-
Verfahren zur Herstellung einer di- bzw. tetrahydrierten Formylteroinsäure
und ihrer Derivate Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer di-
bzw. tetrahydrierten Formylpteroinsäure und ihrer Derivate.
-
Sauberlich und Baumann (vgl. J. Biol. Chem. 176, S. 165 [i948]) stellten
die Existenz einer Substanz fest, die in künstlichem Medium das Wachstum von Leuconostoc
citrovorum anregt. Man fand, daß diese unbekannte Substanz in handelsüblichen Leberextrakten
und auch in Leber und einer Vielzahl von natürlichen Materialien anwesend ist. Später
durchgeführte Arbeiten haben gezeigt, daß der Wachstumsfaktor nicht Pteroylglutaminsäure,
Vitamin B12 und auch keines der anderen, vorher bekannten Vitamine war, die in der
Leber und anderen natürlichen Produkten vorkommen. Im Anschluß daran wurde auch
gefunden, daß die unbekannte Substanz den Folinsäurebedarf von Mikroorganismen und
Kücken ersetzen kann. Ferner wurde festgestellt, daß der Wachstumsfaktor die Wirkung
vpn Pteroylglutaminsäureantagonisten und überraschenderweise auch die toxischen
Wirkungen von 6-Aminopteroylglutaminsäure, N-[4'-(2, 6-Diamino-8-methylpyrimidino-4,
5-pyrazyl)-aminobenzoyl]-glutaminsäure, bei Mäusen und Bakterien unter Bedingungen
aufhebt, unter denen Pteroylglutaminsäure unwirksam ist.
-
Der Citrovorumfaktor kommt in natürlichen Produkten in extrem kleinen
Mengen vor, so daß seine Gewinnung daraus äußerst schwierig und vom wirtschaftlichen
Standpunkt
aus praktisch unmöglich ist. Es wurde jedoch gefunden, daß es möglich ist, Verbindungen
mit der gleichen oder verwandten biologischen Wirksamkeit durch ein Verfahren herzustellen,
welches die Darstellung adäquater Aktivitätsbeträge wirtschaftlich ermöglicht, so
daß sie in der Medizin verwendet werden können. Da die chemische Struktur des von
S a u b e r1 i eh und Mitarbeitern beschriebenen Leuconostoc-citrovorum-Wachstumsfaktors
bisher noch nicht aufgeklärt wurde, kann gegenwärtig darüber keine Aussage gemacht
werden, ob alle erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen mit dem Wachstumsfaktor
identisch sind oder nicht, selbst wenn sie die gleiche biologische Wirksamkeit besitzen.
Soweit bekannt, sind jedoch die durch die vorliegende Erfindung umfaßten Verbindungen
neu.
-
Die erfindungsgemäßen di- bzw. tetrahydrierten Formylpteroinsäuren
und deren Derivate werden hergestellt durch Hydrierung einer formylierten Verbindung
der allgemeinen Formel
worin X eine Hydroxyl-, Amino- oder Alkylaminogruppe und R einen Hydroxyl- oder
Aminosäurerest bedeuten, oder durch Hydrierung eines ihrer Salze. Formylierte Verbindungen
der oben angegebenen Formel sind schon früher hergestellt und einige davon in der
Literatur beschrieben worden, z. B. die Formylpteroinsäure, ihre Salze und Aminosäureamide,
insbesondere die N-[q.'-(2-Amino-6-oxy-8-methylpyrimidino-q., 5-pyrazyl)-formamidobenzoyl]-glutaminsäure.
Die zuletzt genannte Verbindung kann nach verschiedenen Methoden einschließlich
der durch G o r d o n und Mitarbeiter (vgl. J. Am. Chem. Soc. 70, S. 878 i i948
]) beschriebenen Methode hergestellt werden. Gemäß diesem Verfahren wird Formylpteröylglutaminsäure
durch einstündiges Erhitzen von 98°/oiger Ameisensäure und Essigsäureanhydrid mit
Folinsäure (Pteroylglutaminsäure) auf zoo° C hergestellt. Die flüchtigen Reaktionskomponenten
werden im Vakuum entfernt, und ein hellgelbes Produkt wird aus der alkalischen Lösung
durch Essigsäure abgeschieden. Auch andere Formylderivate der Pteroinsäure und ihrer
Aminosäureamide können nach dem gleichen allgemeinen Verfahren hergestellt werden.
