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Verfahren zur Herstellung hydrierter Verbindungen mit dem Formylpteroinsäurekern
Die Erfindung betrifft die Herstellung von hydrierten Verbindungen mit dem Formylpteroinsäurekern.
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Im Jahre 1948 entdeckten Sauberlich und Baumann (vgl. Journal of Biological
Chemistry, 176, S. 165, (I948) die Existenz einer Substanz, welche das Wachstum
von Leuconostoc Citrovorum in einem synthetischen Medium anregte. Es wurde gefunden,
daß diese unbekannte Substanz in handelsüblichen Leberextrakten und auch in der
Leber und einer Vielzahl natürlicher Materialien anwesend ist. Weiter wurde gefunden,
daß die unbekannte Substanz den Folinsäurebedarf von Mikroorganismen und Küken ersetzen
kann. Außerdem wurde noch festgestellt, daß der Wachstumsfaktor die Wirkung von
Pteroylglutaminsäureantagonisten aufhebt und überraschenderweise die toxischen Wirkungen
von Aminopterin, N- [p-( (2, 4-Diamino-6-pyrimido-[4, 5-b] -pyrazyl) -methyl] -amino@
-benzoyl]-glutaminsäure, bei Mäusen und Bakterien aufhebt unter Bedingungen, bei
denen Pteroylglutaminsäure unwirksam ist.
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Der Citrovorum-Faktor kommt in natürlichen Produkten in äußerst geringen
Mengen vor, so daß seine Gewinnung außerordentlich schwierig und vom wirtschaftlichen
Standpunkt aus praktisch unmöglich ist. Es wurde jedoch gefunden, daß es möglich
ist, durch ein wirtschaftliches Verfahren Verbindungen herzustellen, die eine verwandte
biologische Wirksamkeit besitzen.
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Die erfindungsgemäßen hydrierten Verbindungen mit dem Formylpteroinsäurekern
werden durch Hydrieren
einer formylierten Verbindung der allgemeinen
Formel
oder eines Salzes derselben hergestellt.
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In dieser Formel bedeuten X und Y Hydroxyl- oder Aminoradikale, Z
ein niedrigmolekulares Alkylradikal, R ein Hydroxyl- oder Aminosäureradikal und
R, und R2 Wasserstoffatome oder Halogene.
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Ir. der obigen Formel wurde R als Hydroxylgruppe oder als Radikal
einer Aminosäure beschrieben. Diese Aminosäure ist vorteilhaft Glutaminsäure oder
ein Peptidder Glutaminsäure, wie Glutamylglutaminsäure, Glutamylglutamylglutaminsäure,
Hexaglutamylglutaminsäure oder C.lycylglutaminsäure. Das Aminosäureradikal kann
jedoch auch das einer anderen Aminosäure sein, wie Asparaginsäure, Glycin, Alanin
oder Serin. Da dieAminosäuren Carboxylgruppen enthalten, können auch die Salze dieser
Verbindungen bei dem Verfahren benutzt «erden.
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Die genaue Struktur der durch die Reduktion der obigen formylierten
Verbindungen erzeugten neuen Verbindungen konnte im Hinblick auf die komplizierte
Natur noch nicht endgültig bestimmt werden. Es wird jedoch angenommen, daß sie durch
eine der folgenden Formeln wiedergegeben werden können:
In dieser Formel haben X, Y, Z, R, R, und R, die oben angegebene Bedeutung. Es sei
auch bemerkt, daß die obigen Verbindungen in tautomeren Formen existieren können,
was von den Bedingungen abhängt, unter denen sie vorliegen. Wie erläutert, können
die Verbindungen in der offenen Form (I) oder der tautomeren geschlossenen Form
(II) existieren.
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Die Reduktion der Formylverbirdungen, wodurch die reuen erfindungsgemäßen
Produkte hergestellt werden, kann entweder mit oder ohne Zuhilfenahme von Katalysatoren
durchgeführt werden. Im Falle einer katalytischen Reduktion kann eine Vielzahl von
Lösungsmitteln bei dem Verfahren verwendet werden, z. B. Wasser, Ameisensäure, Alkohole,
Glykol, Essigsäure oder Dimethylformamid, je nach. der Natur des angewandten Katalysators.
Die Reduktionstemperatur kann über einen weiten Bereich von o' bis etwa 15o° liegen.
Der pH-Wert kann in dem Bereich (wäßriges Medium) von etwa Pu 3 bis p$ 12 variieren.
