Verfahren zur Darstellung eines Doppelsalzes des Streptomycins. Die Erfindung betrifft die Herstellung neuer, therapeutisch wertvoller, kristallisier ter komplexer Salze aus Streptomycinsalzen und anorganischen Salzen, speziell Erdalkali- halogeniden.
Es wurde von Schatz, Bugie und Waks- man [Proe. Soc. Exp. Biol. & Med. 55, 66-69 (1944) ] gezeigt, dass die Streptomy ein ge nannte Substanz aus bei der Züchtung des Mikroorganismus A. griseus erhältlichen Ver arbeitungsprodukten durch Adsorption an aktivierte Kohle und nachfolgendes Eluieren mit einem sauren Lösungsmittel gewonnen.
werden kann, in ähnlicher Weise, wie dies für die Herstellung von Streptothricin bekannt ist [Proc. Soc. of Exp. Biol. & Med. 49, 207 bis 212 (1942) ]. Produkte, wie Streptomycin- ehlorhydrat, welche auf diese Weise erhalten werden, entstehen in der Form von rohen Konzentraten mit einer Wirksamkeit, welche allgemein unter 50 Einheiten/mg liegt.
(Eine Einheit der Wirksamkeit ist hier diejenige Menge des Materials zu verstehen, welche das Wachstum eines Standard-Stammes von Eshe- richia coli in einem em3 eines geeigneten Kulturmediums verhindert.
Eine Einheit des Streptomycins, wie sie durch dieses Verfahren bestimmt ist, stellt ein Mikrogramm reines Streptomycin dar.) Konzentrate von bedeutend erhöhter Wirksamkeit können durch selektive Adsorp- tion gemäss dem in der schweizerischen Pa- tentschrift Nr.260202 beschriebenen Verfah ren erhalten werden. Ferner ist ein Verfahren zur Herstellung des kristallisierten Helian- thinsalzes des Streptomycins bekannt.; vgl.
Kuehl, Peck, Walti und Folkers [Seience Bd. 102, Seiten 34-35 (1945) ]. Durch das genannte Adsorptionsverfahren oder durch Rüekverwandlung des Helianthinsalzes in das chlorwasserstoffsaure Salz können Präparate von recht grosser Reinheit und mit einer Wirksamkeit von 600 und mehr der genann ten Einheiten pro mg erhalten werden.
Diese Produkte stellen jedoch noch keine chemi schen Individuen dar, die eine Standardisie rung nur durch rein chemische Versuche er möglichen, so dass sie jeweils durch Proben auf ihre physiologische Wirksamkeit hin standardisiert werden müssen.
Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass gewisse Salze anorganischer Säuren, ins besondere Erdalkalihalogenide, sieh mit Salzen des Streptomycins und einer Säure zu kri stallisierten Doppelsalzen verbinden können. Diese komplexen Salze haben eine grosse Wirksamkeit und können durch Umkristalli sation in angenähert reiner Form erhalten werden. Die anorganische Komponente des Komplexsalzes, welche natürlich nichttoxisch sein soll, beeinträchtigt den therapeutischen Wert des Produktes nicht. Dadurch wird zum erstenmal Streptomycin in einer Form er hältlich, welche nicht nur wertvolle therapeu tische Eigenschaften besitzt, sondern auch in praktischer Weise hergestellt und dosiert werden kann.
Bei der Herstellung komplexer Strepto- mycinsalze gemäss der Erfindung werden zweckmässig Salze des Streptomycins von mässig hoher bis hoher Wirksamkeit verwen det, das heisst Salze, welche eine Wirksamkeit in der Grössenordnung von 300 Einh/mg oder mehr aufweisen. Salze mit einer Wirksamkeit unter etwa 300 Einh/mg sind im allgemeinen so unrein, dass es schwierig oder unmöglich ist, ein kristallisertes Komplexsalz zu ge winnen.
Unreine Salze dieser Art können leicht durch eine oder mehrere Behandlungen mit Tonerde gereinigt werden, wie dies in dem erwähnten Aufsatz von Kiiehl, Peck, -Valti und Folkers beschrieben ist, so dass man ein Produkt mit einer Wirksamkeit von mehr als 300 Einh/mg erhält.
