'impuret4s dans d'autres,matières que par addition soient au moins approxi-
EMI14.3
mativement 0,00,033o' de manganèse sous forme? de MnC12 4, H20, 0.00033 de cuivre sous forme de Culs0,. 5 1-120, et ZnSO4 7 H20'.
Le pH du milieu de fermentation doit'être environ 5,0 à 6,5 et de préférence 5,8 à 6,2 au début de la fermentation.
La température préférée du procédé de fermentation est environ 24 à 30 C. Le rendement maximum du produit est généralement obtenu en 1 à 5 jours, suivant le procédé de culture du Streptomyces.
EMI14.4
L'Omégar?;cine est active in vivo ainsi aue in vitro et exerce une activité chimiothérapeutique marquée .sur les infections expérimentales chez les souris. Les résultats des essais, et des déterminations de toité sont indioués dans le tableau qui suit.
EMI14.5
CiMgamycine Essai de p1aoue Toxicité algue CD50g/kg Lot n Réaction en mm. LDõmg/jcg/-sov.ris souris, lntra,reineuse -tntr8nri tonf::Üe 1 25 à 1 mg/cm3 98 - 171 5 25 23 à 1/16 mg! cm --- 4,6
EMI14.6
La CD50 (Dose curative - 50) est la dose minircum d'Om0Faycin oui ru4rit 50 des sujets d'un groupe de souris ajTar¯t reçu des injections intrap±riton4ales de 100 à 1000 LD50 doses de Dinlococcus One z.oniae, chaque dose LD50 ±tant suffisante, ad:n"Í.-
<Desc/Clms Page number 15>
nistrée seule, pour tuer 50% d'un groupe de souris. L'infection
EMI15.1
est conuvuniüupe en une fois après la deuxième dose du médicament soumis à l'essai. Le médicament soumis à l'essai est administra en deux doses égales, à environ 18 heures d'intervalle.
Les animaux sont soumis à des observations pendant quatre jours et les morts de chanue groupe sont exprimés en % du total des animaux par groupe. La proportion de morts est transformée en valeurs de probit et celles-ci sont portées sur un graphique et comparées au logarithme de la dose en mg par kg de poids de souris. Le point d'intersection de la ligne de probit 5 et de la meilleure ligne passant par les points expérimentaux correspond à la concentration d.u médicament qui protège la moitié des animaux dans les conditions de l'expérience. L'antilo-
EMI15.2
garitbme de ce terme est la valeur CD50.
EXEMPLE 1 Pour préparer 1 '?méga:myclne à l'échelle du laboratoire, la fermentation est effectuée dans des bouteilles agitées ouvertes à l'air, mais protégées de la contamination par des couvercles
EMI15.3
d'ouate ou de gaze. Le Streptoinyces BL 567?01 est cultivé dans un milieu nutritif approprié, par le procède de culture sul3,iierg('%e, l'agitation et l'aération de la culture 6tant effectuées en plaçant les bouteilles dans un agitateur du type à va-et-vient qui assure la pulvérisation, la projection ou l'agitation de la bouillie dans une atmosphère contenant de l'oxygène. Dans un cas typique, on introduit dans des bouteilles de 4 litres 500 cm3 de milieu de culture constitua de
1% de sucrose
1% farine de soya
1% peptone de soya
EMI15.4
1., 5?, KHI'0.
0,5'l' (NËHPO 0,5< (NHI. 8HPO,,:;.
:?au -'!-l 0' - -Tb on stérilise. Après passage à l'autoclave on inocule le ,i}j.811 avec 1.1 envlron, en vol'Ju=, d'une suspension I1f1UCmSi 1,r;<il>1,e àe fxytJT'?5 de Streptomyces provcnnnt d'une couche C.i'iFu.îi' rirt e"t ±),0 \ 6,? an d±1>ut de la fermentation. Le contenu de
<Desc/Clms Page number 16>
la bouteille est alors' incubé à 26-28 C pendant 48 heures tout en agitant à 130 coups/minute avec une amplitude de 11/4 pouce (29 mm). A la fin de la période d'incubation le liquide de fermentation est vert bleuâtre,et, soumis à l'essai par le pro- cède décrit ci-dessus donne des zones d'inhibition d'environ 27 mm lorsque le bouillon est dilué 30 fois. Ce bouillon contient
EMI16.1
de l'0mégaizycine qui peut être isolée cosme décrit plus loin.
EXEMPLE II
Pour une préparation d'Omégamycine à plus grande échelle, on prépare un inoculum dans un milieu de fermentation contenant, en poids,
1% liqueur de macération de maïs
1% sucrose
EMI16.2
,55l] (NH4) 2HPO 4 1,5dlof KH2PO 4 . o, 2. MgS04" 7 H20 Eau q.s. 100%
EMI16.3
PHé 6?¯-bs- on l'étend à un Volume de 2.500 cm3 et on l'introduit dans une bouteille de 2 1/2 gallons (10 1). Le milieu est stérilisé par de la vapeur à 118 à 120C pendant une heure. Après refroidisse- Dent., on inocule avec environ 0,5%, en volume, d'une suspension aqueuse trouble de spores de Streptomyces provenant d'une souche d'agar.
Le contenu de la bouteille est alors incubé à 26 à 28 C pendant 48 heures dans un agitateur du type à va-et-vient et on souffle de l'air stérile à la surface du liquide. De la bou-
EMI16.4
teille de l'inoculun le bouillon contenant le StreptoillyceS s est déversé dans la cuve de fermentation dans des conditions parfaitement aseptiques (voir Exemple III). Au moment voulu, le liquide peut être traité comme décrit plus loin, et l'Oméga- mycine peut être isolée.
EMI16.5
'xEi:PL l III On peut préparer à grande échelle 1'antibioti ue produit par Strento'lyces BL 567201., 1 'Omégamycine, par culture
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EMI17.1
Profonde ou S'U:7:î1''v-rbe Des cures de fermentation fixes et de noyons approprias d'agitation et d'aération sont utiles à cette .fin. Un milieu nutritif formé de 56,8 litres de liqueur de
EMI17.2
macération de mais, 56,8 k de sucrose, 28,4 k de (NTL,4)2.11po4y 5, 2 kg de KH 2 PO 4.p 11, 3 ka de KgS04. 7 H20 et de l'eau pour faire 1500 gallons (560 1) convient. Le milieu 3ut âtre or-'.na.r' dans un récipient de fermentation doubla de verre d'une capacité de 2.000 gallons (750 1) équipa d'une chemise à circulation
EMI17.3
d'eau pour le réglage de la température, d'un.
D'2:itat'?ur a1)P1:'oori en acier inoxydable et d'un dispositif arroseur pour l'aération.
EMI17.4
Le milieu est st<$rilis6 par chauffage avec de la vapeur sous pression puis refroidi. Après stérilisation la concentration .en ions hydrogène du milieu doit correspondre a,pp1 oxiina.iv<e<noent au pH 6,?. Le milieu nutritif est alors inocule avec 15% en volume d'une culture végétative cul ti ve s::rl.tdaas un i'!.T)1)8.y'cil de fenrmntation semblable, préalablement inocula d'un inoculini décrit plus haut, ou d'un inoculun prlpar4 au laboratoire. La culture drns le récipient de fermentation de 2000' gallons est incubée à une température à 83 F (28 C) pendant deux ou trois jours.
Pendant l'incubation on fait tourner l'hélice à la vi- -%L'esse de 90 tours/minute, et on introduit de l'air stérile
EMI17.5
c3ans le milieu par l'arroseur à raison de 100 .pieds cube (2,,a m3) minute. A la fin de la période d'incubation, le liquide de culture contient normalement assez d'activité antibiotique pour donner dans l'essai contre les organismes une zone d'inhibition d'en-
EMI17.6
viron 23 mm de diamètre avec un bouillon dilué 16 fois. L'OYn0,!';:3- mycine est isolée comme décrit plus loin.
EMI17.7
EX :PL 8 IV On prépare un liquide de fermentation contenant de l'om4gai<iycine suivant le procède de l'Exemple I, avec le milieu de culture ci-dessous.
<Desc/Clms Page number 18>
1% Gluten de froment
EMI18.1
1< Gl-rrcÂrol 0, 5 Na.Cl 0,05% Produits solubles de distillation
EMI18.2
0,lfl C2C03
Eau q.s. 100% EXEMPLE V
On prépare un'liquide de fermentation contenant de
EMI18.3
1-'O,iégac,à-ycine-su.-:.vont le procède de l'Exemple I, avec le milieu . de culture ci-dessous.
1% Farine de coton
1% Glucose
EMI18.4
0,05 a.tières solubles de distillation 0,1% CaC03 Eau a. s. 100%
EMI18.5
EJCt'1PL VI On prépare un liquide de fermentationacontenant de l'0m4ganycine suivant le -procédé de 1-'ExemDle'-i., avec le milieu de culture ci-dessous- 1 Lioùeur de mavàration de mais 1% Cérélose
EMI18.6
O', 5?4 NaCl 0,1% CaC03 -
EMI18.7
Eau C!. s. 100% EX1i;,lPL S VII On prépare un liquide de fermentation contenant de 1-IO.ciéga-riiyeine suivant le procède de l'Exemple I, avec 1'e milieu de culture ci-dessous.
1% Farine de soya
1% Cérélose
0,5% NaCl
0,05% Extrait de levure 0 1 le,' CaCO3
Eau q.s. 100% EXEMPLE VIII
On -prépare un liquide de fermentation contenant de
EMI18.8
1-'Oml?'gai-nycine suivant le procède de l'Exemple I, avec le milieu de culture ci-dessous* 3 Farine de soya
0,5% Amidon de mais
EMI18.9
0,1f N-Z-k-1ine B (Produit de digestion en7.ymati- que de la caséine) 0,3% NaN03
EMI18.10
0, 5,, f CaC0 Eau q. s. 100%
<Desc/Clms Page number 19>
EXEMPLE IX
On prépare un liquide de fermentation contenant de l'Omégamycine suivant le procédé de l'Exemple I, avec le milieu de culture ci-dessous.
1% N-Z-Amine B'
1% Cérélose
0,5% Extrait de levure
0,5% NaCl
0,1% CaCO3
Eau q.s. 100%
La fermentation terminée, et comme le montrent les exemples X à XVI, XVIII à XXII, XXV, XXVII et XXIX, on séparait jusqu'à présent l'Omégamycine du bouillon, en filtrant pour éliminer le mycélium, en agitant le bouillon (de préférence au pH 8,5 environ) avec du butanol ou de la méthyl-isobutyl- cétone, en séparant la couche de solvant contenant l'Omégamycine, en la concentrant à un petit volume par distillation, et en la mélangeant à un hydrocarbure inférieur liquide,/par exemple le Skellysolve C, pour précipiter l'Omégamycine solide sous la forme de la base, si le bouillon était un pH alcalin, par exemple le pH 8,
5 et sous la forme du chlorhydrate, si par exemple, le bouillon avait été acidifie avant l'extraction par l'acide chlor- drique. L'Omégamycine solide ainsi obtenue était encore purifiée en formant une suspension dans de l'hydroxyde d'ammonium et égale- ment par, adsorption à partir d'une solution de la base libre sur un adsorbant chromatographique (par exemple une slicé comme le Florisil), suivie du lavage (par exemple à l'acétone ou au métha- nol) pour éliminer les impuretés, et d'élution par un acine.
