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Herstellung und Gewinnung von Streptozotocin Die Erfindung betrifft
die Herstellung und Gewinnung von Streptozotocin.
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Die neue Verbindung ist das Ergebnis von Entwicklungsversuchen mit
Streptomyces achromogenes Variante 128. Sie hat die Eigenschaft negativer Beeinflussung
des Wachstums verschiedener Organismen, besonders von Bakterien. Sie unterscheidet
sich von bekannten antibakteriellen - Mitteln oder Antibioticas durch ihre charakteristischen
IR- und UV-Spektren,
| Tabelle I |
| Assimilation von Kohlenstoffverbindungen in |
| synthetischem Medium |
| J. Bact., 56, S. 107 bis 114 (1948) |
| Streptomyces achromogenes |
| Waksman |
| Var.128 Nr.3730 |
| Kontrolle - (-) |
| 1. d-Xylose . . . . . . . . . . . . . . -[- |
| 2. 1-Gummizucker . . . . . . . . -f- |
| 3. Rhamnose ...... .... -f- |
| 4. d-Fruchtzücker........ |
| 5. d-Galaktose . . . . . . . . . . -. |
| 6. d-Traubenzucker ...... -f- |
| 7. d-Mannose . . . . . .. . . . . . -[- |
| 8. Maltose ............ -f- |
| 9. Saccharose . . . . . . . . . . . . (-) (-) |
| 10. Laktose .............. |
| 11. Cellobiose ............ (-@-) -f- |
| 12. Raffinose ............. (-) (-) |
| 13. Dextrin .............. (-@-) |
| 14. Inulin ................ (-) (-) |
| 15. Lösliche Stärke ....... (-@-) -t- |
| 16. Glycerin .............. |
| 17. Dulcit ................ (-) (-) |
| 18. d-Mannit ............. |
| 19. d-Sorbit .............. (-@-) |
| 20. dl-Inosit .............. (-) (-f-) |
| 21. Salicin ............... (-f-) |
| 22. Phenol ............... - - |
| 23. Kresol................ - |
| 24. Na-Formiat .......... - (-) |
| 25. Na-Oxalat . . . . . . . . . . . . - - |
| 26. Na-Tartrat ........... - (-) |
| 27. Na-Salicylat .......... - - |
| 28. Na-Acetat ............ |
| 29. Na-Citrat . .. ...... .. .. (-@-) -E- |
| 30. Na-Succinat .......... |
| Alle Fälle ............ Bei Wachstum an der |
| Luft rosa bis grau |
| -f- positive Assimilation; -negative Assimilation; (-) leichtes |
| Wachstum, keine Assimilation; (-f-) positive Assimilation,
nur |
| leichtes Wachstum. |
durch ihre typischen Papierchromatogramme, durch ihre antibakterielle Wirksamkeit
gegen Staphylokokken- und Proteusorganismen, wogegen sie nicht gegen Sarcina lutea
wirkt und keine Querresistenz mit bekannten Antibioticas zeigt, von denen Celesticetin,
Neamin, Neomycin B, Neomycin C, Erythromycin, Tetracyclin, Penicillin, Novobiocin,
Streptomycin, Streptothricin, Chloramphenicol, Polymyxin, Kanamycin und Carbomycin
geprüft wurden.
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Streptomyces achromogenes Var. 128 ist eine neue Abart eines bekannten
Antinomycetes, das aus einem Bodenmuster von unbebautem sandigem Grasland in der
Gegend von Blue Rapids, Kansas, isoliert worden ist.
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Eine lebende Kultur, hier als Streptomyces achromogenes Var. 128 bezeichnet,
ist bei der Fermentationsabteilung der Northern Utilization Research Branch, U.
S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, niedergelegt worden und der Dauersammlung
unter der Bezeichnung NRRL 2697 eingegliedert.
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Diese neue Abart eines Microorganismus ist deutlich gekennzeichnet
durch die Absonderung eines braunen Pigments, sobald es auf feuchtem Nährboden gezüchtet
wird, und durch meist gerade Sporenträger, von denen einige offene Schlingen aufweisen.
Es ist eine Variante von Streptomyces achromogenes Waksman 3730. Dieser Organismus
erzeugt jedoch kein Streptozotocin.
Die Verwertung von Kohlenstoffv
erbindungen durch Varianten von Streptomyces achromogenes Var. 128 in einem synthetischen
Medium wird in der vorstehenden Tabelle I gezeigt. Das Verfahren von Pridham und
Gottlieb, J. Bact., 56, S. 107 bis 114 (1948), wurde mit folgenden Abänderungen
angewendet: (1) Ein 500-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit 100 Milliliter Lösung sterilen
Tryptonhefeextrakts wurde von einem Nährboden von Streptomyces achromogenes Var.
128 okuliert, auf einen Wechselschüttler gesetzt und bei 28' C inkubiert.
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(2) Nach 48 Stunden wurde die obere Schicht abgegossen. Das vegetative
Wachstum wurde mit 100 Milliliter sterilem, destilliertem Wasser gewaschen und die
obere Schicht wiederum abgegossen. Dann wurden 100 Milliliter steriles destilliertes
Wasser zu dem gewaschenen vegetativen Wachstum zugegeben. Die Mischung wurde auf
einen Wechselschüttler gesetzt und bei 28' C inkubiert.
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(3) Nach weiteren 48 Stunden wurde wiederum die Oberschicht abgegossen
und das vegetative Wachstum, wie oben beschrieben, gewaschen und 1 Minute in 100
Milliliter destilliertem sterilem Wasser gemischt.
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(4) Die Agar-Schrägnährböden wurden mit 0,2 Milliliter des gemischten
Impfmaterials besät. Tabelle II zeigt das makroskopische Aussehen von Streptomyces
achromogenes Var. 128 auf verschiedenen Kulturen in schräggestellten Röhrchen von
der Oberseite und von der Unterseite (Rückseite) gesehen. Bestimmte charakteristische
Eigenschaften, die es mit Streptomyces achromogenes Waksman 3730 gemeinsam hat,
sind in Tabelle II aufgeführt,
| Tabelle II |
| Makroskopische Erscheinungsform |
| Echtachrome - Objektträger |
| Medium Variante 128 Streptomyces achromogenes |
| Waksman Nr. 3730 |
| Oberseite I Rückseite I Oberseite 1 Rückseite |
| Bennetts Grau Braun Grau j Braun |
| Czapeks Saccharose Grau Braungelb Grau Braungelb |
| Maltose-Trypton Grauweiß Braun Grauweiß Braun |
| Peptoneisen Kein Wachstum Braun Kein Wachstum Braun |
| an der Luft an der Luft |
| 0,1 % Tyrosin Grauweiß Braun Grau Braun |
| Kasein-Stärke Grau Braun Grau Braun |
Streptomyces achromogenes Var. 128 zeigt deutliche Wachstums- und morphologische
Eigenschaften, wenn es auf den folgenden Medien gezüchtet wird, wie die nächste
Tabelle III zeigt. Die Bestandteile der Medien sind in Gramm pro Liter destilliertes
Wasser angegeben. Die Medien behandelt man 15 Minuten lang bei einem DrucI: von
1,05 kg/cm2 und bei 121° C im Autoklav.
