DE1287574B

DE1287574B - Verfahren zur Herstellung von kristallinem, sehr reinem, praktisch chlortetracyclinfreiem Tetracyclin

Info

Publication number: DE1287574B
Application number: DEN25127A
Authority: DE
Inventors: Svanholm Gert
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1963-06-17
Filing date: 1964-06-16
Publication date: 1969-01-23
Also published as: SE321466B; US3230254A; DK122658B; ES301090A1; GB1038538A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur tetracyclin weitgehend ausgeschaltet werden kann, Herstellung von kristallinem, sehr reinem, praktisch jedoch ist es bisher nicht gelungen, eine derartige chlortetracyclinfreiem Tetracyclin. Bildung von Chlortetracyclin vollständig zu unter-

Bei der Gewinnung von Tetracyclin wird im allge- binden.

meinen derart vorgegangen, daß ein wässeriges tetra- 5 Es sind eine Vielzahl von weiteren Verfahren zur cyclinhaltiges Kulturmedium einem kombinierten Auf- Gewinnung von Tetracyclin bekannt, bei denen jedoch bereitungs- und Reinigungsverfahren unterworfen das Tetracyclin nicht in kristalliner, also nur in grob wird. Wird bei diesem Verfahren eine Extraktion ange- gereinigter Form anfällt. Schließlich sind noch Verwendet, so wird dem Kulturmedium dabei gewöhnlich fahren zur Herstellung von Tetracyclin bekanntgezunächst das Myzel der Mikroorganismen entzogen, io worden, bei denen in einer Zwischenstufe ein Tetradie das Tetracyclin gebildet haben. Anschließend wird cyclinderivat ausgefällt wird, das in einer weiteren das Tetracyclin unter Zuhilfenahme eines organischen Stufe zu Tetracyclin umgewandelt werden muß. Dies Lösungsmittels extrahiert, dem gegebenenfalls noch bedeutet einen erhöhten Arbeitsaufwand, geeignete Trägersubstanzen zugesetzt sind. Der pH- Bei Anwendung der nachstehend noch im einzelnen

Wert des organischen Lösungsmittels ist dabei derart 15 beschriebenen Erfindung ist es möglich, kristallines, gewählt, daß sich soviel Tetracyclin wie möglich in der sehr reines, praktisch chlortetracyclinfreies Tetracyclin organischen Phase löst, wobei das Volumen dieser in einer einzigen Arbeitsstufe aus einer wässerigen verPhase wesentlich kleiner gehalten wird als dasjenige unremigten tetracyclinhaltigen Lösung nach einem eindes Kulturmediums. Die so erhaltene organische fachen Verfahren unter Erzielung einer hohen AusPhase enthält Tetracyclin in konzentrierter Form. 20 beute unmittelbar in kristalliner Form auszufällen, Einige der in dem Kulturmedium noch vorhandenen ohne daß gleichzeitig auch Chlortetracyclin gefällt Verunreinigungen werden nicht in die organische wird.

Phase übergeführt, so daß das Tetracyclin bei diesem Die Erfindung beruht auf der überraschenden Fest-

