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Verfahren zur Reinigung roher Folinsäure bzw. ihr verwandter Säuren
Die biologisch und therapeutisch wertvolle Folinsäure, auch Pteroylglutaminsäure
oder N-[4'-(2-Atn ino- 6- oxy- 8-metliv 1- pyrimidino-d., 5-pyrazyl) -aminobenzoyl]-glutaminsäure
genannt, wird nach bekannten Verfahren synthetisch hergestellt. Dabei treten zahlreiche
Nebenreaktionen auf oder schließen! sich an die Hauptreaktion an, wie aus der .Natur
der verschiedenartigen Zwischenprodukte erkennbar ist. Demgemäß enthält das rohe
keaktionsprodukt gewöhnlich eine verhältnismäßig große Menge an unerwünschten Substanzen,
einschließlich nicht zur Reaktion gelangter Zwischenprodukte, Kondensations- oder
Polymer isationsprodukte, Stellungsisomere, Oxydationsprodukte und verschiedene
Hydrolysen- und Zersetzungsprodukte. Viele dieser Produkte enthalten einen Pyrimidinopyrazinkern
und besitzen nahezu dieselbe Löslichkeit und andere physikalische und chemische
Eigenschaften wie die gewünschte Folinsäure. Soweit die letztere als therapeutisches
Mittel verwendet wird, ist es daher wünschenswert, daß die biologisch nicht wirksamen
Pteridine abgetrennt werden.
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Die bisher bekannten Verfahren zur Reinigung der Folinsäure sind kostspielig
oder sehr umständlich und erfordern genaue Handhabung, wenn eine befriedigende Ausbeute
an Pteroylglutaminsätire erzielt werden soll.
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Demgegenüber wurde nun gefunden, daß man auf einfache, wirtschaftliche
und in der Praxis leicht anzuwendende Weise eine Reinigung der Folinsäure und ihr
verwandter Säuren dadurch
erzielen kann, daß man die Rohprodukte
der Säuren zunächst mit einem Alkali- und/oder einem Erdalkalisalz bei etwa pl,
11,5 bis 12,1 behandelt, die unlöslichen Stoffe abfiltriert, das auf p$ 1o,5 bis
11,2 eingestellte Filtrat sodann mit einem löslichen Zinksalz versetzt, filtriert,
das Filtrat,nunmehr auf etwa pl, 6,5 bis 7,o einstellt, das gebildete Zinksalz abfiltriert
und die freie Säure in bekannter Weise zur Abscheidung bringt.
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Erfindungsgemäß ist das Reinigungsverfahren auch auf der Folinsäure
verwandte Säuren anwendbar. Dies sind in erster Linie solche, die den Glutaminsäurerest
in polypeptidartiger Verkettung mehrfach enthalten, z. B. Pteroylglutaminsäure und
Pteroylglutamylglutamylglutaminsäure.
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Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren beruht auf der Löslichkeit
oder Unlöslichkeit der Zinksalze der verschiedenen Pteridine; die im Reaktionsgemisch
der Rohprodukte auftreten. So sind die ZinWalze von einigen unerwünschten Pteiidinen
bei einem p$ von 1o,5 bis 11,2 verhältnismäßig unlöslich, während das Zinksalz der
tPteroylglutaminsäure bei dieser Wasserstoffionenkonzentration verhältnismäßig löslich
ist. Andererseits ist das Zinksalz der Pteroylglutaminsäure verhältnismäßig unlöslich,
wenn der pH-Wert 6,5 bis 7,o beträgt, während andere Pteridine bei diesem pH-Wert
wasserlöslich sind.
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Praktisch arbeitet das vorliegende Verfahren nun so, daß zunächst
eine Vorreinigung der Ausgangsstoffe durch Behandeln mit einem Alkali-und/oder einem
Erdalkalisalz bei etwa p$ 11,5 bis 12,1 vorgenommen wird. Vom Unlöslichen wird hierbei
abfiltriert. Dann wird .das Filtrat mit einem löslichen Zinksalz auf p$ 1o,5 bis
11,2 eingestellt und wiederum filtriert. Darauf wird das Filtrat durch Zusatz von
löslichem Zinksalz oder, falls dieses schon vorher in genügender Menge zugesetzt
worden ist, mit Hilfe anderer sauer reagierender Agentien auf etwa p116,5 bis
7,0 gebracht, wobei das schwerlösliche Zinksalz der Folinsäure oder der ihr
verwandten Säuren ausfällt und durch Filtrieren gewonnen wird.