Le sel d'acide de l'Omégamycine purifiée dans l'éluat est alors séparé par cristallisation, précipitation, lyophilisation ou par un procédé analogue- Les hydrocarbures inférieurs liquides utilisés comme agents de précipitation sont des éthers de pétrole du commerce, par exemple le Skellysolve A, point d'ébullition 28-38 C; le Skellysolve B, point d'ébullition 60-71 C; le Skellysolve C, point d'ébullition 85-100 C.
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
Suivant les procédés nerf ectionns de la présente invention, et lorsaue la ferment ion est achevée, l'omôgmmycine, également dnoJ11mée tétracycline, est séparée du bouillon de fermentation par précipitation alcaline. -r,,ssentielle-,nent., le bouillon de fermentation est réglé à un pH alcalin dans la gamme 8 à 11, et le mélange précipite du mycélium et de la tétracycline est recueilli par filtration. En variante de ce procédé, le bouillon de fermentation est acidifié à un pH inférieur à 3,
EMI20.2
filtré pour éliminer le mycéli1Fl, et le filtrat est traité comme ci-dessus, c'est-à-dire, réglé à un pH alcalin dans la gamme de 8 à 11 inclus, et le précipité de tétracycline brut est recueilli par filtration.
N'importe quel alcali soluble dans l'eau d'une concentration suffisante peut être utilisée
EMI20.3
la préférence étant toutefois accordée à 1-'aiLmo.-i:iaciue ou l'hydroxyde de sodium. Le pH 'est réglé dans la gamme de 8 à 11; un pH alcalin dans la gamme de 9 à 10 est préféré. Le précipité de tétracycline, avec ou sans mycélium, est dissous pour le manipuler suivant l'un ou l'autre des procédés décrits dans de l'acide aqueux en dessous du pH 3 ou dans un alcali aqueux au-dessus du pH 11. Des exemples de ces acides aqueux sont les acides solubles dans l'eau, fournissant le pH désiré,
EMI20.4
par exemple l'acide chlorhydrique., l'acide sulfurique, l'acide phosphoriaue et l'acide nitrique.
Ces mêmes acides ont pour effet d'abaisser le pH du.bouillon de fermentation en-dessous
EMI20.5
du pH 3, et de préférence au pH 2,0-2,5 environ, oour perniettre la séparation de la tétracycline, qui est en solution sous la forme d'un sel d'addition d'acide, du mycélium solide par filtration avant d'utiliser la précipitation alcaline décrite ci-dessus.
EMI20.6
Divers sels d'addition d'acide de l'Omégamycine peuvent être préparés, très simplement en ajoutant l'acide désirée
EMI20.7
inorganicue, (y compris -les acides minéraux) ou organique, à 15a-nt--Iliotique dans l'eau jusau'à ce au?une solution limpide soit
<Desc/Clms Page number 21>
obtenue. Les sels solides peuvent être préparés en reglant le
EMI21.1
pH d'une telle solution d'un sel d'0m4gavqycine à un point inü0di&taent inférieur à celui qui provoquerait la séparation de l'antibiotique. La solution peut être alors séchée, par exemple en soumettant la, solution congelée au vide. Les sels
EMI21.2
d'acide de 1 'OméaYllycine sont obtenus par RV8poration d'une solution du sel dans l'eau à un pH peu élevé.
Des acides minéraux qui peuvent être utilisés, sont l'acide chlorhydrioue, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique. Les acides organiques qui peuvent être utilises sont l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide gluconique, l'acide benzoïque, l'acide acétique, l'acide ascorbique, l'acide succinique,.l'acide nicotinique, l'acide formique, l'acide maléique etc . Comme l'Omégamycine est amphotère, des sels de différents éléments métalliques avec 1' antibiotique peuvent être préparés, par exemple les sels de sodium, potassium, calcium et magnésium.
EMI21.3
Les sels de métal alcalin de l'Ompgamycine sont formés en traitant une suspension aqueuse de l'antibiotique par deux équivalents d'un hydroxyde alcalin. Les sels solides de métaux
EMI21.4
et d'0méganiycine sont obtenus par évaporation sous vide dame solution aoueuse de l'antibiotique au pH approprié. La prénara- tion de l'Omégamycine à partir de solutions nèutres, par exemple, par lyophilisation, donne la base libre généralement sous la forme d'un trihydrate, si l'eau est présente et' si on
EMI21.5
n'applique pas de chaleur. Le trihydrate de t0.tracycl ;'n.""- est également préparé en dissolvant la base dans un solvant orra-
EMI21.6
nique soluble dans l'eau, par exemple le méthanol, l'éthanol., et en versant la solution obtenue dans l'eau.
La tétracycline
EMI21.7
calcique solide est transformée en trihydrate de t0trpcycline par dissolution dans un acide aqueux, var exemple pH 3 ou moins, en utilisant de l'acide sulfuriaue ou de l'acide c111or'l1.ydril1ue,. puis en a joutant un agent pour bloquer le calcium, pa.r exemple le 'r #snate de sodium (acide "'thylènediamine-ttr:1p,ctil1ue),
<Desc/Clms Page number 22>
et finalement en ajoutant un alcali pour élever le pH à 6 au moins mais pas sensiblement à plus de 8, ce qui provoque la
EMI22.1
précipitation du trihydrate de tétracycline. Ce trit7A,drate est recristallisé d'alcools aqueux, par exemple de méthanol, et converti en la anhydre par application d'une chaleur modérée dans le vide sur un agent de dessiccation.
EMI22.2
Les sels d'addition d'acide de l'0n;égamwcine sont préparés de différentes manières. Par exemple, on ajoute des quantités stoechiométriaues de l'acide à une solution de l'0m4ga- mycine dans de llee-u ou dans un solvant org2nioue, nar exemple le butanol, l'acétone, le méthanol, pour former le sel d'addi- tion d'acide;
si on le désire le sel solide est alors isolé par lyophilisation du mélange obtenu (par exemple dans l'eau), ou en recueillant le sel précipité par filtration (par exemple
EMI22.3
de l'acétate d'ét!lej" ou en précipitant le sel par addition d'un autre solvant organique (par exemple en ajoutant un hydrocarbure, comme le Skellysolve, au butanol ou de la cyclo-
EMI22.4
hexane à l'acétate d"' éthyle)" ou en réduisant le volu-ne du solvant par distillation dans le vide jusc-iulà ce que le sel précipite par refroidissement (par exe-npie du butanol).
De 110111- breux autres procédéssont utilisés pour préparer ces sels, par exemple l'Oniéganycine peut être transformée en clorhydrate d'0ùiégi=ycine par adsorption d'Omégal'ùycine sur un adsorbant chromatographique (par exemple une silice comme le !'larisil suivi dilution d'OmgaTI1ycine par un acide, par exemple, l'acide chlorhydrique en solution aqueuse, méthanolicue ou butanolique.
Dans un autre procédé la base de l'Omég@nycine" dans de l'eau au pH 8-9 environ, est extraite par le butanol; le butanol est séparé et la base d'Omégamycine est trsfoY:T1e en chlorhy- drate d 'Om gai11ycine et on 'la. fait passer en phase'acjue use par extraction par de l'acide chlorhydrioue aaueux; le chlorhy-
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drate d'0m6xa>nycine ainsi préparé peut être séparée si on le désire par exemple par lyophilisation.
Dans un nrocédé nr6ç,<rfi,
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la base ::'1'Oms::a.:'1Y0in8 est convertie en sels d'Omf.fl;;1ycina en dissolvant la base dans de l'acétone anhydre ou du n-propanol anhydre, et en ajoutant l'acide anhydre, c'est-à-dire l'acide chlorhydrioue gazeux, l'acide sulfurique, l'acide sulfurique dans l'acétone anhydre, l'acide phosphoriaue, l'acide tartriaue,
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l'acide citrique, l'acide nitriaue dans 1a ¯rFtizyl--iso'utyl- ctone anhydre, et en recueillant par filtration li sel qui -prci'oite, par exemple le chlorhydrate d'Um0rTIycine ou le sulfate, phosphate, tartrate, citrate etc.
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EXfP L 8 X On extrait facilement l'OmÂgat11ycine des liquides de fermentation alcalins par des solvants organiaues non-polaires.
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Le procr dé ci-des sous a 4=té utilisé .
On extrait un litre d'un bouillon de fermentation de ntreotomvces Il 5672Ql au pH $,5 par 0, 5 litre de rn:thzTl-i sooutyl- cétone. Le solvant organique est sépara lavé à l'eau, réduit par distillation azéotropique à un volume d'environ 20 cm3
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et ajout à 250 cm3 de Skellysolve C. 20 mg d'0ùi±gai'ùjr=ine (lot 26) précipitent et sont recueillis par filtration; ils possèdent une activité à 1 :'flg/cm3, dilution 1:61+ de 19,5 Tin (diamètre de la zone dans l'essai sur plaque de B. subtilis sur agar au pH 6,2); 24,2 1. mm à 1:16 et 27,7 nm à 1:4. Le bouillon initial donne 27, '3 mm à une'dilution de 1:4.
13XS:,1Pt 15 XI Dans un autre procédé, on règle au pH 5,5, 4,5 litres
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d'un bouillon de fermentation de Streptomyces BL 567201 au pH 6,7 et on l'extrait par 3 litres de butanol. L'extrait par le butanol est séparé, lavé à l'eau, réduit à un volume à environ 35 cm3 par distillation azéotropique, et ajout à 350 cm3 de Skellysolve C, (heptanes techniaues) . L'Omgamycine (lot 27) précipite sous la forme solide et est recueillie par filtration
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(1,2 gra-n.mes, ayant une activité à 1 mg/cm3 dilution 1:16 de 23,2 mm; dianétre de la zone dans l'essai de plaque sur B. suhtilis a,vec agar au pH 6,2).
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Le bouillon résiduel au pH 5, 5 après extraction par le Butanol est règle au p5 ,5 et extrait nar 3 litres de butanol.
Le buta-nol est s6pat4, lavé à l'eau, réduit à un volume d'environ 30 cm3 et ajouta à 350 cm3 de Skellysolve C. L'Omégéì1ycine brute (lot 28) précipite sous la ror¯me d'ttn solide jaune-orange ayant une activit4 à 1 m°/c3 dilution 1:16' de 25,2 rmn (diamètre de la zone de l'essai due plaque sur 3. subtilis sur agit au nl 6,?) . Le bouillon initial donne 27.,3 'Jùa à une dilution de 1: I-.
S{1' :rJL t7-rT Dans un troisiëaie procède on règle au 1J3 674, 2, 5 litres d'un bouillon de fermentation de Streptomyces 3L 56720l donnant 25,7 yrc,,n à une dilution de 1 :.l-',. et on 1'entrait nar ? litres de butanol.Le butanol est' sëpar4j, l2.vP à l'eau, réduit à un vo L u:. e -'- nVl '..J!l 50 cri3 par distillation allotropique et ajout 1< un litre de Skellysolve C. r';v?'2::v'C:r2e solide jauns fonce (500 11g) (lot 24) précipite et est recueillie par 'f'1 ¯ tion; elle possède une activité à 1 =a;g/ci==3 dilution 1:16 de ls m'n (diamètre de la zone de l'essai sur plaque avec B subtilis sur -ity-2r au pl-1 7,z et de 23 #:ceo1= à une dilution de l:l..