Vorgang sowohl konzentriert als auch in gewissem stellung, daß die Tetracyclinbase unter Erzielung einer Maße gereinigt wird. Das somit teilweise gereinigte 25 hohen Ausbeute und mit hohem Reinheitsgrad un-Tetracyclin wird anschließend von der organischen mittelbar in kristalliner Form ausgefällt werden kann, Phase abgetrennt, was beispielsweise durch Extraktion wenn einmal dafür Sorge getragen ist, daß bestimmte mit Wasser geschieht. Dies erfolgt bei einem pH-Wert, Ester der Phosphorsäure oder phosphorigen Säure in bei dem das Tetracyclin in der wässerigen Phase weit- entsprechender Konzentration in gelöstem Zustand in aus leichter löslich ist als in dem organischen Lösungs- 30 einem organischen Lösungsmittel vorliegen, welches mittel. Wird die Extraktion mit Wasser durchgeführt, sich mit Wasser nicht oder nur schlecht vermischt, und so wird das Volumen des Extraktionsmittels, d. h. im zum anderen darauf geachtet wird, daß keine Calciumvorliegenden Fall der wässerigen Phase, wesentlich oder andere Metallionen, die mit dem Tetracyclin kleiner gehalten als das Volumen der organischen komplexe Verbindungen bilden könnten, in der wässe-Phase, so daß die Tetracyclinlösung noch weiter kon- 35 rigen tetracyclinhaltigen Lösung in solchen Mengen zentriert wird. Zugleich verbleiben auch einige der in vorhanden sind, daß ein erheblicher Teil des Tetrader organischen Phase noch vorliegenden Verunreini- cyclins komplex gebunden wird, gungen in dieser Phase. Auf diese Weise wird eine kon- Bei Beachtung dieser Maßnahmen ist es möglich, aus

zentrierte wässerige Lösung von Tetracyclin erhalten, einer verunreinigten wässerigen Tetracyclinlösung das aus welcher der Hauptanteil der ursprünglich in dem 40 Tetracyclin in einem derart reinen Zustand auszu-Kulturmedium vorhandenen Verunreinigungen bereits kristallisieren, daß es unmittelbar für therapeutische ausgeschieden ist (vgl. deutsche Auslegeschrift Zwecke verwendet werden kann. Es wird gleichzeitig 1 026 481). von Chlortetracyclin abgetrennt, das in der wässerigen

Die vorstehend beschriebenen Extraktionsverfahren Lösung möglicherweise vorhanden war. können so lange wiederholt werden, bis eine Lösung 45 Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung erhalten wird, welche das Tetracyclin in derart reiner von kristallinem, sehr reinem, praktisch chlortetra- und konzentrierter Form enthält, daß es durch Aus- cyclinfreiem Tetracyclin aus einer mindestens 5000 Tekristallisieren als Tetracyclinbase abgetrennt werden tracyclineinheiten pro Kubikzentimeter enthaltenden kann. Die zunächst aus der Lösung auskristallisierende wässerigen tetracyclinhaltigen Rohlösung ist also freie Tetracyclinbase kann nun durch eine Reihe von 50 dadurch gekennzeichnet, daß der tetracyclinhaltigen Umkristallisationen noch weiter gereinigt werden. Die Rohlösung, die im wesentlichen frei von Calcium- oder Tetracyclinbase kann aber auch im Wege einer Gefrier- anderen Metallionen ist, welche mit Tetracyclin komtrocknung aus der konzentrierten Lösung gewonnen plexe Verbindungen bilden können, ein mit Wasser werden. nicht oder nur schwer mischbares organisches Lösungs-

Es mußte also bisher stets eine verhältnismäßig 55 mittel zugegeben wird, in dem ein Di- oder Monoester große Zahl von Reinigungsvorgängen durchgeführt der Orthophosphorsäure oder der phosphorigen Säure werden, um eine wirksame Ausscheidung der Verun- mit mindestens einem abspaltbaren Wasserstoffatom reinigungen zu gewährleisten und eine reine kristalline im Molekül gelöst ist, daß der pH-Wert der wässerigen Fällung Tetracyclinbase zu erhalten. Lösung vor oder nach der Zugabe des organischen

Wird Tetracyclin durch Fermentation unter Ver- 60 Lösungsmittelsauf 3 bis 8, vorzugsweise auf 5 bis 7, einwendung eines Mikroorganismus gewonnen, welcher gestellt und die kristalline, sehr reine und praktisch sowohl Tetracyclin als auch Chlortetracyclin produ- chlortetracyclinfreie Tetracyclinbase abgetrennt wird, ziert, erscheint es häufig wünschenswert, entsprechende Es war nicht vorherzusehen, daß die in der wässe-

Maßnahmen gegen die Bildung von Chlortetracyclin rigen Ausgangslösung enthaltenen Verunreinigungen zu ergreifen. Es sind nun zwar verschiedene Ver- 65 bei einer derartigen Behandlung im wesentlichen in der fahren bekannt (vgl. die deutschen Auslegeschriften organischen Phase verbleiben würden, so daß die 026 481, 1 039 196, 1 032 480, die britische Patent- kristallin gefällte Tetracyclinbase sich durch einen schrift 773 453), mit deren Hilfe die Bildung von Chlor- hohen Reinheitsgrad auszeichnet.

