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Verfahren zur Gewinnung der Antibiotika Tetracyclin, Chlor-und/oder
Bromtetracyclin aus ihren wäßrigen Lösungen Die Erfindung betrifft die Gewinnung
der Antibiotika Tetracyclin, Chlor- und/oder Bromtetracyclin aus ihren wäßrigen
Lösungen, die Verunreinigungen der Fennentationmaische enthalten.
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Die Antibiotika Chlortetracyclin, Tetracyclin und Bromtetracyclin
können durch Züchtung von Mikroorganismen und insbeson(tere verschiedener Stämme
von Streptomyces aureofaciens, einschließlich natürlicher und induzierter Mutanten,
hergestellt werden. Die Eigenschaften der Spezies Streptomyces aureofaciens variieren
in so weitem Bereich, daß einige Varianten bei oberflächlicher Betrachtung als zu
anderen Spezies gehörend angesehen werden können, die bei sorgfältigerer Untersuchung
Eigenschaften aufweisen, die identisch sind mit denen bekannter Stämme von Streptomyces
aureofaciens und die daher in diese Spezies zu klassifizieren sind.
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Die Erfindung betrifft die Abtrennung und Gewinnung der Antibiotika
Chlortetracyclin, Tetracyclin und Bromtetracychn auch dann, wenn sie durch einen
Stamm Mikroorganismen erzeugt sind, der von einem bestimmten Mykologen anders eingeordnet
wurde.
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Diese Antibiotika wurden bisher aus ihren wäßrigen ,Lösungen abgetrennt,
indem man sie mit einem organischen
Lösungsmittel extrahierte oder
indem man sie durch geeignete Wahl der Konzentrationen und der Säuren oder Basen
sowie des pa-Wertes in Form eines Salzes mit einer Säure als neutrales -Material
oder in Form eines Salzes mit einer Base ausfällte. Sie sind auch schon aus wäßrigen
Lösungen abgetrennt worden, indem man den Lösungen einen organischen Träger zusetzte,
durch den das Antibiotikum entweder iri Form eines Salzes mit dem Träger ausgefällt
oder irl organischen Lösungsmitteln löslicher gemacht wurde. Bevorzugte organische
Träger sind anionische organische Schwefelsäurederivate der allgemeinen Formel R-0,j-SO.OH,
worin n # o oder i und R einehydrophobeorganischeGruppeist. DasMolekulargewicht
dieser Verbindungen ist im allgemeinen nicht kleiner als etwa 2oo und ist klein
genug, daß das Derivat wenigstens teilweise in Wasser löslich ist. Die bevorzugten
hydrophoben Gruppen sind diejenigen, die, wenn sie unter Bildung einer Verbindung
R-H an Wasserstoff gebunden sind, zu weniger als etwa ? 0/, und vorzugsweise
zu weniger als etwa 1/, "/, in Wasser löslich sind. Geeignete Derivate dieser
Art sind die langkettigen Dialkylsulfosuccinate, Alkylsulfate und substituierten
Alkylsulfenate. Diese Verbindunge*n sind gewöhnlich in Form von Salzen, wie beispielsweise
der Natriumsalze, im Handel verfügbar.
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Bei den bekannten Verfahren zur Gewinnung dieser Antibiotika durch
Ausfällung, Extraktion oder Ab-
trennung bleiben Verunreinigungen der Fermentationsmaische
bei den Antibiotika und fallen mit diesen aus oder werden mit diesen extrahiert,
so daß ein unreines Produkt erhalten wird. Die fertigen pharmazeutischen Produkte
sollen jedoch von heller Farbe und frei von Verunreinigungen sein. Außerdem machen
diese Verunreinigungen die Antibiotika löslich, so daß die gereinigten Materialien
nur in niedrigen Ausbeuten erhalten werden.
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Ein dunkles organisches Pigment unbekannter chemischer Eigenschaften
hat eine besondere Neigung, die Antibiotika bei ihrer Abtrennung und Reinigung zu
begleiten. Sehr geringe Mengen dieses Pigments verändern die hellgelbe Farbe der
reinen Kristalle der Antibiotika in einen bräunlichen Ton. Dieses Dunklerwerden
kann schon durch so geringe Mengen der gefärbten Verunreinigungen hervorgerufen
werden, daß die Wirkung des Antibiotikums dadurch nicht merklich beeinträchtigt
wird. jedoch verliert auch dann das Material durch die Färbung vom pharmazeutischen
Standpunkt aus an Wert.
