DE855853C - Verfahren zur Abtrennung der Pteroylglutaminsaeure von verwandten Pteridinen - Google Patents

Description

Erteilt auf Grund des Ersten Uberleitungsgesetzes vom 8. Juli 1949

(WiGBl. S. 175)

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

AUSGEGEBEN AM 17. NOVEMBER 1952

DEUTSCHES PATENTAMT

PATENTSCHRIFT

KLASSE 12p GRUPPE 10

p 36566 IVc112p D

Coy Webster Waller, Pearl River, N. Y. (V. St. A.)

ist als Erfinder genannt worden

American Cyanamid Company, New York, N. Y. (V. St. A.)

Verfahren zur Abtrennung der Pteroylglutaminsäure von verwandten Pteridinen

Patentiert im Gebiet der Bundesrepublik Deutschland vom 12. März 1949 an

Patentanmeldung bekanntgemacht am 20. März 1952

Patenterteilung bekanntgemacht am 18. September 1952

Die Priorität der Anmeldung in den V. St. v. Amerika vom 5. Oktober 1946 ist in Anspruch genommen

Die Pteroylglutaminsäure oder Folinsäure der Formel

^0H O COOH

N
NH₂-,,

N _N : i

V/ V-CNh-CHCH₂CH₂COOH

^;N' N' ■

ίο stellt bekanntlich ein wichtiges therapeutisches Mittel | Oxydationsprodukte, Zwischenprodukte, Konden-

zur Behandlung der Makrozytenanämie, anderer ' sations- und/oder Polymerisationsprodukte, Hydro-

ähnlicher Blutkrankheiten und gewisser Tropen- lysenprodukte und verschiedene andere Zersetzungs- -

krankheiten dar. Die bekannten Verfahren zur

produkte als biologisch nicht aktive Nebenprodukte

Herstellung dieser Säure führen aber zu Gemischen, enthalten. Ihre Abtrennung zwecks Reinigung "der die neben Folinsäure verschiedene Stellungsisomere, Folinsäure von schädigenden Produkten in tech-

nischcm Ausmaße gestaltet sich schwierig, vor allem wegen der Ähnlichkeit vieler Eigenschaften der letzteren mit denen der ersteren, vor allem der Löslichkeit.

Es wurde nun gefunden, daß man Pteroylglutaminsäure von den verwandten Pteridinen und anderen Verunreinigungen unter Erhalt therapeutisch verwendbarer Produkte verhältnismäßig hohen Reinheitsgrades vorteilhaft, auf einfache Weise ίο trennen kann, wenn die unreine Pteroylglutaminsäure in einer wäßrigen Lösung, einer mindestens 2n-, vorzugsweise wenigstens 5n-Säure gelöst wird und die Lösung unter Verdünnung mit Wasser auf eine Normalität von ungefähr 0,5 bis 5 n, vorzugsweise von ι ibis 2n, gebracht wird, worauf die Pteroylglutaminsäure ausfällt.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nun so ausgeführt, daß das synthetische Rohprodukt in einer verhältnismäßig konzentrierten Säure aufgelöst wird, worauf vom Ungelösten abfiltriert wird. Hierbei werden offenbar schon die meisten biologisch nicht aktiven Pteridine entfernt.

Vorzugsweise wird Salzsäure verwendet, doch sind auch Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chloressigsäuren, Ameisensäure, Toluolsulfonsäure verwendbar.

Die Stärke der verwendeten Säure soll mindestens 2 η sein, doch wird vorzugsweise mit einer über 5 η-Säure gearbeitet. Ein Erhitzen der Lösung ist im allgemeinen nicht erforderlich, wenn auch ein Erwärmen bis gegen 75⁰ C nicht oder nur - mäßig zersetzend auf die Pteroylglutaminsäure wirkt, weshalb die zulässigen Temperaturen für die Auflösung derselben zwischen o° C oder niedriger und 75° C liegen.