Die Einwirkung der Streptomycinsalze auf Erdalkalihalogenide erfolgt zweckmässig in Gegenwart eines organischen Lösungsmit tels oder dessen Mischung mit Wasser, worin sowohl das Streptomycinsalz und das Erd- alkalihalogenid wie auch das entstehende Komplexsalz gut löslich sind (es sollte z. B. jede dieser Substanzen in 1-10 Teilen des Lösungsmittels löslich sein). Ein allzu grosses Lösevermögen des Lösungsmittels für das Komplexsalz ist nicht vorteilhaft, weil dann das Auskristallisieren Schwierigkeiten be reitet.
Es wurde gefunden, dass Methanol allein als Lösungsmittel sehr gut geeignet ist. Als Lösungsmittelmischungen kommen insbeson dere Äthanol-Wasser und Methanol-Äthanol, im Verhältnis von ungefähr 1 : 2 bzw. 5 : 4 in Betracht. Ferner können auch z. B. Propanol, Isopropanol usw. entweder in Mischung mit Wasser oder Methanol verwendet werden.
Zur Isolierung des gebildeten Komplex salzes aus dem Lösungsmittel kann man einen Teil des Lösungsmittels, zweckmässig bei ver ringertem Druck, verdampfen oder die Lös lichkeit des komplexen Salzes dadurch ver ringern, dass man der Lösung des komplexen Salzes ein zweites Lösungsmittel zufügt, wel ches mit dem schon vorhandenen Lösungs- mittel mischbar ist, und in welchem das kom plexe Salz nur wenig löslich ist. Beispiels weise ist ein Teil der Streptomycinchlor- hydrat-Calciiimchlorid-Verbindung in etwa fünf Teilen Methanol löslich, dagegen erst in 100 Teilen Äthanol.
Durch Zufügen von einem oder mehreren Volumenteilen Äthanol zu einer Lösung des Komplexsalzes in Metha nol, zweckmässig unter Erwärmen der Me- thanollösung auf etwa 50 oder 60 C, wird die Löslichkeit des Komplexsalzes in dem Lö sungsmittel erheblich herabgesetzt, so dass das Komplexsalz ohne Verdampfen des Lösungs mittels auskristallisiert. Das nach einer der v orbeschriebenen Arten erhaltene Komplex salz kann dadurch bequem gereinigt -werden, dass man es in einem Lösungsmittel, welches nicht notwendigerweise das gleiche sein muss, wie .das zuerst verwendete, löst und das Pro dukt daraus umkristallisiert.
Als Ausgangsstoffe können verschiedene Salze des Streptomycins verwendet werden. Halogenwasserstoffsaure, z. B. ehlorwasser- stoffsaure, bromwasserstoffsaure und jod- wasserstoffsaure Salze, sind am geeignetsten, obwohl andere Salze, insbesondere das Helian- thinsalz, ebenfalls verwendet werden können. Die Einwirkung dieser Salze auf Erdalkali- halogenide, z.
B. Calciumehlorid, Caleium- bromid, Strontiumchlorid usw., erfolgt vor teilhaft in der Weise, dass man die Substan zen bei Raumtemperatur mit einem Lösungs mittel der erwähnten Art mischt.
Bei Verwendung von halogenwasserstoff- saurem Streptomycin und Erdalkalihalogen- iden geht man z. B. wie folgt vor: Die Aus gangsstoffe werden dem Lösungsmittel unter Rühren zugefügt, und zwar so, dass eine vollkommene Lösung erzielt wird. Die Lösung wird dann auf ein solches Volumen eingeengt, dass Kristallisation des Komplexsalzes ein tritt.