Le bouillon au pH 6,4, après extraction au bubanol est maintenu en ch nbre froide pendant trois OS.rs9 nUls rg18 au pH 8,5 par de l'hydroxyde de sodium et extrait par ceux litres de butanol. Le buta.nol est sénaré.7 lavé à l'eau, rduJ.:G à un voltne d' environ 30 c3 tzar distillation az40tropiqu= ¯ = ajouta a 600 cIIl3 de Skellysolve C. L'Om3a'vciLie solide brun ,.wne4 (lsr0 ) (lot 25) précipite et est recueillie par 'iltif¯tion; elle possède une activité à 1 ''La/C??3 dilution 1:16 de 2g m (diamètre de la zone dans tressai de plaoue sur B. subtilis S rsT?C de l'8ar Pu pH E,2.
-.;,,T 1 ; mi Dans un autre Eroc:d- on extrait nar . cw3 C-,- n- o 1 760 rTl3 de bouillon de fermentation .'1? 3t.r2ptor'1'.cr:
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131 567"'01. r;l au pH par de 1 'hydro}yde :1<e so,3jirii. Le n- butanol est s'par', ajouta à de l'acide chlorhvdricue aaU811X" Dour obtenir le pH 7,35, et le butanol est ±limin.4 par distilla- tion dans le vide; 1 P produit concentra a.queuy restant est étendu à environ 38 cm 3 avec de l'eau et lyophilisa pour obtenir 339 rlg solide., qui a une activité à 1 zn;/crn3 de ta90n de 25 lncn (diamètre de la zone dans l'essai sur plaoue avec B. sztilis sur aear au pH 6,2 et de 18,7 iiii-il â une dilution de 1:3. Le bouillon initial donne ?6,3 rilln (et 20,0 rtliii à. une dilution de 1:3) et le bouillon épuisé donne 19,0 rem ( et 12,' iffil1 à une dilution de 1: 3) .
EX'.IPL3 XIV Dans un autre nrocéd9 on extrait par 3 litres de n-butanol 5,5 litres d'un bouillon de fermentation de 3 brotpmyces L '67OI r9g1é au p3 5,5. Le solvant est s6pay-4, lava à l'ca.u, réduit à. un voluaie de 35 cm 3 environ par distilln- .l;1<Jn xzòt.ropique, et ajouta à 350 cm3 de S"kelJysolv\'3 C. 1pra- ,ll.'lcln'3 solide jaune d'or (1,2 g) précipite et est recueillie
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1-,Ion (solide A). Elle possède une activité à 1 Tnr/c;rl3 dilation 1:16 d.e 23,2 mrn. {dïanètre de la zono dans l'essai. de plaque sur 3.subtili.s sur agar au pH 6.72) et de 26,9 imn à une dilution de 1: .
Le bouillon résiduel après extraction au but'anol au pH 5, est r<'g14 au p3 8, et extrait nar 3 litres de butanol.
Le hutanol est sf98r,. lav à 1" e8U,. réduit en evolutie à 30 r¯m3 environ par distillation azÉ-otropioue et ajouta à 350 crn3 de 8':r:lly-solvc C (heptanes techniaues). Une nouvelle c1uantitp. ci'0;ar:,rc.i¯e solide jaune orange (05 F) (lot 30) nrôcii,1.te et e.3t recueillie par filtration (solide B). Elle a. une activité à 1 mÇcri3, dilution 1:16, de ?5,? nr'i (diamètre de la zom dans l'essai sur r-lanue 2vec .3','i;llS ?2'pr pu nil 6e2) :'i r13 1-8,,5 5 io,m lJY1'3 dilution d e 1:4. r,'Ülr,f'.'1 Cjtl9 est identifiée v c c0rti.l.;l]rl"!, ri
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lorscu' elle est colltasinée Dar des Droduits chimioues orgaiiiauL2b semblables car son "spactre'' d'activité (c'e#t-à--dire le der de migration des val.èurs fj en utilisant une s-,^'rie de solvants dans le vroc4d4¯ connu sous le nolil de sur bande de papier.
Cette technioue est un iJrocFd4 relativement nouveau, mais déjà bien connu, pour l'identification des coeàxwosôs orga- niques. Co7niïe .les ..Jaxiiia dans 1-ip-fra-rouze, les valeurs Rf dans une srie de systèmes solvants sont une caractéristique uniaue et reproductible d'un produit chzrüauP donn, et constituent en quelque sorte ses empreintes digitales.
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Le procédé utilisa est le suivant. Des bandes de va1Jier filtre, e;em13t de c,,rilres, dense,' et à zrande capacité d'absorption (par exemple le 5S9 Blue Ribbon Specini de Cari¯ Scl-icher Schell Co., K'eene, N,15. ) , de .1 2 nbuee (l3 pin) de largeur et de 58 cril de longueur, sont suspendues à teric).-er,,iture ambiante constante dans une rngion prot6ijj4e (nsr eyemole dans un stand bocal) au bord d'une cuvette La nartie suorieure de chaque bande est en contact avec une certaine quantité d'un système - solvant particulier (également appelé phase de développe- ment) dans la cuvette;
chacune fies bandes est suspendue à une cuvette différente, contenant un solvant différent d'une série de systèmes solvants utilisée dans l'essai. La partie inférieure . de chaque bande pend librement et n'atteint bas la quantité de système solvant (ou de ses ingrédients volatils) placée en dessous de la bande suspendue pour faciliter la saturation de l'air par le solvant choisi.
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Le produit exa7-!inp' (dans un bouillon de fermentation ou cornue solide isol>fi) est pla,c4 à un endroit marqua a la .partie. supérieure de la portion de bande oui nend librement dans l'air.
Dans le cas d'une matière solide.9 on la dissout dans un solvant
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utile auelconue Les ouantit4s utilisées ce!-1-es. oui '-'onnent une 7one de àil?en7i,JnJ 3DrTJMTiQS lors fµ2 1'?SZôoi. rir.l¯, pt cet t"111i'nt2 t muvent 4fre dtpr''iTLeF' opr un ?ç;i;l'1 ç '1'. f¯. rnr r.,,oe:i,;.1 ,
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une quantitéutile est 5 microlitres (0,005 cm3) d'une solution contenant 1 mg/cm3 d'Omégamycine dans un solvant pour l'essai sur B.subtilis. La bande est séchée, puis placée avec son extrémité supérieure en position dans la cuvette qui contient le système solvant choisi. On laisse migrer le solvant vers le bas, c'est-à-dire, développer la bande, jusqu'à ce que le front du solvant atteigne la partie inférieure de la bande.
Il faut pour cela environ 15 heures; l'atmosphère environnante est maintenue à une température constante sans courants d'air, et saturée de vapeurs de solvant provenant d'une mare au fond du bocal.
Chaaue bande est alors retirée, séchée à l'air, et placée sur un plateau d'agar à un pH déterminé (,dans ce cas 6,2) inoculée avec un organisée d'essai, dans ce casB.subtilis.
Après séjour au réfrigérateur jusau'au lendemain, les bandes développées dans les différents systèmes solvants sont retirées et les plateaux sont marquas pour identifier et situer les bandes, incubes jusau'au lendemain et relevés directement ou photographiés pour obtenir un document permanent*
Le contour de l'ensemble de la bande est généralement visible sur la surface de l'agar et souvent sur la photographie.
L'enlacement de chaque agent antiliotiaue sur la bande est indiqué par une région claire, oui contraste avec la région trouble où l'onganisme d'essai s'est dévelopné. La bande représentée sur la photographie est divisée en zonesreprésentant 5,10, 10, 10,10, 10, 10, 10, 10, et 15% de la distance depuis le point de l'application de l'échantillon jusqu'à la partie inférieure respectivement, et ces zones sont décrites comme avant 'des valeurs R@ de 1 à 10 inclus. Une petite tache au centre eyact, aurait donc une va.leur Rf 6, tendis qu'une grande tache qui s'étendrait dens les zones adjacentes aurait une valeur Rf 5, 6, 7 puisqu'on compte la zone toute entière.
Suiyant ce procédé, on a établi le spectre Rf de
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l'O:t;aiCi2le (lot 30) avec:; microlittes d'une solution à 1 mo:/ c:rt3 de l'antibiotique COTilll1e échantillon pour chaque bande, et en utilisant le B.subtilis sur de l'agar au pH 6,2., les bandes étant développées dans les douze\systèmes solvants ci-dessous :
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------------------------------------------- --------------------- -1
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<tb> Système <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> G <SEP> H <SEP> I <SEP> J <SEP> K <SEP> L
<tb> solvant
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Valeur <SEP> 6,7 <SEP> 5,6 <SEP> 4,5 <SEP> 4,5,6 <SEP> 1 <SEP> 8,9,10 <SEP> 6,7 <SEP> 8 <SEP> 5 <SEP> 9,10 <SEP> 6,7,8 <SEP> 3,4,5
<tb>
<tb> Rf
<tb>
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-----------...---------------------...------------...------------ -'----"'''---\ La composition de ces systèmes solvants est la suivante:
A-Eau B - Citrate de sodium en solution aqueuse à 10% C - Citrate de sodium en solution aqueuse à 40% D - Butanol saturé d'eau
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E - Mtthyl-isobutyl-cétone anhydre
F - Mélange de 100 parties de méthanol à 80%, et de la,5 parties de pipéridine, réglé au pH 9,5par de l'acide acétique.
G - Mlane de 80 narties de mthanol,5 parties d'acide acétiaue glacial et 15 parties d'eau en volume.
H - Butanol saturé d'eau et contenant 2% diacide p-toluène sulfonique.
I - Mélange de'100 cm3 de butanol saturé d'eau et de 5 cm3 d'acide acétique glacial.
J - Butanol saturé d'eau et contenant 2% d'acide p-
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toluène Sl.Ù forL'1up'. et 2rtf. de- pipéridine.
K - 100 narties de butanol saturé d'eau et 2 grammes d'acide p--toluène sulf¯oniaue plus 2 cm3 de pipéridine plus 2 graines d'acide lauriiue.
L - Mélanse de deux parties d'alcool isoamylicue et d'une nprtte de chloroforme saturé de citrate de sodium en ;olu- tlon aaUC;US8 à 10'. Dans ce cas, avant d'aTI1Jli(nvr l'chn'ntillon, les 1')APr1'3S Gont saturées de citrate dA podium ";11. solutior anlzzl7;e 1,"''. réglée RU pH 5,7 nar de ¯'ac¯raF; C1lrl.'118 et '-éhé"s.
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E.lPLE ZV On extrait le solide A de l'Exemple XIV car 50 cm3
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d'hydroxyde d'ami'tioniuai en solution aqueuse au pH 6,4 ce qui laisse 220 mg de matière solide brune. On extrait le solide B (0,5 g) de l'Exemple XIV par 30 cm3 d'hydroxyde d'ammonium aqueux au pH 6,4, ce qui laisse 120 mg de matières solides. Les
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solutions basioues aqueuses d'Ornég21yc3.ne sont combinées et on les fait passer par une colonne chrorriatogriphique (0, 5 sur 4 pouces) (1,3 x 10 cm) contenant 7, 5 gr. de Florisil (silice chromatographioue). On sépare de l'effluent brun environ 600 mg de matière solide brune de faible activité.
On élue ensuite la colonne avec 125 cm3d'acétone puis
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125 cis3 d'éthanol et on rejette les eluats aunes. On 'lue ensuite la colonne avec de l'acide chlorhydrique à 1 ' (100 cm3).
L':luat d.'éthanol acide est déplacé par l'eau (c'est-à-dire distillé dans le vide avec addition d'eau jusou'à ce que. tout le solvant organiaue ait été Rliminé) et l'eau est neutralisme par
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l'hydroxyde d'ammonium puis lyophilisée pour obtenir l'0inEvJ;=ijrcine solide (lot 32) pesant 0,5 g et ayant une activité à 1 mg/cm3, dilution 1:16, de 24 mm (diamètre de la zone dans l'essai sur
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planue avec B.svutilïs sur 'agar au pH 6 , 2) .