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Kaseinstärke-Agar Kaliumkaseinat 2,0, lösliche Stärke 1,0, K2 H P
04 0,2, Mg S 04 - 7 H2 O 0,2, Fe S 04 - 7 H20 spurenweise, Agar 15,0. Czapeks Saccharose-Agar:
NaN 03 2,0, K2 H P O4 1,0, Mg S 04 ' 7 H2 O 0,5, KCl 0,5, Fe S04 - 7H20 0,01, Saccharose
30,0, eingestellt auf einen pH-Wert von 6,6, Agar 15,0. Maltose-Trypton-Agar: Maltose
10,0, Trypton 5,0, K2 H P 04 0,5, Na Cl 0,5, Fe S 04 - 7 H20 spurenweise, Agar 15,0
(Trypton ist ein Pankreatdigest eines Kaseins mit hohem Tryptophangehalt).
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Bennetts Agar: Hefeextrakt 1,0, Fleischextrakt 1,0, N-Z-Amin A (enzymatischer
Digest von Kasein) 2,0, Glukose 10,0, eingestellt auf einen pa-Wert von 7,0, Agar
15,0.
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Nährstärke-Agar Fleischextrakt 3,0, Pepton (Hydrolysat von tierischem
Eiweiß mit niedrigem Molekulargewicht) 5,0, lösliche Stärke 2,0, eingestellt auf
einen pÄ Wert von 7,0, Agar 15,0. Peptoneisen-Agar Pepton 15,0, Albumosepepton (Hydrolysat
von tierischem Eiweiß mit hohem Molekulargewicht) 5,0, Ferriammoniumcitrat 0,5,
Dikaliphosphat 1,0, Natriumthiosulfat 0,08, Agar 15,0. Glukoseasparag in-Agar Glukose
10, Asparagin 0,5, K2 H P O4 0,5, Agar 15, pH-Wert 6,8.
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Gewöhnliche Gelatine: Gelatine 120. Nährgelatine: Fleischextrakt 3,0,
Pepton 5,0, Gelatine 120, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0. Tryptonbrühe: Trypton
1,0, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0.
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Lackmusmilch Entwässerte Milch, der Lackmuslange zugegeben ist.
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Stickstoff-Nährbrühe: Fleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, K N 03 1,0.
Synthetische Stickstoffbrühe: is2H O P4 0,5, Na Cl 0,5, M9S 04 - 7 H2 O 0,2, NaN03
2,0, Glukose 10,0.
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Kalziummalat-Agar: Kalziummalat 10,0, N H4 Cl 0,5, K2 H P 04 0,5,
Medium-pH-Wert von 7,0, Agar 18,0. Tyrosin-Agar Tyrosin 1,0, Agar 15,0;
| Tabelle III |
| Charakteristisches Wachstum in verschiedenen Medien, nach 7
Tagen untersucht |
| Streptomyces adiromogenes |
| Variante 128 I Waksman Nr. 3730 |
| Einfache Gelatine Graues Wachstum an der Luft, braunes Graues
Wachstum an der Luft, braunes |
| Pigment, Spuren von Verflüssigung. Pigment, keine Verflüssigung. |
| Nährgelatine Kein Wachstum an der Luft, braunes Weißes Wachstum
an der Luft, braunes |
| Pigment, Spuren von Verflüssigung. Pigment, keine Verflüssigung. |
| Stickstoff-Nährbrühe Grauweißes Wachstum an der Luft auf Grauweißes
Wachstum an der Luft auf |
| der Oberschicht, bräunlichgelbes der Oberschicht, bräunlichgelbes |
| Pigment, Reduktion negativ. (*) Pigment, Reduktion negativ. |
| Synthetische Stickstoffbrühe Vegetativ. Wachstum-Oberschicht
und Vegetativ. Wachstum-Oberschicht und |
| durch-,veg flockig, Spuren grauweißen durchweg flockig, Spuren
grauweißen |
| Wachstums an der Luft, Spur gelbes Wachstums an der Luft, starkes |
| Pigment, Reduktion negativ. (*) gelbes Pigment, Reduktion negativ. |
| Tryptonbrühe Spuren grauweißen Wachstums an der Spuren grauweißen
Wachstums an der |
| Luft bei den Kolonien der Oberfläche, Luft bei den Kolonien
der Oberfläche, |
| gelblichbraunes Pigment. gelblichbraunes Pigment. |
| Lackmusmilch Keine Veränderung. Keine Veränderung. |
| Tyrosin-Agar Graues Wachstum an der Luft, graue Graues Wachstum
an der Luft, graue |
| Rückseite, braunes Pigment. Rückseite, rosagelbbraunes Pigment. |
| Peptoneisen-Agar Farbloses vegetatives Wachstum, Farbloses
vegetatives Wachstum, |
| H2 S dunkelt. H2 S dunkelt. |
| Kalziummalat-Agar Graues Wachstum an der Luft, graue Grauweißes
Wachstum an der Luft, |
| Rückseite. grauweiße Rückseite. |
| Glukoseasparagin-Agar Grauweißes Wachstum an der Luft, Grauweißes
Wachstum an der Luft, |
| cremefarbene Rückseite, gelbes cremefarbene Rückseite, gelbes |
| Pigment. Pigment. |
| Maltosetrypton-Agar Graublaues Wachstum an der Luft, Graublaues
Wachstum an der Luft, |
| braune Rückseite, braunes Pigment. braune Rückseite, braunes
Pigment. |
| Bennetts Agar, 18' C Bei Wachstum an der Luft feines
Grau- Bei Wachstum an der Luft feines Grau- |
| rosa mit Grün schattiert, gelbbraune rosa-cremefarben, gelbbraune
Rück- |
| Rückseite, gelbbraunes Pigment. seite, gelbbraunes Pigment. |
| Bennetts Agar, 24' C Helles grauweißes Wachstum an der Helles
grauweißes Wachstum an der |
| Luft, gelbbraune Rückseite, Luft, gelbbraune Rückseite, |
| gelbbraunes Pigment. gelbbraunes Pigment. |
| Bennetts Agar, 28° C Graurosa Wachstum an der Luft, Graurosa
Wachstum an der Luft, |
| gelbbraune Rückseite, gelbbraunes gelbbraune Rückseite, gelbbraunes |
| Pigment. Pigment. |
| Bennetts Agar, 37° C Gutes graublaubraungelbes Wachstum Gutes
graublaubraungelbes Wachstum |
| an der Luft, gelblichbraune Rück- an der Luft, gelblichbraune
Rückseite, |
| seite, gelblichbraunes Pigment. gelblichbraunes Pigment. |
| Bennetts Agar, 55° C Kein Wachstum. Kein Wachstum. |
| Czapeks Saccharose-Agar, Spuren eines grauen Wachstums an der
Spuren eines grauen Wachstums an der |
| 18° C Luft, graue Rückseite. Luft, graue Rückseite. |
| Czapeks Saccharose-Agar, Wachstum an der Luft von hellem Grau,
Wachstum an der Luft von hellem Grau, |
| 24° C graue Rückseite. graue Rückseite. |
| Czapeks Saccharose-Agar, Wachstum an der Luft von hellem Grau,
Wachstum an der Luft von hellem Grau, |
| 28' C graue Rückseite. graue Rückseite. |
| Czapeks Saccharose-Agar, Gutes Wachstum an der Luft von Gutes
Wachstum an der Luft, grau; |
| 370 C grauer Farbe, graue Rückseite. graue Rückseite. |
| Czapeks Saccharose-Agar, Kein Wachstum. Kein Wachstum. |
| 550 C |
| Kaseinstärke-Agar An der Luft lavendelgraues Wachstum, An der
Luft lavendelgraues Wachstum, |