Zusätzlich zu den genannten können auch die entsprechenden Derivate der 6-Aminopteroylglutaminsäure
verwendet werden, die sich strukturell nur durch einen Aminorest in der 6-Stellung
des Pyrimidinringes von ihnen unterscheiden.
-
Die Dihydro- und Tetrahydroderivate bilden sich, wenn x Mol Wasserstoff
bzw. 2 Mol Wasserstoff bei der Umsetzung angewandt werden.
-
Die genaue Struktur der neuen, durch die Hydrierung der oben angegebenen
Formylverbindungen hergestellten Substanzen ist bis jetzt noch nicht endgültig bestimmt
worden. Es wird jedoch angenommen, daß sie durch eine der nachstehenden Formeln
wiedergegeben werden kann:
In diesen Formeln haben X und R die vorstehend angegebene Bedeutung. Es sei erwähnt,
daß die obigen Verbindungen in tautomeren Formen existieren können, was von den
Bedingungen abhängt, unter denen sie zugegen sind. Die vorstehend wiedergegebenen
Formen, worin X ein Hydroxylrest ist, können als hydrierte Formylpteroinderivate
aufgefaßt werden, die in der offenen, (I) und (III), oder geschlossenen, (II) und
(IV), tautomeren Form vorhanden sein können.
Die Hydrierung der
Formylverbindungen, durch die die neuen erfindungsgemäßen Produkte hergestellt werden,
kann sowohl mit als auch ohne Katalysatoren durchgeführt werden. Bei Verwendung
einer katalytischen Hydrierung kann eine große Anzahl von Lösungsmitteln, einschließlich
Wasser, verwendet werden, z. B. Ameisensäure, Alkohol, Glykol, Essigsäure oder Dimethylformamid,
wobei das benutzte Lösungsmittel selbstverständlich von der Natur des Katalysators
abhängig ist. Die Hydrierungstemperatur kann in einem weiten Bereich von etwa -
2o bis ungefähr i5o° C liegen. Das pu kann innerhalb eines Bereiches (in wäßrigem
Medium) von etwa 3 bis 12 variieren.
-
Erfindungsgemäß können viele verschiedene Hydrierungskatalysatoren
Verwendung finden; einige von ihnen sind in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen
beschrieben.
-
Im allgemeinen findet die Umsetzung ziemlich rasch statt; merkliche
Ausbeuten des gewünschten Produktes können schon bei Raumtemperatur nach einer kurzen
Reaktionszeit von etwa io Minuten unter Verwendung von z. B. Platin in Ameisensäure
