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Publication number: DEA0015687MA
Authority: DE

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 3. Mai 1952 Bekanntgemacht am 27. Oktober 1955

DEUTSCHES PATENTAMT

PATENTANMELDUNG

KLASSE 12p GRUPPE 10 A 15687 IVc/12 ρ

John A. Brockman jun._r Pearl River, N. Y., und Barbara Roth, Middlesex Borough, N. J. (V. St. A.)

sind als Erfinder genannt worden

American Cyanamid Company, New York, N. Y. (V. St. A.)

Vertreter: Dr. F. Zumstein, Patentanwalt, München 2

Verfahren zur Herstellung von hydrierten Formylpteroinsäuren

Zusatz zum Patent 910 892

Die Priorität der Anmeldungen in den V. St. v. Amerika vom 5. Mai und 20. Juni 1951

ist in Anspruch genommen

Die Erfindung ist eine weitere Ausbildung des Verfahrens gemäß Patent 910 892 zur Herstellung von hydrierten Formylpteroinsäuren.

Gemäß dem Hauptpatent werden di- bzw. tetrahydrierte Formylpteroinsäure oder ihre Derivate hergestellt, indem eine formylierte Verbindung der allgemeinen Formel

^x HCO

COR

N'

(X bedeutet einen Hydroxyl-, Amino- oder Alkylaminorest und R einen Hydroxyl- oder Aminosäurerest) oder ein Salz derselben hydriert wird. Die erhaltenen Verbindungen regen das Wachstum von Leuconostoc citrovorum an und besitzen etwa die gleiche biologische Wirksamkeit wie die natürlich vorkommenden Stoffe mit Citrovorumaktivität.

Es wurde nun gefunden, daß die Citrovorumaktivität der Tetrahydroderivate von N^-formylpteroinsäure oder ihrer Aminosäureamide und ihrer tautomeren Formen durch Behandlung mit einem alkalischen Mittel bedeutend erhöht wird und daß durch diese Maßnahme ein hochaktives, für die Herstellung

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von Arzneimitteln geeignetes Material in guter Ausbeute gewonnen werden kann.

Das crfindungsgeinäße Verfahren besteht darin, daß man Tetnihydro-N¹²-forrnylpteroinsäure oder deren Aminosäureamide in wäßrigem Medium bei einem Pi₁-WeH zwischen 7 und 14, vorzugsweise zwischen

II., N

OH

'Ν

II

O
CH

CH„N-

-COR

^XN^/XH

II

(I)

10 und 13, mit einem alkalischen Mittel behandelt, wobei ein alkalisches Salz der Tetrahydro-N⁷-formylpteroinsäure oder eines Aminosäureamids derselben erhalten wird. Die Umlagerung des N¹²-formylderivates in das N'-Derivat erfolgt vermutlich nach dem folgenden Schema:

HO

OH

V-CH₂N -

COR

Imidazolidin-Tautomeres von (I) O

CH

>—COR

alkalisches Mittel N

H₂N-I,

OH

CH

linidazolinium-Tautomeres von (I)

R bedeutet eine Hydroxylgruppe oder einen Aminosäurerest, vorzugsweise den Glutaminsäurerest oder den Rest eines Glutaminsäurcpeptids, z. B. Glutamylglutaminsäurc, Glutamylglutamylglutaminsäure oder Hexaglutainylglutaminsäure, oder aber Reste einer anderen Aminosäure, wie Asparaginsäure, Glycin, Alanin oder Serin.

Als alkalische Mittel sind beispielsweise Alkalihydroxyde, -carbonate, -bicarbonate und -phosphate sowie Erdalkalihydroxyde und quaternäre Aminosäurebasen verwendbar. Die Umsetzung erfolgt in wäßrigem Medium, jedoch können auch Mischungen von Wasser mit anderen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, z. B. mit Alkohol, verwendet werden. Bei Stehen bei Zimmertemperatur verläuft die Reaktion langsam. Durch Erwärmen auf eine Temperatur von Ko bis ioo° kann erreicht werden, daß sie in kürzerer Zeit, beispielsweise in 30 Minuten bis zu 2 oder 3 Stunden, erfolgt.