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Es ist äußerst erwünscht, diese Verunreinigungen zu entfernen und
ein wertvolleres Produkt herzustellen.
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Eine Untersuchung der Ultraviolettabsorption der rohen Antibiotika
ergibt, daß diese Verunreinigungen bei Wellenlängen von 46o mti, d. h. in
einem Bereich, in dem die reinen Antibiotika nur sehr wenig absorbieren, eine starke
Absorption zeigen. Durch die Absorption bei dieser Wellenlänge ergibt sich eine
bequeme Methode zur Messung #er Menge an diese. gefärbten Verunreinigungen. Zu diesem
Zweck wiru die Extinktion einer i 0/,igen Lösung der Probe in Wasser in einer Küvette
mit einem Lichtweg von i cm bei 46o mß -als Einheitswert genommen. Dieser Wert kann
definiert werden als
worin I, Energie des einfallenden Lichtes-und I Energie des austretenden Lichtes
ist.
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Dieser Extinktionskoeffizient ist für gereinigtes Chlortetracyclin
o,16, und ein Wert unter 0,30 ist gewöhnlich für eine pharinazeutische Verwendung
annehmbar.
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. Es wurde nun gefunden, daß viele der Verunreinigungen, die
sonst mit den durch Streptomyces aureofaciens erzeugten Antibiotika oder ihren Salzen
ausfallen oder diese in Lösung halten würden, entfernt oder sequestriert werden,
wenn man der Lösung ein starkes komplexbüdendes Mittel für Metalle und insbesondere
Innerkomplexe bildendes Mittel, dessen pK für Calcium wenigstens 7 ist, zusetzt,
so daß bei allen oben angeführten Gewinnungsverfahren Produkte mit sehr verbesserter
Reinheit erhalten werden.
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Wenn ein Metallion sich mit einem Elektronendonator vereinigt, so
ist die entstehende Substanz ein Komplex oder eine Koordinationsverbindung. Wenn
die Substanz, die sich mit dem Metall vereinigt, zwei oder mehr Donatorengruppen
enthält, so daß ein Ring gebildet wird oder mehrere Ringe gebildet werden, so ist
die entstehende Substanz ein Innerkomplex oder Chelat oder Metallchelat, und der
Donator ist das chelatbüdende Mittel (vgl. Martell, Arthur E.,
Calvin, Melvin,
»Chenüstry of the Metal Chelate Compounds«, Prentice-Hall, Inc., Neiv York _L19521,
S.I).
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-Um für die Entfernung von Verunreinigungen der Antibiotika Chlortetracyclin,
Tetracyclin und Bromtetracychn sowie für deren Gewinnung geeignet zu sein, muß das
chelatbildende Mittel eine stärkere Affinität zu diesen Verunreinigungen besitzen
als die Antibiotika. Die Affinität für Calciumionen ist ein gutes Maß für die Wirksamkeit
bei den vorliegenden Gewinnungsmethoden.