Die Kristallisation erfolgt im allgemei nen dann, wenn der Gehalt der Lösung an festen Stoffen 10-40J beträgt, je nach dem verwendeten Lösungsmittel. Die Einengung kann in einem Exsikkator bei verringertem Druck (0,5-0,75 at) über Calciumehlorid oder durch andauerndes Evakuieren erfolgen. Die beste Kristallisation wird durch lang sames Verdampfen bei einem Druck von 0,5 bis 0,75 at erhalten, jedoch beeinträchtigt eine schnellere Einengung bei einem Druck von 30 mm Quecksilber oder darunter die Ausbeute und die Qualität des erhaltenen Komplexsalzes nicht.
lach dem Einengen lässt man die Lösung des Komplexsalzes stehen, um eine maximale Kristallbildung zu erhalten. Die Kristalle werden dann abfiltriert, mit geeigneten Lö sungsmitteln, beispielsweise Methanol oder einer Metlianol-Äthanolmischung und darauf mit Äthanol, gewaschen und getrocknet. Die Mutterlauge kann noch weiter eingeengt wer den, um zusätzliche Mengen des Komplex salzes zu erhalten. Wenn die so gebildeten Kristalle bei 25"C im Vakuum getrocknet werden, enthalten sie etwas Kristallalkohol. Wenn sie jedoch bis zur Gewichtskonstanz bei 100"C im Vakuum getrocknet werden, wird der Kristallalkohol entfernt, und es ent steht reines Komplexsalz.
Die Komplexsalze sind sehr hygroskopisch, und es ist daher schwierig, charakteristische Schmelzpunkte zu erhalten. Die Schmelz punkte scheinen in der Grössenordnung von 200 C (unter Zersetzung) zu liegen. Die Komplexsalze sind jedoch optisch aktiv, so dass die optische Drehung als gutes lIass für die Reinheit dienen kann.
So hat die reine Streptomycinchlorhydrat-Calciumchlorid-Ver- bindung nach Umkristallisation aus Methanol Äthanol und Trocknen bei 100 C im Vakuum eine Drehung (a) D = -77 (c = 0,882 % in Wasser) und eine Wirksamkeit von unge fähr 750 Einh/mg. Die Strukturformeln des Streptomyeins und des Chlorhydrat-Calcium- chlorids sind noch nicht. bekannt. Dem letz teren Komplexsalz wird aber folgende Brutto formel zugeschrieben: (Cz1Hs"N;Olz . 3HCl)_ . CaCL.
Für diese Formel betragen die berechneten Werte 0=33,799,; <B>H-=5,67%; N=13,14%;</B> Cl =19,00 % und Ca = 2,68 %. Durch Ana lyse eines Präparates wurde gefunden: C = 33,67 % ; H = 5,79 % ; N = 13,13 % ; Cl =19,48 % und Ca = 2,87 %. Wenn man von Heliantliinsalz des Strepto- 3nycins ausgeht, so kann man diese Substanz mit einer solchen Menbe z.
B. von Calciumchlo- rid zusammenbringen, welche genügt, um zu nächst eine doppelte Umsetzung von unlösli chem Helianthincalcium und Streptomycin- chlorhydrat zu bewirken und darauf die Cal ciumchlorid-Verbindung zu bilden. Das un lösliche Helianthincalcium kann abfiltriert werden, worauf dann das Filtrat auf ein ge eignetes Vohimen eingedampft werden kann, um das Komplexsalz in der beschriebenen Weise auszukristallisieren.
Die Bildung des unlöslichen Helianthincalciums scheint durch Zusatz von Salzsäure bis zu einem PH von angenähert 4 verlangsamt zia werden.
Gegenstand des Patentes ist ein Verfahren zur Darstellung eines Doppelsalzes des Strep- tomycins, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Calciumchlorid und Strepto- mycinhydrochlorid in einem Lösungsmittel für diese beiden Stoffe aufeinander ein wirken lässt und aus der Lösung die ent standene Streptomycinhydroehlorid-Calcium- chlorid-Verbindung auskristallisieren lässt.
Die Abscheidung des komplexen Salzes kann dadurch bewirkt werden, dass man einen Teil des Lösungsmittels verdampft oder ein damit mischbares Lösungsmittel zufügt, in welchem das komplexe Salz nur wenig löslich ist.