Das rohe, bei Durchführung des erfmdungsgemäßen Verfahrens entstehende Reaktionsgemisch enthält neben denn aktiven Material eine Anzahl Pterine, die ähnliche! physikalische und chemische Eigenschaften, jedoch keine Citrovorumaktivität besitzen, und von denen das aktive Material nur schwer abgetrennt werden kann. Es wurde jedoch gefunden, daß die Calciumsalze der als Nebenprodukte anwesenden Pterine weniger in Wasser löslich sind als die Calciumsalze der N'-formyltetrahydropteroylaminosäuren und daß dieser Unterschied in der Löslichkeit für die Abtrennung des gewünschten Materials von den Ver-

COR

(Π)

OH

C-CH₂NH

ab. In dieser Formel ist — NHR ein Aminosäurerest,

unreinigungen praktisch ausgenutzt werden kann. Diese Reinigung wird so durchgeführt, daß vorzugsweise bei einem p_H-Wert von über etwa 8 unter Verwendung von Alkali eine Lösung des rohen Reaktionsproduktes hergestellt und die Lösung dann mit einer wasserlöslichen Calciumverbindung versetzt wird. Viele der unerwünschten Pterine fallen dabei als Calciumsalze aus und können durch Filtrieren abgetrennt werden. Auf diese Weise ist es möglich, bei nur sehr geringen Verlusten an aktivem Material den größten Teil der Verunreinigungen abzutrennen.

Die Calciumsalze sind beständig gegen Hitze und gegen das Kohlendioxyd der Luft, sind nicht hygroskopisch und sind daher besonders geeignet für die Herstellung therapeutischer Präparate für orale, parenteral oder sonstige Verabreichung in der Human- und Veterinärmedizin.

Die Ca-Salze leiten sich von Säuren der allgemeinen Formel

HC = O

CONHR

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wobei — NH den Aminosäurerest der Aminosäure darstellt. Wenn die Aminosäure Glutaminsäure ist, dann sind zwei Carboxylgruppen und eine Enolhydroxylgruppe in der Formel vorhanden, und es sind sowohl Salze mit zwei als auch mit drei Metalläquivalenten denkbar. Beide Gruppen von Salzen können hergestellt werden, jedoch ist gewöhnlich das Salz mit zwei Metalläquivalenten leichter erhältlich und stellt die geeignete Form dar. Diese Salze können

ίο durch Zusatz von Calciumionen im Überschuß zu einer Lösung der Säuren in Wasser leicht erhalten werden. Das Calciumsalz wird, erforderlichenfalls nach Klären der Lösung, durch Verdünnen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Alkohol, oder durch Einengen, z. B. durch Eindampfen unter vermindertem Druck, gewonnen.

Beispiel 1

100 Teile Pteroylglutaminsäure in 650 Teilen 90%iger Ameisensäure werden 1 Stunde auf 40 bis 50⁰ erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur setzt man 5 Teile Ascorbinsäure und dann 3 Teile Platinoxyd hinzu und hydriert die Mischung, bis 2 Mol Wasserstoff absorbiert sind. Der Katalysator wird dann abgetrennt und das Filtrat etwa 64 Stunden stehengelassen. Es wird danach in 9000 Teile Wasser, das 1400 Teile Natriumbicarbonat enthält, gegossen. Die erhaltene Lösung hat ein Volumen von 10 000 Teilen und enthält, wie durch biologischen Versuch festgestellt wurde, 16 Teile an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität. Dann wird Natriumhydroxyd zugesetzt, bis der p_H-Wert der Lösung etwa gleich 12 ist, und die Lösung 1 Stunde auf 95⁰ erhitzt, dann gekühlt und mit Essigsäure auf einen p_H-Wert von 7 neutralisiert. Die Lösung enthält nun, wie durch biologischen Versuch bestimmt wurde, 41 Teile an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität.

