Procédé pour la préparation d'un nouvel antibiotique La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique très efficace, appelé variotine.
Ce nouvel antibiotique est formé pendant la cul ture d'une nouvelle souche de l'espèce connue de micro-organisme, Paecilomyces varioti Bainier. Cette souche que nous avons isolée du sol, et que nous désignons par le numéro de culture K-5201, présente des caractéristiques très semblables à celles qui sont attribuées au Paecilomyces varioti Bainier dans le Thom's Manual of the Penicillia, 1949, p. 691.
Une culture du micro-organisme vivant a été déposée dans la American Type Culture Collection ; elle a été désignée par ATCC 13435.
Ce nouvel antibiotique est actif contre une va riété de champignons. On connaît déjà plusieurs substances fongicides qui sont produites par la cul ture de micro-organismes appartenant aux moisis sures. Comme on le décrira plus loin, les propriétés physiques, chimiques et biologiques de cet antibioti- que, de même que les caractéristiques de la souche qui le produit, différencient cette substance des anti biotiques déjà connus.
La nouvelle souche Ne K-5201 fut inoculée sous la forme d'une petite tache dans le centre de boîtes de Petri ayant un diamètre intérieur de 86 mm, et contenant respectivement de la gélose de Czapek et de la gélose de corn-steep (la gélose de Czapek con- tenant 1-% de liqueur de corn-steep). L'incubation eut lieu à la température de 25e C, 300 C et 37o C, respectivement,
et les colonies cultivées furent obser vées macroscopiquement et microscopiquement.
Les résultats obtenus furent consignés dans les tableaux suivants. Les notations employées sont celles de Shigeo Abe's : The Classification of the Genus Penicillium (voir Journal of General and Applied Microbiology, vol. 12, Nos 1, 2 et 3, 1956).
Les couleurs indiquées sont celles de Ridgway, Color Standards and Nomenclature.
EMI0001.0065
<I>Caractéristiques <SEP> des <SEP> colonies <SEP> de <SEP> la <SEP> souche <SEP> Ne <SEP> K-5201</I>
<tb> Taux <SEP> de <SEP> croissance
<tb> (diamètre <SEP> des <SEP> colonies, <SEP> en <SEP> mm)
<tb> Gélose <SEP> de <SEP> corn-steep <SEP> Gélose <SEP> de <SEP> Czapek
<tb> Température
<tb> de <SEP> culture
<tb> 20 <SEP> jours <SEP> 10 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours <SEP> 10 <SEP> jours <SEP> 20 <SEP> jours
<tb> 85 <SEP> 37o <SEP> C <SEP> 85
<tb> 85 <SEP> 30e <SEP> C <SEP> 85
<tb> 86 <SEP> 85 <SEP> 55 <SEP> 250C <SEP> 55 <SEP> 85 <SEP> 86
EMI0002.0001
' <SEP> -<U>Milieu</U> <SEP> de <SEP> culture
<tb> Observation <SEP> Gélose <SEP> de <SEP> Czapek <SEP> Gélose <SEP> de <SEP> corn-steep
<tb> Texture <SEP> Funiculose <SEP> Gélose <SEP> de <SEP> corn-steep
<tb> Profondeur <SEP> après <SEP> culture <SEP> de <SEP> 5-6 <SEP> jours <SEP> (") <SEP> - <SEP> 200-600-1000 <SEP> 250-700-1000
<tb> Profondeur <SEP> après <SEP> culture
<tb> de <SEP> 10-12 <SEP> jours <SEP> (")
<SEP> 300-800-1200 <SEP> 300-900-1300
<tb> Caractère <SEP> de <SEP> la <SEP> surface <SEP> Lisse <SEP> 300-900-1300