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Zweckmäßig erscheint es, die Lösung auf 50 bis 95° zu erhitzen,
ehe sie auf pl, 6,5 bis 7,0 eingestellt wird.
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Erscheint dieses Produkt noch nicht genügend rein, so kann man die
vorgenannte Behandlung beliebig oft wiederholen, bis der gewünschte Reinheitsgrad
des Zinksalzes der Folinsäure erreicht ist. Dies führt man zweckmäßig so aus, daß,
die gereinigten Zinksalze durch Alkali- oder Erdalkalizusatz bei 'einem pH-Wert
über 11,5 gelöst werden, z. B. durch Zusatz von Natriumhydroxyd, Calciumhydroxyd
oder Bariumhydroxyd. Das unlösliche Zinkhydroxyd und andere unlösliche Stoffe können
durch Filtrieren entfernt und das Verfahren dann, wie oben beschrieben, wiederholt
werden.
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Wenn die -Reinigung weit genug getrieben ist, ergibt die Behandlung
des Zinksalzes bei einem p[, unter 5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von ungefähr
3, die Ausfällung der freien Pteroylglutaminsäure bzw. ihr verwandter Säuren. Das
Produkt wird dann von der Mutterlauge getrennt und getrocknet oder zu pharmazeutischen
Erzeugnissen verschiedener Art weiterverarbeitet.
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Beispiel i Rohe Pteroylglutaminsäure (erhalten durch Umsetzung von
.2, q., 5-Triamino-6-oxy-pyrimidin, a, ,B-Dibrompropionaldehyd und p-Aminobenzoylglutaminsäure)
wird in Wasser mit Kalk bei 6o° und einem pH-Wert zwischen 11,5 und 12,1 unter Erhalt
einer Konzentration von i g reiner Pteroylglutaminsäure im Liter gelöst. Die Lösung
wird dann zur Entfernung unlöslicher Calciumsalze und einiger Verunreinigungen filtriert.
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Nun wird zu dem Filtrat unter Herabsetzung des pg-Wertes auf einen
Bereich von 1o,6 bis 1o,8 eine 2oo/oige Zinkchloridlösung zugegeben und die Lösung
dann wiederum filtriert, wobei eine klare, gelbe Lösung erhalten wird, die den größten
Teil der ursprünglich angewendeten Pteroylglutaminsäure enthält.
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Die Lösung des Zinksalzes der Pteroylglutaminsäure wird dann mit einer
größeren Menge der Zinkchloridlösung bei 8o° - behandelt, um den pH-Wert auf 6,8
herabzusetzen, bei welchem das Zinksalz aus der Lösung ausfällt.
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Das ausgefällte Zinksalz wird wiederum mit Kalk in Wasser gelöst und
das oben beschriebene Verfahren fünfmal wiederholt. Die endgültige Lösung des.-Zinksalzes
bei einem p$ von 1o,6 bis 1o,8 wird dann mit Schwefelsäure behandelt und auf einen
pH-Wert von ungefähr 3 gebracht, wobei sich 85- bis goo/oige Pteroylglutaminsäure
niederschlägt. Beispiel 2 ioo g nasses Rohmaterial, enthaltend 3 g Pteroylglutaminsäure,
werden in etwas Wasser zu einer weichen Paste angeteigt und dann auf 2ooo ccm verdünnt.
Die Masse wird mit 40 ccm 5 n-Natriumhydroxydlösung behandelt, auf 5o° erwärmt und
dann weiter auf 3400 ccm verdünnt.
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Zu dieser Lösung werden unter starkem Rühren 14g einer 15o/oigen w"aßrigen
Calciumchloridlösung zugesetzt (pH-Wert 11,7). Der dunkle Niederschlag wird durch
Filtrieren .entfernt und auf dem Filter mit kaltem Wasser gewaschen.
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Das Filtrat samt Waschwasser wird dann mit einer ioo/oigen wäßrigen
Zinkchloridlösung versetzt, so daß sich ein pH-Wert von 1o,8 einstellt. Dann werden
2o g Diatomeenerde hinzugefügt; der sich bildende dunkle Niederschlag wird durch
Filtrieren entfernt.