Beispiel 2

454 Teile Pteroylglutaminsäure werden wie in Beispiel 1 angegeben behandelt. Nachdem das Reduktionsgemisch in Natriumbicarbonat gegossen worden war, waren 37 Teile an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität anwesend. Diese Lösung wird dann mit Natriumhydroxyd bis zu einem p_H-Wert von etwa 12 alkalisch gemacht und 1 Stunde auf 95⁰ erhitzt. Nach Neutralisieren (p_H-Wert 7) wurde durch biologischen Versuch festgestellt, daß die Lösung 232 Teile an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität enthält.

Beispiel 3

Durch dieses Beispiel wird der Einfluß von Zeit, Temperatur, Verdünnung und Alkali auf die Ausbeute an umgelagerter Tetrahydroformylpteroylarninosäure veranschaulicht. Gemäß (A) wurde Tetrahydro-N¹²-formylpteroylglutaminsäure nur mit Wasser verdünnt. Die Ausbeute betrug 3,9 °/₀. Gemäß (B) wurde die gleiche Menge an Material mit Wasser verdünnt, das Natriumbicarbonat enthielt. Die Ausbeute stieg auf 10,2 %. Gemäß (C) wurde das Material bis zur gleichen Konzentration verdünnt, jedoch wurde zweimal so viel Natriumbicarbonat zugesetzt. Die Aktivität oder Ausbeute stieg auf 14,9 %. Gemäß (D) wurde ein Teil der Lösung von (C) erwärmt. Die Ausbeute stieg auf 35,1%. Die Versuche (E), (F), (G) und (H) dieses Beispiels zeigen ähnliche Ergebnisse, aus denen ersichtlich ist, daß bei Erwärmen mit Alkali die höchsten Aktivitäten erzielt werden.

ι g 90%iger Pteroylglutaminsäure werden in 20 ecm 87- bis 90%iger Ameisensäure 1 Stunde auf 40 bis 50° erwärmt. Die Lösung wird auf Raumtemperatur gekühlt, und dann werden 0,1 g Platinoxyd-Katalysator zugegeben. Man reduziert die Mischung, bis 2 Mol Wasserstoff absorbiert sind. Dann wird der Katalysator abfiltriert und man erhält 21,2 ecm hydrierte Lösung. Verschiedene Portionen dieser Lösung werden dann wie folgt behandelt:

A. ι ecm wird in 10 ecm Wasser gegossen und auf 15 ecm verdünnt; das p_H beträgt 1,8. Diese Lösung ergibt beim biologischen Versuch 120 y/ccm Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität, entsprechend einer 3,9%igen Ausbeute.

B. ι ecm wird zu 10 ecm Wasser, das 1 g Natriumbicarbonat enthält, zugegeben und auf 15 ecm verdünnt; das p_H beträgt 3,64. Diese Lösung ergibt beim biologischen Versuch 310 y/ccm Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität, entsprechend einer io,2%igen Ausbeute.

C. 10 ecm werden zu 100 ecm Wasser zugegeben, das 20 g Natriumbicarbonat, also eine theoretisch ausreichende Menge, enthält, um die gesamte vorhandene Acidität zu neutralisieren. Man verdünnt dann auf 150 ecm. Das p_H der erhaltenen Lösung beträgt 5,95. Die Ausbeute an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität ist in diesem Falle 14,9 %.

D. ι Teil der Lösung C wird auf einem Dampfbad 30 Minuten lang erhitzt. Nach 15 Minuten beträgt das p_H 6,6 und nach 30 Minuten 7,45. Diese Lösung ergibt beim biologischen Versuch 1067 y/ccm an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität, was einer Ausbeute von 35,1% entspricht. · .

E. Zu ι Teil der Lösung C wird Natriumhydroxyd bis zu einem p_H-Wert von 8,1 zugegeben. Diese Lösung ergibt beim biologischen Versuch 167 y/ccm an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität, entsprechend einer 5,5%igen Ausbeute.