<tb> Caractère <SEP> des <SEP> bords <SEP> Un <SEP> peu <SEP> velouté <SEP> 300-900-1300
<tb> Exsudat <SEP> Aucun <SEP> 300-900-1300
<tb> Couleur <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie <SEP> et <SEP> ses <SEP> Vieil <SEP> or <SEP> ou <SEP> jaune <SEP> sulfine <SEP> <U>-@</U> <SEP> Zone <SEP> marginale <SEP> et <SEP> intermé changements <SEP> citrine <SEP> diaire <SEP> : <SEP> comme <SEP> pour <SEP> la <SEP> gé lose <SEP> de <SEP> Czapek. <SEP> Zone <SEP> cen trale: <SEP> chamois <SEP> olive <SEP> foncé
<tb> .-> <SEP> citrine <SEP> chamois
<tb> Envers <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie <SEP> Zone <SEP> marginale <SEP> :
<SEP> Comme <SEP> pour <SEP> la <SEP> gélose <SEP> de
<tb> chamois <SEP> olive <SEP> foncé <SEP> Czapek <SEP> .-@ <SEP> noir <SEP> de <SEP> Chaetura
<tb> Zone <SEP> centrale
<tb> olive <SEP> foncé <SEP> <B>--></B> <SEP> noir <SEP> olivâtre
<tb> Pigmentation <SEP> du <SEP> substrat <SEP> Aucune <SEP> ou <SEP> vert <SEP> gris <SEP> bleuâtre <SEP> Aucune
<tb> Notice <SEP> Inclinaison:
<SEP> vert <SEP> gris <SEP> bleuâtre
EMI0002.0002
<I>Observation <SEP> microscopique <SEP> au <SEP> stade <SEP> conidien <SEP> de <SEP> la <SEP> souche <SEP> N4 <SEP> K-5201</I>
<tb> - <SEP> Conidies
<tb> Chaîne <SEP> conidienne
<tb> <B>Grandeur <SEP> Forme <SEP> Marquage</B>
<tb> Colonie- <SEP> I <SEP> Inclinaison <SEP> I <SEP> Forme
<tb> 190=340a <SEP> 250-390-a- <SEP> Divergente <SEP> 3,4-4,5 <SEP> X <SEP> 1,7-2,8 <SEP> Ellipsoïde <SEP> i <SEP> Lisse
<tb> 5,6-7,6X3,1-4,3 <SEP> ou <SEP> fusiforme
<tb> (parfois)
EMI0002.0003
Stérigmates
<tb> Nombre <SEP> usuel <SEP> # <SEP> Arrangement <SEP> # <SEP> Diamètre <SEP> Longueur <SEP> Forme <SEP> i <SEP> Marquage
<tb> <U>1-4</U> <SEP> Divergent <SEP> 2,8-4,2 <SEP> @t <SEP> 9,3-18,
7-21 <SEP> It <SEP> Paecilomyces <SEP> Lisse
EMI0002.0004
Metulae
<tb> Nombre <SEP> usuel <SEP> Arrangement <SEP> Apex <SEP> @. <SEP> Diamètre <SEP> Longueur <SEP> Marquage
<tb> <B><I><U>1-5</U></I></B> <SEP> Divergent <SEP> 2,8-4,3 <SEP> #t
<tb> 2,8-4,3 <SEP> <U>It</U> <SEP> 6,2-15,6 <SEP> #t <SEP> Lisse
EMI0003.0001
Branches
<tb> Apex <SEP> I <SEP> Diamètre <SEP> I <SEP> Longueur <SEP> Marquage
<tb> -- <SEP> I
<tb> <U>351-5,0'u</U> <SEP> 2,8-4,9 <SEP> tt <SEP> 6,2-18,7 <SEP> [t <SEP> Lisse
<tb> <U>I</U>
<tb> Conidiophores
<tb> Apex <SEP> I <SEP> Diamètre <SEP> I <SEP> Longueur <SEP> Marquage
<tb> 5,0-7,5 <SEP> tt <SEP> 3,1-5,0 <SEP> [t <SEP> 30-65 <SEP> tt <SEP> Lisse Ainsi, la souche No K-5201 montre une crois sance abondante et étendue,
l'apparence de ses colo- nies étant celle de la funiculose et non pas plissée et ayant une couleur vieil or ou jaune sulfine qui tourne à la couleur citrine à un stade ultérieur de la culture. La zone marginale de la colonie repré sente une texture de funiculose veloutée. En ce qui concerne l'envers de la colonie, la zone marginale présente une couleur chamois olive foncé et la zone centrale présente une couleur olive foncé, ces teintes tournant au noir olivâtre après une culture de 20 jours.
