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Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclinen aus ihren Lösungen Gegenstand
des Patents 952 632 ist ein Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclinen aus ihren
Lösungen, wobei man die Tetracycline aus ihrer wäßrigen Lösung durch Zugabe von
Eisen(III)-ionen und grenzflächenaktiven sauren Schwefelsäureestern oder Sulfonsäuren
in einem pH-Bereich von 1 bis 4 ausfällt, den Niederschlag in verdünnter Säure suspendiert,
ihn in Gegenwart eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels und
eines Stoffes, der ein größeres Komplexbildungsvermögen zum Eisen(III)-ion aufweist
als das Tetracyclin, zerlegt, die organische Schicht abtrennt, das Lösungsmittel
daraus abdestilliert, den Rückstand in einem niedermolekularen aliphatischen Alkohol
löst und durch Zugabe einer Mineralsäure das Tetracvclin als Salz kristallin abscheidet
und gegebenenfalls durch Umkristallisieren weiter reinigt.
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Gegenstand der Patentanmeldung F 16615 IVc/ 12 o ist eine Abänderung
des Verfahrens des Patents 952 632, wobei die Gewinnung der Tetracycline ohne die
Notwendigkeit des Destillierens der Tetracyclin-Butanol-Lösung durchgeführt werden
kann, indem man die zunächst erhaltene schwefelsäurederivatlialtige Tetracyclin-Eisen(III)-Komplexverbindung
mit einer solchen organischen Base umsetzt, die mit den verwendeten oberflächenaktiven
Schwefelsäurederivaten in organischen Lösungsmitteln lösliche Salze bildet, vorzugsweise
mit einem primären, sekundären oder tertiären Amin oder mit einer quaternären Ammoniumbase,
worauf das Eisensalz des Tetracyclins in die wäßrige Schicht übergeführt wird, aus
der dann durch Umsetzung mit den iin Patent 952632 angegebenen Komplexbildnern
das Tetracyclin isoelektrisch ausgefällt wird. Es werden also die Schwefelsäurederivate
in der organischen Lösung mit geeigneten organischen Basen gebunden.
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In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens zur Gewinnung von Tetracyclinen
aus ihren Lösungen gemäß Patent 952 632 und Patentanmeldung F 16615 IV b / 12o wurde
nun gefunden, daß man die Zerlegung der zunächst erhaltenen schwefelsäurederivathaltigen
Tetracyclin-Eisen(III)-Komplexverbindung vorteilhaft auch in der Weise vornehmen
kann, daß man das Ferriion der Komplexverbindung in einem Zweiphasensystem, das
aus Wasser und einem mit Wasser nicht oder nur teilweise mischbaren Lösungsmittel
besteht, mit Hilfe eines Reduktionsmittels zum Ferroion reduziert und nach der Schichtentrennung
die Tetracycline aus der organischen Schicht gemäß dem Verfahren des Patents 952
632 oder der Patentanmeldung F 16615 IV b / 12 o gewinnt.
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Als Reduktionsmittel können alle Verbindungen verwendet werden, die
zur Überführung des Eisens von der dreiwertigen in die zweiwertige Stufe geeignet
sind, ohne dabei die Tetracycline zu verändern.
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Von den technisch gebräuchlichen Reduktionsmitteln erfüllen insbesondere
Formaldehydnatriumsulfoxylat und Natriumdithionit diese Voraussetzungen, jedoch
ist auch die Verwendung von Metallen, wie Zink, Eisen und Zinn, sowie von reduzierenden
Metallsalzen, wie Zinn(II)-chlorid oder Titan(III)-chlorid, möglich.
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Man arbeitet nach dem Verfahren gemäß der Erfindung zweckmäßig so,
daß man den Niederschlag, wie er nach dem Verfahren des Patents 952 632 durch Ausfällen
der Tetracycline aus ihrer wäßrigen Lösung durch Zugabe von Eisen(III)-ionen und
grenzflächenaktiv en sauren Schwefelsäureestern oder Sulfonsäuren in einem pu-Bereich
von 1 bis 4 erhalten wird, in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel
suspendiert, etwas Wasser zufügt und unter starker Durchmischung das Reduktionsmittel
anteilweise einträgt. Die Beendigung der Zerlegung des Niederschlags ist daran erkennbar,
daß sich dieser aufgelöst hat und daß die kräftige, durch die Eisen(III)-Tetracyclin-Komplexverbindung
hervorgerufene dunkelrotbraune Färbung der Lösung nicht mehr vorhanden ist. Die
Zeit, die zur Zerlegung des Niederschlags erforderlich ist, ist je nach dem verwendeten
Reduktionsmittel verschieden.
