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Verfahren zur Herstellung von hydrierten Formylpteroinsäuren Die Erfindung
ist eine weitere Ausbildung des Verfahrens gemäß Patent gxo.892 zur Herstellung
von hydrierten Formylpteroinsäuren.
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Gemäß dem Hauptpatent werden di- bzw. tetrahydrierte Formylpteroinsäure
oder ihre Derivate hergestellt, indem eine formylierte Verbindung der allgemeinen
Formel
(X bedeutet' einen I--Iydroxyl-, Amino- oder Alkylaminorest und R einen Hydroxyl-
oder Aminosäurerest) oder ein Salz derselben hydriert wird. Die erhaltenen Verbindungen
regen das Wachstum von Leuconostoc citrovorum an und besitzen etwa die gleiche biologische
Wirksamkeit wie die natürlich vorkommenden Stoffe mit Citrovorumaktivität.
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Es wurde nun gefunden, daß die Citrovorumaktivität der Tetrahydroderivate
von Ni2-formylpteroinsäure oder ihrer Aminosäureamide und ihrer tautomeren Formen
durch Behandlung mit einem alkalischen Mittel bedeutend erhöht wird und daß durch
diese Maßnahme ein hochaktives, für die Herstellung
von Arzneimitteln
geeignetes Material in guter Ausbeute gewonnen werden kann.
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Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, saß man Tetrahydro-N'2-formylpteroinsäure
oder deren Aminosäureamide in wäßrigem Medium bei einem pH-Wert zwischen 7 und 14,
vorzugsweise zwischen io und i3, mit einem alkalischen Mittel behandelt, wobei ein
alkalisches Salz der Tetrahydro-N7-formylpteroinsäure oder eines Aminosäureamids
derselben erhalten wird. Die Umlagerung des N12-formylderivates in das N'-Derivat
erfolgt vermutlich nach dem folgenden Schema:
R bedeutet eine Hydroxylgruppe oder. einen Aminosäurerest, vorzugsweiss den Glutaminsäurerest
oder den Rest eines Glutaminsäurepeptids, z. B. Glutamylglutaminsäure, Glutamylglutamylglutaminsäure
oder Hexaglutamylglutaminsäure, oder aber Reste einer anderen Aminosäure, wie Asparaginsäure,
Glycin, Alanin oder Serin.
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Als alkalische Mittel sind beispielsweise' Alkalihydroxyde, --carbonate,
-bicarbonate und -phosphate sowie Erdalkalihydroxyde und quaternäre Aminosäurebasen
verwendbar. Die Umsetzung erfolgt in wäßrigem Medium, jedoch können auch Mischungen
von Wasser mit anderen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, z. B. mit Alkohol,.
verwendet werden. Bei Stehen bei Zimmertemperatur verläuft die Reaktion langsam.
Durch Erwärmen auf eine Temperatur von 8o bis ioo° kann erreicht werden, saß sie
in kürzerer Zeit, beispielsweise in 30 Minuten bis zu 2 oder 3 Stunden, erfolgt.
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Das rohe, bei Durchführung des. erfindungsgemäßen Verfahrens entstehende
Reaktionsgemisch enthält neben dem aktiven Material eine Anzahl Pterine, die ähnliche
physikalische und chemische Eigenschaften, jedoch keine Citrovorumaktivität besitzen,
und von denen das aktive Material nur schwer abgetrennt werden kann. Es wurde jedoch
gefunden, saß die Calciumsalze der als Nebenprodukte anwesenden Pterine weniger
in Wasser löslich sind als die Calciümsalze der N7-formyltetrahydropteroylaminosäuren
und saß dieser Unterschied in der Löslichkeit für die Abtrennung des gewünschten
Materials von den Verunreinigungpn praktisch ausgenutzt werden kann. Diese Reinigung
wird so durchgeführt, saß vorzugsweise bei einem pH-Wert von über etwa 8 unter Verwendung
von-Alkali eine Lösung des rohen Reaktionsproduktes hergestellt und die Lösung dann
mit einer wasserlöslichen Calciumverbindung.- versetzt wird. Viele der unerwünschten
Pterine fallen dabei als Calciumsalze aus und können, durch Filtrieren abgetrennt
werden. Auf diese Weise ist es möglich, bei nur sehr geringen Verlusten an aktivem
Material den größten Teil der Verunreinigungen abzutrennen.