erhalten werden. Gewöhnlich wird die Hydrierung während eines Zeitraumes von
30 Minuten bis zu q. Stunden durchgeführt.
-
Obgleich weiter unten zahlreiche spezielle Beispiele für die katalytische
Hydrierung beschrieben werden, wird das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen
neuen Verbindungen im allgemeinen vorzugsweise wie folgt durchgeführt. Pteroylglutaminsäure
oder Pteroinsäure oder ein Amid derselben wird zunächst formyliert, indem man sie
in 2o Teilen gobis iooo/oiger Ameisensäure während eines Zeitraumes von 30 Minuten
bis zu i Stunde auf 8o bis 95° C erhitzt. Die so erhaltene Formylverbindung kann
gewünschtenfalls isoliert und die Hydrierung in einem anderen Lösungsmittel beendet
werden. Im allgemeinen ist es jedoch bequemer, die Hydrierung fortzusetzen durch
Abkühlen der Lösung und Eintragen des Katalysators, worauf Wasserstoff unter Schütteln
oder Rühren in die Reaktionsmischung eingeleitet werden kann. In einigen Fällen
kann es von Vorteil sein, den Katalysator mit Wasserstoff zu aktivieren, bevor er
mit formylierter Pteroylglutaminsäure vermischt wird; diese Behandlung ist jedoch
nicht notwendig. Der Wasserstoffdruck in dem Reaktionsgefäß kann von i bis ioo und
mehr Atmosphären betragen; gewöhnlich genügt aber ein Druck von i bis 3 Atmosphären,
um gute Ausbeuten zu erhalten. Nach der Hydrierung wird der Katalysator durch Filtrieren
entfernt und die Lösung in wäßrigem Natriumcarbonat gepuffert; es zeigt sich, daß
die erhaltene Lösung das aktive Material enthält. Wenn man die überschüssige Ameisensäure
aus der Hydrierungslösung nach der Abtrennung des Katalysators zu entfernen wünscht,
kann man sie in Äther einfließen lassen und das unlösliche aktive Produkt durch
Filtrieren isolieren.
-
Wenn man Hydrierungsverfahren verwendet, bei denen Metalle oder Metallkombinationen
benutzt werden, wie z. B. Natriumamalgam, Zink, Aluminiumamalgam, Natriumborhydrid,
Magnesiumamalgam, Magnesium u. dgl., dann ist das Lösungsmittel gewöhnlich Wasser
oder ein Lösungsgemisch von im wesentlichen wäßriger Natur, wobei Alkohol, Benzol
od. dgl. mitbenutzt werden Um das erfindungsgemäße Verfahren näher zu erläutern,
sollen im folgenden Ausführungsbeispiele beschrieben werden, in denen, wenn nicht
anders angegeben, die Teile Gewichtsteile bedeuten. Beispiel i i Teil Pteroylglutaminsäure
wird in 24 Teilen 98-bis ioo°/,iger Ameisensäure gelöst und i Stunde auf dem Dampfbad
erhitzt. Nach dem Abkühlen werden o,25 Teile Platinoxydkatalysator zugegeben und
die Lösung 2 Stunden bei einem Wasserstoffdruck von annähernd 2,46 Atmosphären hydriert.
Der Katalysator wird abfiltriert und die Lösung in eine Mischung von qo Teilen Natriumbicarbonat
und 3oo Teilen Wasser gegossen. Ein aliquoter Teil dieser Lösung, entsprechend i
mug pro Gramm des Ausgangsmaterials in 2 ccm Kulturmedium ist für l,/,-Maximum-Wachstum
von Leuconostoc citrovorum erforderlich. Die Ausbeute, bezogen auf die biologische
Aktivität, beträgt 15 bis 30 °/o. Beispiel 2 Die in dem Beispiel i beschriebene
Umsetzung 9o wird unter Verwendung von go°/oiger Ameisensäure wiederholt. Es werden
im wesentlichen die gleichen Ergebnisse und die gleiche Ausbeute erhalten. Beispiel
3 i Teil Formylfolinsäure (Formylpetroylglutaminsäure) wird in 5o Teilen Wasser
bei einem schwach alkalischen pH-Wert gelöst und danach das pH auf 7 eingestellt.
Man setzt 1/2 Teil Platinoxydkatalysator dieser Lösung zu, welche dann 2 Stunden
bei einem Wasserstoffdruck von annähernd 2,46 Atmosphären hydriert wird. Danach
wird der Katalysator abfiltriert und das pa erneut auf 7 eingestellt. Die Lösung
enthält den Leuconostoc-citrovorum-Wachstumsfaktor. Beispiel q. i Teil Formylfolinsäure
wird, wie in dem Beispiel 3 beschrieben, unter Verwendung von 2 Teilen io°/oigem
Palladium auf Kohle als Katalysator hydriert. Der Leuconostoc-citrovorum-Wachstumsfaktor
wird wie vorstehend gebildet. Beispiel 5 2 Teile Formylfolinsäure in ioo Teilen
Wasser werden bei einem pH-Wert von 7 in Gegenwart eines Raney-Nickel-Katalysators
2 Stunden bei i2o° C und einem Druck von rund ioo Atmosphären hydriert. Es wird
annähernd die gleiche Ausbeute an Leuconostoc-citrovorum-Faktor wie in dem Beispiel
3 erhalten. Beispiel 6 i Teil Formylfolinsäure in 21 Teilen Essigsäure, die vorher
erhitzt wurde, um einen Teil der Formylfolinsäure in Lösung zu bringen, wird 2 Stunden
unter
Verwendung von o,25 Teilen Platinoxydkatalysator hydriert. Der größte Teil der nicht
gelösten Formylfolinsäure geht beim Fortschreiten der Reaktion in Lösung. Der Katalysator
wird entfernt und die Lösung in einen Überschuß an wäßrigem Natriumbicarbonat gegossen.