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Die Affinität für Metalle kann durch eine Gleichgewichtskonstante
definiert werden. Die Gleichgewichtskonstante für die Bildung eines Metallinnerkomplexes
durch Umsetzen eines Metalles mit dem chelatbildenden Mittel der Art M
+ nKe = MKe" ist durch die Gleichung gegeben:
worin ( ) die Aktivitäten wiedergibt und MKe" gebildetes Metallchelat, M
Metallion, Ke Chelation, = Anzahl an das Metall gebundene Liganden ist. Der
Logarithmus dieser Konstanten, der für zweiwertiges Calcium als pK##' bezeichnet
werden kann, ist ein bequemes Maß für die Stärke der verschiedenen
chelatbildenden
Mittel. Außerordentlich geeignet sind Aminopolycarbonsäuren, die stabile wasserlösliche
Chelate bilden. Der pK",-Wert beträgt vorzugsweise wenigstens etwa 7, damit
die chelatbildenden Mittel mit Sicherheit stärker sind als die chelatbildende Wirkung
der Antibiotika und daher die Verunreinigungen von den Antibiotika entfernen, so
daß diese in verhältnismäßig reiner Form erhalten werden. Zu den derzeit im Handel
verfügbaren derartigen Aminopolycarbonsäuren gehören: Äthylendiamintetraessigsäure
(HOOCCH,),N-CH27-CH,--N (CH,COOH), Trimethylendiamintetraessigsäure (HOOCCH,),N-CH2#-CH,-CH,7-(CH,COOH#,
Trinitrilotriessigsäure N(CH,COOH), N'-(2-Oxyäthyl)-äthylendianün-N,N,N'-triessigsäure
i, 2-Diamino-cyclohexan-N,N, N', N'-tetra,-essigsäure
Dipropylen-i, 2-triaminpentaessigsäure
I, 3-Diamino-2-propanol-tetraessigsäure (HOOCCH,),NCH,CH(OH)CH,N(CH, COOH), Bis
(N, N-carboxymethyl-2-aminoäthyl)-äther (H 0 0 C C HJ, N -C
H, C H2 0 C H, C H, N (C H, COOH), Bis [2- (N, N-carboxymethyl)-aminoäthoxy)]
äthan (HOOCCH,),N-CH,CH,OCH,CH,OCH, CH,#-N(CH,COOH), z-Aminoäthylphosphonsäure-N,
N-diessigsäure H, 0 P-C H, C H,--N H (C H2 C 0 0 H),
Amülobarbitursäure-N, N-diessigsäure (Uramü-N, N-diessigsäure)
i, 2-Propylendiamintefraessigsäure (H 0 0 C C HJ,N C H (C H,)
C H, N (C H, C 0 0 H), Diäthylentriaminpentaessigsäure
Die durch die Zugabe der chelatbildenden Mittel zu den die Antibiotika enthaltenden
Lösungen erzielten Ergebnisse lassen sich durch die Theorie, daß die Antibiot
' ika mit den mehrwertigen Metallen und mit den Verunreinigungen Komplexe
bilden, erklären. jedoch muß diese Theorie nicht unbedingt zutreffend sein. Die
Antibiotika sind selbst chelatbildende Mittel und bilden daher mit den Verunreinigungen
Chelate. Wenn ein chelatbildendes Mittel mit einer stärkeren Affinität für die Verunreinigungen
anwesend ist, so. wird das Antibiotikum von den Verunreinigungen befreit und ist
leichter in reiner Form erhältlich. Daher ist die Verwendung der chelatbildenden
Mittel für jedes Verfahren geeignet, bei dem die Antibiotika Chlortetracychn, Tetracyclin
und Bromtetracyclin von einer wäßrigen 'Phase abgetrennt werden.
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Die bevorzugte Menge an chelatbildendem Mittel variiert natürlich
mit der Konzentration der Verunreinigungen, die entfernt werden sollen, und dem
angewendeten Verfahren. Häufig sind zwischen o,i und 10/, (Gewicht pro Volumen
Lösung) ausreichend, um die störenden Verunreinigungen so weit zu entfernen, daß
aus einem Maischefiltrat ein pharmazeutisch annehmbares Produkt erhalten wird. Die
Form, in der das Antibiotikum dann erhalten wird, kann leicht in eine pharmazeutisch
erwünschte Form umgewandelt werden, ohne daß eine Umkristallisation oder sonstige
Maßnahme eingeschaltet werden muß, Schon eine geringere Menge an dem chelatbildenden
Mittelkann ein so reines Produkt ergeben, daß einmaliges Umkristallisieren sowohl
die endgültige Reinigung als auch die Umwandlung in die gewünschte Form des Antibiotikums
bewirkt, wodurch die von der Kulturflüssigkeit efzielte Endausbeute erhöht wird.
Auch eine noch geringere Menge ist noch günstig, wenn auch nicht im gleichen Maße,
sofern nicht die Menge an Verunreinigungen gering ist.
Die chelatbildenden
Mittel geben die besten Ergebnisse in dem p.-Bereich von etwa zbisio. Für Chlortetracyclin
wird der untere Teil dieses Bereiches bevorzugt, da Chlortetracyclin sich bei Maßnahmen,
die bei pH-Werten von mehr als etwa 8 durchgeführt werden, leicht zersetzt.
Tetracyclin ist in dem pR-Bereich von 8 bis io stabiler und kann daher leichter
in diesem Bereich gereinigt werden.