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Die Calciumsalze sind beständig gegen Hitze und gegen das Kohlendioxyd
der Luft, sind nicht hygroskopisch und sind daher besonders geeignet für die Herstellung
therapeutischer Präparate für orale, parenterale oder sonstige Verabreichung in,
der Human- und Veterinärmedizin.
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Die Ca-Salze leiten sich von Säuren der allgemeinen Formel
ab. In dieser Formel ist - N H R ein.Aminosäurerest,
wobei - N H
den Aminosäurerest der Aminosäure darstellt. Wenn die Aminosäure Glutaminsäure ist,
dann sind zwei Carboxylgruppen und eine Enolhydroxylgruppe in der Formel vorhanden,
und es sind sowohl Salze mit zwei als auch mit drei Metalläquivalenten denkbar.
Beide Gruppen von Salzen können hergestellt werden, jedoch ist gewöhnlich das Salz
mit- zwei Metalläquivalenten leichter erhältlich und stellt die geeignete Form dar.
Diese Salze können durch Zusatz von Calciumionen im Überschuß zu einer Lösung der
Säuren in Wasser leicht erhalten werden. Das Calciumsalz wird, erforderlichenfalls
nach Klären der Lösung, durch Verdünnen mit einem organischen Lösungsmittel, wie
Alkohol, oder durch Einengen, z. B. durch Eindampfen unter vermindertem Druck, gewonnen.
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Beispiel i Zoo Teile Pteroylglutaminsäure in 650 Teilen go%iger
Ameisensäure werden i Stunde auf 4o bis 50° erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur
setzt man 5 Teile Ascorbinsäure und dann 3 Teile Platinoxyd hinzu und hydriert die
Mischung, bis. 2 Mol Wasserstoff absorbiert sind. Der Katalysator wird dann abgetrennt
und das Filtrat etwa 64 Stunden stehengelassen. Es wird danach in gooo Teile Wasser,
das i4oo Teile Natriumbicarbonat enthält, gegossen. Die erhaltene Lösung hat ein
Volumen von io ooo Teilen und enthält, wie durch biologischen Versuch festgestellt
wurde, 16 Teile an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität. Dann wird Natriumhydroxyd
zugesetzt, bis der p11-Wert der Lösung etwa gleich 12 ist, und die Lösung i Stunde
auf 95° erhitzt, dann gekühlt und mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert.
Die Lösung enthält nun, wie durch biologischen Versuch bestimmt wurde, 41 Teile
an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität.
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Beispiel 2 -454 Teile Pteroylglutaminsäure werden wie in Beispiel
i angegeben behandelt. Nachdem das Reduktionsgemisch in Natriumbicarbonat gegossen
worden war, waren 37 Teile an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität anwesend.
Diese Lösung wird dann mit Natriumhydroxyd bis zu einem pH-Wert von etwa i2 alkalisch
gemacht und i Stunde auf g5° erhitzt. Nach Neutralisieren (pH-Wert 7) wurde durch
biologischen Versuch festgestellt, daß die Lösung 232 Teile an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität
enthält.
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Beispiel 3 Durch dieses Beispiel wird der Einfluß von Zeit, Temperatur,
Verdünnung und Allkali auf die Ausbeute an umgelagerter Tetrahydroförmylpteroylaminosäure
veranschaulicht. Gemäß (A) wurde Tetrahydro-Ni2-formylpteroylglutaminsäure nur mit
Wasser verdünnt. Die Ausbeute betrug 3,9 0/0. Gemäß (B) wurde die gleiche
Menge an Material mit Wasser verdünnt, das Natriumbicarbonat enthielt. Die Ausbeute
stieg auf 1o,2 0/0. Gemäß (C) wurde das Material bis zur gleichen Konzentration
verdünnt, jedoch wurde ' zweimal so viel Natriumbicarbonat zugesetzt. Die Aktivität
oder Ausbeute stieg auf 14,9 0/0. Gemäß (D) wurde ein Teil der Lösung von (C) erwärmt.
Die Ausbeute stieg auf 35;Z 0/0. Die Versuche (E), (F), (G) und (H) dieses Beispiels
zeigen ähnliche Ergebnisse, aus denen ersichtlich ist, daß bei Erwärmen mit Alkali
die höchsten Aktivitäten erzielt werden.