Il n'y a pas de formation de pigment sus ceptible de diffuser dans le milieu de culture, excepté une formation de pigment de couleur vert gris bleuâtre, dans une faible mesure. Dans la culture inclinée, une formation de pigment de couleur vert gris bleuâtre fut observée occasionnellement.
Comme on le voit d'après les observations mi- croscopiques, la forme des conidies est ellipsoïde ou fusiforme, et leur grandeur est de 3,4-4,5 ut sur 1,7- 2,8 tt et parfois 5,6-7,5 tt sur 3,1-4,3 ut. Les sté- rigmates sont minces et longs, leurs apex étant minces et crochus. Ces derniers sont les plus caractéristiques du genre Paecilomyces. Tous les organes croissent de telle manière qu'ils se développent diversement. Tous les organes sont lisses.
La couleur de la colonie et la formation de pigment dans le milieu de culture ne sont pas les mêmes que dans le Paecilomyces varioti Bainier précédemment connu (voir Kenneth B. Raper & Chartes Thom : A Manual of the Peni- cillia, 1949), mais ces différences ne sont pas assez grandes pour différencier la souche N K-5201 comme une nouvelle espèce.
Bien que jusqu'à présent il n'ait jamais été men tionné qu'un antibiotique peut être obtenu par cul ture d'une souche du Paecilomyces, notre souche N- K-5201 peut produire une nouvelle substance fongicide, la variotine.
En nous référant aux points susmentionnés, nous avons maintenant considéré que la souche N,, K-5201 est une variante du Paecilomyces varioti Bainier, et avons donné à ladite souche le nom de Paecilomyces varioti Bainier var. antibioticus.
Il doit être entendu que pour la préparation de variotine, nous ne désirons pas nous limiter à la souche particulière décrite ici, car des variations peu vent se produire dans les caractéristiques de culture de cette souche sans affecter la production de l'anti biotique.
Nous désirons spécialement inclure dans l'expression souche de Paecilomyces varioti Bainier var. antibiotieus les micro-organismes qui sont des mutants obtenus par différents moyens, naturels ou artificiels, tels que rayons X, rayons ultraviolets, mou tardes à l'azote, etc.
La variotine est active contre une variété de champignons, mais n'est pas active contre les bacté ries. L'efficacité de la variotine peut être mesurée de différentes façons. Le procédé calice-plaque em ployant une souche de Penicillium chrysogenum Q-176 comme organisme de test, est l'un de ces pro cédés.
Mentionnons à titre de référence qu'une unité de variotine est la quantité minimum d'une telle substance qui empêche complètement la croissance d'une souche standard de Penicillium chrysogenum Q-176, dans un ml de gélose de Czapek.
Le procédé selon la présente invention est carac térisé en ce qu'on cultive en aérobie une souche mutante du micro-organisme Paecilomyces varioti Bainier dans un milieu de culture approprié contenant des substances nutritives, jusqu'à ce qu'une activité antimicrobienne appréciable soit produite dans le milieu. Les matières nutritives qui peuvent être employées comprennent celles qui étaient utilisées auparavant pour la culture des moisissures.
On peut employer, par exemple, une source de carbone telle que le sucrose, le glucose, le fructose, le mannose, la glycérine, l'amidon, le mannan, le sucre de malt, le xylose, le lactose, la mélasse, ete. Comme source d'azote, on peut prendre une source d'azote inorga nique, par exemple le nitrate de sodium, le nitrate d'ammonium, le nitrate de calcium, le sulfate d'am monium, etc.
et une source d'azote organique telle que la farine de soja, la farine d'arachides, la farine de graines de coton, l'extrait de viande, la peptone, la liqueur de corn-steep, l'extrait de levure, etc. Le cas échéant, on peut ajouter au milieu de culture des sels minéraux tels que le chlorure de sodium, des sels de l'acide phosphorique, des sels de métaux lourds, etc.
En ce qui concerne le procédé de culture, un milieu solide peut être employé pour une production importante de variotine, mais pour la production commerciale, on préfère un milieu liquide, et spéciale ment une culture submergée est employée avec succès. Une telle culture peut être conduite dans des conditions aérobies, c'est-à-dire avec aération de l'air stérilisé, à une température de culture de 20 à 400C, de préférence vers environ 250 C; jusqu'à ce qu'une quantité appréciable de variotine soit accu mulée dans le milieu de culture.