F,:L\:E1,;PLE zei Comme dans l'Exemple XV ci-dessus, on extrait le bouillon
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adsorbe par le Florisil pardu butanol au pH 8, 5, et on sèche le produit pr distillation azéotropicue. nn le versant dans le Skellysolve C, l'Ùr>;6g>môrcine solide (500 ;-ntr; lot 36) D1-,±<;j-jt== et est s'<pàr6e: elle a une activité à 1 mg/ C3 dilution 1.:16, de plus de 30 mm (dif'..:':ètre de la zone dans l'essai sur -0181113.9 avec B.pubtilis sur apar au pli 6,2 .
Eµ1"fl"PLE XVII On transforme de l'OIflgHY1wci!î( d'un':: pureté ""1lCI)'r')(nJP or,. sel de SI)(H1J!'1 en traitant cette matière dans l'e[11) Nl1' (1' l'hyr1roY;Tr]8 d( 80:111.1'1 jusnu'1. ce Que ln pH noit f'11r/'f""'n A ') 5. 0 ;on'":1-G> n!î;.11it.( 12 s01ntion 8t on 1" f.' tel .'r.,, r,11;
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vide pour obtenir le sel de sodium sec sous la forme d'une poudre stable soluble dans l'eau.
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EXE-fPLE V I I I On règle au pK 9,0$ par de l'hydroxyde de sodiUl:1, un bouillon de fermentation de Strepton.yces BL L56667 A -500 cm3 donnant 16,9 mm à l'essai sur S. aureus non dilué (X) et 13,8
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mm dilué trois fois (3Xypréparé suivant les procédés.décrits plus haut, et on l'extrait par. 250 cm3 de n-butanol.
Le butanol est séparé et règle au pH 6,90 en y ajoutant de l'eau et de l'acide chlorhydricue. Le butanol est élimina de ce mélange par distillation dans le vide ce qui laisse un concentré aqueux
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d.10-,ir'leaniyeir-9., actuellement appelée tétracycline qu'on étend à 25 cm3 par addition de eau, ;et qui donne une zone de 19,5 mm dans l'essai sur S.aureus dilution trois fois, puis on le
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lyophilise pour obtenir 115 mg d'OmRga8ycine solide (lot 6667A-3) donnant un diamètre de 19. mm sur S.aureus à 1 mg/cm3*
On règle encore 500 cm3 de ce bouillon.au pH 2,37 par de l'acide phosphorique et on extrait à 250cm3 de n-butanol.
Le butanol est séparée réglé au pH 6,40 par de l'eau et de l'hydroxyde de sodium. Le butanol est éliminé de ce mélange par distillation dans le vide, ce qui laisse un concentré aqueux
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d'Ompga111rcine qu'on étend à 25 cm3 nar addition'. d-eau., et oui donne un diamètre de 19;1 !nm dans l'essai sur S.aureus à une dilution de trois fois,): et ou'on lyophilise ensuite pour obtenir 356 mis d'Omaycine solide (lot 6667A-4} donnant 15,1 ma sur S. Purel--ts à i ;jcm3, Les spectres Ff des échantillons d'Qgn4çamycine sont déteminés comire décrit ci-dessus, avec S.Pureu et sont les suivants : .
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Schan-Système.* tiJ¯loT"l solvant¯¯¯¯"- B C E F" 7 6667A-3 Valeur Ef 4-7 5,63,4,5 1 8,g,10 S,b,,9,10 7,8,9 6667A-4 Valeur R 5,6 5,67 4,5,6 1 8,10 - 6-9
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Le systn'5 solvant 7 est nu mtt.h8TIol 80.f conenpnt
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2e de pipridine, 2 f d'acide p-toluènesulfonioue et 2"< d'acide lauricue. Le système sol.vent 8 est de la pyridine contenant 1 d'eau, 1% d'acide 1J-toluènesulfoniaue et 1% diacide lauriaue.
TXPL=â ZIJ( On règle au pH 9,25 nar de l'hvdroxyde de sodium un bouillon de fermentation de Streptomyces BL 456667 L .10 en? donnant 20,1 mu sur S. aureus non dilup' (X et 15,0 1Jun dilué trois fois (3x) J prépare suivant les procèdes ci-dessus, et on l'extrait par 205 cm3 de n-butanol. Le butanol est sépara et réglé au pH 7,30 en ajoutant de l'eau et de l'acide chlorhydriaue.
Le butanol est Elimine de ce mélange en distillant dans le vide "" ce oui laisse un produit concentre aqueux d'O)11.égamycine, actuelle- ment appelle tétracycline., qu'on étend à 21 cm3 par addition d' eau et qui donne 18,0 in-ra dans 15essai sur z. awreus dilution 3 fois, nuisonlelyonhilise pour obtenir 93 ng d'0m±gamycine solide (lot 6667-1)' donnant 19,3 :rrn à 1 rip.,/cri,3.
On règle encore 410 cn3 de ce bouillon au pH 2,59 par de Ilacidc phosphorioue et on extrait par 205 cm3 de butan.ol.
Le hutanol est s6par4 et rôg14 au pH 6, 9 nar de l'eau et de l 'hydroxyde de SOdlui2. Le butanol est 01i1Y'.in de ce m41rnge par
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distillation dans le vide, ce oui laisse un concentre aqueuy
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(POrn'gal11ycine qu'on tend à 21 CM3 par addition d'eau, aui donne 20,0 rim sur S.Rureus lorsoueil est dilue trois fois, et au'on lyophilise pour obtenir 331 r à'0m4garoeycine solide, actuelle- ment d/notum6e ttracycline (lot 6667-2) donnant 17,3 mm sur S. Fureus à 1 mg/cm3.
Les spectres Rf d'Om^gamycine sont déterminés comme
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décrit ci-dessus, sur S. aureus, et sont les suivants :
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"Schan-Système"
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<tb> tillon <SEP> Solvant <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> G
<tb>
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6667-1 Valeur Rf 6.,7 g7 1,5 1,2,3 1 10 7 9,10 8 9667-2 Valeur Rf 6 6,7 4,5 2,3,4 1 10 7 9,10 7
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ey'lf1Pr...'ft: ex Le coefficient de rnartiti.on de la t6tracycIine en±T J
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le butanol et l'eau (concentration dans le butanol divisée par concentration dans l'eau) est inférieur à l'unité à tout pH mais est sensiblement modifié par addition d'ions calciques.
C'est ainsi que le coefficient 'de répartition de la tétracycline entre le butanol et le chlorure de calcium en solution aqueuse à 2,0% est inférieur à 2 (est souvent inférieur à 1) du pH 1 au pH 6,6 environ, mais s'élève rapidement lorsque le pH augmente et est supérieur 'à 5 du pH 7,4 à 11, en atteignant un maximum de 9-10 entre le pH 9 et le pH 10. Une allure très semblable de la courbe du coefficient de répartition de la tétracycline et du pH est obtenue en utilisant du butanol et du chlorure de calcium en solution aqueuse à 0,5% avec un maximum d'environ. /0.au pH 10 environ.
On n'obtient pas de coefficient de répartition supérieur à 1,5 pour'la tétracycline entre le butanol et les solutions aqueuses contenant 5 ou 10% de sulfata de sodium ou 2,5 ou 10% de chlorure de sodium du pH 4 au pH les coeffi- cients de répartition entre 2 et 4 peuvent être obtenus a.vec 2 à 10% NaCl uniquement au pH très acide 2, ce qui rend. les. opéra- tions. industrielles' difficiles sinon impossibl
L'extraction d'une solution aqueuse (bouillon) contenant au moins 250 meg/cm3 de tétracycline par un quart de volume de butanol au pH 8,5 en présence de 0,5% de chlorure de calcium, donne une séparation élevée, (40 à 50%) de tétracycline sous la.
forme d'une matière solide de bonne puissance après séparation et concentration du butanol, extraction en retour par de l'acide aqueux, comme l'acide chlorhydrique, et isolation. La tétracycline est ensuite extraite comme décrit plus haut.
Dans ce procédé, on utilise l'ion calcique normale- ment présent dans le bouillon (par exemple dans la liqueur de macération du mais), ainsi que des ions calciques ajoutés. L'ion calcique peut être ajouté sous la forme d'un sel quelconque par exemple le chlorure de calcium ou le carbonate de calcium, et on utilise de préférence une concentration totale d'ions calcium
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dans le bouillon variant entre 0,01 et 2,0 pour cent.
L'addition d'environ 0,1 pour cent de chlorure de calcium est me mesure utile; la quantité à ajouter peut être également la Quantité nécessaire pour créer dans le bouillon l'équivalent stoechiométrique de la tétracycline présente déterminé par essai pour établir la quantité de tétracycline et la quantité d'ion calcique.
Des quantités excessives d'ion calcique ne sont pas désirables à certains moments parce qu'elles précipitent des phosphates calciques sui ont tendance à absorber de la tétracycline. On ne peut récupérer celle-ci qu'au prix d'opérations supplémen- taires.
D'autres renseignements sur la plus grande efficacité de l'extraction de la tétracycline par le butanol de bouillons de fermentation contenant des ions calciques sont fournis par l'observation que l'addition d'un agent de séquestration ou de chélation de l'ion calcique à un bouillon, réduit l'extraction de la tétracyclique dans le butanol en dessous du niveaulobservé lorsqu'on n'ajoute pas de chlorure de calcium au bouillon.
Un bouillon de fermentation contenant de la téracycline et utilisant de la liqueur de macération de mais dans le milieu, est réglé au pH 8,5 et divisé en trois portions égales auxquelles on'ajoute les quantités indiquées de chlorure-de calcium.
L'extraction par le butanol est améliorée par les ions calciques
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aJout/s, cor2me l'indiquent les résultats repris au tab7eau ci- dessous., et obtenus par essais biologiques.
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Ttracyc1ine prpsel1t n Cg/C!Jl3 Portion n fi Cad dans le butanol dans le bouillon frrJ 111 â .-.'
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<tb> 1 <SEP> ' <SEP> 0 <SEP> 136 <SEP> 21
<tb>
<tb> 2 <SEP> 0,1 <SEP> 196 <SEP> 20
<tb>
<tb> 3 <SEP> 0,5 <SEP> 196 <SEP> 20
<tb>
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Y'''L '2vvI On ajoute à un bouillon de fermentation contsn-nt au -moins 100 mc!!/ cm3 de t ftracy<31ine environ J1' de C-,C12' ot on rè(18 leu bouillon au pil 8,5 - 9,0 environ par de la 801100 cqusi:1-
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eue ou de l'ammoniaoue, puis on extrait le bouillon par environ un cinquième de volume.de n-butanol dans une extraction en
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plusieurs phases' Le Biélange est filtré et la tétracycline contenant du butanol est concentrée par distillation dans le vide avec addition facultative d'assez d'eau à la fin pour permettre la formation d'hydrates.
Les matières solides contenant de la.
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tétracycline (au moins 6tJ0 ¯L.cIQ .rcipitant sous la forme de la base ou du sel de calqiun et sont recueillies par filtra- tion et dissoutes dans des quantités miniuurn de n-propsnol.
On fait alors passer de l'acide chlorhydrique gazeux dans le
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n-propanol pour précipiter le chlorhydrate cristallise de tétra- cyeline, d'une puissance aplrqxi0iativewent' théorique.