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Nach beendeter Zerlegung werden die Schichten getrennt. Hierfür setzt
man zweckmäßig eine Zentrifuge
ein. Die wäßrige Schicht enthält
das zur Fällung eingesetzte Ferrisalz als Ferrosalz. In der organischen Phase befindet
sich das Tetracyclin und die zur Ausfällung zugefügte grenzflächenaktive Substanz.
Aus der organischen Phase gewinnt man das Tetracyclin nach den Angaben des Patents
952 632 oder der Patentanmeldung F 16615 IV b / 12 o.
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Vorzugsweise wird die Zerlegung des Niederschlags im sauren pH-Bereich
vorgenommen, da die Tetracycl_ine in alkalischer Lösung weniger beständig sind und
darüber hinaus das Eisen(II)-ion leichter oxydierbar ist. Beispiel 1 10 1 aufgeschlossene
und vom Mycel befreite Kulturlösung, die einen pH-Wert von 2 bis 2,5 aufweist und
deren Tetracyclingehalt 10 g beträgt, wird mit 50 ccm 20%iger Eisen(III)-chloridlösung
versetzt, und anschließend werden unter Rühren 400 ccm einer 5%igen Lösung des Natriumsalzes
des Schwefelsäuremonododecylesters eingegossen. Nach Zusatz von z. B. 30 g Kieselgur
als Filterhilfsmittel wird das Rühren noch 10 Minuten fortgesetzt und dann der Niederschlag
abgetrennt.
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Der erhaltene Niederschlag wird dann in 500 ccm Butanol und 150 ccm
n/100-Schwefelsäure suspendiert. Nach vollständiger Durchmischung werden unter Kühlen
und Rühren 30 ccm 5 n-Schwefelsäure und 25g Formaldehydnatriumsulfoxylat anteilweise
eingetragen, so daß der PH-Wert zwischen 2 und 3 gehalten wird. Nach dem Eintragen
wird der pH-Wert auf 1,9 bis 2,1 eingestellt und das Rühren etwa 2 bis 3 Stunden
fortgesetzt. Die Temperatur der Lösung soll 20° nicht überschreiten. Nach der Entfärbung,
die etwa die angegebene Zeit beansprucht, wird eine kleine Probe entnommen und auf
Vollständigkeit der Zerlegung geprüft. Nach beendeter Zerlegung werden 40 g Natriumsulfat
eingetragen und nach 10 Minuten die Schichten mittels einer Zentrifuge getrennt.
Die Butanolschicht wird gesondert aufgearbeitet. Die wäßrige Schicht wird mit weiteren
500 ccm Butanol versetzt und die Extraktion 1 Stunde fortgeführt. Man trennt die
Schichten und verwendet den zweiten Butanolextrakt zur Zerlegung eines neuen Ansatzes.
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Der zuerst gewonnene Butanolextrakt wird mit dem gleichen Volumen
Tetrachlorkohlenstoff versetzt, 75 ccm 1n- und 425 ccm n/100-Schwefelsäure werden
eingetragen und nach der Durchmischung 20 g geschmolzenes Oleylamin zugefügt. Nach
kräftiger Durchmischung werden die Schichten getrennt und die organische Schicht
mit weiteren 250 ccm n/100-Schwefelsäure extrahiert. Die Schichtentrennung kann
im Scheidetrichter oder besser mit einer Zentrifuge ausgeführt werden. In die vereinigten
wäßrigen Schichten trägt man 5 g Tetranatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure
ein und stellt unter Rühren und Kühlen mit starker Natronlauge den pH-Wert auf 4,4
bis 4,6 ein. Nach zehnstündigem Stehen wird die auskristallisierte Tetracyclinbase
abgesaugt, mit Wasser nachgewaschen und unter vermindertem Druck bei 50° getrocknet.
Die Ausbeute an Tetracyclinbase beträgt 8,5 g. Das Produkt weist einen Reinheitsgrad
von 91 bis 95 % auf.
