DE855261C - Verfahren zur Herstellung hydrierter Formylpteroinsaeuren - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung hydrierter Formylpteroinsäuren Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von hydrierten Verbindungen, welche den Formylpteroinsäurekern enthalten.
• Sauberlich und Baumann (vgl. Journal of Biologi;al Chemistry, 176, S. 165 [I948]) stellten die Existenz einer Substanz fest, welche anregend auf das Wachstum von Leuconostoc citrovorum in einem synthetischen Medium wirkte. Es wurde gefunden, daß diese unbekannte Substanz in handelsüblichen Leberextrakten und ebenfalls in der Leber und einer großen Anzahl natürlicher Materialien anwesend ist. Nachfolgende Untersuchungen zeigten, daß der Wachstumsfaktor (growth factor) nicht Pteroylglutaminsäure, Vitamin B12 oder irgendeines der anderen früher bekannten Vitamine war, welche in der Leber oder in anderen natürlichen Produkten vorkommen. Es wurde anschließend weiterhin gefunden, daß die unbekannte Substanz den Folinsäurebedarf von Mikroorganismen und Küken ersetzen kann, Außerdem wurde gefunden, daß der Wachstumsfaktor die Wirkung der Pteroylglutaminsäureantagonisten aufhebt und überraschenderweise die toxischen Wirkungen der N-[p-(2, 6-Diamino-8-methylpyrimidino-4, 5-pyrazyl)-aminobenzoyl]-glutaminsäure bei Mäusen und Bakterien unter Bedingungen aufhebt, bei denen Pteroylglutaminsäure unwirksam ist.
• Der Citrovorumfaktor kommt in natürlichen Produkten in äußerst geringen '.Mengen vor, so daß seine Gewinnung aus diesen außerordentlich schwierig und vom wirtschaftlichen Gesichtspunkt aus praktisch unmöglich ist. Es wurde jedoch gefunden, daß es möglich ist, Verbindungen herzustellen, welche dieselbe oder verwandte biologische Wirksamkeit besitzen, durch ein Verfahren, das die Erzeugung von hinreichenden Mengen wirksamer Substanz wirtschaftlich möglich macht, so daß sie in der Medizin verwendet werden können. Da die chemische Struktur des von Sauberlich und Mitarbeitern beschriebenen Leuconostoc-citrovorum-Wachstumsfaktors bisher nicht aufgeklärt wurde, so ist es gegenwärtig nicht möglich, anzugeben, ob alle erfindungsgemäß erzeugten Produkte identisch sind oder nicht, selbst wenn sie dieselbe biologische Wirksamkeit besitzen. Jedoch sind die durch die vorliegende Erfindung umfaßten Produkte neu.
• Die neuen hydrierten Formylpteroinsäuren werden hergestellt, indem man die di- oder tetrahydrierte Form einer Verbindung der Formel oder ein Salz derselben mit einem Formylierungsmittel behandelt. In der obigen Formel bedeutet R eine Hydroxyl- oder Aminosäuregruppe.
• Die di- oder tetrahydrierten Formen der Verbindungen der obigen Formel wurden bereits hergestellt und einige davon in der Literatur beschrieben. Sie umfassen die Di- oder Tetrahydropteroinsäure und die Aminosäureamide derselben, insbesondere Di-oder Tetrahydropteroylglutaminsäure, Di- oder Tetrahydropteroylglutamylglutamylglutaminsäure und andere Aminosäureamide der Di- oder Tetrahydropteroinsäure, wie diejenigen der Asparaginsäure, des Manins oder des Serins. Die Salze dieser Verbindungen können auch bei dem Verfahren verwendet werden. Diese Di- oder Tetraverbindungen können durch Hydrieren von Pteroylglutaminsäure oder verwandten Verbindungen und Derivaten derselben mit i oder 2 Mol Wasserstoff hergestellt werden.
• Die genaue Struktur der erfindungsgemäßen formylierten Verbindungen wurde bisher noch nicht genau festgestellt. Es wird jedoch angenommen, daß sie durch eine der folgenden Formeln wiedergegeben werden können: Dihydroderivate Tetrahvdroderivate In diesen Formeln bedeutet R eine Hydroxylgruppe oder das Radikal einer Aminosäure. Es sei erwähnt, daß die obigen Verbindungen in tautomeren Formen existieren, was von den Bedingungen abhängt, in denen sie vorhanden sind.
• Um die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen durch Umsetzung mit hydrierter Pteroinsäure oder hydrierten Pteroinsäureamiden herzustellen, können verschiedene Formylierungsmittel verwendet werden. Bevorzugte Formylierungsmittel sind Ameisensäure und die Ester und Amide von Ameisensäure und Orthoameisensäure. Unter diesen seien besonders angeführt: Ameisensäure, Methylformiat, Äthylformiat, Butylformiat, Benzvlformiat, Glykolformiat, Methylorthoformiat, Äthylorthoformiat, Formamid, Formamidin und Formanilid.