0Ti,ojv[F u f .-u. L.. J ¯W1 On ajoute à un bouillon de fenfl'entation contenant de la tétraéyclinc 0,1% de Cad- et on rpgILé le bouillon au pH S,5-90 environ par de la soude ou de la Dotasse . caustique ou de l'ammo- iliaque., nuis on l'extrait par du n-butanol eh utilisant un demi
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volmie pour l'extraction par lots ou 1/4'a 1,5 de volume pour l'extraction en plusieurs phases.' Le mélange, est filtré .et la phase dans le butanol est s4pa.r'.5e .Bi l'on utilise le -,.Oroc'p* par
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lots. Le butanol contenant -la tetracycline est concentré au 1/200 du. bouillon par distillation dans le vide.
Le concentré de butanol et les matières insolubles qu'il contient 4ventuell;f/i=nt, sont extraites par 3 volumes égaux successifs d'eau r41é )' au pH 2,5 par de l'acide chlorhydrique* Les extraits. aqueux sont combinés,
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filhrés et concentrés par distillation dans le vide au 1/400 ou au 1/500 du volume du bouillon. On ajoute à ce concentré aqueux 1% de chlorure de 'calcium (poids/volume) et on règle le pH à
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7,8-3,5 environ par addition d'hydroxyde 3' ar.soniu;.
Le précipité obtenu de tetracycline calcique solide est recueilli par filtra- tion et sec-ile 1-*air ou sous vide, après l'avoir lavé à l'acé- tone
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xr: PT.; S Y36II 1 On dissout 1 gramme de base libre de tétracycline dans un voirie ú1Ínil':u:.J. d'acétone anhydre et on fait passer sous la for;e âe gaz la quantité stocchi-o-,2iétrioue d'acide chlorhydrique T?-CeSSa:.I'¯"2 f:0'ü forcer le sel. Le chlorhydrate de tftracyc1ine
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solide jaune cristallisé précipite et est recueilli par filtra- tion.
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]<'\1' f." rOI [j' V'7I On purifie la tttracycliD.9 des quantités contô111inantes r7e chlortS'tracycline et à'oxyt4.ti?acycline, lorsaue ces C01TJpOSS sont or-5sents, par répartition à contrecoiarant, par exemple dms 7¯'ar:Gril de Craig, en utilisant un système solvant n- h'a Jétn<Jl/2,5Ji d'acide acétique, comme décrit par exemple dans TTcïsi7"arer, Technique of Organic Gher:1Ïstry, Vol. Xiii, Inte1'sci(nce Pu7l. Co. N.Y. 1950 pages 171-311 et .".nal. Chem. Vol. 21+e pages 66-70 (1952) et Vol, 23, pages 41-44 (1951).
::T!::: ;[11: X)[V
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\ On ajoute des agents mouillants cationiques, anio-
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niaues et non-ionioues à des bouillons de fermentation de tt[,Dc"vcllne pour augmenter Inefficacité ,de l'extraction de la 1,>'tracycline des bouillons par le buta,nol ou l'alcool 8mylique ou la thyl-isobutyl-ctone. Le pH est soigneusement r='.1"' dans chanue cas cour obtenir la répartition i"azimurJ1 dans le solvant o1'g;:mique, oui peut être d0termins par un. simple essai. Des exemples d'agents et de concentrations utiles sont l' a/.1'0801 OT (1.70'), le Ttreen 21 (05) et le Teri o1 (0,1='j. La concentra- tion utilisée peut atteindre 5.
D'autres agents utiles sont les agents ioui112ntS a--iionicues, COrl")?! 1-'acide laurinue, 1-'acide sta1'in1Je, les esters due l'acide sulpurinue.7 les acides napthalène-su1 foniqu9s, les acides siilroni ues 8lkvl- é' r01Î1::,tiues suprieurs, les agents mouillants cationinues corme les sels d' ;:rrl1'""'oni 1111 nua t 0rYJ.ai l'es (par e:re:irle, (CH)) 3NCH2 CU11F¯ C H!)OCR Cl" ou OCR repr4sentent les acides j7,rens en 1.11[1nr()
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de l'huile de coprah), et des--agents mouillants non-ioniaues
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cornue les thers d' û1'¯syl-ph nal et de rolyalycol.
Dans un procédé simple suivant ce principe, on utilise
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un véhicule pour faire oasser la tétracycline du bouillon de fermentation contenant .100 mcg,/cm3 de tétracycline, dans la méthyrlisobutyl-c4t<Jne. Ce solvant est sépara; l'addition d'acide chlorhydrique gazeux précipite le chlorhydrate de tétracycline cristallisé solide-
Dans un autre procédé-, suivant ce princine, on fait
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passer la tétracycline du bouillon dans la m4thyl-isobutyl- cétone par addition au bouillon au pH 2 à 4 d'environ 0,? '. d'un agent ffiouillant anioniaue corume le Tergitol 4 (t3tradécyl- sulfate de sodium le Tergitol 7 (heptadécylsulfate de sodium) ou l'Aérosol 0 (dioctyl-sulf.osucpinate de sodium).
EX%.4IÎJÉ YVI
Un procédé très simple, peu coûteux et efficace, pour isoler la tétracycline solide brute de volumes importants de bouillons de fermentation est le suivant. Un bouillon de fermen-
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tation contenant au moins 250 mcg/cm3 de tétracycline, et de préférence 1000 mcg/cm3 de tétracycline ou plus est réglé à un pH acide et le mycélium est élimine par filtration. Le bouillon filtré. est alors réglé au pH 8 ou plus par addition de soude caustique ou d'ammoniaque par exemple. La tétracycline solide, brute, active, prpcipite sous la forme de la base libre ou du sel calcique, contaminé par du sulfate de calcium ou d'autres impuretés et est recueillie par filtration. Ce produit brut est encore purifié, si on le désire, par les procèdes décrits plus haut.
Par exemple, ce produit est dissous dans l'acide chlorhy- drique au pH 2 contenant 10 de chlorure de sodiun, et extrait
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par le butanol et le butanol est-s0p8r et concentra nat distilla- , tion dans le vide pour précipiter le chlorhvdrate de tétracycline.
EXE;,;PL 4.: XXVII On vr'Dare plusieurs lots d'8mgam.ycine à partir de
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bouillons de fermentation Strepto-myces BL-567201 de la manière suivante- On ajoute à l'ensemble du bouillon (150-285 gallons) 285 à 532 g de chlorure de calcimi, et 50 à 120 gallons de n- butanol humide. Le pH du bouillon qui est 4,9 à 5,5 est réglé
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à e,35 à 8,8 par de l'hydroxyde de sodium à 50% z.- 10,5 litres).
Après agitation, qui donne une émulsion séparée par filtration en utilisant de la Dicalite (terre d'infusoires), la phase de
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butanol contenant de l'0m<4gaiycii)e est séparée (100-122 gallons) et concentrée à un volume d'environ 2,5 à 7,0 litres par distillation dans le vide à des températures de Moins de 100 F (38 C) et sous moins de 35 mm de.pression.
Les concentrés dans le'butanol, ayant des pH d'environ 7,0 à 7,5 sont extraits trois fois par des volumes égaux. d'eau
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et réglés au pH 2,0 par l'acide gulfurique ou chlorhydrique.
Ces extraits aqueux sont combinas, règles au pH 1,5 par de l'acide chlorhydrique, mis en suspension avec 1 ou 2% de charbon activé (par exemple Darco KB), filtres et le filtrat est concentré à environ 1/5 de son volume par distillation dans le vide.
Le pH de ces concentrés aqueux est ensuite réglé à 6,0 environ
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par de 1'hydroxyde d'ammonium, e qui précipite l'0m-qamycine qu'on recueille pa.r filtration. Une seconde Quantité d'Omégamycine est souvent obtenue en concentrant le filtrat à nouveau au cinquième de son volume environ.
Les différents lots d'Omégamycine obtenus ci-dessus (63 g) sont combinés et dissous dans 630 cm3 d'eau réglée au
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pH 1,5 par de l'acide chlorhydrique. Anrès filtration, on ajoute à cette solution 63 g. de Vrsine (acide ntl;rl=ner3iarinetntr aeé- tique). Le pli est ensuite réglé à 6,0 par de 15bvrîro7v-',r,, dl,-im,tio- nian et i'0mFgaoiycine qui -précipite (30 g) ert recueil'] je onar filtration, sÀcii6e dans le viie sur P205 et deux foj? nise en suspension avec 120 cm3 dp :1^t'1n7]¯, en rj et''nt 1.4, j à-a lintlere insoluble. Les FQl'iHor)".Tith?'Tioli"'u3 -ont. r;o'i''; et, r,r-r !p00 c-.yi3 :1',a .u.
L3tJ(rl'ç;",,rri-; , r,r,,'.,,¯j 'H" .., r-ip
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solution noueuse par repos )llSCii7.'Ll 1-3nde-'lêil1 en chambre f>roi1:;,. et. est recueillie Dar .filtration (8,9 q en deux fois) et séchée à l'air.
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Cette 0:nEgamjveine est traitée par du carbone tandis au'elle est en solution dans l'eau au p3 1,5; la solution est filtrée et 1-10LP'eaIiyeine prpcipit2e en portant le pH à 3,5 par de l'ï2ydroxjrda d'ali1HJ.onil1.'il. On dissout les 6,9 z d'O:m0glliJwcin6' dans 3.4 cm3 d'eau réglée au pH 1,5 par de 1-1 acide* chlorhydriau; la solution est réglée au pH 3,5 par de ll-hvdro7rde d'arIl!lloniutl1 et ensemencée; la base d'0m4gamycine hydratée cristallisée précipite lentement et est recueillie par filtration (6,45 g), et séchée à l'air;
elle fond à. environ 171,5-173,5 C, contient à l'analyse aux rayons ultra-violets 890 mcg/mg (sur la base
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de 1000 mcg/m? d'OmÓ8111ycine ou de 96l. rncam de trihydrate d'Omégamycine}, et à l'essai biologiaue 892 mcg/mg sur B. subtilis sur des plaques au pH z et est exempte de chlortetra- cycline et d'oxytétracycline ou d'a.utres impuretés comme le montre la résultat de la chromatographi'9 sur bande de papier.
Cette base d'Omegamycine hydratéecristallisée contient 19?; d'eau et est analyste après séchage'
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Analyse : Calculé pour C 22 H 24002
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<tb> Calcula <SEP> Trouvée
<tb>
<tb> C <SEP> 59,45 <SEP> 59, <SEP> 6 <SEP>
<tb> H <SEP> 5,44 <SEP> 5,45
<tb> N <SEP> 6,30 <SEP> 6,29
<tb>
Une suspension obtenue en broyant cette base libre
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d'0na8gany-cine hydratée et cristallisée dans l'huile Tinrale (Flujol) nrfsente de nombreuses bandes d'absorption catact4ristL- . aues dans l'infra-rouge. Parni celles-ci on relevé les ir4auences suivantes (en cm-l) 3J.0, 1672, 1607, 1524, 1259, 1222, 1130, 1065, lOl0,9, 963, 91+8, 932, 861, 838, 803, 736, 741, 739 et 6C".
Le snectre ;ahSy'T?'l.Oi1 dans l'Ínfré1-ro1)e-e r'e cette 1:>t">11 \ l1.i g ,;x-1x l'huile :'1in6rle dans lx 1-/zion csractrjstinu 4;>s ''rs d'0YJnes 1350 5 650 on-1 est 1,nài,,iJà sur la fi"'.l zÏS 'SSaYt ,".,.-'.S
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Cette base 4'0môgaJycine hydratée cristallisée (2 p:raIi1111es) est dissoute dans 20 cm3 de n-Dropanol contenant environ 0,5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré.