Diese Lösung enthält die für das Maximum-Wachstum von Leuconostoc citrovorum erforderliche
aktive Substanz. Die Ausbeute, bezogen auf die biologische Aktivität, beträgt 15
bis 30 Beispiel 7 21/2 Teile Formylfolinsäure werden in 5o Teilen einer io°/oigen
wäßrigen Natriumcarbonatlösung gelöst und dann mit Wasser auf r25 Teile verdünnt.
3o Teile 2°/oiges Natriumamalgam werden zugegeben. Unter Rühren wird Kohlendioxyd
durch die Lösung geleitet. Im Verlaufe von i Stunde werden drei Portionen Natriumamalgam,
jeweils 16 Teile, zugesetzt. Das. erhaltene Rohprodukt fördert das Wachstum von
Leuconostoc citrovorum 8o82.
-
Beispiel 8 i Teil Formylfolinsäure wird in ioo Teilen einer 3o°/oigen
Ammoniumchloridlösung gelöst; zu der Mischung wird Zinkstaub im Überschuß gegeben.
Die Mischung wird i Stunde geschüttelt und danach io Minuten auf dem Dampfbad erhitzt.
Die Lösung enthält den Leuconostoc-citrovorum-Wachstumsfaktor. Beispiel 9 ii Teile
Aluminiumspäne werden mit Natriumhydroxyd und Salzsäure gereinigt und dann durch
Behandlung mit Quecksilberchlorid amalgamiert. io Teile Formylfolinsäure, in iooo
Teilen verdünntem Ammoniumhydroxyd gelöst, werden zugesetzt, dann wird die Mischung
2 Stunden gerührt. Die Lösung fördert das Wachstum von Leuconostoc citrovorum. Beispiel
io 47 Teile Formylfolinsäure werden in 2ooo Teilen Wasser durch Zusatz von Natriumbicarbonat
und Natriumhydroxyd gelöst. Man erhitzt die Lösung auf dem Dampfbad und setzt im
Verlaufe von wenigen .Minuten drei Portionen von jeweils io bis 15 Teilen Natriumborhydrid
zu. Danach erhitzt man io Minuten lang und findet, daß die Lösung den Leuconostoccitrovorum-Wachstumsfaktor
enthält.
-
Beispiel ii io Teile des Magnesiumsalzes der Formylfolinsäure, 71/2
Teile Platinoxyd und 2ooo Teile Wasser werden im Wasserbad auf 8o° C erhitzt. Dann
leitet man 45 Minuten lang Wasserstoffgas durch die Mischung. Nach Ablauf dieser
Zeit erweist sich die Lösung als wirksam zur Wachstumsförderung von Leuconostoc
citrovorum 8o81.
-
Beispiel 12 0,25 Teile Magnesiumformylfolat werden in 12,5
Teilen heißem Wasser und o,22 Teilen Eisessig gelöst. Dazu werden 0,03 Teile
Magnesium, das mit Quecksilberchlorid behandelt war, zugesetzt. Die Mischung wird
unter Rückfluß so lange erhitzt, bis das Magnesium gelöst ist. Die Lösung enthält
den Wachstumsfaktor.