3 4

Für den Fall, daß die wässerige Tetracyclinlösung kann. Zur näheren Erläuterung sei beispielsweise angeauch Chlortetracyclin enthält, wird mit dem erfindungs- führt, daß bei Verwendung einer wässerigen Tetragemäßen Verfahren eine wirksame Abtrennung des cyclinrohlösung mit einem Tetracyclingehalt von Chlortetracyclins erreicht, so daß die so erhaltenen 25 000 Einheiten pro Kubikzentimeter und von Butyl-Tetracyclinkristalle den normalerweise an Tetracyclin- 5 acetat als organischem Lösungsmittel mit einem bei präparate gestellten Reinheitsanforderungen ohne 5 Gewichtsprozent liegenden Gehalt an Di-(2-äthylweiteres entsprechen. Bei Anwendung des erfindungs- hexyl)-orthophosphorsäureester eine Ausbeute an gemäßen Verfahrens können also ohne weiteres für kristalliner Tetracyclinbase von annähernd 85% eralle praktischen Zwecke Tetracyclinkristalle erhalten zielt wird, wenn das Volumverhältnis zwischen dem werden, welche frei von Chlortetracyclin sind, auch io Butylacetat und der Tetracyclinrohlösung 1: 5 beträgt, wenn die Ausgangssubstanz nicht unwesentliche Men- Falls die rohe Tetracyclinlösung noch Calciumionen gen von Chlortetracyclin enthält. und andere komplexbildende Metallionen enthält,

Wenn die wässerige tetracyclinhaltige Ausgangs- können diese vor dem Auskristallisieren der Tetralösung nur eine unbedeutende Menge an Tetracyclin cyclinbase in bekannter Weise, beispielsweise durch enthält, so ist die Ausbeute an reinem Tetracyclin nur 15 Ionenaustauscher oder Ausfällen schwerlöslicher Vergering; trotzdem kann eine Fällung von Tetracyclin- bindungen, entfernt werden, oder sie können komplex kristallen bereits bei Verwendung einer Lösung er- gebunden werden. Die zuletzt genannte Möglichkeit halten werden, welche Tetracyclin in so geringen Men- kann dabei in der Weise ausgenutzt werden, daß eine gen wie etwa 5000 Einheiten je Kubikzentimeter ent- ein Chelat bildende Verbindung, deren Neigung, mit hält. In der Praxis enthalten die Tetracyclinlösungen ao den Metallionen ein Chelat zu bilden, stärker ist als meist weitaus mehr Tetracyclin und eignen sich deshalb die des Tetracyclins, der wässerigen Tetracyclinlösung ganz besonders gut für die Zwecke der Erfindung. vor der Auskristallisierung zugegeben wird. Eine für

Die zur Verwendung gelangenden Ester der Phos- diesen Zweck besonders geeignete Verbindung ist bei-

phor- und phosphorigen Säure müssen mindestens ein spielsweise Äthylendiamintetraacetat.

abspaltbares Wasserstoffatom im Molekül enthalten 25 Das erfindungsgemäße Verfahren wird im einzelnen

und in dem organischen Lösungsmittel löslich sein. noch durch die nachstehend beschriebenen Beispiele

Die erforderliche Löslichkeit ist dann gegeben, wenn erläutert. In diesem Zusammenhang wird darauf hinge-

der einen Teil des Estermoleküls bildende organische wiesen, daß eine Tetracyclineinheit 1 μg Tetracyclin-