| braungelbe Rückseite, Hydrolyse. braungelbe Rückseite, Hydrolyse. |
| Nährstärke-Agar Rosaweißes Wachstum an der Luft, Rosaweißes
Wachstum an der Luft, |
| cremefarbengelbbraune Rückseite, cremefarbengelbbraune Rückseite, |
| Hydrolyse. Hydrolyse. |
| Alle Beobachtungen nach 7 Tagen Inkubation bei 28°C, falls
nicht anders angegeben. |
| (*) Auf Nitratreduktion, bei 24 und 48 Stunden untersucht. |
Streptozotocin gewinnt man durch Züchtung von Streptomyces achromogenes
Var.128 oder einer seiner Varianten in einem wäßrigen Medium unter submersen aeroben
Bedingungen, vorzugsweise auf einem Nährboden mit einem assimilierbaren Kohlehydrat
und einer Stickstoffverbindung oder einem proteinhaltigen Material. Es gibt natürlich
viele geeignete Medien, doch sind zwecks billiger Herstellung, größtmöglicher Ausbeute
und leichter Isolierung bestimmte Nährböden vorzuziehen. Die gegenwärtig bevorzugten
Kohlehydratquellen sind Glukose. Dextrin, Melasse, Maismehl (fein oder grob), Stärke
(gesiebt oder löslich) sowie Kombinationen aus diesen Stoffen. Andere geeignete
Quellen sind Maltose, Galaktose, Mannitol, Sojabohnenöl, tierische und pflanzliche
Fette. Bevorzugte Quellen für Stickstoff sind Eiweißquellen wie Baumwollsamenmehl,
Sojabohnenmehl, Fischmehl, entöltes Sojabohnenmehl, Pepton und ähnliche. Andere
geeignete Quellen sind Erdnußmehl, Brauhefe (getrocknete Hefezellen, die bei der
Biergärung anfallen), Mais-Klebermehl, Maisquellwasser, Fischpreßwasser, distiller's
soluble, Trypticase, Fleischextrakt, 'NT-Z-Amin A, N-Z-Amin B, der Eiweißspaltung
unterzogene Milch- und Eiprodukte. Kombinationen von zwei oder mehr dieser Stickstoffquellen
können vorteilhaft verwendet werden.
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Anorganische Nährsalze, z. B. Salze, die Ione erzeugen, wie Kalium-,
Natrium-, Kalziumphosphate oder Sulfate und ähnliche, verleibt man vorteilhaft dem
Nährmedium ein. Wirksame Spurenelemente wie Magnesium, Mangan, Zink, Kobalt, Eisen
und ähnliche, kann man ebenfalls dem Nährboden zur Züchtung von Streptomyces achromogenes
Var.128 beigeben. Diese Spurenelemente gelangen meist als fremde Beimengungen rein
zufällig mit den normalen Bestandteilen in das Medium.
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Die erfindungsgemäßen Medien können zusätzlich auch Vorstufen (precursors)
enthalten, um wertvolle Produkte zu erhalten. Zum Beispiel kann man eine assimilierbare
Kobaltquelle hinzugeben, falls man Cobalamine (Vitamin Bi. und Vitamin B12 ähnliche
Stoffe) gewinnen will, und diese Nebenprodukte können dann nach üblichen Methoden
gewonnen werden. In ähnlicher Art kann man auch Steroidvorstufen zugeben, wie Progesteron
oder Reichsteins Verbindung S oder S-Acetat, und dann das oxydierte Steroid gewinnen.
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Eine bevorzugte Methode zur Fermentation von Streptomyces achromogenes
Var.128 besteht darin, daß man das Inoculum 48 Stunden unter Brutbedingungen hält
(Temperatur 28° C und der okulierte Fermentierstoff die ersten 70 Stunden bei 37°
C unter Brutbedingungen gehalten wird, hinterher bei 28° C, bis die fermentierte
Brühe zur Verwendung bereit ist.
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Um höchstes Wachstum und Entwicklung von Streptomyces achromogenes
Var. 128 zu erreichen, bringt man den Nährboden vor der Impfung mit dem Mikroorganismus
auf einen p11-Wert von 6,5 bis 7,5. Vorteilhaft hält man den PH-Wert während der
Fermentation durch kleine Beigaben von Glukose unter 5,5.
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Aerobische Tauchkulturbedingungen sind bei der Herstellung großer
Mengen von Streptozotocin die weitaus besten. Zur Gewinnung kleinerer Mengen kann
man Schüttelkolben und Oberflächenkulturen in Flaschen verwenden. Geschieht die
Züchtung in großen Behältern und Tanks, so empfiehlt es sich, die vegetative Form
des Mikroorganismus zur Impfung zu benutzen und so eine starke Verzögerung in der
Entstehung des Streptozotocins und eine damit verbundene unvollkommene Auslastung
der Apparatur zu vermeiden. Demgemäß ist es empfehlenswert, erst ein vegetatives
Inoculum des Mikroorganismus zu züchten, indem man eine verhältnismäßig kleine Menge
Nährboden mit dem Stoff, den man von einem Schrägnährboden des Mikroorganismus kratzt,
impft. Ist ein junges, aktives Vegetativ-Inoculum entstanden, überträgt man es aseptisch
in die großen Gefäße oder Tanks. Das zur Zucht des Vegetativ-Inoculums benutzte
Medium kann dasselbe wie das zur Herstellung des Streptozotocins verwendete, aber
auch ein anderes sein.
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Zur Erreichung einer Optimalausbeute an Streptozotocin hält man das
Kulturmedium auf einer Temperatur zwischen 24 und 37° C, vorzugsweise zwischen 28
und 37° C, wobei die Zeitdauer 2 bis 7 Tage beträgt.
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Die Menge, in welcher das Streptozotocin entsteht, und seine Konzentration
in dem Kulturmedium kann man ohne weiteres während der Wachstumsperiode des Mikroorganismus
verfolgen, indem man Proben des Mediums auf antibakterielle Wirksamkeit gegen einen
Organismus untersucht, der bekanntermaßen für Streptozotocin empfänglich ist, z.
B. Proteus vulgaris, wobei man Standard-Agardiffusion oder turbidimetrische Verfahren
anwendet. Im allgemeinen liegt die Maximalproduktion von Streptozotocin bei Verwendung
von aeroben Tauchkulturen 2 und 7 Tage nach erfolgter Impfung.
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Man kann das Streptozotocin aus dem Kulturmedium mit Extraktions-
oder Absorptionsmethoden abscheiden, z. B. durch Adsorption in Kohle oder ein ähnliches
Kapillar-Adsorbens und anschließende Elution mit einem geeigneten Elutionsmittel.
Extraktionsverfahren mit Lösungsmitteln haben bei der Produktion in technischem
Maßstab den Vorrang, da sie weniger Aufwand an Zeit und Kosten erfordern und höhere
Produktionsmengen gewährleisten.