Après repos pendant 30 minutes à la température ordinaire et 90 minutes à
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froid, le chlorhydrate d'OnÉ-.P,,a7,,iycine cristallis0, nr4ciDite et est recueilli par filtration (1,5 g); il fond à 217-219 C en se décomposant*
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Analyse: Calcula pour C22H 2408N 2 HCl :
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<tb> Calculé <SEP> Trouvé
<tb>
<tb> C. <SEP> 54,9 <SEP> 55,0 <SEP> ; <SEP>
<tb>
<tb> H. <SEP> 5,03 <SEP> , <SEP> 5,2;
<tb>
<tb> N. <SEP> 5,83; <SEP> 5,99 <SEP> ; <SEP>
<tb>
<tb> Cl. <SEP> 7, <SEP> 37 <SEP> ; <SEP> 7,5 <SEP> ;
<tb>
Une suspension obtenue en broyant le chlorhydrate
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d'0m4gam,ycine cristalliséedans de l'huile minérale (Nujol) présente de nombreuses bandes d'ab-sorption caractéristiques dans l'infra.-rouge.
On y relève les fréquences suivantes (en centimètres -1) 3340, 1678, 1623, 1597, 1315, 1248, 1229, 1175,
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1140, 1061, 1036, 1002, 964, 949, 864, 823, 796, 781, 7.3, 719, 692 et 667. Le spectre d'absorption dans 1-linfrà-rouge de cette bouillie d'huile minérale dans la région caractéristique des nombres d'ondes entre 1350 et 650 cm-1 est indiqué sur la fig. 2 des dessins annexés.
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L'Ompgamycine a un pouvoir rotatoireLë<-7 27 - 245
D à une concentration de 1% dans le méthanol et présente des
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pointes d'absorption dans l'ultra-violet à 2671U(,, 17, 400) et 355rnt( (-e 13, 500) dans de l'acide chlorhydrique 0,1 N. 27 Le chlorhydrate d'0môgamycine a un Douvoir rotatoire -O<-7
D - 253 à une concentration de 0,5% dans l'acide chlorhydriaue 0,1 N.
EXEMPLE XXVIII
On isole la tétracycline de bouillon de fermentation acidifiant le bouillon au pH 2,0 - 2,5 environ, nar exemple
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à l'acide sulfurique et en filtrant. Le filtrat limpide contenant la tétracycline est alors réglé au pH 9-10 par de l'alcali , par exemple de l'hydroxyde de sodium ou de l'ammoniac. Un peu de carbonate de sodium peut -être ajouté vers la fin pour réagir avec l'ion calcique présent et précipiter le carbonate de cal- cium qui adsorbe la tétracycline; La tétracycline qui précipite au pH 9 - 10 a une puissance d'au moins 200 mcg/mg et est recueillie par filtration et purifiée suivant les procédés décrits.
A titre d'exemple de cette purification.., le produit est dissous dans de l'acide nitrique aqueux au pH ?¯- on y ajoute du nitrate de sodium et on extrait la tétracycline par- du n- butanol. Le butanol,est séparé et neutralisé, ce. aui précipite la base de tétracycline*'
Dans un autre exemple, on forme directement une sus- pension du produit avec dun-butanol et on en récupère la tétra- cycline pure, par exemple sous la forme du chlorhydrate, par acidification et concentration.
Dans un troisième procédé, on forme une suspension du produit avec de l'acide sulfurique diluée on filtre, et on règle le filtrat au pH 6 environ en y ajoutant de l'alcali, ce qui précipite la tétracycline purifiée solide.
Le bouillon acide filtré ou le filtrat alcalin venant de la précipitation de la tétracycline du bouillon, conviennent dans les cas où ils sont recueillis ou après séchage comme ali- ments pour lesanimaux ou comme additifs à ces aliments: Ces filtrats contiennent de grandes quantités de facteurs alimen- taires importants (par exemple les prot4ines, les hydrates de carbone, les substances minérales, les vitamines et particulière- ment la vitamine B12 et les vitamines du même groupe et des agents non identifiés stimulant le développement des naimaux, souvent appelés facteurs protéiques animaux) et peuvent être ajoutés aux aliments pour animaux particulièrement ceux d'origine
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végétale, avant ou après concentration ou séchage.
La valeur de ces aliments et additifs pour animaux provenant de ces filtrats est augmentée par addition au milieu, avant la fermen- tation, d'un sel de cobalt soluble, par exemple environ 0,1 à 20 parties par million du milieu nutritif du nitrate de cobalt, et èn ajoutant au milieu avant la fermentation une substance (par exemple un cyanure de métal alcalin ou un ferrocyanure ou ferricyanure de métal alcalin) constituant une source d'ion cyanure à raison de 0,1 à 100 parties par million environ.
EXEMPLE XXIX
Un procédé efficace pour obtenir de la tétracycline cristallisée à partir de bouillons de fermentation est le suivant. On acidifie le bouillon au pH 2,0 - 2,5, environ.,
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pa.r exemple à l'acide sulfurioue on le filtre et on .,:5jette les matières solides- Le filtrat est 1.±g14 à un pH'a.ICalin, par exemple environ 9,0 - 9,5, et extrait par un tiers de volume de n-butanol. Le butanol est sépara on rej ette la phase aqueuse (bouillon épuisé), on acidifie par de l'acide sulfurique, par exemple au pH 5 - 6, et on concentre par distillation dans le vide à un cinquième du volume initial du bouillon environ. La tétracycline qui précipite est recueillie, par fil tration et a une puissance d'au moins 200 mcg/mg.
Le butanol est recyclé. On dissout 100 g de tétracycline brute dans 1 litre d'eau acidifiée au pH 1,5 par de l'acide sulfurique; les matières
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insolubles sont 8 liRiinôes par filtration et rejettes. La sol- tion anueuse est traitée par du charbon activé (10 à 50 g) et filtre- A ce moment, on peut ventuelle-nent ajouter 10 de Sequestrpne (l'acide ':t"f1ylènc1i é';Ün -t'tr"' rrt i oue) ou d'un autre agent pour s ooestr'f'1' le cn18ill"'. Le pi de 1* ;()l11ti')n -lisp- est ensuite 1'/1"'1 â 3,5, par I?YO'1Yt!.'" 1 l'r>' r"j{e 3' par repos la base pure de tf,trecrr.ljy:8 cri +.<,11 i^^ ."t r.t, rwc zl'1¯ie par filtration*
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On peut précipiter encore de la tétracycline moins pure convenant pour le recyclage en portant le pH du filtrat final à 6 environ.
Les agents séquestrants utiles pour éliminer le calcium et faciliter ainsi la précipitation de. la base pure de t4tracycline sont notamment l'acide citrique, l'acide tartriau.e, le phytate de sodium, l'acide gluconique, les phosphates comme le m4taphosphate de. sodium et en général les membres de cette classe conus dans la partie, voir par exemple J.Chem. Educ. 25 482-488 (1948) et les références que contient cet article.
Nombre de ces agents sont des composés d'acides polybasiques faiblement ionisés, ou des acides carboxyliques organiques hydroxylés.
EXEMPLE XXX
Un procède efficace et simple pour isoler la tétra- cycline des bouillons de fermentation sans employer de grands volumes de solvant pour l'extraction est le suivant. Le bouillon est régé au pH 9 - 10 en y ajoutant de l'aclcali et filtre.
Il reste moins de 100 mcg/cm3 de tétracycline en glssolution dans le filtrat et on rejette celui-ci. Ce mélange avec le mycélium de la t4tracycline :absorbée et précipitée et d' autres ingrédients du bouillon peut être utilisé dans l'état où on le recueille ou après séchage comme aliments pour animaux ou additifs à ces aliments.
Le filtrat, aui contient peu de tétracy- cline, mais des quantités importantes de facteurs alimentaires intéressants, (par exemple les protéines, les hydrates de car- bone, les substances minérales, des vitamines, et particulièrement la vitamine B12 et des substances du même groupe, et des stimu- lants non identifiés du développement des animaux, souvent appelés facteurs protéiques animaux) peuvent être égale'lent ajoutas aux aliments, particulièrement ceux d'oriine Végétale, -près ou avant concentration ou séchage.
La valeur de ces aliments et de ces additifs provenant du précipita et du filtrat est augment-
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tée en ajoutant au Milieu avant la fermentation un sel soluble de cobalt par exemple environ 0,1 à 20 narties par million du milieu nutritif de nitrate de cobalt et une substance, (par exemple un cyanure de mtal alcalin ou un ferrocyanure ou ferri- cyanure de métal alcalin) fournissant une source d'ion cyanure à raison d'environ 0,1 à 100 parties par million.
La masse solide et la tétracycline adsorbée sont extraites à un pH peu élevé (par exemple 1,5) par de petits volumes diacide aqueux, par exemple d'acide sulfurique ou diacide oxalique, pour obtenir une solution contenant au moins 3000 meg/cm3 de tétracycline*
Dans un procédé, la tétracycline est isolée en neutralisant cette solution acide au pH 4 à'10'et de préférence au moins au pH 6, de façon à précipiter la tétracycline solide sous fbrme de base ou sous forme calcique, avec une puissance d'au moins 100 mcg/mg.
Dans un autre procéder la tétracycline est isolée en neutralisant cette solution acide au pH 9 - 10 et en extrayant la tétracycline par environ un tiers de volume de n-butanol. Le butanol est sépara et concentré à environ un vingtième de son volume, ce aui précipite la tétracycline, sousforme de base ou sous forme calcique, avec une puissance d'au\moins 200 meg/mg.
EXEMPLE XXXI
On transforme de-la base de tétracycline humide et brute (par exemple 1 g contenant 20% d'eau) en chlorhydrate cristallisé. en dissolvant la base dans une quantité minimum de n- butanol anhydre (par exemple 5 cm3) en y ajoutant de lucide chlorhydrique car¯centré (par exemple 0,3 cm3), en filtrant et en décolorant par du carbone si on le désire, puis en ajoutant une quantité supplémentaire de butanol anhydre, par exemple 5 cm3.
Le chlorhydrate de tétracycline pur cristallise par repos et est recueilli nar filtration. La première filtration peut être suppri-
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n.fe; dans ce ces, tout le butanol est ajouté en une fois et la t4tracycline se dissout, puis cristallise snontaz¯ent sous la "forme de chlorhydrate de ttracycline.
T4-:PL :i'¯IT La t9tracycline est séparée des cuantit4s c011t1 Ün2.ntes de chlortstracycline 4ventuellaTient nrhse==tes en formant une SUSDension de la base libre dans le fapthanol. La base de chlor- t<straejrcl in:3 ne se dissout pas; la base de tétracycline dissoute est s4par4e sous flomaie purifiée coùme ci-dessus, par exemple nar 6v8Doration du solvant ou en versant le illth2nol dans l'eau.
La tétracycline est efficacement sppr4e des quantités contsTninantes de chlortetracyeline 10rS0ue celles-ci sont 1Jr±- sentes en ls mettant en suspension dans un acide aoueux, pra- tj,c,u8'18nt au pH 2,5, qui ne dissout que la chlort4tracycline.
