Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin Das Hauptpatent betrifft ein Verfahren zur Her stellung von Tetracyclin, bei welchem man in einer Nährlösung eine Tetracyclin produzierende Strepto- myces-Art kultiviert und sodann das so erzeugte Tetracyclin aus der Fermentationslösung abtrennt. Die Abtrennung des Antibiotikums kann nach den Angaben in der Hauptpatentschrift z.
B. derart durch geführt werden, dass es mit wasserunlöslichen orga nischen Lösungsmitteln, wie Butanol oder höheren Ketonen, aus der Fermentatiönslösung extrahiert und aus dem Extrakt durch Zugabe eines niederen Kohlen wasserstoffs ausgefällt wird, oder dass man das Anti biotikum aus der Fermentationslösung an Kieselsäure adsorbiert und daraus durch Eluieren gewinnt.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Ver fahren zur Herstellung von Tetracyclin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Tetracyclin pro duzierenden Streptomyces-Stamm in einer wässerigen, assimilierbaren Stickstoff und Kohlenhydrat enthal tenden Nährlösung submers und unter aeroben Be dingungen kultiviert, und das entstandene Tetracyclin durch Alkalischstellen der Lösung ausfällt bzw. aus der alkalisch gestellten Lösung extrahiert.
Das Tetra- cyclin kann nachträglich gegebenenfalls mit Säure in ein Salz übergeführt werden.
Es empfiehlt sich, der Nährlösung Spuren von bestimmten Schwermetallsalzen zuzusetzen, wie sie in dieser Menge öfters in rohen, natürlichen Nährmedien, wie z. B. Kornpresssaft, gefunden werden. Sofern solche Komponenten in den Nährmedien nicht schon anderweitig enthalten sind, ergibt der Zusatz dieser Salze erhöhte Ausbeuten an Tetracyclin. Hierbei emfiehlt es sich, so viel Mengen, Kupfer und insbe sondere Zink zuzusetzen, dass in den Nährmedien insgesamt mindestens 0,000331/o Mangan als MnC12 - 4H20, 0,
000331/o Kupfer als CUS04 - 5H20 und 0,00033 0/9 Zink als ZnS04 * 7 H20 enthalten sind.
Man kann z. B. die Fermentationslösung auf einen pH-Wert im Bereich von 8 bis und mit 11 einstellen und das hierbei ausfallende Gemisch von Mycelium und Tetracyclin durch Filtration abtrennen. Man kann auch die Fermentationslösung zunächst auf einen pH-Wert unter 3 ansäuern, hierauf kann das Mycel abfiltrieren und schliesslich das Filtrat in der oben beschriebenen Weise weiter behandeln. Zum Alkalischstellen eignet sich jedes Alkali genügender Stärke. Vorzugsweise aber werden Ammoniak und Natriumhydroxyd verwendet.
Als besonders geeignet hat sich der pH-Bereich von 9-10 erwiesen. Für eine allfällige Weiterbehandlung kann das gefällte Tetra cyclin in Lösung gebracht werden, indem man es (gegebenenfalls in Gegenwart des Mycels) mit Säure bei einem PH-Wert unter 3 behandelt oder mit Alkali bei einem PH-Wert über 11. Hierzu eignet sich bei spielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Salpetersäure. Dieselben Säuren eignen sich auch dazu, um den PH-Wert der Fermentationslösung unter 3 einzustellen, wobei sich insbesondere ein pH-Wert von 2,0-2,5 empfiehlt.
Hierbei ist das Tetracyclin als Salz in Lösung und kann durch Filtration vom festen Mycelium abgetrennt werden, bevor die oben beschriebene alkalische Fällungsmethode angewendet wird.
<I>Beispiel 1</I> Eine Fermentationslösung von Streptomyces BL 456667, die im Plattentest gegen S. Aureus un verdünnt den Wert 20,1 mm und dreimal verdünnt den Wert 15,0 mm ergab, wurde mit Natriumhydr- oxyd auf ein pH von 9,25 eingestellt und mit 205 ml n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wurde ab getrennt und durch Zugabe von Wasser und Salz- säure auf pH 7,30 eingestellt.
Nach Abdestillieren des Butanols im Vakuum verblieb ein wässeriges Konzen trat von Tetracyclin, das mit Wasser auf 21 ml ver dünnt, den Testwert 18,0 mm ergab und aus dem 93 mg festes Tetracyclin gewonnen wurden. Letzteres zeigte gegen S. Aureus bei einer Konzentration von 1 mg pro ml den Testwert 19,3 mm.
Das Rf-Spektrum dieser Probe von Tetracyclin wurde in der in der Hauptpatentschrift beschriebenen Weise bestimmt, wobei S. Aureus zum Test benützt wurde.
Das Lösungsmittelsystem 7 bestand aus 809/oigem Methanol, welches 2 9/o Piperidin, 2 9/o p-Toluolsulfo- säure und 2 9/o Laurinsäure enthielt. Das Lösungs- mittelsystem 8 bestand aus Pyridin, das 19/o Wasser, 19/o p-Toluolsulfosäure und 1 9/o Laurinsäure enthält. Die Zusammensetzung der übrigen Lösungsmittel systeme A-G ist aus der Hauptpatentschrift ersicht lich.