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Beispiel 2 10 1 aufgeschlossene und vom Mycel befreite Kulturlösung,
die einen pH-Wert von 2 bis 2,5 aufweist und deren Tetracyclingehalt 15,5 beträgt,
werden mit 50 ccm 20%iger Eisen(III)-chloridlösung versetzt, und anschließend werden
unter Rühren 400 ccm einer 5%igen Lösung des Natriumsalzes des Schwefelsäuremonododecylesters
eingegossen. Nach Zusatz von z. B. 30 g Kieselgur als Filterhilfsmittel wird das
Rühren noch 10 Minuten fortgesetzt und anschließend der Niederschlag abgetrennt.
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Der Niederschlag wird dann in 500 ccm Butanol und 150 ccm n/100-Schwefelsäure
suspendiert. Nach vollständiger Durchmischung werden unter Kühlen und Rühren 30
ccm 5 n-Schwefelsäure und 25 g Natriumdithionit anteilweise eingetragen, so daß
der pH-Wert zwischen 2 und 3 gehalten wird. Nach dem Eintragen wird der pH-Wert
auf 1,9 bis 2,1 eingestellt und das Rühren etwa 10 bis 30 Minuten fortgesetzt. Die
Temperatur der Lösung soll 20° nicht überschreiten. Nach der Entfärbung, die etwa
die angegebene Zeit beansprucht, wird eine kleine Probe entnommen und auf Vollständigkeit
der Zerlegung geprüft. Nach beendeter Zerlegung werden 40 g Natriumsulfat eingetragen
und nach 10 Minuten die Schichten mittels einer Zentrifuge getrennt. Die Butanolschicht
wird gesondert aufgearbeitet. Die wäB-rige Schicht wird mit 500 ccm Butanol versetzt
und die Extraktion 1 Stunde fortgeführt. Man trennt die Schichten und verwendet
den zweiten Butanolextrakt zur Zerlegung des neuen Ansatzes.
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Der zuerst gewonnene Butanolextrakt wird mit dem gleichen Volumen
Tetrachlorkohlenstoff versetzt, 75 ccm 1 n- und 300 ccm n/100-Sc'hivefelsäti,re
werden eingetragen und nach der Durchmischung 20 g geschmolzenes Stearylami-n zugefügt.
Nach der völligen Auflösung des Stearylamins gibt man 12,5 ccm einer 20%igen Eisen(III)-chloridlösung
zu und trennt nach Durchmischung die Schichten mit Hilfe einer Zentrifuge. Die organische
Schicht wird nochmals mit 100 ccm n/100-Schwefelsäure ausgeschüttelt und die wäßrige
Schicht mit der ersten wäßrigen Schicht vereinigt. Die erhaltene wäßrige Schicht
wäscht man mit 50 ccm Tetrachlorkohlenstoff aus. Durch Zugabe des Dinatriumsalzes
der Äthylendiaminotetraessigsäure wird die tiefgefärbte wäßrige Lösung entfärbt
und nach der Entfärbung mit starker Natronlauge auf p$ 4 bis 6 eingestellt. Die
auskristallisierte Tetracyclinbase wird nach 10 Stunden abgetrennt und unter vermindertem
Druck getrocknet.
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Die Ausbeute an Tetracyclinbase beträgt 13,1 g. Das Produkt weist
einen Reinheitsgrad von 85 bis 90 % auf. Beispiel 3 51 aufgeschlossene, saure und
vom Mycel befreite Oxytetracyclinkulturlösung mit einem Gehalt von 7,3 g Oxytetracyclin
werden mit 25 ccm einer 20%igen wäßrigen Ferrichloridlösung versetzt; hierzu werden
unter mäßigem Rühren 200 ccm einer 5%igen wäßrigen Lösung des Natriumsalzes des
Schwefelsäuremonododecylesters eingegossen. Der erhaltene Niederschlag wird mit
einer Becherschleuder abgetrennt und, wie nachfolgend beschrieben, zerlegt.
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Man suspendiert den Niederschlag in 200 ccm Butanol und 75 ccm n/100-Schwefelsäure,
trägt 26 g Formaldehydnatriumsulfoxylat unter Eiskühlung anteilweise bei guter Durchmischung
ein und stellt durch Zugabe von 5 n-Schwefelsäure den PH-Wert auf 2 ein. Die weitere
Zerlegung bis zur vollständigen Reduktion des Ferriions zum Ferroion wird unter
starkem Rühren bei Zimmertemperatur vorgenommen. Gewöhnlich werden hierfür 1 bis
2 Stunden benötigt. Die Beendigung der Reduktion ist an dem Verschwinden der charakteristischen,
rotbraunen Eisen(III)-oxytetracyclinfarbreaktion erkennbar. Nun löst man
15
g Natriumsulfat in der Mischung auf und trennt die Schichten mit Hilfe einer Zentrifuge.