<B>Zur</B> Darstellung der neuen Verbindung kann man auch Streptomycinhydrochlorid einwirken lassen, welches in Gegenwart des Chlorcalciums aus einem andern Salze des Str eptomy eins erzeugt wurde. Beispiel <I>1:</I> Zu etwa 2,0g Streptomycinchlorhydrat , mit einer Wirksamkeit von etwa 315 Einli/mg werden etwa 1,5 g Calciumchlorid und etwa. 10 cm3 Methanol zugefügt.
Die entstandene klare Lösung wird nach Impfen mit einem kleinen Streptomycinehlorhydrat - Calcium - s chlorid-Kristall über Caleiumchlorid bei etwas verringertem Druck (etwa =/3 at) langsam verdampft. Nach Stehenlassen über Nacht werden die ersten ausgeschiedenen Kristalle nach üblichen Methoden abgetrennt und bei 25 C im Vakuum getrocknet.
Das so erhaltene Komplexsalz hat eine Drehung (a)" =-69 <B>(e</B>=<B>0,97%</B> in Wasser) und in vitro eine Aktivität von ungefähr 630 Einh/mg.
<I>Beispiel 2:</I> Zu etwa 1,31 g Streptomy cinchlorhydrat mit einer Wirksamkeit von etwa 800 Einh/mg werden etwa 4,0 cm3 Methanol und etwa 609 mg Calciiunchlorid zugefügt. Die ent- stehende Lösung wird filtriert und über Cal ciumchlorid unter etwas verringertem Druck (=/3 at) langsam verdampft.
Die erste beim Stehenlassen über Nacht gebildete Menge Kristalle wird nach üblichen Verfahren iso liert, und eine zweite Menge Kristalle wird nach weiterem Verdampfen der Mutterlauge isoliert. Die erhaltene Streptomycinchlor- hydrat-Calciiunchlorid-Verbindung hat fol gende physikalische Eigenschaften: <I>Beispiel 3:</I> Zu etwa 5,0 g Streptomycin-Helianthin- salz, gelöst in etwa 150 cm3 Methanol, werden etwa 1,2 g Calciumchlorid, gelöst in etwa 25 cm@ Methanol, zugefügt.
Die Lösung wird erwärmt und durch aktivierte Holzkohle El triert, um das bei der Reaktion gebildete He lianthincalcium zu entfernen. Das klare, farb lose Filtrat wird unter verringertem Druck (0,5 bis 0,75 at) auf ein Volumen von etwa 10 bis 15 cm3 eingeengt, wobei sich ein kri stallisierter Niederschlag ausscheidet.
Dieses kristallisierte Produkt wird abfiltriert, nach- einander mit kleinen Mengen Methanol, einer Methanol-Äthanol-Mischung 1 : Lund Äthanol gewaschen und im Vakuum über Phosphor- pentoxyd bei Raumtemperatur getrocknet.
Die so erhaltene Streptomycinchlorhydrat- Calciumchlorid-Verbindung hat eine Drehung (a) D = -76 (c = 1,0 % in Wasser) und in vitro eine Aktivität von .
etwa 750 Einh/mg. Eine weitere Einengung der Mutterlauge be wirkt die Ausscheidung einer zweiten Menge Kristalle, welche nach Isolierung in .der oben beschriebenen Weise eine Drehung (a) D = -74n (c = 1,0% in Wasser) und in vitro eine Aktivität von etwa 730 Einh/mg auf weisen.
Zusätzliche kleine Mengen des kristal lisierten Komplexsalzes werden durch Ein engung der Mutterlauge der zweiten Kristalli sation erhalten. Das Komplexsalz kann wie folgt gereinigt werden: Die beiden ersten Kristallfraktionen werden zusammen wieder in etwa 25 cm3 heissem Methanol (50-60 C) gelöst, abfil- triert, auf das halbe Volumen eingeengt und mit 10 cm3 Äthanol verdünnt. Nach Impfen scheiden sich langsam Streptomycinchlor- hydrat-Calciumchlorid-Kristalle aus.