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Ein bevorzugtes Extraktionsverfahren zur Gewinnung von Streptozotocin
aus fermentiertem Nährboden besteht darin, daß man die vergorene Nährflüssigkeit
bei einem p$ Wert von 2 bis 7 filtriert und anschließend im Vakuum auf 0,08 Raumteile
konzentriert. Inaktive Bestandteile des Konzentrats werden durch Zugabe eines organischen
Lösungsmittels, z. B. eines niederen Alkanols oder Alkanons, wie Methanol, Äthanol
oder Aceton, ausgefällt. Der gefällte Stoff wird weggeschüttet. Man gewinnt das
Streptozotocin aus dem Filtrat, das konzentriert und dann durch Gefrieren getrocknet
wird. Dieses durch Gefrieren getrocknete Präparat reinigt man weiter durch Craig-Gegenstromverteilung
unter Benutzung eines Lösungsmittelgemi.sches, wie 1-Butanol und 0,004normale wäßrige
Salzsäure in einem Volumenverhältnis 1 :1; 1-Butanol und 0,001normale wäßrige Salzsäure
in einem Volumenverhältnis 1 : 1; Äthylacetat und Wasser in einem Volumenverhältnis
1 : 1; Benzylalkohol und Methyläthylketon und Wasser in dem Volumenverhältnis 1
: 1. In den meisten Fällen ist der K-Wert der Fraktionen, die Streptozotocin enthalten,
etwa 0,22. Diese Fraktionen werden zusammengegossen und durch Gefrieren getrocknet,
in destilliertem Wasser gelöst und gefiltert und dann mit wassergesättigtem 1-Butanol
extrahiert. Durch Destillierung dieses Wasserextraktes entfernt man das 1-Butanol
(aceotropisch) und gefriertrocknet danach die wäßrigeLösung. Man erhält ein noch
weiter gereinigtes Streptozotocin.
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Der gewonnene Stoff kann noch weiter gereinigt werden durch Teilungschromatographie,
indem man ein Lösungsmittelsystem, wie 1-Butanol, Cyclohexan, PH 4-gepuffertes-
Wasser in einem Volumenverhältnis 20:4:4, Methyläthylketon und Wasser in einem
Volumenverhältnis
1 : 1, oder die oben und im folgenden aufgeführten Lösungsmittelsysteme im Gegenstromverteitverfahren
verwendet. Die eluierte Flüssigkeit aus der Teilungschromatographie wird konzentriert
und durch Gefrieren getrocknet. Sie ergibt ein gereinigtes Streptozotocin, das man
durch Kristallisation aus wäßrigem Methyläthylketon noch weiter reinigen kann. Kristallinisches
Streptozotocin kann man noch weiter reinigen durch Umkristallisieren aus dem gleichen
oder einem ähnlichen niederen Alkanon oder aus einem niederen Alkanol, wie Äthanol.
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Für Streptozotocin ist charakteristisch seine Beweglichkeit bei der
Papierstreifenchromatographie. Das Muster ist einzigartig und kennzeichnet Streptozotocin
als ein neues Antibiotikum. Dasselbe Muster erhält man bei Vollbier, gefiltertem
Bier, wäßrigem oder Lösungsmittelkonzentrat und beim kristallisierten Material.
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Streptozotocin kann auch durch Teilungschromatographie unter Zuhilfenahme
eines Lösungsmittelsystems, beispielsweise 1-Butanol, Cyclohexan und @,Tasser in
einem Volumenverhältnis 20:4:4, gereinigt werden. Es empfiehlt sich, das Wasser
auf etwa pH-Wert 4 zu puffern. Ein anderes geeignetes Lösungsmittelsystem zur Teilungschromatographie
ist Methyläthylketon, Cyclohexan, bei einem pH-Wert von 4 gepuffertes Wasser in
einem Volumenverhältnis von 9:1:1,43.
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Streptozotocin kann man auch unter Zuhilfenahme der in Tabelle IV
aufgeführten Lösungsmittelsysteme nach dem Gegenstromverteilungsverfahren reinigen.
| Tabelle IV |
| Lösungsmittel für Gegenstromverteilung |
| Verhält- Über- |
| Lösungsmittel :@ k ' ` K tragungs- |
| nisse zahl |
| Benzylalkohol ...... 1 1,88 |
| Methyläthylketon ... 1 . 0,3 |
| Wasser ............ 1 |
| Äthylacetat ........ 1 0,085 |
| Wasser ............ 1 |
| 1-Butanol .......... 1 0,235 100 |
| Wasser |
| (0,001 n-HCI) ... 1 |
| 1-Butanol .......... 1 0,256 500 |
| Wasser |
| (0,004 n-HCI) ... 1 |
| Methyläthylketon ... 1 0,15 503 |
| Wasser ............ 1 |
| Methyläthylketon :.. 1 0;22 775 |
| Wasser ............ 1 |
| * k = Teilungskoeffizient vom Ausschütteln. |
| K = Verteilungskoeffizient aus den Übertragungen der |
| Gegenstromverteilung. |
Ein Gemisch aktiver Fraktionen aus der Gegenstromverteilung kann man durch azeotropische
Destillation konzentrieren. In dem Konzentrat bilden sich Kristalle. Man gewinnt
sie durch Filtrieren und trocknet sie im Vakuum. Bei der Umkristallisation aus 95°/aigem
Äthanol fällt praktisch reines Streptozotocin in Kristallform an. Der umkristallisierte
Stoff hat folgende Eigenschaften und Merkmale: Schmelzpunkt Unbestimmt, zerfällt
unter Gasentweichung bei etwa
115' C, wird bei etwa
125' C eine klare
Flüssigkeit.
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Elementaranalyse: C 36,30; H 5,74; N 15,11; O 39,90. Molekulargewicht:
481 und 468 (durch isotherme Destillation). UV-Spektrum 2, max.
228; a =
24 (in Äthanol). IR-Spektrum Zeigt mehrfache O H / N H, mindestens ein Carbonyl
und mehrfache Absorptionslinien im Bereich 1500 cm-'. Das infrarote Absorptionsspektrum
(Natriumchloridprisma) des Streptozotocins in Mineralölsuspension weist charakteristische
Absorptionslinien auf, die, ausgedrückt in Reziprokzentimetern, bei folgenden Frequenzen
liegen:
| Frequenz Dichte |
| 3600 W (sh) |
| 3440-3180 S |
| 2700 W (sh) |
| 2580 W (sh) |
| 1718 S |
| 1705 S |
| 1670 M (sh) |
| 1565 M (sh) |
| 1548 S |
| 1535 S |
| 1505 S |
| 1497 S |
| 1483 S |
| 1425 M (sh) |
| 1413 M |
| 1368 M |
| 1345 M |
| 1325 M |
| 1310 W (sh) |
| 1290 M |
| 1250 M |
| 1225 M |
| 1200 W |
| 1170 S ' |
| 1137 S |
| 115?-1083 (?) S |
| 1065 S |
| 1035 S |
| 1020 S |
| 985 S |
| 968 S |
| 910 W |
| 889 W |
| 818 S |
| 810 M (sh) |
| 793 S |
| 780 M (sh) |
| 770 M |
| 745 M |
| 730 M |
Die oben aufgeführten Dichten sind bei Untersuchungen an gereinigtem Streptozotocin
in Kristallform festgestellt worden.
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Titration: Beim Titrieren des kristallisierten Stoffes zeigten sich
keine basischen oder sauren Gruppen. Das Antibiotikum ist also neutral.
Stabilität:
Streptozotocin ist bei einem pH-Wert von 4 am beständigsten, am unbeständigsten
bei einem alkalischen pH-Wert.
