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Verfahren zur Herstellung hydrierter Formylpteroinsäuren Die Erfindung
betrifft die Herstellung von hydrierten Verbindungen, welche den Formylpteroinsäurekern
besitzen, und ist eine weitere Ausbildung des Patents 855261-In der Patentschrift
855 261 ist ein Verfahren zur Herstellung von hydrierten Verbindungen, welche
den Formylpteroinsäurekern besitzen, beschrieben, wobei die di- oder tetrahydrierte
Form einer Verbindung der Formel
oder ein Salz derselben mit einem Formylierungsmittel behandelt wird. In der Formel
bedeutet R ein Hydroxyl- oder Aminosäureradikal. Bei diesem Verfahren werden Formylierungsmittel,
wie z. B. Ameisensäure oder Ester derselben, verwendet; in den meisten Fällen erfordert
die Umsetzung eine Temperatur von 5o bis 2oo°.
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Gemäß der Erfindung wird als Alkylierungsmittel ein Alkylformiminoäther
verwendet. Es werden erhöhte Ausbeuten erhalten, und die Umsetzung kann bei einer
niedrigeren Temperatur, zwischen o und 6o°, durchgeführt werden.
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Die Alkylformiminoäther, welche bei dem Verfahren gemäß der Erfindung
angewendet werden können, sind z. B. Äthylformiminoäther oder Propylformiminoäther.
Die
Umsetzung findet in einem Lösungsmittel, wie z. B. einer wäßrigen alkalischen Lösung,
statt. Die Umsetzung kann auch in einem wasserfreien Medium, wie z. B. in Glykol,
Glykol/Eisessig oder ß-Methoxyäthylacetat, vorgenommen werden.
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Die Umsetzung zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Verbindungen geht
in einem Temperaturbereich von o bis 6o° vor sich. Die für die im wesentlichen beendigte
Umsetzung erforderliche Zeit liegt zwischen etwa 30 Minuten und 6 Stunden.
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Wenn die Hydrierung der Pteroylglutaminsäure in Eisessig oder in Mischungen
von Eisessig mit Äthylenglykol ausgeführt wird, ist es üblich, vor der Umsetzung
mit dem Alkylierungsmittel den Überschuß an Essigsäure durch Eingießen der Lösung
in eine wäßrige Natriumbicarbonatlösung -zu -neutralisieren. Dabei wird so viel
Natriumbicarbonat verwendet, daß man ein pHvon 7 bis 8 in der entstehenden, gepufferten
Lösung erhält. Die dabei angewandte Menge von Natriumbicarbonat soll einen geringen
Überschuß darstellen. Es wurde festgestellt, daß eine anschließende Einstellung
auf pn zi bis 12 und ein kurzes Erhitzen der Lösung eine höhere Ausbeute an aktivem
Material ergibt.
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Gewünschtenfalls kann die hydrierte Pteroylglutaminsäurelösung zusammen
mit dem Äthylformiminoäther durch direktes Ausgießen in wäßrige Natriumhydroxydlösung
neutralisiert werden; in diesem Fall steigt nach anschließendem Erhitzen die Ausbeute
an aktivem Material.
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Nach der beschriebenen Behandlung der hydrierten Pteroylglutaminsäurelösung
bei pu ii bis 12 wird für den biologischen Test oder als Vorstufe für anschließende
Reinigungs- und Isolierungsverfahren die Lösung auf einen pil-Wert von 7 bis 8 neutralisiert.
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Das Formylierungsprodukt kann, sofern es in dem angewandten Lösungsmittel
unlöslich ist, aus dem Reaktionsgemisch direkt abfiltriert werden, oder im Falle
seiner Löslichkeit in dem angewandten organischen Lösungsmittel durch Eingießen
der Reaktionsmischung in Äther isoliert und durch Filtration erhalten werden.
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Die Reinigung kann durch chromatographische Adsorption an Magnesiumsilicat
und nachfolgende Eluierung oder durch fraktionierte Umkristallisation eines der
Metallsalze vervollständigt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren soll nun an Hand der folgenden Beispiele
näher erläutert werden, wobei sich der Ausdruck »Ausbeute an Citrovorum-Aktivität«
auf die Menge an Formyltetrahydropteroylglutaminsäure in Lösung bezieht, und zwar
berechnet auf Grund des biologischen Testes mit Leuconostoc citrovorum 8o81.
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Beispiel i a) 1o Teile Pteroylglutaminsäure (go%ige Reinheit, 8 %
Wasser) werden in 300 Volumteilen Eisessig und Zoo Volumteilen Äthylenglykol aufgeschlämmt.
Zu dieser Aufschlämmung wird i Teil Platinoxyd zugegeben; dann wird die Hydrierung
durchgeführt, bis kein Gas mehr absorbiert wird. Es werden .etwa 2 bis 2,5 Mol Wasserstoff
pro Mol Pteroylglutaminsäure aufgenommen. Der Katalysator wird unter Stickstoff
abfiltriert und das Filtrat sofort zur Umsetzung mit Äthylformiminoäther verwendet.