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Normalerweise wird der pn-Bereich von etwa 5 bis
8
bevorzugt. Die chelatbildenden Mittel sind besonders geeignet, wenn sie
in Verbindung mit organischen Trägem, wie insbesondere den obenerwähnten anionischen
organischen Schwefelsäurederivaten, verwendet werden. Vorzugsweise wird das chelatbildende
Mittel vor dem Träger zugesetzt, da das chelatbildende Mittel die Verunreinigungen
entfernen soll, die sonst mit dem Träger ausfallen, und da die Gleichgewichtsbedingungen
sich langsamer einstellen, wenn die schon au,-gefallenen Verunreinigungen wieder
aufgelöst werden müssen. Diese pjl-Bereiche sind teilweise niedriger, als sie gewöhnlich
für chelatbildende Mittel empfohlen werden, und decken sogar einen Teil des Bereiches,
Fron dem man annahm, daß er außerhalb des für chelatbildende Mittel wirksamen pl,-Bereiches
läge.
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Bei der Abtrennung mit einem Träger werden bevorzugt i bis
3 MOI Träger pro Mol Antibiotikum verwendet. Sowohl das chelatbildende Mittel
als auch der Träger können in Form ihrer Salze mit Aminen, Ammoniak oder Alkalimetallen
oder in Form der Säuren zugegeben werden, da alle diese Formen in Lösung die freien
Ionen des thelatbilderiden Mittels und des Trägers bilden und da es offensichtlich
diese Ionen sind, die mit dem Antibiotikum und den Verunreinigungen unter Herbeiführung
der gewünschten Ergebnisse reagieren. Die p11-Werte, Temperaturen, Konzentrationen,
Lösungsmittel und Verfahrensbedingungen beeinflussen sich natürlich gegenseitig
und variieren in beträchtlichem Bereich.
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Die Erfindung soll im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert
werden.
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Beispiel i Äthylendiamintetraessigsäure und Di-?,-äthylhexylsulfobernsteinsäure
2,71 einer Chlortetracyclinmaische wurden mit 25 l)/,iger Schwefelsäure auf
Pu 1,5 eingestellt. Die Mischung wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde in
1,41 Wasser aufgeschlämmt, mit Schwefelsäure auf Pr[ 1,5 eingestellt und io Minuten
auf 65' erwärmt. Die Aufschlämmung wurde filtriert und das Filtrat auf Zimmertemperatur
gekühlt. Die vereinigten Filtrate, insgesamt 4 1, wurden mit 8 g eines
handelsüblichen Präparats mit 8o Gewichtsprozent Tetranatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure
versetzt. Nach io Minuten Rühren wurden 18 ml einer 75 0/,igen wUrigen Lösung
von Natrium-di-2-äthylhexylsulfosuccinat zugesetzt. Das Gemisch wurde io Minuten
gerührt. Dann wurde der p.-Wert mit verdünntem Alkali auf 5 eingestellt.
Nachdem weitera io Minuten gerührt war, ließ man den heUgelben Niederschlag des
Chlortetracyclinsalzes äer Di-2-äthylhexylbernsteinsäure 2 Stunden absitzen. Das
überstehende Wasser wurde abdekantiert, und die untere Phase wurde zentrifugiert,
um das restliche freie Wasser zu entfernen. Das abzentrifugierte feste Material
wurde mit 2o ml 2-Äthoxyäthanol vermischt und der pH-Wert mit 25 0/,iger
Schwefelsäure auf 1,9 eingestellt. Nach 15 Minuten Rühren wurden 2 g
Natriumchlorid
zugegeben, und das Gemisch wurde zentrifugiert. Die weniger dichte Phase der Kochsalzlösung
betrug 92 ml. Die dichte organische Phase wurde mit 2o ml 2-Äthoxyäthanol verdünnt
und filtriert. Das Filtrat wurde mit 2 g Natriumchlorid und 2 ml
6 n-Salzsäure versetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und die Kristalle
von Chlortetracyclinhydrochlorid abfiltriert, mit einer kleinen Menge 2-Äthoxyäthanol
und dann mit Äthanol gewaschen und getrocknet. Es wurden 2,5 9 Chlortetracyclinhydrochlorid
mit 972 yg/mg erhalten. Aus Testen ergab sich, daß es ohne weitere Reinigung
direkt für die Therapie verwendet werden konnte.