Man lässt die Kristallbildung etwa 3 Tage andauern. Das so gebildete kristallisierte Produkt wird abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und im Vakuum bei 100 C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Dieses angenähert reine Komplex- salz hat eine optische Drehung (a) D =-77 (c = 0,82% in Wasser), eine Wirksamkeit von etwa 750 Einh/mg,
und schmilzt bei etwa 200 C unter Zersetzung (die Bestimmung des Schmelzpunktes ist schwierig und die Re sultate sind infolge der sehr hygroskopischen Beschaffenheit des Komplexsalzes umsicher. Durch Analyse wurde gefunden, da.ss es 33,67 % C, 5,79 % H, 13,13 % N, 19,48 % Cl und 2,87 % Ca enthält, was den aus der Bruttoformel (C21H3@N7O12 . 3HC1)2 .
CaCI, berechneten Werten 33,79 % C, 5,67 % H, 13,14 % N, 19,00 %. Cl und 2,68 % Ca gut ent spricht.
Ähnliche Resultate wurden erhalten durch Auflösen des erhaltenen Komplexsalzes in. Mi schungen von 1 Teil Wasser und 9 Teilen Methanol, 1 Teil Wasser und 4 Teilen Äthanol
EMI0004.0106
<B>25</B> <SEP> Wirksamkeit
<tb> 0 <SEP> 0
<tb> a) <SEP> D <SEP> Einh <SEP> 1/p <SEP> N <SEP> /o <SEP> Ca
<tb> #
<tb> Fraktion <SEP> I <SEP> -7311 <SEP> (e=1,47 <SEP> in <SEP> Wasser) <SEP> 747 <SEP> 12,56 <SEP> 3,78
<tb> Fraktion <SEP> 1I <SEP> -71' <SEP> <B>(c=:
0,593</B> <SEP> in <SEP> Wasser) <SEP> 730 <SEP> 12,52 <SEP> 3,92 oder andern 3Iischungen niedriger al.iplia- tischer Alkohole mit Wasser, in welchen das Komplexsalz gut löslich ist, und Umkristalli- sieren des Komplexsalzes in der vorher be schriebenen Weise.
Beispiel -1: Etwa 30 g Streptomy eiii-Helianthinsalz werden in etwa 900 cm: auf etwa 50-60" C erwärmtem Methanol gelöst. Der warmen Lö sung wird eine Lösung von 7,2 g Calcium- ehlorid in 50 ein" Methanol zugefügt.
Hierauf werden etwa drei Tropfen konzentrierte Chlorwasserstoffsäure zugefügt, um das pii auf etwa 4- einzustellen, und die Mischun- wird dann dureli aktivierte Holzkohle fil- triert. Das Filtrat wird dann in einem Va- kuumkonzentrator bei einem Druck von etwa 30 min Quecksilber auf ein Volumen von etwa 75 ein:' eingeengt und bei Raumtemperatur stehengelassen. Innerhalb kurzer Zeit schei den sich nadelförmige Kristalle aus.
Nach Stehenlassen über Nacht wird das gebildete Streptomvcinchlorhydrat-Calcitimchlorid ab filtriert Lind getrocknet. Ausbeute 9,2 g. Die Mutterlauge wird auf ein Volumen von etwa 30 enr; eingeengt. Beim. Stehenlassen erhält man eine zweite Menge Kristalle von 2,3 g. Eine weitere Menge von 1,1 -Kristallen wird durch Einengen des zweiten Filtrats erhalten.
Im naelistelienden sind die Daten der ersten beiden Kristallfraktionen naeli Trocknen bei 100" C im Vakuum angegeben:
EMI0005.0033
Gewicht <SEP> Wirksamkeit <SEP> (a) <SEP> D <SEP> Analyse
<tb> Ausbeute <SEP> g <SEP> Einh/mg <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> C <SEP> H <SEP> N
<tb> I <SEP> 9,2 <SEP> 753 <SEP> -761) <SEP> 33,73 <SEP> 5,78 <SEP> 13,18
<tb> <B>11</B> <SEP> 2,3 <SEP> 756 <SEP> -76" <SEP> 33,67 <SEP> 5,77 <SEP> 12,94