L'rC.ïÊ3!' y}r(,.f4r; est l'acide chlorhydrique êl.'autres a,cid=s, par exel.'1::.le l'acide sulfuriaue, l'acide -oho s110riQu, J''--tt.rl1't. être utilisas,, à condition cu'on obtienne le pX voulu. La base ou le sel de tr';t1'acyc::"ine est .'fis en suspension dans l'acide chlor- hydrique en nu.ntitr suffisante pour obtenir un pi-1 de 2.,) ou fe TIT<fiftenee, la base ou le sel i2rnur de t tracycl irm, Dar exemple le cJÜorhydl">;-;C9, est dissous dans de 1''acide aqueux au <JE 1 , 5 ou :aoins, et on ajoute assez de base, par eLe'-1}le 0'}'lydroyYde d'é1":l':onÍurl ou d'h,roro).::yde de sodium pour obtenir le pi, de 2, 5 La q ln-tat s tétracycline utilisée n' '3St nas un facteur liai- tatif en gpnér81, il est 2vantageuy d'utilis3r 50 a 100 Y:l0' de base ou de sel de tâtracycline par c3 à'ez-1J, acidifiée P1J. 1=x 2, 5 F,- de l'acide chlorhydrir-ue.
Le n5: est un facteur cri tt01Y:; on rrff'è1'e 2,5, bien Que tout pH dans la éUL::e de 2,0 à 3,0 soit utile. L2 <iipptit8 de ct=1±-rtfitra.c..rclir>e nr±se-1t= sous orp-e G 'iI; pureté dans ;la tétY-acyrcli==e 1 purifier Der ce p-rocé=1é IL - 1-eut, dépasser 9 "lQJ c::l3 d'eau acidifiée et, de 'Jr:-ér8nce, ne Deut dépasser 5 Tr<;/CI:l; cette linite est -::actle'le'1t: rlrrSri-rr-cr en pupmsntant si nécessaire là Quantité d'eau acidifiée utilisée n?iJ,r la J112e en susnension.
Ces j,:p"ler3S S :.Ci 7¯i '¯,^-¯. n;-r 8yc;,v'nl'"
<Desc/Clms Page number 45>
le chlorhydrate de ttracycline et le chlorhydrate de chlor- tétracline dans cette opération de purification sont alors mélangées, c'est-à-dire ises en suspension dans de l'eau
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acidifiée par de l'acide chlorhydrique nra¯ticruerPnt' au pH 2,5 pendant une période considérable, par exemple 16 heures, assez
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longue pour permettre à la chlort4tracycline de se dissoud.re.
On peut la déterminer par un essai simple. La ba.se de tétra- cycline solide purifiée qui reste non dissoute est alors recueillie par filtration.
A titre d'exemple, on a mis en suspension pendant 16 heures dans 200 cm3 d'ea.u réglée au pH 2,5, environ par d.e l'acide chlorhydrique, 10 g de chlorhydrate de tétracycline
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cot)t'Tfinnt à l'essai 830 cle tétracycline et 171 mce/mg de cb.Iarttracycline (83 de ttracycline) par absorption diff0rentielle dans l'ultraviolet et contenant environ 10 de chlort4t1 à.cycline, détermine par chroratoara.nhie sur bande de papier. La base de t6tacycliTIe nurifipe solide est alors re- cueillie par filtrrtion et s8chpe. lille pesé 3,0 grai=1mes,con- tient 901 Tilcg!mg de ttracycline et 39 T1lcg!:mg de chlortntra- cvcline (96 de t'treicycline) a,r la. TI1f;thode d'absorption clins l'ultra-violet et contient 95 à 97% de tétracycline d'après le nrocédé de chromatographie sur bande de
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papier.
La récupération de la t.'tracycline atteint =7..
Une =xpFrience semblable effectuée sous azote donne une 1'cup!rF\tion de 92 de la base de tétracycline contenant de zl.ero à ';!o-1' de chlort;'tracycline, Duisssnce 929 Y1lCg!r:lg.
1:r::: rT l yXXIV Lp tF'.tr2CZrCllne est efficacement nurij0 et $T5(ITrP des ("l1±'n ti tf,s conté'- 'in2nte::: de c'1.lort!-trRc:rclin e lorsque C?lllCF-ci sont T)r/s"'11te, en 1." l11et"!-a/l1.t. en S7J ',.'W'?nSl.Cn f1'ns ne i'aicxolJ¯ b allTl-1> 1 un pll 'r?yT7.'C0:1 7,5- /), lui nE dissout nue ia chlor- ;4trxc;rcline. ['\:-:1"1s une 5 .ii re (0Y",2 ":'r::.xér;11ion, la b!'1se ou le sel d'iCd'ition acide ost li S.^,OL1S au TJTT ;,5 p.t '7r'"C7.n'.'i.''' ['I")n") . lj for-m de la base de t'"trpc7cline nur5, j!:e rn r.<rl.>nt 1,e ro!T
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à 7.,5-q,0,, de préférence environ 8.5. rar addition d'acide, par exemple d5acide.çhlorhydrioue. L' alcali préféré est l ' ammoniac , mais d'autres alcalis sclubles dans 12eau comme l'hydroxyde de sodiun ou la triéthylamine sont utiles âcondition au'ils fournissent le pll nécessaire.
La base ou le sel d' addition d'acide de tétracycline., par exemple le chlorhydrate est mis en suspension dans l'eau réglée au pH 8.,5-9.,0 environ par .
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addition d'alcali. La quantité de tétracycline n'est pasun facteur limitatif; en général, il est avantageux d'utiliser 50
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à. 100 Hig par cia3 d'eau. Le pH est un facteur critique et doit être pratiquement 7,5 â 9,0. La quantité de chortrtracycline présente coi.me iln-pureté dans la tétracycline à aurifier par ce C'roc ne peut 4--passer 12 mg/cm3 d'eau alcaline et doit être de préférence inférieure à 2 uig/cm3; cette limite esi x%ciieioEenc
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observée en augmentant si nécessaire la quantité d'eau alcaline
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utilisée pour 1a mise en suspension.
Les matières solides, iicr. exemple la tétràcyeline et la chlortétracycline dans wptte -ouri- fication sont la angc'5es, i-riises en suspension r¯cms â; rendu,, alevine par de l'hydroxyde d'aiûnLoniUt)i au 139 -,0 nendant un tnnpsi considérable, par exesiple 16 heures, te'ips suffisant pour permettre à la chlortétraeycline de se dissoudre.
Le tzps exact peut être déterminé par un essai sinpie. La
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base ;le tétracycline solide purifiée oui reste non dissoute est
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alors recueillie par filtration. Toute l'opération est de or'- férence effectuée dans une atmosphère e eate d'ex,yaène, par eye-'ile sous azote, vour réduire ou suppriiier toute d-'co¯:.os3i io.
A titre d' ex e rple, on ---et en suspension pous azote 16 heures dcns 200 c=13 d'exu r-crie eu pli 9,0 T3.I' l'hyrode d's.m.ioniuri chlorhydrate b-'ircyclim d'amioniiri 10 g de clhlorhydrà,te tXttac;rclino cc:¯it-r,¯ant à l'essai 945 =c/¯t2 e t4tr*,c.rjiiT=e -7t lil 1=cv¯/¯-- sa? <niort4tr*c>.qhine (35? de tétracycline) T)?'r le proc<?5.* .y.î=C3ï''1t10?'? différentielle dans Z'üZ'?'%'.-V)¯Oiwt ? Cr.TI '¯; 2: rr ;1."n 10' cblort --etracycline, t ^- r i. .1.I1" , i p'r .C1"L" t:f:' c': i"
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sur bande de 'oapier.
La base de ttracyclilla solide -puri 10= est alors recueillie par filtration et sécii;zee. ille pese'35 e, contient à l'essai 9°6 -lc/-ng de ttracvcl ine et 20 iics/<ng de clnlort4tracjrcline (98.l' de tétracycline) par le procFd6 deabsorb4lio-i différentielle dans l'ultra-violet et contient 97-93;' de tétracycline, diaprés la cro;?rtograpnis sur bande de papier. La récupération de la tétracycline atteint 39"'.
Les résultats des ;essais sont exprimas en,¯icrogralunes équivalents de chlorhydrate de t4tracycline. Les puissances tlnyl.::lUll théoriques en mcg/mg pour des :ir-tières solides, anhydres sont 1000 pour le chlorhydrate de tétracycline et 1080 pour la base de t"tracycline- E]I a-... J.. X77V On purifie la tétracycline c<i.1-Ciqle' n en..'extrayant ppr üu rr t;anal dans leouel elle .est insoluble et en la dissolvant' dans du >iFthaxio1 contenant du chlorure de calcium.
Les 1>npui?e.t,5s non dissoutes sont liolin.es nar filtration et on ajoute ue l'esu et de 1'anifioni ac au pH 8 à la solution pour précipiter la t,atra.ctrc7..ne clcicue purifine. i,'a,+,"W]10 -'-tr-t\r-r On peut transformer de l'Ovn4r a..lyci.ne de pureté aueicon- roue en chlorhydrate en traitant la ;=1a.tiére dpns'l'eau par de l'acide chlorhydrique jusqu?à ce au'on obtienne une solution linpide et nue le plei. soit inférieur à 3-4. La solution est =o1-xe- .L-e et sfc?1<e sous vide pour obtenir une -ooudre facilement r7- luble.
'lY "?' 'l' iJ i VIT On :;:et en suspension 10 0 #rafxres (00275 :..Éle) de 1="'t1-icjrcline anhydre dans'100 cm3 'e ¯-rronan.l et on. a joute 11 Fr?*1"e (02.!h. noie) 'diacide 4or;ni(-,ue à 9t ". Lorsque 'Le est chauffa 50-5511 rendant oueloues -min re- t'ro3.di, un nrc.pit^ cristallin abondant apparei-t. Anres repos psndant 15 heures à 0-5 C, on filtre le :.'lane et on lue
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i'u:-,::i:: te .3.> t;tl'ê1cyclirh3 solide â#.l ':;t cit;111:s: telll' tOUl tl2r du. !1-)ropEffi.)l et de 1"ther én!lyr1'2. O!1 le SC'1' l'.,-.i 1'.
P0iè,s - 9,3 ,7 (391'). i?oint de 'L¯S3OI1 17Ó,5 -177 C s ? l 7" ) .:c.-ë.. . calculez -oour ??--?l'? 0- ...vv'"'"- .
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vG.L^''.a - f¯ r:r011'( C. 56,3 ; 5È,6 E. 5,35 . 5, 59 . r2o , aucune perte à 6ù C dans le vide*
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',¯r^¯w':':%c:i32C de la présente intention est lp '.;# =e 211').t'1rL8 eue celle (JU'Ol1 d/nO!'Ee actuelle.:: 3111 vtrfG'irCl.!ih zips r'!0n les 1JI'OOri!të<s sont décrites dans le Journal of t?ie f? y,L f C!'1 ce.1 Society, Volume 75., 1;su.=s ../.,!;1^t? 1953. in.si nar c etl.?)le 1 " 7r.',7 t : un Echantillon de la base libre de tétracycline suivant la littratn8 partir de C!i.0it.tT'Ç'cyclinF, on constate 0u'i1 ond à 170-175 C et conti ent 0, 7.Il de chlore, ce oui indique urine contamination .par environ 10' de ch1ort2trôcycline n'aYél4.1t 1)88 r'ai.
Cat échan- tillon et un autre Echantillon exempt de chlore et de t tr=- cyline ure (point de fusionl169-171 C avec décomposition) sont les iÎ:3rtles qu'un Echantillon d'0=l=éga.nycînè (lot 30; 1JrQpar8 suivant l'eerile 3J'J ci-dessus) et toutes les z¯puret'Ç sont
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distinguées par examen de ces échantillons et d'échantillons de
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ch10rttracTcline et C',¯'GWttraCtrCz2le seules et en :-^''1%?'zf?' ? par chrofo1atographie sur bande de papier (particulièrement avec les srstéres solvants D et L).