F. Der Rest der Lösung C wird mit Natriumhydroxyd auf einen p_H-Wert von 12 eingestellt. Man läßt ι Teil dieser Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen und neutralisiert auf einen p_H-Wert von 7. Diese Lösung ergibt beim biologischen Versuch 176 y/ccm an Substanz mit Citrovorum-Faktor-Aktivität, was einer 5,8°/_oigen Ausbeute entspricht.

G. Eine Probe von F, mit Natriumhydroxyd bis zu einem p_H-Wert von 12 alkalisch gemacht, wird ι Stunde auf 95⁰ erhitzt, abgekühlt und auf einen p_H-Wert von 7 eingestellt. Diese Lösung ergibt nun beim biologischen Versuch 1,421 y/ccm, was eine 46,8°/₀ige Ausbeute anzeigt. Wenn im obigen Beispiel zur Einstellung des p_H auf 11 bis 12 Kaliumhydroxyd verwendet wird, wird die gleiche Aktivitätssteigerung festgestellt.

H. Eine Probe von F läßt man 40 Stunden bei Raumtemperatur in alkalischem Medium stehen und

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führt dann den biologischen Versuch durch. Diese Lösung ent hall 775 γ j ecm an Substanz mitCitrovorum-Faktor-Aktivität, entsprechend einer 25,5%igen Ausheule.

Heispiel 4

50 Teile des Reaktionsproduktes von 100 Teilen Tetrahydropteroylgliitaminsäure und 650 Teilen Ameisensäure werden nach 48stündigem Stehen entnommen und in 500 Volumteile Äther gegossen. Nach Abfiltrieren des Niederschlags, Waschen mit Äther und Trocknen unter vermindertem Druck über Calciumchlorid, hat das feste Material ein Gewicht von 7,6 Teilen. ICs besitzt als Wachstumsfaktor für Leuconostoe ("ilrovorum geringe Aktivität und ist für die Aufhebung der Aininopterin-Hemmung von Streptococcus feacalie R dreimal so wirksam wie Pteroylglulaininsäure. Dieses Produkt ist vermutlich N'--formyI-7, 8, 9, io-tetrahydropteroylglutaminsäure oder eine tautomere Kingform derselben.

!Cine Lösung von 0,02 Teilen dieses rohen, durch Ausfällung mit Äther erhaltenen Produktes in 20 Volumleilen 0,1-n-Natriuinhydroxyd wird 45 Minuten lang auf dem Dampfbad unter Stickstoffatmosphäre erhitzt. Nach dem Abkühlen und dem Zusatz von Essigsäure bis zn einem p„ von 7 bis 7,5 beträgt das Volumen der Lösung 21 Volumteile. Bei der Untersuchung mit Leueonostoc Citrovorum zeigt die Lösung einen Gehalt von 0,4 mg/ccm Substanz mit Citrovoruin-Faklor-Aktivität. Dies bedeutet eine 42⁰Z₀IgC Ausbeute.

Beispiel 5

454 Teile o,o"/₀iger Pteroylglutaminsäure in 3050 Teilen ()()°/₍₎iger Ameisensäure werden 1 Stunde lang auf 40 bis 50" erwärmt. Die Lösung wird dann mit Platinoxyd in Gegenwart von 22,5 Teilen Ascorbinsäure katalytisch hydriert, wobei 2 Mol Wasserstoff absorbiert werden. Der Katalysator wird abfiltriert und das FiItrat dann 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird dann in 40 000 Teile Wasser, das Nalriumbicarbonat im Oberschuß enthält, gegossen. Danach stellt man das p_M mit Natriumhydroxyd auf 11 bis 12 ein, erhitzt die Lösung 1 Stunde lang auf 90 bis joo°, kühlt auf Raumtemperatur ab und stellt auf einen Ρι,-Wcrt von 7 bis 8 ein. 2040Teile aktiviertes Magnesiumsilikat (Magnesol) werden dann zugegeben und das Gemisch 15 Minuten gerührt und dann filtriert. Das FiItrat wird auf P₁₁ 4 eingestellt