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i g go%iger Pteroylglutalninsäure werden in 2o ccm 87- bis goo/oiger
Ameisensäure i Stunde auf 4o bis 50° erwärmt. Die Lösung wird auf -Raumtemperatur
gekühlt, und dann werden o,i g Platinoxyd-Katalysator zugegeben. Man reduziert die
Mischung, bis 2 Mol Wasserstoff absorbiert sind. Dann wird der Katalysator abfiltriert
und man erhält 21,2 ccm hydrierte Lösung. Verschiedene Portionen dieser Lösung werden
dann wie folgt behandelt: A. i ccm wird in io ccm Wasser gegossen und auf 15 ccm
verdünnt; das p$ beträgt 1,8. Diese Lösung ergibt beim biologischen Versuch i2o
y/ccm Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität, entsprechend einer 3,,g%igen Ausbeute.
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B. i ccm wird zu 1o ccm Wasser, - das i g Natriumbicarbonat enthält,
zugegeben und auf 15 ccm verdünnt; das pH beträgt 3,64. Diese Lösung ergibt beim
biologischen Versuch 310 y/ccm Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität, entsprechend
einer 10,2 %igen, Ausbeute.
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C. io ccm werden zu Zoo ccm Wasser zugegeben, das 2o g Natriumbicarbonat,
also eine theoretisch ausreichende Menge, enthält, um die gesamte vorhandene Acidität
zu neutralisieren. Man verdünnt dann auf 150 ccm. Das p$ der erhaltenen Lösung
beträgt 5,95. Die Ausbeute an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität ist
in diesem Falle 14,9%.
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D. i Teil der Lösung C wird auf einem Dampfbad 30 Minuten lang
erhitzt. Nach 15 Minuten beträgt das p$ 6,6 und nach 3o Minuten 7,45. Diese Lösung
ergibt beim biologischen Versuch 1o67 y/ccm an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität,
was einer Ausbeute von 35,1% entspricht.
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E. Zu i Teil der Lösung C wird Natriumhydroxyd bis zu einem pH-Wert
von 8,1 zugegeben. Diese Lösung ergibt beim biologischen Versuch 167 y/ccm an Substanz
mit Citrovorum-Faktor-Aktivität, entsprechend einer 5,5%igen Ausbeute.
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F. Der Rest der Lösung C wird mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert
von 12 eingestellt. Man läßt i Teil dieser Lösung i Stunde bei Raumtemperatur stehen
und neutralisiert auf einen pH-Wert von 7. Diese Lösung ergibt beim biologischen
Versuch 176 y/ccm an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität, was einer 5,8%igen
Ausbeute entspricht.
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G. Eine Probe von F, mit Natriumhydroxyd bis zu einem pH-Wert von
12 alkalisch gemacht, wird i Stunde auf g5° erhitzt, abgekühlt und auf einen pH-Wert
von 7 eingestellt. Diese Lösung ergibt nun beim biologischen Versuch 1,421 y/ccm,
was eine 46,8%ige Ausbeute anzeigt. Wenn im obigen Beispiel zur Einstellung des
p$ auf ii bis i2 Kaliumhydroxyd verwendet wird, wird die gleiche Aktivitätssteigerung
festgestellt.
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H. Eine Probe von F läßt man 4o Stunden bei Raumtemperatur in alkalischem
Medium stehen und
führt dann den biologischen Versuch durch. Diese
Lösung enthält 775 y/ccm an Substanz mit Citrovorum=" Faktor-Aktivität, entsprechend
einer 25,56/oigen Ausbeute.
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Beispiel 4 .
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5o Teile des Reaktionsproduktes von ioo Teilen Tetrahydropteroylglutaminsäure
und 65o Teilen Ameisensäure werden nach 48stündigem Stehen entnommen und in 50o
Volumteile Äther gegossen. Nach Abfiltrieren des Niederschlags, Waschen mit Äther
und Trocknen unter vermindertem Druck über Caleiumchlorid, hat - das feste Material
ein Gewicht von 7,6 Teilen. Es besitzt als Wachstumsfaktor für Leuconostoc Citrovorum
geringe- Aktivität und ist für die Aufhebung der Aminopterin-Hemmung von Streptococcus
feacalie R dreimal so wirksam wie Pteroylglutaminsäure. Dieses Produkt ist vermutlich
N12-formyl-7, 8, g, io-tetrahydropteroylglutaminsäure oder eine tautomere Ringform
derselben.