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Ein Kontrollversuch wurde in der gleichen Weise durchgeführt, nur
wurde das Natriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure fortgelassen. Man erhielt
einen dunkelbraunen Niederschlag des Chlortetracyclinsalzes von Di-2-äthylhexylbernsteinsäure
und erhielt in weiteren Verfahrensstufen 2,79 g eines bräunlichen Chlortetracyclinhydrochlorid
mit 8io pg/mg.
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Beispiel 2 Äthylendiamintetraessigsäure und alkalische Abtrennung
Zu 4 1 eines wie im Beispiel i erhaltenen angesäuerten Maischefiltrats, die
6,24 9 Chlortetracyclin enthielten, wurden unter Rühren 28 ml einer
43 0/,igen wäßrigen Lösung des Tetranatriumsalzes von Äthylendiamintetraessigsäure
zugesetzt, und der p.-Wert der Lösung wurde mit 15 n-Nafriumhydroxyd auf
8,4 eingestellt. Der sich bildende leichtgelbe Niederschlag, der das Chlortetracychn
enthielt, wurde unter Verwendung von 6 g Diatomeenerde als Filterhilfe abfiltriert.
Der Filterkuchen wurde dreimal mit je 20 MI 2-ÄthOXY-äthanol extrahiert und
dann mit Schwefelsäure auf pH 2 eingestellt. Die klaren Extrakte wurden vereinigt,
mit 3 g Natriumchlorid versetzt und mit 12 n-Salzsäure auf pff oß eingestellt.
Chlortetracyclinhydrochlorid kristallisierte aus, und die Ausfällung war nach 24stündigem
Rühren vollständig. Das goldgelbe Chlortetracyclinhydrochlorid wurde abfiltriert,
mit kleinen Mengen 2-Äthoxyäthanol und Äthanol gewaschen und getrocknet. Man erhielt
4,05 9 Produkt mit 96o yglmg. Dieses Produkt kann ohne weitere Reinigung
direkt für pharmazeutische Präparate verwendet werden.
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Beispiel 3
Äthylendiamintetraessigsäure und Tetradecylsulfat
41 eines angesäuerten Maischefiltrats, die wie im Beispiel i hergestellt waren,
wurden gerührt und mit 12 g eines rohen handelsüblichen Präparats, das 8o
0/, Tetranatriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure
enthielt,
versetzt. Der pH-Wert wurde mit wäßrigem Alkali auf 3,5 eingestellt.
Dann wurden unter Rühren 24 9 einer 50 0/, igen Lösung von
Natriumtetradecylsulfat zugegeben. (Dieses Material ist technisch reines. 2-Methyl-7:-äthylundecyl-4-sulfat.)
Nach 40 Minuten wird das Rühren unterbrochen, und man läßt den leichtgelben flockigen
Niederschlag von Chlortetracyclintetradecylsulfat absitzen, dekantiert und trennt
das feste Material durch Zentrifugieren ab. Das feuchte feste Material wurde in
38 ml 2-Äthoxyäthanol gelöst und mit 3 g Natriumehlorid versetzt.
Nach Rühren wurde der pn-Wert mit 25 O/Jger Schwefelsäure auf 2 eingestellt.
Durch Zugabe von 2,5 InI 12 n-Salzsäure und fortgesetztes Rühren erfolgte
Kristallisation des Chlortetracyclinhydrochlorids. Nach Rühren über Nacht wurde
das Produkt von der Mutterlauge abgetrennt, mit 2-Äthoxyäthanol gewaschen und getrocknet.
Man erhielt 6,95 g, die 700 pg/mg aufwiesen.
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Beispiel 4 Äthylendiamintetraessigsäure und Extraktion mit Lösungsmitteln
Zu 5 1 eines angesäuerten Maischefiltrats (ggo y g/ml), die wie im Beispiel
i erhalten waren, wurden 15 9
technisch reines Tetranatrium-äthylendianiintetraacetat
zugegeben. Das Gemisch wurde gerührt und der pn-Wert mit Natriumhydroxyd aüf 4,io
eingestellt. Unter fortgesetztem Rühren wurden ioo ml Chloroform, die
8,25 g Natrium-di-(2-äthylhexyl)-sullosuccinat enthielten, zugegeben. Nach
40 Minuten Rühren wurde das ganze Gemisch zentrifugiert. Die vereinigten Chlo-roformextrakte
ergaben io6 ml.