-
Beispiel 13 5 Teile Magnesiumformylfolat, Zoo Teile Wasser und o,9
Teile metallisches Magnesium werden zusammen unter Rückfluß erhitzt. Von Zeit zu
Zeit setzt man Eisessig zu, um die Lösung im wallenden Sieden zu halten, und zwar
so lange, bis 5 Teile zugegeben wurden. Nach Auflösen des Magnesiums wird die Lösung
io :Minuten unter Rückfluß erhitzt. Das bei diesem Verfahren erhaltene Produkt wird,
ebenso wie die Produkte der vorhergehenden Beispiele, durch eine der allgemeinen
Formeln (I) bis (IV) wiedergegeben, wobei X Hydroxyl und R den Glutaminsäurerest
bedeuten.
-
Beispiel 14 i Teil 90,4°/oige Folinsäure wird in 2o Teilen 98 bis
ioo°/oiger Ameisensäure bei Raumtemperatur gelöst. Dazu setzt man o,25 Teile Platinoxyd
und hydriert die Mischung 2 Stunden bei einem Wasserstoffdruck von 2,46 Atmosphären.
Das Platin filtriert man ab und puffert die Lösung in überschüssiger Natriumbicarbonatlösung.
Das Reaktionsprodukt fördert das Wachstum von Leuconostoc citrovorum 8o81. Die Ausbeute,
bezogen auf die biologische Aktivität, beträgt etwa 25°/o. Beispiel 15 2 Teile 73
°/oiger 6-Aminopteroylglutaminsäure werden i Stunde auf dem Dampfbad in 4o Teilen
98- bis ioo°/oiger Ameisensäure erhitzt. Die Hälfte dieser Lösung wird in Natriumbicarbonatlösung
gegossen und aufbewahrt, die restliche Hälfte mit o,25 Teilen Platinoxydkatalysator
bei 2,46 Atmosphären Wasserstoffdruck 2 Stunden hydriert. Das Platin wird abfiltriert
und die Lösung in Natriumbicarbonatlösung gegossen. Die nicht hydrierte Lösung besitzt
keine Wirksamkeit zur Wachstumssteigerung und hemmt das Wachstum von Leuconostoc
citrovorum vollständig.
-
Beispiel 16 i Teil gereinigte Formylpteroylglutaminsäure wird in 5o
Volumina Dimethylformamid aufgeschlämmt, dann werden 0,25 Teile Platinoxyd
zugegeben und die Hydrierung mit Wasserstoff in einer Laboratoriumsschüttelmaschine
durchgeführt. Nach 31/2 Stunden bei 25 bis 30° C fiel der Wasserstoffdruck von 2,64
auf 2,58 Atmosphären. Der Katalysator wird abfiltriert und mit io Volumina Dimethylformamid
gewaschen. Die Mutterlauge und die Waschflüssigkeit werden langsam mit
500 Volumina trockenem Äther verdünnt. Es scheidet sich ein kremefarbener
Niederschlag ab, der abfiltriert, mit trockenem Äther gewaschen und an der Luft
getrocknet wird; das Gewicht beträgt o,29 Teile. Dieser feste Körper fördert das
Wachstum von Leuconostoc citrovorum 8o81.
Beispiel 17 1 Teil gereinigte
Formylpteroylglutaminsäure wird in 2o Volumina go°/oiger Ameisensäure gelöst und
auf o bis 5° C abgekühlt. Dann werden 2 Teile Zinkpulver zugegeben. Die Lösung färbt
sich augenblicklich dunkelorange und wird nach einigen Minuten tiefgelb. Die Lösung
wird 1/2 Stunde unter gelegentlichem Rühren bei o bis 5° C gehalten. Nach der Abtrennung
des überschüssigen Zinks durch Filtrieren wird das dunkelgelbe Filtrat in eine Aufschlämmung
von 250 Volumina Wasser und 5o Teilen Natriumbicarbonat gegossen. Die erhaltene
Lösung fördert das Wachstum von Leuconostoc citrovorum 808i. Beispiel 18 i Teil
gereinigte Formylpteroylglutaminsäure wird in 2o Volumina trockenem Äthylenglykol
aufgeschlämmt und auf ioo° C erhitzt; es findet fast vollständige Lösung statt.