En général, la pro duction de variotine avec le rendement le plus élevé est obtenue en employant une culture avec agitation pendant une durée comprise entre 3 et 7 jours ou une culture en cuve pendant une durée comprise entre 2 et 6 jours.
Pour recueillir la variotine après avoir terminé la culture, on peut procéder de deux façons : selon la première façon, on sépare d'abord les matières solides du bouillon de fermentation par filtrage et l'on recueille la variotine séparément à partir des matières solides et du filtrat du bouillon. Selon l'autre façon, on recueille la variotine directement à partir du bouil lon de fermentation, la variotine produite étant pré sente dans la solution de culture et dans les matières solides contenant le mycélium.
Pendant la culture aussi bien que pendant l'extraction, on préfère main tenir la solution à un pH compris entre 4,0 et 7,0, car la variotine est stable pour un tel pH, mais est instable à un pH supérieur à 7,0.
Pour recueillir la variotine à partir du filtrat de bouillon, dont on a séparé les matières solides con tenant le mycélium, la variotine peut être extraite avec un solvant organique non miscible à l'eau, tel que le butanol, l'alcool amylique, la méthyl-isobutyl- cétone, le benzène, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, le tétrachlorure de carbone, etc., la variotine étant extraite dans la couche de solvant organique avec un très bon rendement.
Cependant, la variotine ne peut pas être extraite aussi bien dans la ligroine ou l'éther de pétrole.
Pour recueillir la variotine à partir des matières solides contenant le mycélium mouillé, lesdites ma tières solides peuvent être additionnées d'un solvant miscible à l'eau dans lequel la variotine est soluble, par exemple l'acétone, le méthanol, l'éthanol ou les solvants mentionnés ci-dessus qui sont utilisés pour dissoudre la variotine, et après une vigoureuse agita tion, les parties solides insolubles sont séparées sous pression réduite.
Ensuite, la variotine peut être extraite par un solvant organique non miscible à l'eau de la même manière que dans l'extraction à partir du filtrat de bouillon.
A partir du bouillon de fermentation qui contient les matières solides contenant le mycélium, la vario- tine peut être extraite avec un solvant non miscible à l'eau avec une agitation vigoureuse de la même manière que dans l'extraction à partir du filtrat de bouillon.
Lorsqu'une solution de variotine dans un solvant organique, par exemple une solution de variotine dans l'acétate d'éthyle, est concentrée sous pression réduite et est complètement séchée, on obtient un sirop rouge brunâtre. Le sirop peut être dissous dans un solvant organique tel que le méthanol, l'éther, le tétrachlorure de carbone, etc., réfrigéré, puis filtré pour enlever les matières qui sont insolubles dans chacun des solvants énumérés.
Lors de l'opération de purification utilisant divers solvants organiques, il est avantageux qu'une solution de variotine dans une faible quantité d'un solvant organique tel que l'éther soit additionnée d'un grand volume d'éther de pétrole ou de ligroïne pour précipiter la variotine.
Lorsqu'une solution de variotine dans le solvant organique final est concentrée sous pression réduite, la variotine peut être obtenue sous la forme d'une substance huileuse légèrement colorée en jaune, avec une pureté de plus de 140 #t/mg. La variotine qui est une substance huileuse, lors qu'elle est préparée comme décrit ci-dessus, peut être purifiée par distribution à contre-courant en em ployant de l'eau et des solvants organiques, et les parties fortement actives de l'extrait peuvent être recueillies et concentrées sous pression réduite.
Ainsi, de la variotine purifiée ayant l'activité de 166 tt/mg peut être obtenue sous forme d'une substance hui leuse. On prouve que cet échantillon est une subs tance simple au moyen de la courbe de distribution à contre-courant (voir fin de la description). Les propriétés physiques, chimiques et biologiques de la variotine préparée par le procédé décrit ci-dessus sont les suivantes : la variotine est une substance huileuse incolore et a une odeur parfumée analogue à celle des esters.