• Man nimmt die Umsetzung in einem Lösungsmittel vor, das einen Überschuß von Ameisensäure oder Alkylformiat enthalten kann, oder in einem alkoholischen Lösungsmittel. Die Anwesenheit von inerten Lösungsmitteln in der Reaktionsmischung ist zulässig. Das Lösungsmittel soll im wesentlichen wasserfrei sein, wenn ein Alkylformiat verwendet wird.
• Im allgemeinen werden basische Mittel, wie Alkalimetallalkoxyde, Pyridin, Triäthanolamin und andere tertiäre Amine, mitbenutzt, wenn Alkvlformiate verwendet werden. Vorzugsweise werden 2 bis 3 Mol an Alkalimetallalkoxyden für jedes Mol Tetrahydropteroylglutaminsäureverwendet. Es wurden auch größere Überschüsse an Pyridin und tertiären Aminen verwendet.
• Bei Verwendung von Alkylformiaten kann. die Reaktionstemperatur beträchtlich variieren, von etwa 5o bis 200-C, wobei der bevorzugte Temperaturbereich zwischen ioo bis 150°C liegt. Die für die wesentliche Beendigung der Reaktion erforderliche Zeit beträgt von 30 Minuten bis 6 Stunden. Bei Verwendung von Ameisensäure kann die Temperatur beträchtlich zwischen o und ioo°C variieren.
• Nach der Formylierung kann das Produkt direkt abfiltriert werden, was von dem verwendeten Lösungsmittel abhängt, oder die Lösung kann in wäßrigem Natriumbicarbonat gepuffert werden. Es wurde gefunden, daß die entstehende Lösung aktiv ist. Wenn die überschüssige Ameisensäure aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden soll, so kann die Lösung in Äther gegossen und das unlösliche aktive Produkt durch Filtrieren isoliert werden. Die Ameisensäure kann auch durch Destillation oder Absorption entfernt werden.
• Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele näher erläutert werden. Die Teile bedeuten Gewichtsmengen, wenn nichts anderes angegeben ist.
• Beispiel i 5 Teile Dihydropteroylglutaminsäure, 1,6 Teile Natriummethylat und 25 Teile Äthylformiat werden unter Stickstoff 4 Stunden auf i3o°C in einem geschlossenen Rohr erhitzt. Die entstehende gelblichbraungraue Substanz wird abfiltriert, mit Alkohol und Äther gewaschen und getrocknet. Für das -Nlaximum-Wachstum von Leuconostoc citrovorum sind 4 Millimikrogramm dieses Produktes in 2 ccm Kulturmedium erforderlich.
• Beispiel 2 o,5 Teile Dihy-dropteroylglutaminsäure, o,16 Teile trockenes Pyridin und 5 Teile Äthylformiat werden, wie in Beispiel i angegeben, behandelt. 0,33 Mikrogramm dieses Produktes in 2 ccm Kulturmedium sind für das i/2-blaximum-Wachstum von L-uconostoc citrovorum erforderlich.
• Beispiel 3 i Teil Dihydrofolinsäure wird mit 5 Teilen Äthylformiat und i Teil Triäthanolamin vermischt und in einem geschlossenen Rohr unter Stickstoff 4 Stunden auf i5o°C erhitzt. Die entstehende Substanz wird abfiltriert, mit Alkohol und Äther gewaschen und getrocknet. Das Rohprodukt enthält annähernd o,' Gewichtsprozent des Leuconostoc-citrovorum-Wachstumsfaktors.
• Beispiel 4 Eine Lösung von Dilivdrofolinsäure in verdünntem Natriumhydroxy#d wird in einen großen Überschuß Alkohol gegossen, und der entstehende Niederschlag des Natriumsalzes der Dihydrofolinsäure wird abfiltriert. i Teil des Natriumsalzes wird mit 5 Teilen Äthylformiat vermischt und in einem geschlossenen Rohr unter Stickstoff 4 Stunden auf 150°C erhitzt. Die entstehende Substanz enthält etwa 0,5 Gewichtsprozent des Leuconostoc-citrovorum-«'achstumsfaktors.
• Beispiel 5 o,5 Teile Dihydrofolinsäure, 5 Teile Äthylformiat und 5 Teile Äthylenglykol werden im geschlossenen Rohr unter Stickstoff 4 Stunden auf ioo°C erhitzt. Die Mischung wird mit Äther verdünnt und das feste Produkt isoliert. Es enthält etwa o,6 Gewichtsprozent des Leuconostoc-citrovorum-Faktors.
• Beispiel 6 3 Proben von Tetrahydropteroylglutaminsäure von je 0,8o g werden jede in 2o ccm ioo°/oiger Ameisensäure gelöst. Eine Probe a) wird i Stunde bei o°C stehengelassen, wonach sie in eine Mischung von 5o g Natriumbicarbonat und 300 ccm Wasser gegossen wird, was ein Volumen von 315 ccm ergibt. Diese Lösung enthält 570 ooo Aktivitätseinheiten pro Kubikzentimeter Lösung. Die zweite Probe b) wird i Stunde bei Zimmertemperatur (25°C) stehengelassen und dann wie die Probe a) behandelt und ergibt ein Volumen von 32o ccm. Diese enthält 1,15 Millionen Aktivitätseinheiten pro Kubikzentimeter Lösung. Die dritte Probe c) wird i Stunde auf 6o' C erwärmt und wie oben behandelt und ergibt 325 ccm Lösung. Diese enthält 1,56 Millionen Aktivitätseinheiten pro Kubikzentimeter Lösung.