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Alkalische Zersetzung Behandelt man wäßrige Streptozotocinlösungen
mit 10% NaOH, so entwickelt sich Stickstoff.
| Struktur-Tests |
| Name I Ziel I Ergebnis |
| Benedicts Zuckerreduktion negativ |
| Molisch Substanz, die Furfural fragwürdig |
| bildet |
| @Tinhydrin Aminosäure negativ |
| Biuret Proteine und Peptone negativ |
| Perjodat benachbarte Hydroxyl- negativ |
| Kruppen |
| Feäron- Primär- und Sekundär- negativ |
| Mitchell alkohol |
| Liebermann N-Nitrosegruppe positiv |
| Anthron Zucker bis positiv |
Der positive Liebermann-N-NitrOSe-Test ist eininalig, da keines der bekannten Antibiotika
das Vorliegen einer N-1\TO-Gruppe zeigt. Die Entwicklung von Stickstoff in wäßriger
NaOH ist ebenfalls für eine N-N 0-Gruppe charakteristisch.
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Kristallographie: Zwei Kristallformen wurden erhalten, die beide biologisch
aktiv sind, einen Feder-Typ und einen Prisma-Typ. Die Röntgenstrahl-Diffraktionsmuster
beider Kristallarten zeigen folgende Punkte in den interplanaren Zwischenräumen
in Angströmeinheiten: d, A, (Cu, kn 1) : 10,64, 9,30 7,43, 5,98, 5,53, 4,91, 4,58,
3,94, 3,61, 3,35, 3,19, 3,01, 2,45, 2,26, 2,18 2,12, 2,07. Die optische Drehung
der zwei Kristallarten ist folgende:
| Medium I Feder-Typ I Prisma-Typ |
| [a] D5 C, 0,05 % -f-410 ±l0 -+-680 +-10 |
| Dioxan |
| [a] D5 C, 1,0010 -I-680 +-10 -F-870
+-10 |
| Äthanol |
Streptozotocin kann man acylieren, beispielsweise mit Essiganhydrid zum Acetat oder
zu einem ähnlichen niedrigen Fettsäureester. Es kann hydriert werden und nimmt dabei
ungefähr 5 bis 6 Mol Wasserstoff auf. Es entstehen die hydrierten Formen in aktiver
Form.
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Bei einem anderen Extraktionsverfahren zur Ge-,,vinnung von Streptozotocin
aus dem fermentierten Nährmedium stellt man die Gärflüssigkeit auf einen pH-Wert
von 2 bis 7 und filtriert. Das Filtrat wird auf Aktivkohle, Bentonit, Diatomit,
Fullers Erde oder ähnlichen Stoffen adsorbiert und dann mit einem organischen Lösungsmittel
eluiert, z. B. einem niederen Fettsäureester, niederem Alkanon oder Alkanol, z.
B. Äthylacetat, Butylacetat, Äthanol, Methyläthylketon, vor allem Methanol oder
Aceton. Daraus gewinnt man dann das Streptozotocin direkt oder nach weiterer Reinigung
durch Chromatographie oder Flüssigkeit-Flüssigkeit-Extraktion. Kristallinisches
Streptozotocin, Präparat 4F, zeigt im Reagenzglas die folgenden in Tabelle V aufgeführten
antibakteriellen Wirksamkeiten: Alle Organismen wurden in Röhrchen mit 10 Milliliter
Nährflüssigkeit gepflanzt, mit einer besonders gekennzeichneten Ausnahme und 1 bis
2 Stunden unter Brutbedingungen gehalten. Dann wurde die optische Dichte gemessen
und Streptozotocin zugegeben. Nach sechs weiteren Stunden Incubationszeit wurden
endgültige Messungen durchgeführt und die ID5ö Werte errechnet.
| Tabelle V |
| Antibakterielle Wirksamkeit |
| Organismus ICso Endpunkt'''* |
| (mcg/ccm) |
| (mcg/ccm) |
| Salmonella pullorum Y 0,15 0,25 bis 1,0 |
| Proteus vulgaris 0,20 1,0 bis 2,5 |
| Salmonella schottmuelleri 0,35 1,0 |
| Escherichia coli 0,50 2,5 bis 5,0 |
| Staphylococcus aureus 0,75 5 bis 6 |
| Salmonella typhi 0,90 2,5 bis 5,0 |
| Streptococcus fecalis 2,0 >20 |
| Klebsiella pneumoniae 3,0 5 bis 10 |
| Pasteurella multocida 0,25 <0,25 |
| Aerobacter aerogenes 10,0 <20 |
| * Hirn-Herz-Aufgußbrühe mit pg-Wert 6,8. |
| ** Hemmkonzentration bis 50%, unterbricht das Wachstum |
| der Organismen des Maximums oder der Kontrolle. |
| *** Dieselbe Trübung wie nach der Anfangsincubation; |
| kein Wachstum. |
Wegen der hohen Wirksamkeit von Streptozotocin gegen Pasteurella multocida und Salmonella
pullorum kann man diese Verbindung in der veterinären Medizin bei der Behandlung
von durch Bakterien erkrankten Tieren, wie bei Transportfieber beim Vieh oder die
Pullorumkrankheit bei Küken, verwenden.
-
Streptozotocin wirkt nicht nur wachstumhindernd auf die Bakterien,
sondern bakterienvernichtend, So wurden beispielsweise bei Proteus vulgaris in 30
Minuten durch 10 Mikrogramm pro Kubikzentimeter bei 370 C in Suspension 99% der
Organismen getötet.
-
Die akute Toxizität des Streptozotocins war größer als 160 Tausendstel
Milligramm pro Kilogramm, wie bei Versuchen an Mäusen festgestellt wurde.
-
Ein Beispiel für die Wirksamkeit von Streptozotocin in Kristallform,
Präparat 4F, an lebenden Mäusen gibt die Tabelle VI.
| Tabelle VI |
| Wirksamkeit kristallinischen Streptozotocins |
| am lebenden Objekt |
| * CD5o subkutan P' mda to s. aureus P' r Styppari |
| g |
| Streptozotocin 0,58 3,2 2,5 18 |
| Novobiocin 24 9 35 320 |
| Tetracyclin 1,4 1,1 51 20 |
| Chloromycetin 14 73 100 87 |
| Penicillin 5 1,3 57 7100 |
| * CD50 = die Dosis, bei der 501/o der infizierten Tiere Über- |
| leben, angegeben in Milligramm pro Kilogramm. |
Streptozotocin und seine Derivate sind wertvoll zur Bekämpfung
von Krankheiten bei Mensch und Tier, die durch bakterielle Infektion hervorgerufen
werden. Man vereinigt das Antibiotikum mit einer größeren Menge eines pharmazeutischen
Trägers in fester, pulverförmiger oder flüssiger Form. Die Präparate kann man in
Form von Tabletten, Brausetabletten, Pulver, Körnchen, Kapseln (mitharter oderweicher
Schale), Suspensionen in Speiseöl oder in Wasser oder in anderer für orale Verabreichung
besonders geeigneter Form zubereiten. Zum parenteralen Gebrauch benutzt man sterilisierte
flüssige Verdünnungsmittel. Derartige Medien können sterilisierte Lösungs- oder
suspendierende Mittel ein, z. B. ein injizierbares
01 oder Wasser mit oder
ohne hydrophile Kolloide, wie I\Tatrium-Karboxymethyl-Zellulose, Polyvinyl-Pyrrolidon,
Gelatine, Alginate, Tragacanth und ähnliche suspendierende und/oder dispergierende
Mittel. Man kann die Präparate in Form von aktivem Material verwenden, d. h. das
Antibiotikum mit festen Verdünnungsstoffen bzw. mit Stoffen zur Tablettenbildung
mischen, wie etwa Getreidestärke, Milchzucker, Talkum, Stearinsäure, Magnesiumstearat,
Gummistoffe und ähnliche Stoffe. Alle in der pharmazeutischen Branche gebräuchlichen
Stoffe zur Kapsel- oder Tablettenbildung können Verwendung finden, es sei denn,
sie vertragen sich nicht mit dem Antibiotikum. Man kann den Stoff zu Tabletten formen
oder in die allgemein gebräuchlichen Kapseln aus absorbierendem Material, z. B.