Lorsqu'on la chauffe sous pression ordi naire, elle se colore graduellement jusque vers 1501, C, puis elle vire au brun foncé et se décompose. Pen dant ce temps, la variotine ne présente pas de points de décomposition et d'ébullition définis.
La variotine est à peine soluble dans l'eau, l'éther de pétrole et la ligroïne, mais elle est soluble dans divers solvants organiques tels que le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'alcool amylique, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, l'acétone, la méthyl- isobutyl-cétone, l'éther, le benzène, le benzyl-éther, le chloroforme, le tétrachlorure de carbone, le disul- fure de carbone, la pyridine, 1a dioxane,
le cyclo- hexanol, la glycérine, l'éthylène-glycol, l'acide acéti que, etc. La rotation optique de la variotine est [ ]D-$ =-5,68o (C = 1,0 % dans le méthanol). Le spectre d'absorption ultraviolet de la va.riotine dans le méthanol montra une absorption maximum à 318 324 m#t (Ei gym= 1198).
Le dessin annexé montre le spectre infrarouge de la variotine (film liquide). Le diagramme du dessin indique en abscisses supérieures les fréquences en cm-' avec, en abscisses inférieures, les longueurs d'ondes en microns et en ordonnées les valeurs de tranamittance en %. Cette courbe présente une absorption maximum à 3460, 3100, 2950, 2880, 1740, 1670, 1600, 1485, 1465, 1430, 1350,<B>1</B>310, 1260, 1190, 1160, 1125, 1075, 1065, 1025,<B>1</B>005, 970, 935, 885, 865, 840, 800 et 7<B>1</B>5 cm-'.
L'analyse élémentaire de la variotine donne les valeurs suivantes : C 67,35 %, H 8,58 %, N 4,16 % et O 19,91 % (par différence). On ne trouve ni sou fre, ni phosphore, ni halogène, ni cendre.
Comme spécifié plus loin, la variotine est rela tivement stable en réaction légèrement acide ou neutre (pH 4,0-7,0), mais en réaction alcaline, elle est très instable et perd rapidement ses activités anti biotiques à la température ambiante.
La variotine, lorsqu'elle est réduite catalytique ment en présence de noir de platine, est transformée en une matière huileuse incolore et perd son activité antibiotique.
La variotine donne des réactions positives aux essais pour les groupes diazo, nitroalcoyle et acide hydroxamique, et donne des réactions négatives pour les réactions du chlorure ferrique, de Millon, d'Ehr lich, de Sakaguchi, de Molisch, du biuret, de la xantho-protéine et de la ninhydrine.
Les activités antibiotiques de la variotine sont déterminées par des procédés de dilution employant le milieu de Czapek ou le milieu de Soubraud (milieu de glucose-peptone), et les résultats sont les suivants
EMI0005.0011
Inhibition <SEP> Dilution
<tb> Organisme <SEP> (après <SEP> 7 <SEP> jours
<tb> d'incubation <SEP> à <SEP> 25- <SEP> C)
<tb> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> Q-176.. <SEP> X <SEP> 160,000
<tb> Penicillium <SEP> rubellum <SEP> . <SEP> .. <SEP> .. <SEP> <B>...... <SEP> <SEP> -----</B> <SEP> X <SEP> 40,000
<tb> Penicillium <SEP> glaucum <SEP> .... <SEP> .. <SEP> .............. <SEP> X <SEP> 1,000
<tb> Aspergillus <SEP> clavatus <SEP> .._ <SEP> .... <SEP> .. <SEP> ........ <SEP> ...