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Das lichtgelb gefärbte Filtrat wird nun mit einer ioo/oigen Bleinitratlösung
versetzt, bis ein pH von 6,8 vorliegt. Nach Zufügen von 40 g Diatomeenerde wird
die Lösung auf So' erhitzt und heiß filtriert.
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Der nasse Kuchen wird mit 11 Wasser aufgeschlemmt und mit verdünnter
Natr iumhydroxydlösung behandelt, bis sich ein schwacher roter Fleck auf Benzoazurintestpapier
zeigt, dann auf 31 verdünnt und mit Bleinitratlösung bei einem pH-Wert von 7,5 behandelt.
Die Masse wird dann auf So'
erhitzt und die unlöslichen Teile durch
Filtrieren entfernt.
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Das im vorstehenden Absatz beschriebene Verfahren wird noch dreimal
auf den Filterkuchen angewendet, bis die neutralen Pteridine in der endlich erhaltenen
Lösung weniger als 15 y/ccm betragen.
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;ach der letzten Behandlung wird der nasse Kuchen in 1,5 1 einer o,1
n-Natriumhydroxydlösung aufgeschlemmt und das Unlösliche durch Filtrieren entfernt.
Nach Hinzufügen von 2o- Diatomeenerde wird der pH-W .ert des Filtrats mit Salzsäure
auf 3,2 eingestellt. Der Niederschlagskuchen wird sodann mit einem Überschuß von
Kalk in 1500 ccm Wasser behandelt und filtriert, das Filtrat dann auf 85° erhitzt
und auf einen pH-Wert von 3 bis 4. mit Essigsäure angesäuert. Nach Abkühlen wird
die niedergeschlagene Pteroylglutaminsäure abfiltriert, mit Wasser und Alkohol gewaschen
und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 1,4 g einer 86,5%igen Pteroylglutaminsäure.
Beispiel 3 i884 g rohes Reaktionsprodukt (aus der Umsetzung von e, 4, 5-Triamino-6-oxy-pyrimidinsulfat,
a, ß-Dibrompropionaldehyd und p-Aminobenzoylglutamylglutaminsäure) mit einem Gehalt
an i2,9 % Pteroylglutamylglutaminsäure werden in 2501 o,1 n-Natronlauge bei
6o0 gelöst. 13509 Calciumchlorid, in wenig Wasser gelöst, werden nach Zusatz von
50o g Diatomeenerde als Filtrierhilfsmittel zugesetzt. Dann wird filtriert. Zu den
2551 Filtrat mit einem Gehalt von 0,759m9 Pteroylglutamylglutaminsäure pro Kubikzentimeter
werden 2 kg Diatomeenerde und eine 2o%ige Zinkchloridlösung zugesetzt, bis
der PH-Wert 1o,8 bis 1o,9 beträgt. Die Temperatur der Lösung wird auf 4o0 gehalten.
Nach Filtrieren der Suspension wird das Filtrat von :2671 mit einem Gehalt
von 0,570 mg Pteroylglutamylglutaminsäure pro Kubikzentimeter erneut mit
2 kg Diatomeenerde behandelt, worauf eine 2o%ige Zinkchloridlösung bis zum Erreichen
eines pH-Wertes von 6,8 zugefügt wird. Darauf wird wiederum filtriert und das Filtrat
beseitigt.
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Der Filterkuchen wird mit 351 o, i n-Natronlauge 20 Minuten bei 4o0
verrührt. Konzentrierte Salzsäure wird darauf bis zum PH 2,4 zugesetzt und die Lösung
auf 1o0 abgekühlt. Dann wird filtriert.
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Der so erhaltene Filterkuchen wird mit q.,21 Wasser und
280 ccm 1o n-Natronlauge bei 5o0 angeschlemmt und dann filtriert; darauf
wird er zweimal durch Anschlemmen mit 4,21 Wasser und iooccm 1o n-Natronlauge gewaschen
und jedesmal wieder filtriert. Das Gesamtfiltrat wird bei 40° auf 141 aufgefüllt,
worauf 98o ccm konzentrierter Salzsäure schnell unter Rühren zugesetzt werden. Die
Lösung wird dann während 3 Stunden auf wenig unter o° abgekühlt, danach
700 g Diatomeenerde zugesetzt, worauf wieder filtriert und der Filterkuchen
mit Wasser gewaschen wird.