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Es können viele Reduktionskatalysatoren verwendet werden, wie Platinoxyd,
Palladium auf Aktivkohle oder Raney-Nickel.
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Im allgemeinen verläuft die Umsetzung ziemlich schnell; gute Ausbeuten
können z. B. innerhalb von io Minuten bei Zimmertemperatur unter Verwendung von
Platin in Ameisensäure erzielt «erden. Die Reduktion ist gewöhnlich innerhalb eines
Zeitraumes von 30 Minuten bis etwa 2 Stunden beendet, sie kann jedoch auch
q. Stunden und länger dauern.
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Das im allgemeinen bevorzugte Verfahren zur Herstellung der neuen
erfindungsgemäßen Verbindungen ist folgendes: Das substituierte Pteridin wird zuerst
formyliert, indem man 30 Minuten bis i Stunde bei q.o bis ioo` in go--bis
ioo°;`oiger Ameisensäure erhitzt. Die so hergestellten Formylverbindungen können
gewünschtenfalls isoliert und dann in einem anderen Lösungsmittel reduziert werden.
Es ist jedoch im allgemeinen zweckmäßiger, die Reduktion gleich anzuschließen, indem
die Lösung abgekühlt und ein Katalysator hinzugefügt wird, wonach unter Schütteln
oder Rühren Wasserstoff in die Reaktionsmischung eingeleitet wird. In manchen Fällen
kann es von Vorteil sein, den Katalysator vor dem Vermischen mit dem formylierten
substituierten Pteridin mit Wasserstoff zu aktivieren, obwohl diese Maßnahme nicht
notwendig ist. Der Wasserstoffdruck in dem Reaktionskessel kann von i bis ioo Atm.
oder mehr betragen. Unter den üblichen Bedingungen ist ein Druck von 2 bis 3 Atm.
jedoch zur Erzielung guter Ausbeuten hinreichend. Nach der Reduktion wird der Katalysator
durch Filtration entfernt und die Lösung mit wäßrigem Alkali, wie Natriumbicarbonat,
gepuffert. Wenn es erwünscht ist, die überschüssige Ameisensäure aus der Reduktionslösung
nach der Entfernung des Katalysators zu entfernen, kann die Lösung in Äther gegossen
und das unlösliche biologisch aktive Produkt durch Filtration isoliert werden, oder
das Lösungsmittel kann durch Destillation entfernt und der Rückstand gewonnen werden.
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Wenn Reduktionsmethoden unter Verwendung von Metallen oder Metallkombinationen,
wie Natriumamalgam, Zink, Aluminiumamalgam, Natriumborhydrid, Magnesiumamalgam oder
Magnesium, angewandt werden, so wird gewöhnlich Wasser oder ein im wesentlichen
wäßriges Lösungsmittel verwendet.
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Das reduzierte substituierte Formylpteridin, das wie oben beschrieben
hergestellt wurde, kann an verschiedene adsorbierende Mittel, wie Aktivkohle oder
Magnesiumsilikat, adsorbiert werden. Diese Maßnahmen können zur Reinigung der rohen
Reaktionsprodukte durch chromatographische Adsorptionsmethoden angewandt werden.
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Die folgenden Beispiele sollen die verschiedenen Verfahren zur Erzielung
der biologisch aktiven erfindungsgemäßen Substanzen durch Reduktion von gewissen
substituierten
Formylpteridinen näher erläutern. Die Teile bedeuten Gewichtsmengen, wenn nichts
anderes angegeben ist.
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Beispiel i i Teil 9-Methylfolinsäure wird mit 2o Teilen 98- bis Zoo
°/ oiger Ameisensäure vermischt und auf dem Dampfbad 45 Minuten lang erhitzt. Nach
dem Abkühlen auf Zimmertemperatur werden o,2 Teile Platinoxydkatalysator zugegeben
und die Mischung i Stunde bei 15,87 kg (35 lbs) Wasserstoffdruck reduziert. Das
Platin wird abfiltriert und die Lösung in 3oo Teile Wasser gegossen, das etwa 5o
Teile Natriumbicarbonat oder eine hinreichende Menge desselben zur Erzielung der
Neutralität enthält. Die Lösung wird geklärt und mit Salzsäure auf PH 4 eingestellt.