Rest so hydrophob ist, daß die hydrophile Eigenschaft hydrochlorid entspricht und daß die Tetracyclinbase

des durch die Phosphor- oder phosphorige Säure ge- 30 unter Bildung von Kristallwasser kristallisiert, das nur

bildeten Teiles des Estermoleküls so weit unterdrückt durch heftiges Trocknen, beispielsweise durch 12stün-

wird, daß der Ester in dem zur Verwendung gelangen- diges Trocknen bei 6O⁰C im Vakuum, entfernt werden

den organischen Lösungsmittel löslich ist. Es kann kann.

ohne weiteres durch einfache Experimente festgestellt Beispiel 1
werden, welche Ester der vorstehend beschriebenen 35

Gruppe für die Zwecke der Erfindung anwendbar sind. Zu 1001 eines sauren wässerigen Konzentrats aus Bei Verwendung von Diestern können die beiden einem Gemisch von 60 °/₀ Tetracyclin und 40 °/₀ Chlororganischen Reste einander gleich oder verschieden tetracyclin, das durch Extraktion einer Fermentationssein. Besonders geeignete Ester sind der Di-(2-äthyl- flüssigkeit mit Butylacetat erhalten wurde, dem 2,5 °/₀ hexyl)-phosphorsäureester und der Dinonylorthophos- 40 Di-(2-äthylhexyl)-phosphorsäureester bei einem neuphorsäureester. Bei Verwendung dieser Ester wird eine tralen pH-Wert zugegeben waren, wobei dann nochausgezeichnete Reinigung des Tetracyclins und eine mais mit durch Zugabe von Phosphorsäure angegute Ausbeute erzielt. säuertem Wasser extrahiert wurde, werden 241 einer

Die vorgenannten Ester können in verhältnismäßig 5prozentigen Lösung von Di-(2-äthylhexyl)-phosphor-

unterschiedlichen Konzentrationen angewandt werden. 45 säureester in Butylacetat, 241 einer 40prozentigen

Im allgemeinen ist es unzweckmäßig, daß der Anteil Lösung von Natriumäthylendiamintetraacetat in Was-

mehr als 25 Gewichtsprozent beträgt, da sonst z. B. die ser und 10n-Natronlauge bis zur Erreichung eines

Viskosität der organischen Phase sehr stark erhöht pH-Wertes von 5,5 zugegeben. Dann wird das Gemisch

würde. Im allgemeinen werden geringere Konzen- 2 Stunden gerührt. Es wird über Nacht stehengelassen

trationen bis herab zu 1 Gewichtsprozent verwendet. 50 und anschließend filtriert, worauf der so erhaltene

Eine Esterkonzentration von etwa 5 Gewichtsprozent Niederschlag mit Wasser und Butylacetat gewaschen

führt in vielen Fällen zu guten Ergebnissen. Der zweck- und im Vakuum getrocknet wird. Dadurch wird eine

mäßige Konzentrationsbereich liegt zwischen 2 und nur 1,1 °/₀ Chlortetracyclin enthaltende reine kristalline

10 Gewichtsprozent. Tetracyclinbase in einer Ausbeute von 70°/₀ erhalten,

Das Lösungsmittel, in dem der zur Verwendung ge- 55 die direkt in therapeutisch verwendbares Tetracyclin-

langende Ester gelöst wird, kann aus einer Vielzahl von hydrochlorid übergeführt werden kann,

mit Wasser nicht oder nur schwer mischbaren organi- . .

sehen Lösungsmitteln ausgewählt werden. Ausge- Beispiel

zeichnete Ergebnisse wurden bei Verwendung von bei- 89 1 eines 12 000 Einheiten Tetracyclin pro Kubik-

spielsweise Butylacetat, Chloroform, Amylalkohol und 60 Zentimeter enthaltenden sauren wässerigen Rohkon-