Beim Abkühlen auf 2o° C fällt die Formylpteroylglutaminsäure in feinverteilter Form
aus. Diese Aufschlämmung wird in eine Laboratoriumshydrierungsapparatur gebracht
und mit 20 V olumina Äthylenglykol und 0,25 Teilen Platinoxyd versetzt. Die
Hydrierung wird i Stunde lang bei 25 bis 30° C durchgeführt. Während dieser Zeit
fiel der Wasserstoffdruck von 2,53 auf 2,46 Atmosphären. Der Katalysator wird abfiltriert
und das tiefgelbe Filtrat in eine Aufschlämmung von i50 Volumina Wasser und io Teilen
Natriumbicarbonat gegossen. Die resultierende Lösung fördert das Wachstum von Leuconostoc
citrovorum 8o81. Die Ausbeute, bezogen auf die biologische Aktivität, beträgt 5
bis io °/a. Beispiel i9 2o g Pteroylglutaminsäure (9o°/oig) werden 45 Minuten auf
dem Dampfbad mit Zoo ccm 9o°/oiger Ameisensäure erhitzt. Die Lösung wird gekühlt
und mit i g Ascorbinsäure und 0,5 g Platinoxyd versetzt; die Mischung wird
in einer Schüttelapparatur unter einem Wasserstoffdruck von 2,46 Atmosphären hydriert,
bis annähernd 2 Mol Wasserstoff pro Mol der eingesetzten Pteroylglutaminsäure verbraucht
sind. Wenn die Hydrierung vollständig ist, wird der Katalysator abfiltriert und
das Filtrat 40 Stunden unter Stickstoffatmosphäre gehalten. Die Ausbeute an rohem
Produkt beträgt etwa 2o °/o.
-
Die ameisensaure Reaktionsmischung wird i Stunde auf dem Dampfbad
erhitzt, dann gekühlt und in etwa 2500 ccm Wasser, das 34o g Natriumbicarbonat
enthält, gegossen. Man setzt Natriumhydroxyd zu, um das PR auf einen Wert
von etwa 12 einzustellen, und erhitzt die Lösung 1/2 Stunde auf dem Dampfbad, kühlt
sie und neutralisiert auf etwa PR 7. Hierbei beträgt das Volumen etwa 2900 ccm.
300 g Magnesiumsilikatpulver werden zu der Lösung gegeben, um weitgehend
die Verunreinigungen zu adsorbieren. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 15 Minuten
lang gerührt und dann filtriert. Das Filtrat ist hellgelb gefärbt, und sein Volumen
beträgt 310o ccm. Man stellt es auf einen pH-Wert von 4 durch Zusatz von Salzsäure
und Essigsäure. Dann gibt man 150 g Aktivkohle zu, um das aktive Material weitgehend
zu adsorbieren, und rührt die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Kohle
wird abfiltriert und auf dem Filter mit destilliertem Wasser gut ausgewaschen. Man
erhält ein farbloses Filtrat. Die Ausbeute beträgt etwa 4o bis 45 %.
-
Das aktive Material wird aus der Kohle eluiert, indem man diese 15
Minuten in einer Mischung von 50o ccm Alkohol, zoo ccm 28°/oigem Ammoniak und 400
ccm Wasser rührt. Man trennt die Kohle durch Filtrieren ab und wäscht sie mit wäBrigem,
alkoholischem Ammoniak gut aus. Das Volumen des gelben Filtrates beträgt ii2o ccm.
Es wird unter vermindertem Druck und unter Stickstoffatmosphäre bis zur Trockne
eingedampft und ergibt einen gelbbraunen, sirupösen Rückstand. Der Rückstand wird
mit absolutem Äthanol verrieben, worauf sich ein hellgelber fester Körper bildet.
Er wird abfiltriert, zuerst mit Äthanol, dann mit Äther gewaschen und io Minuten
bei 50° C und dann in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Die Ausbeute beträgt 2,9
g, etwa 20 °/o, berechnet auf Grund der biologischen Aktivität.