<SEP> X <SEP> 240,000
<tb> Aspergillus <SEP> glaucus <SEP> <B>... <SEP> .... <SEP> .... <SEP> .. <SEP> ..... <SEP> ....</B> <SEP> X <SEP> 50,000
<tb> Aspergillus <SEP> cryzae <SEP> . <SEP> .. <SEP> ... <SEP> .. <SEP> <B>... <SEP> ....... <SEP> . <SEP> .</B> <SEP> X <SEP> 1,000
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> <B>.....</B> <SEP> ... <SEP> X <SEP> 1,000
<tb> Aspergillus <SEP> japonicus <SEP> ... <SEP> <B>... <SEP> ....</B> <SEP> .. <SEP> .. <SEP> .. <SEP> X <SEP> 1,000
<tb> Rhizopus <SEP> javanicus <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> X <SEP> 24,000
<tb> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> <B>.. <SEP> ....... <SEP> --------- <SEP> - <SEP> -</B> <SEP> X <SEP> <B>1,000</B>
<tb> Rhizopus <SEP> japonieus <SEP> .... <SEP> .. <SEP> ... <SEP> .. <SEP> .. <SEP> .. <SEP> X <SEP> 1,000
<tb> Rhizopus <SEP> delemar <SEP> .... <SEP> .. <SEP> ... <SEP> _.. <SEP> .... <SEP> .......
<SEP> X <SEP> 30,0.00
<tb> Mucor <SEP> mucedo <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ..... <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> X <SEP> 1,000
<tb> Monillia <SEP> formosa <SEP> - <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> ........... <SEP> . <SEP> . <SEP> X <SEP> 160,000
<tb> Ceratostomella <SEP> fimbriata <SEP> . <SEP> X <SEP> 50,000
<tb> Trichophyton <SEP> interdigitale <SEP> ... <SEP> ..... <SEP> . <SEP> .. <SEP> X <SEP> 160,000
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> . <SEP> .. <SEP> ... <SEP> .... <SEP> .. <SEP> ... <SEP> . <SEP> X <SEP> 80,000
<tb> Cryptococcus <SEP> neoformans <SEP> ...<B>-------</B> <SEP> .-. <SEP> X <SEP> 320,000
<tb> Microsporum <SEP> audouini <SEP> <B>.... <SEP> ............ <SEP> ...</B> <SEP> X <SEP> 640,000
<tb> Epidermophyton <SEP> inguinale <SEP> .. <SEP> ... <SEP> ... <SEP> X <SEP> 160,000
<tb> Blastomyces <SEP> dermatitis <SEP> ....
<SEP> .. <SEP> ... <SEP> . <SEP> . <SEP> X <SEP> 1,280,000
<tb> Microsporum <SEP> japonicum <SEP> ... <SEP> ....... <SEP> X <SEP> 10,000
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> ... <SEP> . <SEP> . <SEP> 0
<tb> Zygosaccharomyces <SEP> salsus <SEP> .... <SEP> .. <SEP> . <SEP> 0
<tb> Torula <SEP> utilis <SEP> ....... <SEP> .................. <SEP> ... <SEP> 0
<tb> Torula <SEP> rubra <SEP> ... <SEP> ......... <SEP> ............... <SEP> 0
<tb> Torulaspora <SEP> delbrückü <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> 0
<tb> Hanseniaspora <SEP> delbrückii <SEP> ........... <SEP> 0
<tb> Pichia <SEP> miyaji <SEP> .. <SEP> ...... <SEP> ... <SEP> .. <SEP> 0
<tb> Willia <SEP> anomals <SEP> ........... <SEP> ... <SEP> +
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> P. <SEP> 0
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 0
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ............................
<SEP> 0
<tb> Wyeobacterium <SEP> s. <SEP> p. <SEP> 607.. <SEP> .. <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> 0 Les activités de la variotine contre les micro organismes pathogènes des plantes sont déterminées par le procédé de dilution par bandes dans la gélose, et les résultats furent les suivants
EMI0005.0013
Organisme <SEP> Inhibition <SEP> Dilution
<tb> (après <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> d'incubation <SEP> à <SEP> 25- <SEP> C)
<tb> Fusarium <SEP> bulbigenum <SEP> ... <SEP> X <SEP> 1,000- <SEP> 10,000
<tb> Altarnaria <SEP> bataticala <SEP> <B>...</B> <SEP> X <SEP> 1,000- <SEP> 10,000
<tb> Colletotrichum
<tb> lagenarium <SEP> ....<B>..........</B> <SEP> - <SEP> X <SEP> 100,000-1,000,000
<tb> Phytophthora <SEP> infestans...