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Der Extrakt wurde 2 Stunden bei 4' mit 20 9
Magnesiumsulfat
getrocknet und im Vakuum auf etwa 15 ml eingeengt. Zu dem Konzentrat wurden
35 ml 7,-Äthoxyäthanol, 1,5 ml Wasser und 1,5 g Triäthylammoniumhydrochlorid
zugegeben. Der p.-Wert wurde mit 1,8 ml konzentrierter Salzsäure auf oj eingestellt.
Nach Altern über Nacht unter kräftigem Rühren bildete sicl# Chlortetracyclinhydrochlorid,
wurde abfiltriert, niä kleinen Mengen 2-Äthoxyäthanol, Wasser und Äthanol gewaschen
und dann im Vakuum getrocknet. Man erhielt 3,54 9 mit 815 IL g/rng.
E`#... = 0,770-Das Verfahren wurde unter Fortlassen der Zugabe an Äthylendiamintetraessigsäu-r'>e
- wiederholt. Man erhielt 2,65 g mit 89o Ag/mg. iM.
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Beispiel 5
N-(2-Oxyäthyl)-äthylendiamin-N, N-triessigsäure und
Di-(2-äthylhexyl)-sulfobemsteinsäure Zu 3,5 1 eines angesäuerten Chlortetracyclinmaischefiltrats
wurde Natriumhydroicyd zugesetzt, um den pH-Wert auf 3 zu erhöhen. Dieser
Lösung wurden dann 10,5 g N-(2-Oxyäthyl)-äthylendiamin-N,N',N'-triessigsäure
zugesetzt. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt. Dann wurden 13
g Natrium-di-(2-äthylhexyl)-sulfosuccinat zugesetzt. Der p11-Wert des Gemisches
wurde mit Natriumhydroxyd auf 7 erhöht, und es wurde weitere 4o Minuten gerührt.
Dann ließ man das Chlortetracyclinsalz von Di-(2-äthylhexyl)-sulfobernsteinsäure
3 Stunden absitzen, dekantierte die Lösung und zentrifugierte das feste Material.
Dem feuchten Niederschlag wurden 2o ml 2-Äthoxyäthanol und 250/,ige wäßrige Schwefelsäure
zugesetzf, bis der pH7Wert 9, betrug. Es wurde weitere 15 Minuten gerührt. Dann
wurden 3 g NatAunichlorid zugegeben, und es wurde weitere 15 Minuten
gerührt. Das Gemisch wurde zentrifugiert und die 2-Äthoxyäthanolschicht abgetrennt.
Die Schicht wurde filtriert, der Filterkuchen mit 2o ml 2-Äthoxyäthanol gewaschen,
und Filtrat und Waschflüssigkeit wurden vereinigt. Dazu wurden 0,5 g Natriumchlorid
und so viel konzentrierte wäßrige Salzsäure gegeben, daß der pR-Wert auf
0,5 sank. Das Reaktionsgeraisch wurde 36_Stunden bei Zimmertemperatur unter
kräftigem Rühren gealtert. Das gebildete Chlortetracyclinhydrochlorid wurde abgetrennt
und mit 2-Äthoxyäthanol, Wasser und wasserfreiem Äthanol gewaschen. Nach Trocknen
bei 56' erhielt man 4,35 9 Chlortetracyclinhydrochlorid, bei dem
965 ßg/mg und ein Extinktionskoeffizient von 0,487 festgestellt wurden.