Methylisobutylketon erzielt. Die zur Verwendung ge- zentrates werden unter ständigem Umrühren zu 13 1

langende Menge des organischen Lösungsmittels einer 40prozentigen Lösung von Natriumäthylendi-

richtet sich nach dem jeweils verwendeten Ester, dessen amintetraacetat und 101 einer lOprozentigen Lösung

Konzentration und der Menge und Art der vorliegen- von Di-(2-äthylhexyl)-phosphorsäureester in Butyl-

den Verunreinigungen. Die letzteren müssen nämlich 65 acetat gegeben, worauf der pH-Wert durch Zugabe

in dem organischen Lösungsmittel gelöst bleiben, in von 10n-Natronlauge auf 6,4 eingestellt wird. Das

dem auch der verwendete Ester gelöst ist, damit die Gemisch wird über Nacht stehengelassen und dann

Tetracyclinbase zum Kristallisieren gebracht werden filtriert. Der erhaltene Niederschlag wird mit Wasser

und Butylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 1012 g reine Tetracyclinbase mit 885 Einheiten pro Milligramm, die unmittelbar in therapeutisch verwendbares Tetracyclmhydrochlorid umgewandelt werden kann. Der Chlortetracyclingehalt beträgt in diesem Fall 2,0 °/₀.

Beispiel 3

10 g durch Butanolextraktion einer Gärflüssigkeit erhaltenes Rohtetracyclin werden in 100 ecm Wasser gelöst. Es wird konzentrierte Salzsäure zugegeben, bis ein pH-Wert von 1,3 erreicht ist. Dieses Gemisch wird filtriert und mit Wasser gewaschen, bis 140 ecm Filtrat erhalten werden. Zu 130 ecm dieses Filtrats, welches 4,9 g Tetracyclin und 0,3 g Chlortetracyclin sowie etwa 0,5 g Calcium enthalten, werden 1 ecm Di-(2-äthylhexyl)-phosphorsäureester, 9 ccm_ Butylacetat und 10 g in 10 ecm Wasser gelöstes Äthylendiamintetraacetat sowie 10 ecm 10n-Natronlauge gegeben. Anschließend wird intensiv gerührt und der pH-Wert des Gemisches auf 6,4 eingestellt. Nach Abschluß des Kristallisationsvorganges wird das Gemisch filtriert, und die Kristalle werden mit 10 ecm Wasser und 10 ecm Butylacetat gewaschen. Dabei ergibt sich eine Ausbeute von 4,76 g hellgelber Tetracyclinbase mit einer Aktivität von 900 Einheiten Tetracyclin pro Milligramm, die unmittelbar zur Herstellung von therapeutisch verwendbarem Tetracyclmhydrochlorid verwendet werden können. Der Gehalt an Chlortetracyclin liegt bei 1,6 %.

Beispiel 4

6 g rohes Tetracyclin, das etwa 0,3 g Calcium und etwa 2,5 g Tetracyclin enthält, werden in 40 ecm Wasser suspendiert. Es wird Schwefelsäure bis zur Einstellung eines pH-Wertes von 1,5 zugegeben. Das Gemisch wird filtriert und der hauptsächlich aus Calciumsulfat bestehende Niederschlag in 20 ecm Wasser mit einem pH-Wert von 1,5 eingerührt, nochmals filtriert und mit Wasser gewaschen. Dadurch werden 87 ecm Filtrat erhalten, dem unter heftigem Umrühren 20 ecm Butylacetat, 1,5 g Di-(2-äthylhexyl)-orthophosphorsäureester und 10 n-Natronlauge bis zur Erreichung eines pH-Wertes von 5,8 zugegeben werden. Nach Abschluß des Kristallisationsvorganges werden die Kristalle filtriert, mit 10 ecm Wasser und 8 ecm Butylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet. Als Ausbeute ergeben sich 1,55 g reine Tetracyclinbase mit 1013 Einheiten Tetracyclin pro Milligramm, die unmittelbar zu therapeutisch verwendbarem Tetracyclinhydrochlorid verarbeitet werden können. Der Chlortetracyclingehalt beträgt 1,5%.