die üblichen Gelatinekapseln, einbringen und in dieser Form verabreichen. Streptozotocin
sowie seine Derivate, genauer gesagt die hydrierte Verbindung oder das Acetat, kann
man als Suspension in einem geeigneten festen Öl mit 2 % Aluminiummonostearat als
Suspendierungsmittel verwenden. Eine Suspension dieser Art kann als solche per os
verabreicht werden oder in Kapseln eingebracht werden. In Form von Salben, wie solchen
auf Petrolatfettbasis, wasserlöslicher Polyäthylenglykolbasis, Cremes und Wasser-in-Öl-Emulsionen,
oder Lösungen eignet sich das Antibiotikum zu lokaler Anwendung. Andere brauchbare
Präparate zur lokalen Anwendung sind z. B. Ohrtropfen, Augentropfen, Aerosole, Nasensprays,
Pastillen, Zäpfchen. Für veterinäre Zwecke kann man das Antibiotikum in Form von
Bougies, Mastitissalben, Ölsuspensionen und wäßrigen Lösungen und Suspensionen usw.
anwenden.
-
Streptozotocin kann auf peroralem, intravenösem oder intramuskulärem
Wege verabreicht werden. Bei der Behandlung von Menschen dosiert man zwischen 25
und 1000 Milligramm pro Dosierungseinheit, je nach Alter, Gewicht, Art der Verabreichung
und Verfassung des Patienten. Diese Dosis kann man ein- bis sechsmal täglich verabreichen,
je nach Alter und Verfassung des Patienten, der Infektion, dem Verabreichungsweg
usw. Der Anteil des aktiven Stoffes in den Präparaten kann verschieden sein und
hängt von der Form und dem Gebrauchszweck ab. Man kann auch einen niedrigeren Prozentsatz
ansetzen, wenn mehrere Dosierungseinheitsarten zugleich verabreicht werden sollen.
Obgleich man, vor allem bei intravenöser Injektion weniger als 10% des Antibiotikums
verwenden kann, sollte man die Möglichkeit nicht weniger als 10% verwenden, weil
die Wirksamkeit des Antibiotikums mit seiner Menge steigt. Tabletten oder Kapseln
mit einem Streptozotocingehalt von 50 bis 500 Milligramm (oder einem entsprechenden
Gehalt von Derivaten) zeigen gute Ergebnisse. Man kann eine oder mehrere Tabletten
bzw. Kapseln auf einmal einnehmen. Wegen seiner bakterienvernichtenden Wirksamkeit
und geringen Giftigkeit eignet sich Streptozotocin und seine Derivate gut zur therapeutischen
Behandlung der verschiedensten Krankheiten. Das Antibiotikum leistet gute Dienste
allein oder in Verbindung mit Sulfonamiden, wie Sulfadiazin, Sulfamerazin, Sulfamethazi.n,
Sulfacetamid, Sulfamethylthiadiazol (im Verhältnis von 1 Teil Antibiotikum zu 2
Teilen der Gesamtsulfonamidmenge) oder in Verbindung mit anderen Antibiotica wie
Tetracyclin. Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Penicillinen, Novobiocin, Neomycin,
Erythromyzin, Streptomyzin, Bazitrazin, Polymyxin, Chloramphenicol, Kanamyzin, Nystatin,
so bei der Behandlung von vielen Infektionen, vor allem durch Staphylococcus- und
Proteusorganismen hervorgerufen. Genauso wertvoll ist das Antibiotikum in Kombination
mit den verschiedensten Vitaminen, wie Thiamin, Laktoflavin, Ascorbinsäure, Nikotinsäureamid,
Pyridoxin, Pantothensäure oder Pantothensalze, Vitamin B12, Folsäure und ähnliche
Vitamine. Auch andere zur Heilbehandlung nützliche Stoffe kann man mit dem Antibiotikum
kombinieren. In Verbindung mit Corticoiden lassen sich Streptozotocin und seine
Derivate ebenfalls gut verwenden, z. B. mit Cortison, Hydrocortison, Prednison und
Prednisolon, sowie deren Estern, z. B. dem Acetat, Cyclopentylpropionat, Succinat
und dem Natriumsalz; weiterhin mit Fluor-, Methyl- und Oxy-Analogonen, wie 6 a-Fluorhydrocortison,
6 a-Fluorprednisolon, 16-Oxy-9 a-fluorhydrocortison, 6-Methyl-21-desoxy-9a-fluor-6a-methylprednisolon
und 16-Methyl-9 a-fluorprednisolon und deren Estern.
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Streptozotocin kann auch als Futterzusatz für Tiere und Geflügel Verwendung
finden, um das Wachstum zu fördern, sowohl allein als auch in Kombination mit anderen
Antibiotika; weiterhin als wirkungssteigernder Zusatz bei Pyelographischen Mitteln
(Journal of Urology, S. 563 bis 566, Oktober 1955).
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Streptozotocin wurde imPlattenversuch mitProteus vulgaris untersucht.
Die Wirksamkeit wird in Proteus vulgaris-Bioeinheiten (P. v. [bio]) ausgedrückt,
d. h. die Menge Antibiotikum, die eine 20-Millimeter-Hinderungszone bewirkt, wenn
sie auf eine 12,7-mm-Papier-Versuchsscheibe auf einer Standard-Agarplatte mit P.-vulgaris-Besamung
gebracht wird; 0,1 Mol Phosphat-Puffer mit dem pH-Wert 6,0 wird zur Herstellung
der Lösung benutzt.
-
In den folgenden Beispielen sind alle Mengenanteile nach Gewicht und
alle Mischungsteile im Volumenverhältnis angegeben. Beispiel 1 Eine aus dem Boden
isolierte Probe von Streptomyces achromogenes Var. 128 wurde auf eine Agarplatte
gestrichen mit folgendem sterilen Medium: Trypton .......................... 0,5
g Melasse ........................... 1,0 g Glyzerin ..........................
1,0 g Hefe-Extrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 g Agar .............................
2,0 g Mit destilliertem Wasser auf 100 ccm gebracht. Durch Kreuzverstreichen mit
verschiedenen Mikroorganismen erzielte man Ergebnisse, die bewiesen, daß man einen
Stoff entwickelt hatte, der aktive Wirkung gegen Staphylococcus aureus, Micobacterium
phlei, Klebsiellapneumoniae, Salmonella schottmuelleri, Proteus vulgaris, Erwinia
carotovora, Agrobacter tumefaciens, Streptococcus fecalis, Diplococcus pneumoniae
und Shigella sonnei zeigte.
Beispiel 2 Auf einem sterilen Maltose-Trypton-Agarschrägnährboden
folgender Zusammensetzung Maltose .......................... 1 g Trypton .........................
0,5 g K= H P 04 ........................ 0,05 g Fes 04 * 7 H20 . .. . .. . .. .