EMI0002.0027
Probe <SEP> Lösungsmittelsystem
<tb> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> G
<tb> a, <SEP> Rf-Wert <SEP> <B>6,7</B> <SEP> 6,7 <SEP> 4,5 <SEP> 1, <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 9, <SEP> 10 <SEP> 8
<tb> b, <SEP> R,-Wert <SEP> 6 <SEP> 6,7 <SEP> 4,5 <SEP> 2, <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> <B>9,10</B> <SEP> 7 <I>Beispiel 2</I> Aus Fermentationslösung von Streptomyces BL 567201 wurden verschiedene Fraktionen von Tetra- cyclin in folgender Weise hergestellt:
Zur genannten Fermentationslösung (570-1080 1) wurden 285 bis 532 g Calciumchlorid und 190-4551 feuchtes n-Bu- tanol zugefügt. Der pH-Wert der Lösung, der nach der Fermentation zwischen 4,9 und 5,5 lag, wurde mit 509/oiger Natronlauge (4-10,5 1) auf 8,35 bis 8,8 eingestellt. Nach kräftigem Durchrühren ergab sich eine Emulsion, die durch Filtrieren mit Diatomeenerde abgetrennt wurde.
Die Butanolphase, welche das Tetracyclin enthielt, wurde hiernach ab getrennt (380-465 1) und auf ein Volumen von 2,5-7,01 durch Vakuumdestillation eingeengt, wobei Flüssigkeitstemperaturen unterhalb 38 C und Drucke unter 35 mm eingehalten wurden.
Die Butanolkonzentrate mit einem PH-Wert von ungefähr 7,0 bis 7,5 wurden dreimal mit gleichen Volumina Wasser, dessen pH mit Schwefel- oder Salz säure auf 2,0 eingestellt worden war, extrahiert. Die wässerigen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzsäure auf<I>PH</I> 1,5 eingestellt, 1-29/a Aktivkohle darin auf geschlemmt, filtriert und das Filtrat auf ungefähr 1/" seines Volumens durch Vakuumdestillation einge engt. Der PH dieses wässerigen Konzentrates wurde hierauf auf mit Ammoniak ungefähr 6,0 eingestellt, wodurch Tetracyclin ausfiel.
Letzteres wurde abfil- triert. Eine zweite Fraktion Tetracyclin ergab sich in den meisten Fällen, indem das Filtrat erneut auf ungefähr 1/, eingeengt wurde.
Die verschiedenen Tetracyclinfraktionen, die in der oben beschriebenen Weise erhalten worden waren (63 g), wurden vereinigt und in 630 ml Wasser, des sen pH mit Salzsäure auf 1,5 eingestellt worden war, gelöst. Nach Filtrieren dieser Lösung wurden dersel ben 63 g Äthylendiamintetraessigsäure zugegeben.
Hierauf wurde mit Ammoniak der pH-Wert auf 6,0 eingestellt und das ausgefallene Tetracyclin (30 g) abfiltriert, im Vakuum über Phosphorpentoxyd ge trocknet und hierauf zweimal in 120 ml Methanol aufgeschlemmt, wobei 14,5 unlösliches Material ver- blieb, welch letzteres verworfen wurde. Die Methanol lösungen wurden vereinigt und in 400 ml Wasser auf gelöst.
Aus der wässerigen Lösung fiel Tetracyclin beim Stehenlassen über Nacht in einem kalten Raum aus; es wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet (8,9 g in zwei Fraktionen).
Dieses Tetracyclin wurde in wässeriger Lösung bei einem pH von 1,5 mit Kohle behandelt, die Lö sung filtriert und das Tetracyclin durch Steigerung des pH-Wertes auf 3,5 mit Ammoniak ausgefällt. Das Tetracyclin (6,9 g) wurde in 34,5 ml Wasser, dessen pH mit Salzsäure auf 1,5 eingestellt worden war, ge löst, die Lösung mit Ammoniak auf pH 3,5 eingestellt und geimpft, worauf das Hydrat der Tetracyclinbase langsam auskristallisierte und durch Filtration abge trennt wurde (6,45 g).
Nach Lufttrocknung ergab die Verbindung einen Schmelzpunkt von ungefähr 171,5 bis 173,5 C. Die Prüfung durch Ultraviolettanalyse ergab einen Gehalt von 89 9/0 (basierend auf 100 9/0 Tetracyclin-hydrochlorid oder 96,4% Tetracyclin-tri- hydrat). Im biologischen Versuch gegen B. subtilis auf Platten beim pH 8,0 ergab sich ein Gehalt von 89,29/o reine Substanz.
Es erwies sich frei von Chlortetra- cyclin und Oxytetracyclin oder anderen Verunreini gungen, wie sich im Versuch mit der Papierstreifen- Chromatographie ergab. Die kristalline Tetracyclin- hydratbase enthielt 19,2 9/a Feuchtigkeit und wurde nach dem Trocknen analysiert.