• Die Aktivitätseinheiten werden durch den mikrobiologischen Test unter Verwendung des synthetischen Mediums, wie es von H. E. Sauberlich und Mitarbeitern (vgl. J. Biological Chemistry 176, S. 163 d948]) beschrieben wurde, und des Organismus Leuconostoc citrovorum 8o81 bestimmt. Jede Aktivitätseinheit wird willkürlich als äquivalent gesetzt zu 16,6 Millimikrogramm einer früheren Standardzubereitung. Diese so bestimmte Aktivitätseinheit ist annähernd gleich zweimal der von Sauber 1 i c h und Mitarbeitern bestimmten Aktivitätseinheit,welche diejenigen Materialmengen pro Kubikzentimeter Kulturmedium ausdrückt, welche notwendig sind, um ein '/,-maximales Wachstum des Testorganismus zu bewirken.
• Beispiel 7 0,50 g einer Probe von Tetrahydropteroylglutaminsäure werden mit 5 ccm Glykolformiat und 0,15 g Natriummethylat vermischt und unter Stickstoff 4 Stunden auf 155°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die entstandene hellcremegraue Substanz abfiltriert und mit Alkohol und Äther gewaschen. Dieses Produkt enthält etwa 320 ooo Einheiten des aktiven Materials pro Milligramm, wie durch mikrobiologischen Test bestimmt wurde.
• Beispiel 8 i g Tetrahydropteroylglutaminsäure wird mit 12 ccm Äthylformiat und 0,3 g Natriummethylat vermischt und im geschlossenen Rohr unter Stickstoff 4 Stunden auf i50° C erhitzt. Die hellcremegraue Substanz wird abfiltriert. Sie enthält etwa 200 ooo Einheiten an aktivem Material pro Milligramm, wie durch mikrobiologischen Test bestimmt wurde.
• Beispiel 9 i g Tetrahydropteroylglutaminsäure wird mit 6 ccm Äthylformiat, 6 ccm Glykol und 0,3 g Natriummethvlat vermischt und unter Stickstoff im geschlossenen Rohr 4 Stunden auf i5o°C erhitzt. Die entstehende klare hellbraune Lösung wird in zwei Hälften geteilt. Die eine Hälfte wird in eine Alkohol-Äther-Mischung gegossen, wobei eine .hellgraue Substanz ausfällt. Aktivität: 68 50o Einheiten pro Milligramm. Die zweite Hälfte wird '/2 Stunde in 5o ccm o,i nAlkali erhitzt und dann mit Essigsäure neutralisiert. Die Aktivität beträgt 420 ooo Einheiten pro Kubikzentimeter.
• Die erfindungsgemäßen, formylierten Dihydroderivate sind gelbe kristalline Substanzen, die Tetrahydroderivate sind weiße bis hellgelbe kristalline Substanzen, Diese Verbindungen sind in o,i n-Natriumhydroxyd selbst bei 30 Minuten langem Erhitzen auf ioo°C beständig. Die wäßrige Lösung ist bei pH2 bei Zimmertemperatur unbeständig und wird rasch in ein Produkt umgewandelt, welches dieselbe biologische Aktivität wie Pteroylglutaminsäure besitzt, unter gleichzeitigem Verlust an Aktivität für den Organismus Leuconostoc citrovorum. Das aktive Material wird an verschiedene absorbierende Mittel absorbiert, wie z. B. an Aktivkohle bei saurem pH und an aktiviertes Magnesiumsilicat bei schwach alkalischem pH. Diese Absorbentien können daher zur Reinigung der rohen Reaktionsprodukte durch chromatographische Adsorptionsmethoden verwendet werden. In o,i n-Natriumhydroxydlösung ist ein Absorptionsmaximum bei etwa 275 bis 285 mp vorhanden. Das aktive Material ist in Wasser bei PH 3,5 bis 4,0 sehr leicht löslich. Es bildet ein in verdünntem, wäßrigem Alkohol unlösliches Bariumsalz. Es wird teilweise als Zinksalz bei pH 6,8 bis 7,0 ausgefällt.

Claims (4)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Herstellung hydrierter Formylpteroinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß die di- oder tetrahydrierte Form einer Verbindung der Formel (R bedeutet ein Hydroxyl- oder Aminosäureradikal) oder eines Salzes derselben mit einem Formylierungsmittel behandelt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß als Formylierungsmittel Ameisensäure bei einer Temperatur zwischen o und ioo°C verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß als Formylierungsmittel ein Alkylformiat bei einer Temperatur zwischen 5o und 200°C verwendet wird, wobei vorteilhaft ein basisches Mittel anwesend ist.
4. 4. Verfahren nach Anspruch i bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels durchgeführt wird.