Le fait cue .'i'T?t'''P¯'Tij,F('ZI2e (lot 30) est la t4tracycline est 'ai.e:=.ent prouva par la vitesse identique ,:le la perte d-* activité au pH Q,0 à 37 C à environ 0,7 #nullz3 (24 de erte en . heures); la chlort4tracvcline perd environ 50 de son activité en 14 heures et l'ortétracyclin8 ryerd environ 50"' de son activité en 26 heures dans les r:ê'11gs conditions. n outre, 10'npa''nycine est clainittent r1i.sU¯nn'e de 1
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ci-i.l-ù2t-'tr-acYcline et àe 1'oxvt'-trac;clâms nar 1L essui sur ,1.i l'éWéH' wv pT ,0 , 01\ la chlortt-racycline 8t l'o:xyt0t1"8.cycU.n,:
se rpvèlent beaucoup uoins actives oue .'0:-ayc3¯n ,
Des essais de solides ont été effectués sur des plaaues de B,subtilis avec agar au pH 6,2 et au pH 8,0 et en utilisant les tampons décrits ci-dessus comme diluant,
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correspondant au pH de l' agar. Les résultats d "essais tYUiOU8S sont les suivants :
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<tb> Antibiotioue <SEP> Concentration <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> plaaues <SEP> B.subtilis
<tb>
<tb> dans <SEP> le <SEP> cy- <SEP> 3 <SEP> Dimensions <SEP> de <SEP> la <SEP> zone <SEP> en <SEP> mm
<tb>
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lindre mc cm3 (pi 6.2)¯¯¯¯¯¯¯¯(on '3.01 -, Chlorttracycline 0,5 19 NR 2 a0,2 NR GyYptracyc1ine 4 15, 5 NR Ttracyc1ine 50 z, 5 19, 0 Ch1orttracycline 1 21,5 lot,2
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<tb> plus <SEP> @ <SEP> 21,5 <SEP> 18,2
<tb>
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'l'trac,yr.line 50 Ornt uiycine (1ot 25) 100 20, 2 ,:
.16, 6 Omgwayc1ne(lot 3 Q) 25 23, 3 15,1 12, 5 20,8 .'1 12,9 Om0f,8myc5.ne (lot 36) 16 25,9 , z, 2 ¯¯¯¯¯¯¯¯¯######.#......#.#t#-#####-#####....#,#<##'#######
L'Omégamycine peut être ainsi prpare des quantités conta minantes de chlortéltracycline ou d'oxytétracyclin en ma.intenant une solution aqueuse au pH 8,0 environ jusqu'à ce
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que toute la chlortptracycline ou l'o7tétrac#cline soit dco- pOS0P. et en isolant ensuite 1-lüm(Ig,-:u-oycine Durifl14e, comme ci- dessus.
C'est ainsi oue la base solide de tétracycline contenant
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environ 26 de chlortetracycline peut être dissoute dans de l'hydroxyde de sodium aqueux et qu'on peut ajouter de nouvelles quantités d'hydroxyde de sodium nour mrter la concentration à
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0,17 - 1,17 normal. Après repos à la teJJ1prature ordinaire ou à. h0 C pendant 6, 20 ou 45 minutes, la solution est acidifiée au pH 1,5-2,0, fil)t6e, et la tptracyc1ine est précipitée et 5nrarre en portant, le pH du filtrat à 3,5 ou 6,0. La tPtracycUne séparée s une puissance satisfaisante et conti'ent moins de 2%
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'de chl()rttracrc1ine.
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Dans un autre cas, on a débarrassé environ 45.000 meg/cm3 de tétracycline brute de la chlort4tracycline qui la contaminait en la dissolvant pendant 24 heures au pH 8,5 à la
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ten'-rature ordinaire et en la récupérant ensuite. La ttr CVC 2.'!e (O:-:1-?g2f?1ycine) oe la Drpsente inven- tion est utile sous la forme de la base libre, y compris la ortie anhydre et les formes hydratées et particulièrement le
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trihydrate. 'oour combattre de nombreuses maladies causées les infections bactériennes chez l'h#:e et les animaux. "aus cette aD'.71'CatOnp la tra¯c,yclir.¯e est associée à une au=ntit4 8' ':ï2Cc.ti'TC c'u.'J. véhicule ou -1-lur- 2i,Cïr3it'lv -;
laT¯7aCCIItiC<Llar.?Snt acceptable cui 'neuf être une matière solide Oil un 1i0uio.e. Les GO':?t7rJS' c''-.iC??: peuvent avoir la- fone de C0"11'J:>ÏI>PS" de c#c'\J!'i':lt?S eff'e:èvescents, de 1JOïJG.1:'e, d-e ;;;rJ.nul'9s,. de capsules (capsules a cooue dure et à coque 1"1011e) ou de suspensions dans des huiles comestibles ou d' é"utr9s formes convenant Dp..Ltic1.lLière'lel1t pour l'a:irninistl.:e.tiol1 1J2rvoie bucc81e. Les dilupnts 1-d-ç;=iideg sont utilises à 1'<'ta,t stérile pour l' 2.c1ninistration. Daren t'rR19, Cp:r7.-â-â7re rar injection. Lg'3i1ieu peut être un solvant st ±- rile ou un. agent de Elise en suspension comme l'eau ou une huile injectable.
Les compositions peuvent être sous la forme de la matière active c'est-à-dire de la tétracycline (terme utilise dans cette description pour la base libre et ses hydrates) en mélange avec des diluants solides et/ou des auxiliaires de
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pastillage coniine l'amidon, le lactoses le talc, l'acide st0arique, le stôz-rate de ¯a.ansiun, les gonzes etc. Toutes les matières d'encapsu1ae ou de -castillane utilisées en =Jt>±1r=ue naracn,-- tique peuvept être utilisées lorsou-lil n'y a nuas incompatibilité avec la ttracycline. Les natières peuvent être transformées
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en com ori--.n-'s avec ou sans auxiliaires.
Sen variante, la ttra- cycline peut être placée dans une capsule connue en matière résorbable, par exemple une capsule de gélatine et administrée
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sous cette forme. Dans une autre forme d 'e-r6ciJtîon, la t6tracy,q in:
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peut tre eil1balle dans des ppnuets sous tonne de poudro <oet utilisée de cette ilanière. La tétracycline peut être ,7rFDà.r<<e sous la tonne d'une suspension agréable au goût dans laauelle la tétracycline n'est pas, soluble, par exemple l'huile de coprah.
Dans ce cas, on peut utiliser de l'huile de copras modifiée pour avoir un noint de figeage inférieur à 60 F (15,5 C) et/ou on peut la gélifier par du stéarate d'aluminium. Cette suspension
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peut r::tre.ad.:rninistree par voie buccale, telle qu'elle ou en capsule' Des onguents et des lotions à la ttracvcline sont utiles localement. On peut également utiliser en thrapeutiaue topinue des gouttes nasales, des trochisnues et des supposi- toires. La tétracycline de la présente invention est parti-
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cUl1.ere'rlent utile lorsau'elle est administrée par vo1.e buccale ou i.ntramusculaire; une qaimne de doses utiles POUl:' ! 'hOJ1l1"e est environ 10 à 1000 mg par dose.
Les doses sont données une à six fois par jour suivant l'état du patient, l'infection, la voie' d'administration, etc..
La proportion des ingrédients actifs dans ces compo-
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sitions peut varier. Il est n6cesRi re oue les ingrédients actifs constituent une proportion telle au'on obtienne une @@s Bien entendu, plusieurs doses unitaires neuvent
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Î't1'<: administrées à peu -près en 111J11e temps. Bfcn au'on ait constata 11f1rtic1.l1ière111ent pour les injections intraveineuses, '1U>1.1TI0 nroportion de moins de 0,10' de t6tracYcline est efficace, 3l st nr'''fr?'ble de ne nas employer -noins de 0,10; de tétracycline.
'nctivit iupineritp- avec la concentration de la. tAtrAc".rcU Yle. L:"1 rrC'17c,rt:j.n?1 d3acen'L. petit peut attei.nd.re 10' ou 5.,;f, ou iai<ne <1::1v':nt.;:lC1'('! de 1" substance :.:r}'11ini.strf.e. Par eyerJ1ple, des co,"- t';';t'e peuvent, 41;re px'T)-3T'^r F'v'3c une 111'r"),",(")Y'tirn nE?71 iYn1')nrt'Y1t-,('! tir' ,1il1Jynt et 17.213 ;')rte proportion ,,:> ';;i¯F:r9 active, f)t:'>'1 ('nl- primé;; (,,'lnt'W;1>'t "': l'J ±? 103a '1:'1'" t"tllÎ' jrf:1,i"fl nrnrlron [-"jY1t r"' t=f ;it j¯n, . ' 1 1,t 1J1'i1..". r, , - c' ?'j'3 ei' ' (,1,;1 T" :l1tjro"f ;.nlidr> t'-i1 j ,' :)'''11. '''Lrn 1;n:"> 1"""I",'1,t")'''' C"1,("qY',prt ,ie j 1 i,ét rar>ycl 1 pu,", p2.)' 0Àr /.'"' '''" '1,1 lé' ;--'11', ", n" 1 î';111T'nl;') 'ans ..:'
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capsule de gélatine.
La solubilité de la ttracycline dans l'eau entre le
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pH 5 et le pH 7 est très faible (a-Dnro7i!n,-tive-lient O,ß. mg,/cm3': L'addition de chlorure de calciuri, nar exemple le.(' en Doids/volu e permet d'obtenir des solutions beaucoup plus concentrées avant une solubilité dépassant 5 mg/cm3, par exemple au pH 6 ou dans la gamme de pH 5 à 7. Ces solutions sont très visqueuses, mais la viscosité peut être modifiée par réglage du pH dans la gamme de forte solubilité* Des solutions ou suspensions stables con- tenant plus de tétracycline sont ainsi facilement obtenues et
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ont une grande utilité dans les compositions 1Jh.arniaceutiaues.
Les solutions aqueuses très concentrées de tétracycline contenant plus de 20 mg/cm3 au pH 3,5 à 9 et convenant pour l'ad- ministration par voie buccale et parentérale sont obtenues en mélangeant de la tétracycline, un sel de métal lourd non toxique, par exemple le sulfate d'aluminium et de l'acide tartrique ou des agents de chélation semblables comme l'acide citrique,
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l'acide pthylènediamine-tptra-acétique, l'acide gluconique et l'acide phytique.
Par métal lourd, on entend ici tout autre métal que les métaux alcalins; c'est ainsi oue les métaux alcalino-terreux comme le calcium sont compris dans cette défi- nition des métaux lourds- Une composition semblable, d'utilité
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et de qolubilit4 comparables, peut être nr6 parôe en -A41anpeant un agent de chlation et un sel de 1n;tal lourd de ttracycl l11P-, Bien que différentes formes de l'invention aient ('tir" f. =:-:ritp-s en dntail, on comprendra oue des I1.o ifications peuvent $tre annortes aux 1Jroc<?dés décrits et aux nroduits sans portir du cadre de l'invention.
Certains ¯agents, composés ou -.ni (par -les acides, des milieux, des solvants, etc.)
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,t '7¯t: e:s c1.'t;::ils -7onn's nJar l'un ou l'autre e;:?-nle nu '1'Y'""i r.ti::m ":1roc.'js ":1-';UV?"t qtre lltj 1 iss 00111' d' :1u.tr'1 ,?;= t.---.¯.. n1J ' r] t: w ¯