Hierbei ergab sich:
EMI0002.0097
Berechnet <SEP> für <SEP> CzzH2408N,: <SEP> gefunden:
<tb> C <SEP> 59,45; <SEP> 59,6;
<tb> H <SEP> 5,44; <SEP> 5,45;
<tb> N <SEP> 6,30; <SEP> 6,29. Die Auflösung der kristallisierten Tetracyclinbase in Mineralöl (Nujol) ergibt verschiedene charakte ristische Absorptionsbanden im Infrarot. Darunter befinden sich die folgenden Frequenzen (in cm-')- 3490, 1672, 1607, 1524, 1259, 1222, 1130, 1065, 1040, 990, 963, 948, 932, 861, 838, 803, 786, 741, 739 und 668.
Die kristallisierte Tetracyclinhydratbase (2 g) wurde in 20 ml n-Propanol, welches ungefähr 0,5 ml konzentrierte Salzsäure enthielt, aufgelöst. Nach 30 Minuten Stehenlassen bei Raumtemperatur und 90 Minuten in der Kälte fiel kristallisiertes Tetra- cyclin-hydrochlorid aus, welches abfiltriert wurde (1,5 g). Es zeigte einen Schmelzpunkt von 217 bis 219 C unter Zersetzung.
EMI0003.0007
Analyse:
<tb> berechnet <SEP> für <SEP> C22H2408N2 <SEP> * <SEP> HCL: <SEP> gefunden:
<tb> C <SEP> 54,9; <SEP> 55,0;
<tb> H <SEP> 5,03; <SEP> 5,2;
<tb> N <SEP> 5,83; <SEP> 5,99;
<tb> Cl <SEP> 7,38; <SEP> 7,5.
Eine Lösung dieser Substanz in Mineralöl (Nujol) zeigt verschiedene charakteristische Absorptionsban den im Infrarot. Hierunter befinden sich die folgen den Frequenzen in cm-': 3340, 1678,<B>1623,</B> 1597, 1315, 1248, 1229, 1175, 1140, 1061, 1036, 1002, 964, 949, 864, 823, 796, 781, 743, 719, 692 und 667. <I>Beispiel 3</I> Eine einfache Methode zur Isolierung des Tetra- cyclins aus den Fermentationslösungen ohne Verwen dung grosser Volumina von Lösungsmittel zur Extrak tion besteht im folgenden Verfahren: Die Lösung wird durch Zugabe von Alkali auf pli 9-10 eingestellt und filtriert.
Im Filtrat bleiben weniger als 100 y Tetracyclin pro ml gelöst. Das Filtrat wird verworfen. Die Mischung aus Mycelium und ausgefälltem Tetracyclin, sowie weiteren Bestand teilen der Fermentationslösung, eignet sich in dem Zustand, wie sie anfällt, oder nach dem Trocknen als tierisches Futter oder Futterbeigabe. Das Filtrat, das wenig Tetracyclin, aber grosse Mengen wert voller Futterstoffe (wie z. B.
Proteine, Kohlehydrate, Mineralstoffe, Pigmente und insbesondere den Vitamin B-Komplex, ferner nicht identifizierbare Stimulanzien für das tierische Wachstum) enthält, kann ebenso zu tierischem Futter, insbesondere sol chem pflanzlichen Ursprungs, zugesetzt werden, und zwar vor oder nach seiner Konzentrierung oder Trocknung.
Der Wert solcher tierischer Futter oder Futterbeigaben sowohl aus der Fällung als aus dem Filtrat kann durch Zugabe löslicher Kobaltsalze vor der Fermentation gesteigert werden, wobei ungefähr 0,l-20 Teile Kobaltnitrat pro Million Teile Nähr medium zugegeben werden, ferner durch Zugabe einer das Cyanid-Ion liefernden Substanz, wie eines Alkalicyanids oder eines Alkaliferrocyanids oder von Ferricyanid, in einem Betrag von 0,1-l00 Teile pro Million der Nährlösung.
Das feste Mycelium und das daran adsorbierte Tetracyclin können auch bei niedrigem pH-Wert, z. B. bei PH = 1,5, mit kleinen Volumen wässeriger Säuren, z. B. von Schwefelsäure oder Oxalsäure, extrahiert werden, wobei eine Lösung erhalten wird, die mindestens 3000 y pro ml Tetracyclin enthält.
Dieses Tetracyclin kann isoliert werden, indem man die Säurelösung auf pH 4-10, vorzugsweise auf wenigstens pH 6 einstellt, wobei festes Tetracyclin in Form seiner Base oder als Calciumsalz ausfällt. Es hat eine Wirksamkeit von mindestens 100 y pro mg.
Nach einem andern Verfahren kann man auch die saure Lösung auf PH 9-10 einstellen, mit ungefähr einem Drittel Volumen an n-Butanol extrahieren und den Butanolextrakt auf ungefähr ein zwanzigstel seines Volumens einengen, wobei Tetracyclin in Form der Base oder des Calciumsalzes ausfällt. Seine Wirksam keit beträgt mindestens 200 y pro mg.