Die Gewinnung der gereinigten Folinsäure erfolgt durch Ausfällung beim Verdünnen der Säurelösung auf eine Normalität zwischen 0,5 und 5 η. Eine stärkere Verdünnung als auf 0,5 η fällt Verunreinigungen mit, während eine schwache auf mehr als 5n-Sä<ure die Pteroylglutaminsäure teilweise gelöst läßt. Die günstigste Säurekonzentration beim Verdünnen ist 1 bis 2 η bei einem Gehalt von ι Teil Pteroylglutaminsäure auf 100 bis 200 Teile Lösung.

Zweckmäßig kann es sein, insbesondere, wenn ein Ausgangsmaterial von geringer Reinheit verwendet wird, zur konzentrierten Säurelösung Aktivkohle hinzuzusetzen, die vor der Verdünnung durch Filtrieren zu entfernen ist. Hierdurch wird eine Verbesserung der Reinigungswirkung erzielt, jedoch nur bei stärkerer Säurekonzentration, da Aktivkohle Pteroylglutaminsäure bei schwächeren Säurekonzentrationen adsorbiert. Die zusätzliche Reinigungswirkung der Aktivkohle scheint darin zu bestehen, Pteridine und andere Stoffe zu adsorbieren, die durch die Säurebehandlung nicht abtrennbar sind, andererseits aber beim Verdünnen der Lösung zusammen mit Folinsäure ausfallen.

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Bei spiel ι

Rohe Pteroylglutaminsäure, die 1 g aktives Material enthält, während das übrige aus der Synthese stammende Nebenprodukt aus Pteridinen besteht, wurde in 20 ecm Salzsäure (12η) bei Zimmertemperatur aufgelöst. Die Lösung wurde dann mit einigen Gramm Aktivkohle behandelt und filtriert. Die klare Lösung wurde dann mit Wasser auf eine Konzentration von 1 η-Salzsäure verdünnt. Beim Stehen schieden sich Pteroylglutaminsäurekristalle aus der Lösung ab.

Beispiel 2

Ein rohes Reaktionsgemisch von 17,5 g, das 5 g reine Pteroylglutaminsäure enthielt, wurde mit 100 ig ιΓ2 η-Salzsäure bei 32⁰C gemischt. Der größte Teil des Stoffes löste sich zu einer klaren braunen Lösung auf, wurde jedoch nach 15 Minuten langem Stehen etwas getrübt. Dann wurden 25 g Aktivkohle zugefügt und nach 20 Minuten das Gemisch filtriert. Der Filterkuchen wurde gewaschen, zuerst mit 20 ecm i<2nSalzsäure, dann mit 10 ecm derselben, und das Filtrat samt Waschsäure mit iooccrn Wasser verdünnt und auf 5⁰C ungefähr ι Stunde lang abgekühlt. Der Niederschlag wurde auf dem Filter gesammelt, mit Wasser und Aceton gewaschen und getrocknet. Die chemische Untersuchung des Produktes ergab einen Gehalt von 82,1 °/o Pteroylglutaminsäure. Ausbeute 1,334g.

Nach Stehen über Nacht setzte die Lösung eine zweite Ausbeute an Kristallen ab, die einen etwas höheren Reinheitsgrad aufwiesen. Ausbeute 0,44 g einer 85,o,⁰/oigen Pteroylglutaminsäure.

Beispiel 3 _g5

4 g eines rohen Reaktionsproduktes, das 24,8% reine Pteroylglutaminsäure enthielt, während der Rest aus verwandten Pteridinen und einigen Filterresten bestand, wurden mit 20 ecm I2n-Salzs:äure gemischt, dann 1 g Aktivkohle zugefügt und der Schlamm filtriert. Das leicht gelbe Filtrat wurde auf 100 ecm mit Wasser verdünnt und abgekühlt. Nach 16 Stunden wurde der gebildete gelbe Niederschlag gesammelt, mit Wasser und Aceton gewaschen und getrocknet. Bei der Analyse ergab das Produkt 85,5 °/oige Pteroylglutaminsäure. Ausbeute 0,8555 g.