. .. .. . . . 0,01 g Agar ............................ 1,5 g Destilliertes Wasser
auf 100 ccm.
-
Streptomyces achromogenes Var. 128 wurde 7 Tage lang bei
28' C gezüchtet. Die entstandene Kultur wurde als Inoculum für folgendes
steriles Medium benutzt: Glukose ........................... 2 g Sojabohnenmehl
................... 1 g Hefe ............................. 0,25-Na Cl . . . . .
. . . . .. . . ... . . . . . . . . . .. . . 0,3 g (N H4)2 S 04 . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . 0,59 Destilliertes Wasser auf 100 ccm.
-
Das Impfmedium wurde in Schüttelkolben 2 Tage lang bei 28' C auf einem
rotierenden Schüttler unter Incubationsbedingungen gehalten. Das klare Filtrat,
Präparat 2, zeigte aktives Verhalten gegen Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Salmonella schottmuelleri, Proteus vulgaris, Erwinia carotov ora,
Penicillium oxalicum und Candida albicans.
-
Ein Papierchromatogramm des klaren Filtrats in sechs Lösungsmittelsystemen
zeigte folgende typische Beweglichkeit des Antibiotikums.
| Lösungsmittel Beweglich- |
| keit (Rp) |
| 1. 81% n-Butanol in Wasser . . . . . . . . . . 0,3 |
| 2. 81% n-Butanol, 0,25 % p-Toluol- |
| Schwefelsäure, in Wasser .......... 0,3 |
| 3. n-Butanol, Essigsäure, Wasser (2: 1 :1) 0,59 |
| 4. 81% n-Butanol, 2°/o Piperidin ...... keine Zone |
| 5. 96°/o Wasser, 4% n-Butanol . . . . . . . . 0,7 |
| 6. 96°/o Wasser, 4% n-Butanol, 0,25°l0 |
| p-Toluol-Schwefelsäure :........... 0,7 |
Beispiel 3 Ein Maltose-Trypton-Agarschrägnährboden von Streptomyces achromogenes
Var.128 wie im Beispiel 2 wurde für folgendes Sterilmedium als Inoculum benutzt
Glukose
..................... » ..... 1 g Fleischextrakt .....................
1 g Bactopepton (Difco) . . . . . . . .. . . .. . . 0,5 g \Ta Cl .............................
0,5 g Destilliertes Wasser, um eine Flüssigkeitsmenge von 100 ccm herzustellen,
das auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht wurde, ehe man es sterilisierte.
-
Das inokulierte Medium wurde 3 Tage lang in Schüttelkolben bei
28' C auf einem Wechselschüttler unter Incubationsbedingungen gehalten. Mit
75 ccm des entstandenen Wachstums inokulierte man 121 Sterilmedium der gleichen
Art. Das Medium wurde in einer 20-1-Flasche aus rostfreiem Stahl 2 Tage lang bei
28' C unter Incubationsbedingungen gehalten. Der Inhalt wurde ununterbrochen
mit Luft gerührt, wobei man 61 Luft in der Minute zuführte und zerstäubte. Das entstandene
Wachstum benutzte man zur Inokulation von 250 1 eines sterilen Mediums folgender
Zusammensetzung Bacto-Pepton .................... 2 g Melasse .........................
2,5 g Glukose .......................... 2 g Na Cl . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . 0,25 g Destilliertes Wasser auf 100 ccm, das man vor dem
Sterilisieren auf einen pH Wert von 7,0 brachte.
-
Dieses Medium wurde in einem 455-1-Fermenter aus rostfreiem Stahl
bei 24' C mit zerstäubter Luft (501 pro Minute), die durch ein Gebläserad bewegt
wurde, unter Incubationsbedingungen gehalten. Nach 66 Stunden Gärung zog man die
Gärbrühe ab. Auf 455 1 Medium gab man 7,71 kg Diatomeenerde und 15,88 kg Aktivkohle
zu. Das Gemisch wurde gut umgerührt und dann filtriert. Der Kuchen wurde mit 45,51
Leitungswasser und anschließend mit 113,751
Aceton und endlich mit
136,51 wäßrigem Aceton im Mischverhältnis 1 : 1 gewaschen. Die Acetonlösungen
mit dem Streptozotocin wurden zusammengeschüttet und im Vakuum getrocknet. Es sammelten
sich 1,75 kg Präparat 3, das sich als aktiv gegen Mikroorganismen erwies, wie oben
beschrieben.
-
Beispiel 4 Sporen von Streptomyces achromogenes Var. 128 aus einem
Maltose-Trypton-Aagarschrägnährboden (Beispiel 2) wurden in Form einer 0,5 ccm sterilen
Wassersuspension zur Impfung von 1 g sterilen Bodens benutzt. Die Bodenmischung
wurde bei Zimmertemperatur getrocknet, 0,25 g dieses Bodens benutzte man zur Impfung
von 100 ccm des folgenden sterilisierten Mediums in einem 500 ccm-Erlenmeyerkolben
Glukose ........................... 1 g N-Z-Amin B * ..................... 1 g Yeastolac*
....... ................ 1,5 g Destilliertes Wasser, um eine Flüssigkeitsmenge
von 100 ccm herzustellen.
-
N-Z-Amin B ist Sheffields Umsetzungsmedium aus Casein, und Yeastolac
ist ein Protein-Hydrolysat von Hefezellen. Dieses Medium wurde in Schüttelkolben
auf einem Wechselschüttler 24 Stunden lang bei 28' C inkubiert und dann zur
Impfung von 201 des folgenden sterilisierten Mediums benutzt: Wilsons Pepton-Flüssigkeit
-' . . . . . . . . . . 1 g Maisquellwasser . . . .. . . . . . .. . . . .
. .. 1 g Baumwollsamenmehl . . . . . . . . . . . . . . , 0,2 g Glukose ...........................
1 g Destilliertes Wasser auf 100 ccm.
-
'" Wilsons Pepton-Flüssigkeit ist eine hydrolysierte tierische Flüssigkeit
(animal stick liquor).
-
Das okulierte Medium wurde in einem 34,12-1-Fermenter 21 Stunden lang
unter Rühren bei 28' C inkubiert und mit zerstäubter Luft (10l pro :Minute)
behandelt. Mit diesen 201 Gärstoff impfte man 2501 des folgenden Sterilmediums:
Gelbes Maismehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 g N-Z-Amin B ......................
0,5 g Destilliertes Wasser, um eine Flüssigkeitsmenge von 100 ccm herzustellen,
das vor der Destillation auf einen p,1-Wert von 7,2 gebracht wurde.