Die anfallende wäßrige Schicht wird mit 50 ccm Butanol nachgewaschen. Sie enthält
das zur Fällung benutzte Ferrisalz als Ferrosalz. In den vereinigten butanolischen
Phasen befindet sich das Oxytetracyclin und der Schwefelsäuremonododecylester. Aus
der butanolischen Lösung gewinnt man, wie im Beispiel 1 für Tetracyclin beschrieben,
das Oxytetracyclin. Zur Abtrennung des Natriumsalzes des Schwefelsäuremonododecylesters
vom Oxytetracyclin werden 10 g N-Methyldodecylamin verwendet.
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Die Ausbeute an kristallisierter Oxytetracyclinbase beläuft sich auf
5,7g. Der Reinheitsgrad der Base beträgt 89 bis 91%. Beispiel 4 1 1 aufgeschlossene,
saure und vom Mycel befreite Chlortetracyclinkulturlösung mit einem Gehalt von 1,63
g Chlortetracyclin werden mit 5 ccm einer 20o/oigen wäßrigen Ferrichloridlösung
versetzt; hierzu werden unter mäßigem Rühren 40 ccm einer 5o/oigen wäßrigen Lösung
des Natriumsalzes des Schwefelsäuremonododecylesters eingegossen. Der gebildete
Niederschlag wird abgeschleudert und seine Zerlegung, wie im Beispiel 1 für Tetracyclin
beschrieben, ausgeführt. Durch Aufarbeiten des butanolischen Extraktes nach Beispiel
1 gewinnt man 1,l g
Chlortetracyclin mit einem Gehalt von 85 bis 891/o. Beispiel
s 21 aufgeschlossenes, saures und vom Mycel befreites Oxytetracyclinkulturfiltrat
mit einem Gehalt von 3,1 g Oxytetracyclin werden mit 6 ccm 20o/oiger Ferrichloridlösung
versetzt; hierzu werden unter mäßigem Rühren 72 ccm einer 5o/oigen Lösung des Natriumsalzes
des Schwefelsäuremonododecylesters eingegossen.
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Den abgeschleuderten Niederschlag suspendiert man zur Zerlegung in
75 ccm Butanol und 50 ccm n/100-Schwefelsäure und trägt nach guter Durchmischung
5 g Formaldehydnatriumsulfoxylat unter Eiskühlung und Rühren anteilsweise ein, wobei
durch Zugabe von 5 n-Schwefelsäure der pH-Wert auf 2 eingestellt wird. Nach beendeter
Reduktion löst man in der Mischung 10g Natriumsulfat auf und führt die Schichtentrennung
mit einer Zentrifuge aus. Die wäßrige Schicht wird mit 25 ccm Butanol nachgewaschen
und das Waschbutanol zur Hauptmenge gegeben. Zur Entfernung geringer Schwermetallspuren
wäscht man den Butanolextrakt mit 10 ccm einer wäßrigen Lösung, die 0,5 g Äthylendiamintetranatriumacetat
enthält und mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt ist, aus und dampft
das Butanol im Vakuum auf 50 ccm ein. Der ausgefallene Niederschlag wird abgenutscht
und mit 10 ccm Butanol ausgewaschen. Der Rückstand ist inaktiv und wird verworfen.
Die butanolische Lösung dampft man zur Gewinnung des Oxytetracyclins im Vakuum bis
zum dicken Sirup ein, nimmt den Sirup mit 15 ccm Methanol auf und fällt aus der
methanolischen Lösung das Oxytetracyclin durch Zugabe von 2,5 ccm konzentrierter
Salzsäure als Hydrochlorid aus. Die konzentrierte Salzsäure wird unter Rühren und
Eiskühlung innerhalb von 5 bis 10 Minuten zugetropft. Nach 5stündigem Stehen im
Kühlschrank wird das Oxytetracyclinhydrochlorid abgesaugt und mit wenig Isopropanol
und Äther ausgewaschen. Das im Vakuum bei 50° getrocknete Oxytetracyclinhydrochlorid
wiegt 2,7 g und besitzt einen Reinheitsgrad von 89 bis 93 0/0.