-
Das Produkt ist sehr wasserlöslich, die wäBrigen Lösungen zeigen blaBblaue
Fluoreszenz. Eine Probe von o,2 g wird in 4 ccm n/io-Natriümhydroxyd gelöst und
das pH auf einen Wert von 12 durch Zusatz von einigen Tropfen 5 n-Natriumhydroxyd
eingestellt. Die Lösung wird 45 Minuten auf dem Dampfbad erhitzt. Die Fluoreszenz
bleibt erhalten. (Unter diesen Bedingungen wird das Ausgangsmaterial, die N12-Forrnylpteroylglutaminsäure,
zu Pteroylglutaminsäure, einer nicht fluoreszierenden Verbindung, hydrolysiert.)
Man kühlt die Lösung und zentrifugiert von der kleinen Menge unlöslichen Materials
ab und säuert dann bei o° C auf einen pH-Wert von 3,8 an. Ein hellgelbes Produkt
fällt aus, welches abfiltriert, mit Aceton und Äthanol gewaschen und getrocknet
wird. Die Ausbeute beträgt 0,o62 g, 4o bis 45 °/o, berechnet auf Grund der biologischen
Aktivität. Durch Erniedrigung des PR des Filtrates bei o° C auf einen Wert von 3,3
werden weitere 0,015 g erhalten. Das zuletzt erhaltene Produkt zeigte im mikrobiologischen
Versuch mit Leuconostoc-citrovorum-8o81-Organismen einen Gehalt von 3 bis 5 Millionen
Aktivitätseinheiten pro Milligramm.
-
Die Aktivitätseinheiten werden durch den mikrobiologischen Test unter
Verwendung des von H. R. Sauberlich und Mitarbeitern beschriebenen synthetischen
Mediums (vgl. J. Biol. Chem. 176, S. 165 [1948]) und des Organismus Leuconostoc
citrovorum 8o81 bestimmt. Jede Aktivitätseinheit wird willkürlich als Äquivalent
zu 16,6 mug einer früheren Standardzubereitung gesetzt. Die so bestimmte Aktivitätseinheit
ist annähernd gleich zweimal der von Sauber 1 i c h und Mitarbeitern definierten
Aktivitätseinheit, welche diejenige Materialmenge pro Kubikzentimeter Kulturmedium
darstellt, welche für das 1/2-Maximum-Wachstum des Testorganismus notwendig ist.
Beispiel 2o ioo g go%ige Pteroylglutaminsäure werden i Stunde in 60o ccm go°/oiger
Ameisensäure auf dem Dampfbad erhitzt. Nach dem Kühlen werden 4 9 Platinoxydkatalysator
zugesetzt,
dann wird die Mischung bei Raumtemperatur hydriert, bis 2 Mol Wasserstoff absorbiert
sind (2 Stunden). Das Platin wird abfiltriert und die Lösung bei Raumtemperatur
über Nacht stehengelassen. Dann erhitzt man sie i Stunde auf dem Dampfbad, kühlt
sie ab und gießt sie allmählich in g 1 Wasser, die 1300 g Natriumbicarbonat enthalten.
Dann wird Natriumhydroxyd (5o°oig) zugegeben bis zu einer Konzentration der Lösung
von etwa o,i n, und man erhitzt die Lösung 30 Minuten auf dem Dampfbad. Nach
dem Abkühlen wird die Mischung mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,6 angesäuert.
goo g Magnesiumsilikat werden zugesetzt; die Mischung wird 15 Minuten gerührt und
filtriert, wobei ein gelbes Filtrat erhalten wird, das den größten Teil der Aktivität
der ursprünglichen Lösung enthält. Das Filtrat wird auf einen pH-Wert von q, angesäuert,
20 Minuten mit 450 g Aktivkohle gerührt und anschließend filtriert. Der Kohlekuchen
wird gut mit Wasser ausgewaschen und dann in einer Mischung von 1500 ccm Äthanol,
300 ccm 28%igem Ammoniak und i2oo ccm Wasser aufgeschlämmt. Man erhitzt die Aufschlämmung
30 Minuten auf dem Dampfbad unter Rühren und leitet während dieser Zeit gasförmigen
Stickstoff ein. Dann filtriert man die heiße Mischung und wäscht mit verdünntem
alkoholischem Ammoniak. Das Filtrat enthält 7o °/o der ursprünglichen Aktivität.