Das Volumen des Filtrats beträgt 53o Teile oder o,oi7 Teile tetrahydrierte Pteroylglutaminsäure
pro Volumen Lösung.
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b) 30 Volumteile der nach a) hergestellten hydrierten Pteroylglutaminsäurelösung
werden in ungefähr 225 ccm einer 7- bis io%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung
gegossen, zu der 1,27 Teile Äthylformiminoäther-hydrochlorid zugegeben wurden. Die
Neutralisation wird bei o bis 5° durchgeführt. Die Ausbeute an Citrovorumfaktor-Aktivität
beträgt etwa 25-0/0-c) Ein Teil der nach Beispiel ib) erhaltenen wäßrigen Lösung
wird unter Stickstoff mit Natriunihydröxyd auf einen pH-Wert von ii,o bis i2,o eingestellt
und 1/2 Stunde -lang bei 55 bis 6o° erhitzt. Der pH-Wert wird dann; mit Eisessig
auf 7,o bis 8,o erniedrigt. Der Bioversuch zeigt eine Ausbeute von etwa 30 % an
Citrovorumfaktor-Aktivität.
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' Beispiel e a). Weitere 30 Volumteile einer Probe von hydrierter
Pteroylglutaminsäurelösung (hergestellt wie im Beispiel i a) werden in Wasser gegossen,
das i,2 Teile Äthylformiminoäther-hydrochlorid enthält, während der pn-Wert durch
gelegentliche Zugabe von ?o%iger Natriumhydroxydlösung zwischen ii,o und i2,o und
die Temperatur bei o bis 5° gehalten werden. Das erhaltene, endgültige Volumen beträgt
25o Teile. Der Bioversuch zeigt eine Ausbeute von etwa 30 % an Citrovorumfaktor-Aktivität.
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b) Ein Teil der im Beispiel 2 a) erhaltenen wäßrigen Lösung wird unter
Stickstoff i/2 Stunde auf 55 bis 6o° erwärmt. Der pH-Wert wird dann mit Eisessig
auf 7,o bis 8,o erniedrigt. Der Bioversuch zeigt eine Ausbeute von etwa 25 % an
Citrovorumfaktor-Aktivität.
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Beispiel 3 a) Zu 30 Volumteilen hydrierter Pteroylglutaminsäurelösung
(hergestellt wie im Beispiel ia) werden 1,27 Teile Äthylformiminoäther-hydrochlorid
gegeben. Diese Lösung wird dann folgendermaßen behandelt: b) io Volumina der Lösung
aus Beispiel 3 a) werden bei o bis 5° in ungefähr 150 ccm 7- bis io%ige wäßrige
Natriumbicarbonatlösung gegossen. Das endgültige Volumen beträgt 166 Teile. Der
Bioversuch dieser Lösung zeigt eine Ausbeute an Citrovorumfäktor-Aktivität, welche
etwa 38 % entspricht.
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c) Ein Teil der nach Beispiel 3b) hergestellten Bicarbonatlösung wird
unter Stickstoff mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von ii,o bis i2,o eingestellt
und % Stunde bei 55 bis 6o° erhitzt. Der pn-Wert wird dann mit Eisessig auf 7,o
bis 8,o erniedrigt. Die Ausbeute an Citrovorumfaktor-Aktivität beträgt etwa 43 0/0.
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d) io Volumina- hydrierte Pteroylglutaminsäurelösung, welche wie im
Beispiel 3 a) hergestellt worden waren, werden durch gelegentliche Zugabe von
2o°/oiger
Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert zwischen =i und i2 gepuffert und die Temperatur
bei o bis 5° gehalten. Das endgültige Volumen beträgt 166 Teile. Die Ausbeute an
Citrovorumfaktor-Aktivität (festgestellt durch Bioversuch) beträgt etwa 28°/o.
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e) Ein Teil der nach Beispiel 3d) hergestellten wäßrigen Lösung wird
unter Stickstoff 1/2 Stunde auf 55 bis 6o° erwärmt. Der pH-Wert wird dann mit Eisessig
auf 7,o bis 8,o erniedrigt. Die Ausbeute an Citrovorumfaktor-Aktivität (festgestellt
durch Bioversuch) beträgt etwa 50')/,.
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f) =o Volumina hydrierte Pteroylglutaminsäurelösung, welche wie im
Beispiel 3a) hergestellt wurde, wird 1,`2 Stunde auf 5o bis 6o° unter Stickstoff
erwärmt und dann in etwa 150 ccm 7- bis io°/oige wäßrige Natriumbicarbonatlösung
gegossen. Das endgültige Volumen beträgt 166 Teile. Der Bioversuch zeigt eine 2o°/oige
Ausbeute an Citrovorumfaktor-Aktivität.
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g) Ein Teil der Bicarbonatlösung, welche nach Beispiel 3f)
hergestellt wurde, wird unter Stickstoff mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von
==,o bis =2,o eingestellt und 1;'2 Stunde auf 55 bis 6o° erwärmt. Der pH-Wert wird
dann mit Eisessig auf 7,o bis 8,o erniedrigt. Die Ausbeute an Citrovorumfaktor-Aktivität
(festgestellt durch Bioversuch) beträgt 30 %.