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Der erhaltene Filterkuchen wurde mit 2o 1 Wasser und 22q. ccm 1o n-«L\atronlauge
bei 6o0 behandelt. Danach wurden q.50 Teile 30%ige Calciumchloridlösung zugesetzt
und die Lösung filtriert. Nach Zufügen von 700 g Diatomeenerde bei ¢o° sowie
von genügend Zinkchlorid, um die Lösung auf pA 1o,85 zu bringen, wurde filtriert
und das Filtrat mit so viel konzentrierter Salzsäure behandelt, daß der zuerst gebildete
Niederschlag gerade wieder gelöst wurde. Nach Abkühlung der Lösung während 3 Stunden
äuf etwas unter o° wurde der ausgefallene Niederschlag durch Filtrieren gewonnen
und zweimal durch Anschlemmen mit je 21 Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen eines
kleinen Teils des Produktes im Vakuum bei 1000 ergab sich ein Gehalt von 95 % reiner
Pteroylglutamylglutaminsäure. Beispiel Zu q.oo Teilen Wasser werden 2o,6 Teile 2,
4, 5-Triamino-6-oxypyrimidinsulfat und 21 Teile Bariumchloriddihydrat zugesetzt
und 20 Minuten auf 6o0 erhitzt. Dann wird eine Lösung von a2, i Teilen p-Aminobenzoyl-y-glutamyl-y-glutamylglutaminsäure
in 44o Teilen Wasser zugesetzt und der pH-Wert durch Zusatz von ao%iger Natronlauge
auf 3,0 bis 3,5 eingestellt. Nachdem die Temperatur auf 75 bis 8o0 erhöht
worden ist, werden 4o Teile Tribromaceton innerhalb von 5 Minuten zugleich mit so
viel 2oo/oiger Natronlauge zugesetzt, daß ein PH-Wert von 3 bis 3,5 vorliegt. Der
Schlamm wird dann i Stunde auf 75 bis 8o0 gehalten. Das Freiwerden weiterer Salzsäure
wird durch Zusatz von 2o%iger Natronlauge unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes
auf 3 bis 3,5 unschädlich gemacht. Nach Abkühlen auf 1o° wird die dunkelrotbraune
feste Substanz abfiltriert und mit einer kleinen Menge Eiswasser gewaschen.
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Die rohe Pteroyl-y-glutamyl-y-glutamylglutaminsäure mit einem Gehalt
von 1o,6 Teilen Reinsubstanz wird mit den Verunreinigungen in 1o ooo Teilen o, i
n-Natronlauge aufgeschlemmt und die Temperatur auf 6o0 erhöht. Zu dieser Lösung
werden 26o Teile 3o%iger Calciumchloridlösung und ioo Teile Diatomeenerde zugesetzt,
worauf die Lösung durch Filtrieren geklärt wird. Das Filtrat wird auf 45' abgekühlt
und so viel io%ige Zinkchloridlösung zugesetzt, bis der pH-Wert auf 1o,6 bis 1o,8
gesunken ist. Nach Zusatz von ioo Teilen Diatomeenerde wird wiederum filtriert.
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Der piI-Wert des Filtrats wird nun durch Zusatz einer io%igen Zinkchloridlösung
auf 6,7 bis 6,9 eingestellt und die Temperatur auf 70° erhöht. Nach Zusatz von ioo
Teilen Diatomeenerde wird erneut filtriert. Der Filterkuchen, der das Zinksalz der
Pteroyl-y -glutamyl-;,-glutamylglutaminsäure enthält, wird in iooo Teilen Wasser
unter Zusatz einer ausreichenden Menge Kalk aufgeschlemmt, so daß die Lösung einen
starken Fleck auf Benzoazurinindikatorpapier hervorruft. Die Temperatur wird dann
auf 5o0 erhöht und die Lösung wiederum durch Filtrieren geklärt. Nach Ansäuern des
Filtrats bis auf einen pH-Wert von 2,5 vermittels konzentrierter Salzsäure und Erniedrigung
der Temperatur auf 5° wurde wieder Diatomeenerde zugesetzt und filtriert. Der Filterkuchen
enthält die
genannte Säure ohne die Verunreinigungen der Toben Reaktionsmischung
und kann durch Wieder-1iolung der Zinksalzfällung wie oben weitergereinigt werden.