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Beispiel 6
Tetracyclin mit Äthylendiamintetraessigsäure, ohne
Träger 5 1 Tetracychnmalsche mit 5770 A 9/ml wurden mit Schwefelsäure
auf pl, iß eingestellt und i Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurde
Diatomeenerde zugegeben und filtriert. Der Kuchen wurde auf dem Füter mit #
1 Wasser gewaschen und mit Schwefelsäure auf pH 2 eingestellt. Das saure
Maischefiltrat und Waschflüssigkeit ergaben zusammen 5,781 mit 4350 izg/ml
(880/,ige Ausbeute). Ein Teil von 1,92 1
wurde mit Natriumhydroxyd auf pa
8,3 eingestellt und i Stunde gerührt. Dann wurde Diatomeenerde zugegeben
und filtriert. Der Filterkuchen wurde 2 Stunden in -145 ml Wasser vom pl, 1,7 aufgeschlämmt,
filtriert und der Kuchen mit 45 ml Wasser gewaschen. Der saure wäßrige Extrakt und
Waschflüssigkeit wurden vereinigt und ergaben 2o3 ml mit 28 8ooAglm,-Der
saure Extrakt wurde mit Natriumhydroxyd auf P,u 5,5 eingestellt, i Stunde
gerührt, in der Kälte über Nacht gealtert und filtriert. Der Kuchen wurde mit
25 ml Wasser gewaschen. Man erhielt 7,10 g neutrales Tetracyclin mit
758 yglml, E = 3,38 (570/,ige Ausbeute).
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-Der Versuch wurde mit weiteren 1,921 saurem Maischefiltrat wiederholt,
jedoch wurden dem sauren wäßrigen Extrakt 4g Natriumäthylendiamüitetraacetat
zugegeben, bevor der p]ff-Wert auf 5,5 erhöht wurde. Man erhielt 6,15
g neuträles Tetracyclin mit 887 A 9/ml, E = 3J4
(58 0/0 Gesamtausbeute).
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Beispiel 7
Bromtetracyclin mit Äthylendiamintetraessigsäure
und Di-(2-äthylhexyl)-bernsteinsäure 3 1 Bromtetracyclin enthaltende Ferrnentationsbrühe
wurden mit 250/,iger Schwefelsäure auf p" 1,8 eingestellt. Dann wurde Diatoffieenerde
zugegeben und die Aufschlämmung filtriert. Der Kuchen wurde mit
11
warmem Wasser (4o') gewaschen, auf Pii 1,5 angesäuert und wieder filtriert. Die
vereinigten Filtrate ergaben 3,8 1. Sie wurden im Vakuum bei 25' auf
11
eingeengt. Der pH-Wert wurde, durch Zugabe von 4 9 8o 0/,igem Tetranatriumsalz
von Äthylendiamintetraessigsäure und 2 ml io n-Nlatriunihydroxyd auf 3,5
eingestellt. Die Lösung wurde langsam gerührt, und es wurden 3 g einer 750/jgen
Lösung von Natriuin-di-(2-äthylhexyl)-sulfosuccinat zugesetzt. Es bildete sich ein
Niederschlag. Das Gernisch wurde eine weitere Stunde gerührt. Dann wurde das Rühren
unterbrochen. Nach 2stündigem Absitzen wurde die überstehende Flüssigkeit dekantiert.
Der Niederschlag wurde zentrifugiert und der Rest der so befreiten wäßrigen Phase
verworfen. Dem " Niederschlag wurden To ml 2-Äthoxyäthanol zugegeben. Der
p_U-Wert wurde unter kräftigem Rühren mit Schwefelsäure auf 2,?, eingestellt. Unter
fortgesetztem Rühren wurden 1,5 g Natriumbromid zugegeben. Nach
-15 Minuten wurde das Rühren unterbrochen. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert.
Man erhielt zwei flüssige Phasen. Die verbrauchte wäßrige Phase wurde verworfen.
Die 2-Äthoxyäthanolphase, die den größten Teil des Bromtetracyclins enthielt, wurde
- mit 5 ml 2-Äthoxyäthanol verdünnt und filtriert. Dem filtrierten
Extrakt wurden 0,5 g Natriumbromid zugegeben, und der pn-Wert wurde mit i
ml Bromwasserstoffsäure auf 0,5 - eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde
30 Stunden gerührt. Das rohe Bromtetracychnhydrobromid wurde :filtriert und
mit geringen Mengen 2-Äthoxyäthanol, Wasser und Äthanol gewaschen. Das Produkt wurde
bei 560 getrocknet. Man erhielt iß g mit 89o pg/mg.