Dann werden io Teile Aktivkohle zugegeben und die Mischung bei Zimmertemperatur
i " Stunde gerührt und dann filtriert. Der Aktivkohlekuchen wird mit einer Mischung
von Ammoniak-Äthanol extrahiert und das Eluat dann unter vermindertem Druck zur
Trockne verdampft. Der Rückstand wird in etwa 15 Teilen Wasser aufgenommen und auf
pH 7 eingestellt; dann wird eine konzentrierte Bariumchloridlösung, die 0,4 Teile
Bariumchlorid enthält, zugegeben. Die Mischung wird von Verunreinigungen filtriert
und 5o Teile Äthanol zu dem Filtrat zugegeben. Es fällt ein hellgelbes Bariumsalz
von reduzierter 9-Methylio-formyl-pteroylglutaminsäure aus, das nach dem Isolieren
und Trocknen 0,47 Teile wiegt. Beispiel 2 Diese Umsetzung wird in derselben Weise
wie in Beispiel i beschrieben durchgeführt. Aus einem Teil 4-Amino-g-methyl-pteroylglutaminsäure
werden 0,43 Teile eines hellgelbbraunen Bariumsalzes von reduzierter 4-Amino-g-methyl-io-formyl-pteroylglutaminsäure
erhalten. Beispiel 3 0,41 Teile 3', 5'-Dichlor-g-methylfolinsäure in 15 Teilen 98-
bis ioo°/oigerAmeisensäure werden i Stunde auf dem Dampfbad erhitzt. Die Mischung
wird auf Zimmertemperatur abgekühlt, 0,02 Teile Platinoxydkatalysator werden zugegeben
und die Mischung reduziert, bis kein Wasserstoff mehr absorbiert wird. Im Verlauf
von i Stunde werden etwa 2 Mol aufgenommen. Nach der Entfernung des Katalysators
wird die Lösung in 25o Teile Wasser gegossen, das überschüssiges Natriumbicarbonat
enthält. Dann wird Natriumhydroxyd bis annähernd p$ 12 zugegeben und die Mischung
30 Minuten unter Stickstoff auf dem Dampfbad erhitzt. Sie wird dann abgekühlt
und auf PH 4 eingestellt. Es werden 8 Teile Aktivkohle zugegeben und die Mischung
I, , Stunde bei Zimmertemperatur gerührt und anschließend filtriert. Der Kuchen
wird mit einer Ammoniak-Äthanol-Mischung extrahiert, welche dann zur Trockne 'verdampft
wird. Dann werden Äthanol und Äther zugegeben, damit sich der Rückstand verfestigt.
Dieser erwies sich jedoch bei der Isolierung als ziemlich hygroskopisch, so daß
er, in Wasser gelöst, von den unlöslichen Verunreinigungen filtriert und mit einer
konzentrierten, o,i Teil Bariumchlorid enthaltenden Lösung gerührt wurde. Es wurden
2o Teile Äthanol zugegeben, was die Ausfällung des Bariumsalzes der reduzierten
3', 5'-Di-Chlor-g-methyl-io-formyl-pteroylglutaminsäure hervorrief, die nach der
Isolierung ein Gewicht von O,13 Teilen hatte.
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Beispiel 4 Man führt die Umsetzung in der gleichen Weise wie in Beispiel
i beschrieben durch. Es werden aus o,5 Teilen 9-Methyl-3'-chloraminopterin o,og
Teile eines gräulichweißen Bariumsalzes von reduzierter 4-Amino-3'-chlor-g-methyl-io-formyl-pteroylglutaminsäure
erhalten. Beispiel 5 Die Umsetzung wird in derselben Weise wie in Beispiel i durchgeführt,
wobei o,5 Teile 9-Methyl-2'-chlorpteroinsäure an Stelle von 9-Methylfolinsäure verwendet
werden. Es werden 0,023 Teile eines hellgelbbraunen Bariumsalzes der reduzierten
2'-Chlorg-methyl-io-formyl-pteroinsäure erhalten. Beispiel 6 Es wird eine weitere
Umsetzung in der gleichen Weise wie in Beispiel i beschrieben durchgeführt. Aus
i Teil 4-Amino-g-methyl-2'-chlorpteroinsäure werden 0,033 Teile des Bariumsalzes
der reduzierten 2'-Chlor-4-amino-g-methyl-io-formyl-pteroinsäure erhalten. Beispiel
7 i Teil 4-Amino-g-methyl-pteroylasparaginsäure wird in derselben Weise wie in Beispiel
i beschrieben formyliert und reduziert; es werden 0,27 Teile des Bariumsalzes
der reduzierten 4-Amino-9-methylio-formyipteroylasparaginsäure erhalten.