So und mit 1800 Teilen Aktivkohle behandelt. Nach 15 Minuten wird das Gemisch filtriert und der Aktivkohlekuchen gut mit Wasser ausgewaschen. Der Kuchen wird dann mit einer heißen Lösung von Ammoniak in verdünntem Äthanol extrahiert, die Extrakte auf etwa 2200 Volumteile eingeengt und auf einen ρ,,-Wert von 7 eingestellt. Eine Lösung von 100 Teilen Calciumchlorid in 275 Teilen Wasser wird dann zugegeben. Nach dem Klären werden etwa 7000 Teile Äthanol hinzugefügt, wobei ein heller, cremefarbener Niederschlag erhalten wird, den man abfiltriert, mit Äthanol wäscht und trocknet. Das entstandene Calciumsalz wiegt etwa 240 Teile und ist von 6o°/₀iger Reinheit.

Das so erhaltene Produkt wird in 1000 Teilen Wasser an einer Säule, die 3200 Teile aktiviertes Magnesiiimsilikat (Magnesol) enthält, chromatographisch weiter gereinigt. Die Zonen werden mit Wasser entwickelt. Die Tetrahydroformylpteroylglutaminsäure geht durch die Säule hindurch und läßt die Verunreinigungen zurück. Die Anwesenheit der Tetrahydropteroylglutaminsäurefraktion im Eluat wird durch Fällungsproben ermittelt, indem man einige Tropfen Calciumchlorid und drei Volumina Alkohol hinzufügt. Die Tetrahydroformylpteroylglutaminsäurehauptfraktion wird unter Vakuum auf ein Volumen von 1500 Teilen konzentriert, auf alkalisch gemacht (p_H 11), filtriert und das Filtrat auf p_lr 7 eingestellt. Man fügt dann eine Lösung von 67,5Tcilen Calciumchlorid in 250 Teilen Wasser zu und fällt nach dem Klären das Calciumsalz der Tetrahydroformylpteroylglutaminsäure durch Zugabe von 6600 Teilen Alkohol aus. Man erhält etwa 87 Teile an weißem Produkt von etwa 87°/_oiger Reinheit. Weitere 40 Teile eines etwas weniger reinen Produktes werden aus Nachbarfraktionen erhalten. Nach dem erneuten Chromatographieren über 200 Teilen Magnesiumsilikat ergeben sie ein Calciumsalz von 96°/₀iger Reinheit.

Claims

PATENTANSPRÜCHE:

1. Weitere Ausbildung des Verfahrens gemäß Patent 910 892 zur Herstellung von hydrierten Formylpteroinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach dem Verfahren des Hauptpatents erhältlicheTetrahydro-N¹²-formylpteroinsäurebzw. ihre Aminosäureamide durch Einwirkung von alkalischen Mitteln in wäßrigem Medium bei p_n 7

bis 14, vorteilhaft 10 bis 13, und zweckmäßig bei 80 bis ioo° in ein dem angewandten alkalischen Mittel entsprechendes Salz der Tctrahydro-N'-formylpteroinsäure oder deren Derivate umlagert und aus diesem gegebenenfalls die Säuren in Freiheit setzt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tetrah ydro-N⁷-formylpteroinsäure bzw. ihre Derivate als Ca-Salze gefällt und gereinigt werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man vor Ausfällung der Calciumsalze der Tetrahydro-N⁷-formylptcroinsäurc bzw. ihrer Aminosäureamide diese in Alkali, zweckmäßig bei p_H 8, löst, die Lösung mit einem wasserlöslichen Ca-SaIz versetzt, die dabei als Ca-Salze ausgefällten Verunreinigungen abfiltriert und dann aus dem Filtrat die gewünschten Ca-Salze ausfällt.