Beispiel 5

250 ecm eines etwa 7 g Tetracyclin enthaltenden sauren wässerigen Rohkonzentrates werden 50 ecm Butylacetat und 10 ecm »Lensodel A« (enthält Natriumdinonylphosphat) sowie 65 ecm einer 40prozentigen Lösung von Natriumäthylendiamintetraacetat zugegeben, worauf der pH-Wert unter heftigem Umrühren auf 5,8 eingestellt wird. Nach Abschluß des Kristallisationsvorganges werden die Kristalle abfiltriert, mit Wasser und Butylacetat gewaschen und schließlich im Vakuum getrocknet. Als Ausbeute werden 73% Tetracyclinbase erhalten, die unmittelbar zur Herstellung von therapeutisch verwendbarem Tetracyclinhydrochlorid verwendet werden kann. Der Chlortetracyclingehalt liegt bei 1,0 %.

Beispiel 6

200 ecm eines 2700 Einheiten Tetracyclin und Einheiten Chlortetracyclin pro Kubikzentimeter enthaltenden sauren wässerigen Rohkonzentrates werden unter heftigem Umrühren 40 ecm Methylisobutylketon, 2 gDi-(2-äthylhexyl)-phosphorsäureester, 50 ecm einer 40prozentigen Lösung von Natriumäthylendiamintetraacetat und 10 η-Natronlauge bis zur Erreichung eines pH-Wertes von 6,0 zugegeben. Nach Abschluß des Kristallisationsvorganges werden die Kristalle abfiltriert, mit 15 ecm Wasser und 5 ecm Methylisobutylketon gewaschen und im Vakuum getrocknet. Als Ausbeute werden 4,5 g reine Tetracyclinbase erhalten, deren Aktivität bei 981 Einheiten pro Milligramm liegt und die unmittelbar zur Herstellung von therapeutisch verwendbarem Tetracyclinhydrochlorid verwendet werden kann. Der Chlortetracyclingehalt liegt bei 1,8 %.

Erfindungsgemäß können noch folgende Ester mit Erfolg verwendet werden: Phosphorigsäuredecylester, 2-Äthylhexylphosphat, Decylphosphat, Laurylphosphat und Octylphenylphosphat.

Claims

Patentansprüche:

1. Herstellung von kristallinem, sehr reinem, praktisch chlortetracyclinfreiem Tetracyclin aus einer mindestens 5000 Tetracyclineinheiten pro Kubikzentimeter enthaltenden wässerigen tetracyclinhaltigen Rohlösung, dadurch gekennzeichnet, daß der tetracyclinhaltigen Rohlösung, die im wesentlichen frei von Calcium- oder anderen Metallionen ist, welche mit Tetracyclin komplexe Verbindungen bilden können, ein mit Wasser nicht oder nur schwer mischbares organisches Lösungsmittel zugegeben wird, in dem ein Di- oder Monoester der Orthophosphorsäure oder der phosphorigen Säure mit mindestens einem abspaltbaren Wasserstoffatom im Molekül gelöst ist, daß der pH-Wert der wässerigen Lösung vor oder nach der Zugabe des organischen Lösungsmittels auf 3 bis 8, vorzugsweise auf 5 bis 7 eingestellt und die kristalline, sehr reine und praktisch chlortetracyclinfreie Tetracyclinbase abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Phosphorsäureester Di-(2-äthylhexyl)- bzw. Dinonylorthophosphat verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Verwendung gelangende Menge an Phosphorsäureester 2 bis 10 Gewichtsprozent beträgt.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässerige Tetracyclinrohlösung verwendet wird, aus der die Calciumionen und ähnliche Metallionen vermittels einer chelatbildenden Verbindung, vorzugsweise Äthylendiamintetraacetat, entfernt wurden.