-
Das geimpfte Medium wurde in einem 455-1-Fermenter aus rostfreiem
Stahl 66 Stunden lang bei 37' C und dann bei 28' C inkubiert, bis
es geerntet
wurde. Mit der 26. Stunde begann man mit Glukose-Zuführung
in wäßriger Lösung von 50 Volumprozent in einer Menge von 100 ccm stündlich bis
zur 71. Stunde, von da an 107 ccm stündlich bis zur 143. Stunde. Dann wurde der
Gärer- geleert. Die Gesamtflüssigkeit brachte man mit Schwefelsäure auf einen pff-Wert
von 4,0 und filtrierte sie durch Diatomeenerde. Den Kuchen spülte man leicht mit
Leitungswasser. Das gefilterte Medium konzentrierte man bei Unterdruck und Temperaturen
unter 50° C auf 0,08 Volumina oder 201 und brachte sie langsam mit 100 1 Aceton
zusammen. Dann gab man 20 kg Diatomeenerde zu. Die entstandene Flüssigkeit wurde
gefiltert und der Kuchen mit 5 1 Aceton gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit
vereinigte Acetonfiltrat wurde zu einer wäßrigen Lösung konzentriert und durch Gefrieren
getrocknet, `vorauf sich 150g Rohstreptozotocin, Präparat 4A, ergaben. 10 g Präparat
4 A wurden in 800 ccm 1-Butanol und 0,004 n-Salzsäure in Wasser im Volumenverhältnis
1 :1 gelöst. Nach 500 Überführungen in einer Craig-Gegenstromverteilermaschine sammelte
sich bei einer Spitze von K = 0,256 eine bioaktive Menge Streptozotocin, die nach.
dem Trocknen 2 g gereinigtes Präparat 4B ergab.
-
Präparat 4B suspendierte man in 10 ccm destilliertem Wasser und filtrierte
es. Das Filtrat wurde viermal mit einer jeweils neuen Menge von 100 ccm wassergesättigtem
1-Butanol extrahiert. Die Butanolextrakte wurden zusammengeschüttet und mit insgesamt
45 ccm Wasser gewaschen. Der Butanolextrakt wurde unter 40° C azeotropisch in eine
wäßrige Lösung übergeführt und durch Gefrieren getrocknet. Das Ergebnis waren 1,5
g gereinigtes Streptozotocin, Präparat 4C.
-
Präparat 4C reinigte man weiter durch Teilungschromatographie unter
Verwendung des Lösungsmittelsystems 1-Butanol, Cyclohexan, auf einen p11-Wert von
4,0, gepuffertes Wasser im Volumenverhältnis 20:4:4. Die Lösungsmittel wurden gemischt
und in eine obere und untere Phase getrennt. Die Säule wurde mit einer Aufschlämmung
von 150 g Diatomeenerde und 100 ccm oberer Phase beschickt und 60 ccm untere Phase
unter Rühren zugegeben. Diese Mischung wurde in eine Säule von 2,54 cm Durchmesser
geschüttet und mit Preßluft auf eine konstante Höhe von 101,60 cm gepackt. Präparat
4C wurde in 3 ccm untere Phase gelöst und mit 3 g Diatomeenerde sowie einer Minimalmenge
oberer Phase unter Umrühren und Gasentfernung gemischt und oben auf die gepackte
Säule gegeben und mit oberer Phase im Tempo von 1 ccm pro Minute entwickelt. Der
ausfließende Stoff wurde beim Austritt aus der Säule in Teile von 20 ccm getrennt.
Der erste bioaktive Teil trat nach 1050 ccm Eluat aus. Die aktiven Teile wurden
zusammengeschüttet und dann im Vakuum bei weniger als 50° C von 5 1 Eluat auf 50
ccm Konzentrat konzentriert. Diese 50 ccm wäßriges Konzentrat wurde mit 5 ccm 1-Butanol
extrahiert. Der Butanolextrakt wurde mit 5 ccm Wasser gewaschen. Die wäßrigen Phasen
wurden zusammengeschüttet, durch Gefrieren getrocknet und ergaben 1,4 g gereinigtes
Streptozotocin, Präparat 4D.
-
Präparat 4D wurde in 10 ccm Methyläthylketonwasser aufgelöst, Mischverhältnis
1 : 1, und gefiltert. Die Lösung wurde durch azeotropische Destillation bei unter
35° C konzentriert. Nach Zugabe von Methyläthylketon bildeten sich Streptozotocinkristalle.
Nach Kühlung, Filterung und Vakuumtrocknung erhielt man 0,9 g Streptozotocin, Präparat
4E, in Kristallen. Die Kristalle wurden weiter gereinigt durch dreimalige Umkristallisation
aus 95 °/o Äthanol. Der gereinigte Stoff in Kristallform, Präparat 4F, wies die
charakteristischen Eigenschaften auf, wie sie oben beschrieben worden sind.
-
Beispiel 5 2501 völlig gegorener Nährflüssigkeit des Beispiels 4 mit
einem pH Wert von 6,2 brachte man mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,2 und
filtrierte es dann mit 4°/0 = 9,98 kg Diatomeenerde als Filterhilfe. Den Filterkuchen
wusch man zweimal mit je 4,5 1 Leitungswasser. Die klare Brühe und die Flüssigkeit
aus den Spülungen goß man zusammen und kühlte sie über Nacht. Die zusammengegossene
Brühe, die gefilterte Brühe und die Spülflüssigkeit wurden mit 40/0 = 9,98 kg Aktivkohle
und mit 1 Rio = 2,27 kg Diatomeenerde behandelt. Die Mischung wurde 1/2 Stunde gerührt
und dann filtriert. Der Kuchen wurde zweimal mit Leitungswasser gewaschen (Wassermenge
9,11). Der Kohlekuchen wurde einmal mit 801 3A-Äthanol eluiert. 3A-Äthanol
ist ein vergälltes Gemisch, das auf 4551 190 g Äthanol, 22,75 1 absolutes Methanol
enthält, d. h. 5 °/o Methanol, 5 % Wasser und 90°/a Äthanol. Der Kuchen wurde anschließend
einmal mit je 181 3A-Äthanol gewaschen. Die Äthanoleluate wurden zusammengegossen
und bei unter 45° C zu einer wäßrigen Lösung konzentriert und durch Gefrieren getrocknet.
Das ergab 400 g gereinigtes Streptozotocin, Präparat 19A. Bei weiterer Reinigung
nach dem gleichen Verfahren, das man auf 4C, Beispiel 4, anwendete, erhielt man
ähnliche Präparate wie 4D, 4E und 4F. Beispiel 6 250 Milligramm Streptozotocin,
Präparat 4F, wurden in 5 ccm Essigsäureanhydrid gelöst und zu dieser Lösung 5 ccm
wasserfreies Pyridin zugegeben. Das Gemisch wurde gut gemischt und dann über Nacht
bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann destillierte man Pyridin und überschüssiges
Essigsäureanhydrid bei vermindertem Druck ab und erhielt als Rückstand 280 Milligramm
acetyliertes Streptozotocin, Präparat 17 A. Statt des Essigsäureanhydrids können
auch andere Acylierungsmittel angewendet werden, z. B. Propionsäureanhydrid, Propionsäurechlorid,
Benzoylchlorid oder Acetylchlorid.
-
Beispiel 7 10,39 Milligramm Streptozotocin, Präparat 4F, wurden in
2 ccm Essigsäure gelöst und zu dieser Lösung mit 10 Milligramm Platinoxyd zugegeben.
Das Gemisch wurde bei atmosphärischem Druck 30 Minuten lang hydriert. Das Streptozotocin
nahm etwa 5,43 Mol Wasserstoff pro Mol der Probe auf, wenn man für Streptozotocin
das Molekulargewicht 470 annimmt. Der Katalysator wurde durch Filtrieren entfernt
und die Essigsäure bei vermindertem Druck abdestilliert. Man erhielt 10,2 Milligramm
hydriertes Streptozotocin, Präparat 18A. Die Hydrierung kann auch mit Palladium
auf Holzkohle als Katalysator in Äthanol durchgeführt werden. In diesem Falle nimmt
das Streptozotocin 2 Mol V@rasserstoff pro Mol der Probe auf.