Beispiel 4

Ein rohes Gemisch von 10,4g, das ig reine Pteroylglutaminsäure in Form des Zinksalzes enthielt, wurde mit 20ecm I2n-Salzsäure angeteigt und mit 1 g Aktivkohle behandelt. Der Schlamm wurde dann filtriert und der Kuchen mit genügend Wasser gewaschen, so daß sich ein Gesamtvolumen von 100 ecm ergab. Pteroylglutaminsäure von höherem Reinheitsgrad schied sich beim Stehen aus der Lösung aus. Ausbeute 0,344 g.

Beispiel ς

Zu 40 ecm konzentrierter Salzsäure wurden bei Zimmertemperatur 3,91 g 39,3 °/oige Pteroylglutaminsäure sowie 10 g Aktivkohle zugefügt und der Schlamm V2 Stunde lang gerührt. Nach dem Filtrieren durch ein gesintertes Glasfilter wurde das Filtrat auf 430 ecm verdünnt. Nach Vsstündigem

Stehen bei Zimmertemperatur begann'die Pteroylglutaminsäure aus der Lösung auszukristallisieren. Die Lösung würde ³A Stunde lang bei 25° C gerührt und dann auf 10⁰C abgekühlt, die festen Teile abfiltriert und mit Wasser und Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen bei 6o° C ergab die Analyse einen Gehalt von 92,2 °/o Pteroylglutaminsäure und 2.9 °/o Wasser. Ausbeute 1,11g.

Beispiel 6

Das in dem vorstehenden Beispiel beschriebene Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von weniger Aktivkohle, 3 Gewichtsteile für jedes Teil reine Pteroylglutaminsäure. Das erhaltene Produkt hatte einen wenig höheren Reinheitsgrad und wurde in wesentlich höherer Ausbeute gewonnen.

Beispiel 7

ao 5 g 88 Voiger Pteroylglutaminsäure wurden in 50 ecm 37°/oiger Salzsäure gelöst, mit 5 g Aktivkohle behandelt und filtriert. Die Kohle wurde mit 100 ecm Chlorwasserstoff gewaschen und darauf die Waschwässer mit dem Filtrat vereinigt, das

as dann auf 500 ecm mit warmem Wasser verdünnt wurde. Bei dem Stehen bei 4 bis 6° C schieden sich 4,6 g kristallinische Pteroylglutaminsäure ab. Nach Wiederholen der Kristallisation wurde das Produkt gesammelt, mit Wasser, Alkohol und Äther gewaschen und bei 140⁰ C 4 Stunden lang getrocknet. Die chemische Analyse des Produktes auf C, H und X ergab nahezu vollständig die hteoretischen Werte für C₁₉H₁₉O₆N₇ · H₂O.

Beispiele

2,78 g eines Rohmaterials, das i2°/o Pteroylglutaminsäure enthielt, wurden in 15 ecm 15 η-Phosphorsäure gelöst. Die Lösung wurde dann mit 2,78 g Aktivkohle behandelt und filtriert. Die Kohle wurde mit 10 ecm Phosphorsäurelösung gewaschen, die Waschflüssigkeiten und das Filtrat vereinigt und auf 100 ecm mit Wasser verdünnt. Nach Stehen über Nacht bei 4 bis 6° C wurde eine 50°/oige Pteroylglutaminsäure erhalten. Ausbeute 0,42 g.

Nach zweifacher Wiederholung der vorstehend beschriebenen Behandlung stieg der Reinheitsgrad der Pteroylglutaminsäure auf ungefähr 92 °/o bei einer Ausbeute von 0,104 g.

Beispiel 9

2,78 g I2%»iger Pteroylglutaminsäure wurden in einem Gemisch von 20 g Trichloressigsäure in 20 g Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde mit 1 g Aktivkohle behandelt, filtriert und auf 120 ecm mit Wasser verdünnt. Das Gemisch wurde erwärmt, bis sich eine klare Lösung ergab, die dann mit 1 g Aktivkohle behandelt und filtriert wurde. Beim Abkühlen des Filtrats schied sich schnell eine teerige Masse ab, die entfernt wurde. Beim Stehen bei 4 bis 6° C schieden sich Pteroylglutaminsäurekristalle von 8o°/oigem Reinheitsgrad aus. Ausbeute 0,22 g. Eine zweite Ausbeute an Kristallen, die beim weiteren Stehen sich abschieden, hatte einen Reinheitsgrad von 90%. Ausbeute 0,05 g.