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Beispiel 8
Tetracyclin mit Äthylendiainintetraessigsäure und
Di-(z-äthylhexyl)-sulfobemsteinsäure 2, 1 Tetracyclinmaische, die nach mikrobiologischem
Versuch eine Aktivität von ii g besaßen, wurden mit konzentrierter Schwefelsäure
auf pl, 1,4 eingestellt, 2 Stunden gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde mit
Natriumhydroxydlösung auf Pu 3,4 eingestellt. Dann wurden 2o g Natriumäthylendianüntetraacetat
zugegeben, und das Rühren wurde io Minuten fortgesetzt. Dann wurden 30 g
einer 750/,igen Lösung von Natrium-di-2-äthylhexylsulfosuccinat zugesetzt. Nach
io Minuten Rühren wurde der pR-Wert auf 6,5 eingestellt, und es wurde eineweitereStunde
gerührt. DieAufschlämmung wurde zentrifugiert und das feste Materi2 mit JO ml 2-Äthoxyäthanol
und 2,5 ml konzentrierte Salzsäure vermischt, wodurch der pn-Wert auf
3,2
eingestellt wurde. Dann w urden 2 ml gesättigte Natriumchloridlösung zugegeben,
und das Gemisch wurde zentrifigiert. Der Niederschlag wurde in io ml 2-Äthoxyäthanol
gelöst, wobei man ein Gesamtvolumen von 56 ml erhielt. Dazu wurden im ml
Chloroform zugegeben, und die erhaltene Lösung wurde dreimal mit 4o ml i0/jger Natriumboratlösung
extrahiert, wobei das Extraktionsgemisch, mit Triäthylamin auf pH 9,8 eingestellt
wurde. Eine beträchtliche Menge dunkelgefärbte Verunreinigungen gingen in die wäßrige
Phase über. Die Chloroformphase wurde mit 30 ml gesättigfer Natriumbicarbonatlösung
vermischt und dann mit Natriumhydroxyd auf p.H 10,5 eingestellt. Nach dem Zentrifugieren
wurde in der wäßrigen Phase nur sehr wenig Farbe gefunden. Dasselbe Gemisch wurde
dann auf p.. ii eingestellt. Nach dem Zentrifugieren wurde wiederum nur sehr wenig
Farbe festgestellt. Und'wenn die abgetrennte wäßrige Phase auf pja 7 eingestellt
wurde, wurde kein Niederschlag festgestellt, so daß zu vermuten ist, daß keine merklichen
Mengen an Tetracyclin anwesend waren. Die Chloroformphase wurde dann gewaschen,
indem -man sie dreimal mit je 30 ml wäßriger o,i n-Salzsäure extrahierte.
Die Extrakte waren leichtgelb gefärbt. Schließlich wurde die Chloroformphase mit
30 ml Wasser und vierinal mit ?,5 ml einer i0/#gen Natriumboratlösung, die
alle einen p_,-Wert von io,2 hatten, extrahiert. Wenn die vereinigten alkalischen
wäßrigen Phasen auf Pii 5,6 eingestellt wurden, erschien ein gelber Niederschlag.
Das Gemisch wurde i Stunde gerührt und filtriert und das Produkt mit wenig Wasser
gewaschen und im Vakuum unter 45' getrocknet. Man erhielt 6,75 g gelbes,
festes, neutrales Tetracyclin Init 756 A gimg-Beispiel 9
Tetracyclin
mit Dodecylbenzolsulfonsäure und Äthylei#diaminl,--traessigsäure 6oo ml Tetracyclinmaische
wurden mit 18 n-Schwefelsäure auf p" 1,5 eingestellt, % Stunde gerührt,
mit 12 g Diatomeenerde vermischt, auf 550 erwärmt und sofort filtriert.
Der Kuchen wurde mit :i2o ml Wasser gespült, und die vereinigten Filtrate wurden
nach Stehen im Kühlschrank über Nacht noch einmal filtriert. Der pH-Wert wurde auf
2,9 eingestellt. Unter Rühren wurden 16 g Natriumäthylendiamintetraacetat
und dann 7 g des Natriumsalzes von roher Dodecylbenzolsulfonsäure zugegeben.
Es wurde weiter i Stunde gerührt. Der pH-Wert wurde auf 6,5 eingestellt,
und es wurde noch i Stunde gerührt, während welcher Zeit 5o g Natriumehlorid
zugesetzt wurden. Die Aufschlämmung wurde zentrifugiert, das feste Material abgetrennt
und im Vakuum getrocknet. Man erhielt neutrales Tetracyclin. Das im Vakuum getrocknete
feste Material enthielt 68."/, der Maischeaktivität und hatte eine Reinheit von
23 0/,.