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Eine Lösung von 0,o2 Teilen dieses rohen, durch Ausfällung mit Äther
erhaltenen Produktes in 2o Volumteilen o,i-n-Natriumhydroxyd wird 45 Minuten lang
auf dem Dampfbad unter Stickstoffatmosphäre erhitzt. Nach dem Abkühlen und dem Zusatz
von Essigsäure bis zu einem pH von. ,7 bis 7,5 beträgt das Volumen der Lösung 21
Volumteile: Bei der Untersuchung mit Leuconostoc Citrovorum zeigt die Lösung einen
Gehalt von 0,4 mg/ccm Substanz mit .Citrovorum-Faktor-Aktivität. Dies. bedeutet
eine 42°/oige Ausbeute.
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Beispiel s 454 Teile go°/oiger Pteroylglutaminsäure in 3050
Teilen
go°/oiger Ameisensäure werden i Stunde lang auf 40 bis 5ö° erwärmt. Die Lösung wird
dann mit Platinoxyd in Gegenwart von 22;5 Teilen Ascorbinsäure katalytisch hydriert,
wobei 2_Mol Wasserstoff absorbiert werden. Der Katalysator wird abfiltriert und
das Filtrat dann 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird dann in 46 ooo
Teile Wasser, das Natriumbicarbonat im Überschuß enthält, gegossen. Danach stellt
man das p$ mit Natriumhydroxyd.auf ix bis 12 ein, erhitzt die Lösung i Stunde lang
auf go bis ioo°, kühlt auf Raumtemperatur ab und stellt auf einen pH-Wert von 7
bis 8 ein. 204o Teile aktiviertes Magnesiumsilikat (Magnesol) werden dann zugegeben
und das Gemisch 15 Minuten gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird auf Pu 4
eingestellt und mit i8oo Teilen Aktivkohle behandelt. Nach 15 Minuten wird das -Gemisch
filtriert und der Aktiv= kohlekuchen gut mit Wasser ausgewaschen. Der Kuchen wird
dann mit einer heißen Lösung von Ammoniak in verdünntem Äthanol extrahiert, die
Extrakte . auf etwa 220o Volumteile eingeengt und. auf einen pH-Wert von 7 eingestellt.
Eine Lösung von ioo Teilen Calciumchlorid in 275 Teilen Wasser wird dann zugegeben.
Nach dem Klären werden etwa 7ooo Teile Äthanol hinzugefügt, wobei ein heller, cremefarbener
Niederschlag erhalten wird, den man abültriert, mit Äthanol wäscht und trocknet.
Das entstandene Calciumsalz wiegt etwa 24o Teile und ist von 6o°/oiger Reinheit.
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Das so erhaltene Produkt .wird in , iooo Teilen Wasser an einer Säule,
die 320o Teile aktiviertes Magnesiumsilikat (Magnesol) enthält, chromatögraphisch
weiter gereinigt. Die Zonen werden mit Wasser entwickelt. Die Tetrahydroformylpteroylglütaminsäure
geht durch die Säule hindurch und läßt die Verunreinigungen zurück: Die Anwesenheit
der Tetrahydropteroylglutaminsäurefraktion im Bluat wird durch Fällungsproben ermittelt,
indem man einige Tropfen Calciumchlorid- und drei Volumina Alkohol hinzufügt. Die
-Tetrahydroforrnylpteroylglutaminsäurehauptfraktion wird unter Vakuum auf ein Volumen
von 150o Teilen konzentriert, auf alkalisch gemacht (p$ ix), filtriert und das Filtrat
auf p" 7 eingestellt. Man fügt dann eine Lösung von 67,5 Teilen Calciumchlorid in
25o Teilen Wasser zu und fällt nach dein Klären das Calciumsalz der Tetrahydroformylpteroylglutanünsäure
durch Zugabe von 660o Teilen Alkohol aus. Man erhält etwa 87 Teile an weißem Produkt
von etwa 87°/oiger Reinheit. Weitere 4o Teile eines etwas weniger reinen Produktes
werden aus Nachbarfraktionen erhalten. Nach dem erneuten Chromatographieren über
Zoo Teilen Magnesiumsilikat ergeben sie ein Calciumsalz von g6°/oiger Reinheit.