Beispiel 10

2,78g" Rohmaterial mit 10% Pteroylglutaminsäuregehalt wurden in 8 ecm i8n-Schwefelsäure gelöst, mit 1 g Aktivkohle behandelt und filtriert. Die Kohle wurde mit 2 ecm I2n-Schwefelsäure gewaschen, die Waschflüssigkeiten mit dem Filtrat vereinigt, das auf 90 ecm verdünnt war, und bei 4 bis 6° C über Nacht stehen gelassen. Die abgekühlte Lösung wurde filtriert und das Filtrat mit Wasser auf 180 ecm verdünnt. Nach dem Stehen bei 4 bis 6° C schied sich Pteroylglutaminsäure von 50 °/o Reinheitsgrad aus. Ausbeute 0,25 g.

Beispielii

5 g i2°/oiger Pteroylglutaminsäure wurden in 20 ecm 48°/oiger Bromwasserstoffsäure gelöst, mit 3 g Aktivkohle behandelt, filtriert, ein zweites Mal mit 3 g Kohle behandelt und nochmals filtriert. Das Filtrat wurde auf 200 ecm mit Wasser verdünnt und über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Das kristalline Produkt, welches sich abgeschieden hatte, wurde gesammelt, gewaschen, getrocknet und untersucht. Es erwies sich als 88°/oige Pteroylglutaminsäure in einer Ausbeute von 0,215 g.

Beispiel 12

Durch Auflösen in starker Säure und darauffolgendes Verdünnen der Lösung erhält man ein wesentlich reineres Produkt bei der Behandlung von Pteroylglutaminsäure, die schon einmal auf 75 bis 90% Reinheit gereinigt worden ist. Die Kristalle der Pteroylglutaminsäure, die sich niederschlagen, haben einen Reinheitsgrad von etwa 95 %. Bei diesem Verfahren wird Pteroylglutaminsäure in heißem 'Wasser mit einem Minimum starker Säure zur Erreichung der Lösung aufgelöst. Beim Abkühlen scheiden sich die genannten Kristalle ab.

ig Pteroylglutaminsäure von 88°/oigem Reinheitsgrad wurden in 20 ecm 2on-Phosphorsäure gelöst. Die Lösung wurde dann mit heißem Wasser auf 100 ecm verdünnt. Die Kristallisation setzte alsdann ein. Nach Stehen über Nacht bei 4 bis 6° C konnten 0,88 g Pteroylglutaminsäure von verbessertem Reinheitsgrad gewonnen werden.

Das vorstehende Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von i8n-Schwefelsäure, Ausbeute 0,85 g; 7o%iger Salpetersäure, Ausbeute 0,75g; Dichloressigsäure,Ausbeute0,75g; 90°/oiger Ameisensäure, Ausbeute 0,45 g, ^un^ 75°/oiger Toluolsulfonsäure, Ausbeute 0,2 g. In jedem Fall schied sich Pteroylglutaminsäure von verbessertem Reinheitsgrad ab.

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   i. Verfahren zur Abtrennung der Pteroylglutaminsäure von verwandten Pteridinen, dadurch gekennzeichnet, daß die unreine Pteroylglutaminsäure in einer wäßrigen Lösung einer

   mindestens 2 η-, vorzugsweise wenigstens 5 η-Säure gelöst und die Lösung mit Wasser verdünnt auf eine Normalität von ungefähr 0,5 bis 5 η, vorzugsweise von 1 bis 2 η, gebracht wird, worauf die Pteroylglutaminsäure ausfällt.
2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 'daß der konzentrierten Säurelösung Aktivkohle zugefügt und diese vor der Verdünnung durch Filtrieren wieder entfernt wird.

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