Es wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und ergibt 37 g eines Materials,
das beim Biotest 1,6 Millionen Einheiten pro Milligramm aufweist. Die Ausbeute beträgt
etwa 15 bis 30 °/o. Dieses Material wird, wie in dem Beispiel ig beschrieben, weiter
gereinigt. Beispiel 21 5 g go°/oige Pteroylglutaminsäure werden 45 Minuten auf dem
Dampfbad mit ioo ccin go°/oiger Ameisensäure erhitzt. Die Lösung wird auf Raumtemperatur
abgekühlt und dann mit i g Platinoxyd versetzt; die Mischung wird mit Wasserstoff
in einer Schüttelapparatur hydriert, bis annähernd 2 12o1 Wasserstoff für jedes
Mol der eingesetzten Pteroylglutaminsäure aufgenommen sind. Wenn das erreicht ist,
filtriert man den Katalysator ab und teilt das Reaktionsfiltrat in 3 Teile. Die
Ausbeute, berechnet auf Grund der biologischen Aktivität, beträgt etwa 2o bis 30
%.
-
Teil A. Dieser Teil wird in etwa 250 ccm Wasser gegossen, welches
so viel Natriumbicarbonat enthält, daß die resultierende Lösung einen pH-Wert von
7 bis 8 aufweist. Sie enthält nach dem mikrobiologischen Test 88o ooo Aktivitätseinheiten
pro Kubikzentimeter.
-
Teil B. Den zweiten Teil läßt man ig Stunden in der ameisensauren
Lösung stehen und behandelt ihn dann mit Natriumbicarbonatlösung wie den Teil A.
Die resultierende Lösung enthält nach dem mikrobiologischen Test i ioo ooo Aktivitätseinheiten
pro Kubikzentimeter.
-
Teil C. Den dritten Teil läßt man gi Stunden in der ameisensauren
Lösung stehen und behandelt ihn dann mit Natriumbicarbonatlösung wie den Teil A.
Die resultierende Lösung enthält nach dem mikrobiologischen Test 1530 ooo
Aktivitätseinheiten pro Kubikzentimeter.
-
Die erfindungsgemäß formylierten Dihydroderivate sind gelbe kristalline
feste Körper. Die Tetrahydroderivate sind weiße bis hellgelbe kristalline feste
Substanzen. DieseVerbindungen sind in o,i n-Natriumhydroxyd, selbst bei 30 Minuten
langem Erhitzen auf ioo° C, beständig. Die wäßrige Lösung bei pH 2 ist bei Raumtemperatur
unbeständig und wird rasch in ein Produkt umgewandelt, welches dieselbe biologische
Aktivität wie Pteroylglutaminsäure besitzt, unter gleichzeitigem Verlust an Aktivität
für den Organismus Leuconostoc citrovorum. Das aktive Material wird an verschiedene
Adsorptionsmittel absorbiert, wie z. B. an Aktivkohle bei saurem pH und an aktiviertes
Magnesiumsilikat bei schwach alkalischem pH; diese Absorptionsmittel können zur
Reinigung der rohen Reaktionsprodukte durch chromatographische Adsorptionsmethoden
herangezogen werden. In o,i n-Natriumhydroxyd ist ein Absorptionsmaximum bei etwa
275 bis 285 mu vorhanden. Das aktive Material ist in Wasser bei einem PH 3,5 bis
4,0 sehr leicht löslich. Es bildet ein in verdünntem wäßrigem Alkohol unlösliches
Bariumsalz. Bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,o wird es als Zinksalz partiell gefällt.