<SEP> X <SEP> 1,000- <SEP> 10,000
<tb> Ophiobolus <SEP> miyabeanus <SEP> X <SEP> 1,000,000
<tb> Ophiobolus <SEP> graminis <SEP> .- <SEP> X <SEP> 100,000-1,000,000
<tb> Colletotrichum
<tb> cingulata <SEP> . <SEP> ........... <SEP> .. <SEP> ._ <SEP> X <SEP> 10,000- <SEP> 100,000
EMI0005.0014
Organisme <SEP> Inhibition <SEP> Dilution
<tb> (après <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> d'incubation <SEP> à <SEP> 25- <SEP> C)
<tb> Colletotrichum
<tb> lindemuthianum <SEP> X <SEP> 1,000- <SEP> 10,000
<tb> Colletotrichum
<tb> gossypii <SEP> <B>....</B> <SEP> ....._ <SEP> . <SEP> ..... <SEP> X <SEP> 10,000- <SEP> 100,000
<tb> Ceratostomella
<tb> fimbriata <SEP> . <SEP> <B>. <SEP> . <SEP> ... <SEP> .............</B> <SEP> X <SEP> 10,000- <SEP> 100,000
<tb> Endothia <SEP> parasitica......... <SEP> X <SEP> 1,000- <SEP> 10,000
<tb> Rosellinia <SEP> necatri <SEP> ............
<SEP> X <SEP> 1,000- <SEP> 100,000
<tb> Gibberella <SEP> fujikuroi <SEP> ...... <SEP> X <SEP> 10,000- <SEP> 100,000 L'activité fongicide de la variotine en ajoutant du sérum humain au milieu de culture fut examinée, en employant le Tricophyton interdigitale et le Tri- cophyton rubrum comme organismes de test. L'acti vité de la variotine diminua jusqu'à environ la moitié et même le quart, en comparaison avec le cas où l'on n'avait pas ajouté de sérum humain.
La variotine fut mise en suspension dans de l'eau stérilisée contenant 5 % de carboxy-méthyl- cellulose et la suspension obtenue fut injectée intra- péritonéalement à des souris pour contrôler la toxi cité de la variotine. L'administration de la variotine à un dosage allant jusqu'à 330 mg/kg ne présente pas d'effets toxiques.
Cependant, pour un dosage supérieur à 330 mg/kg, la toxicité de la variotine ne put être mesurée, en raison de la solubilité moindre de la variotine dans l'eau.
La variotine a une activité fongicide spécifique spécialement à l'égard des espèces de champignons pathogènes telles que le Trichophyton interdigitale, le Trichophyton rubrum et le Cryptococcus neofor- mans, et des espèces de champignons pathogènes des plantes telles que le Colletotrichum lagenarium et le Gibberella fujikuroi,
et son activité fut peu affectée par l'addition de sérum humain au milieu de culture.
Il a été prouvé que la variotine n'irrite pas la peau humaine et présente une faible toxicité. Elle est efficace dans la thérapie de la mycose superfi cielle de l'homme et des animaux, spécialement de la dermatomycose, et sur la base des faits mentionnés ci-dessus, nous présumons qu'elle sera efficace contre la mycose générale, l'anthraenose du concombre et la maladie de Bakanae du riz.
<I>Exemple 1</I> A un milieu de base contenant 0,1 % de nitrate de sodium, 0,2 % de biphosphate de potassium, 0,05 % de sulfate de magnésium, 0,05 % de chlorure de potassium et 0,001 % de sulfate ferreux et ayant un pH de 6; on ajouta respectivement 3 % de a) sucrose, b) glucose, c) fructose, d) mannose, e) gly cérine, f) mannan, g) maltose, h) amidon, i) xylose, j) lactose et k) galactose.
Une souche Ne K-5201 de Paecilomyces varioti Bainier var. antibioticus fut inoculée à chacun des milieux de culture ainsi obte nus, qui avaient été introduits dans des ballons à agitation d'un volume de 500 ml à raison de 100 ml par ballon, puis stérilisés et cultivés à la façon d'une culture agitée à une température de<B>250</B> C. Après une culture de 3 à 6 jours, la production maximum de variotine dans la solution de culture fut obtenue.
Des mesures faites suivant le procédé du calice don nèrent la teneur suivante de variotine, exprimée en [/ml : a) 35, b) 17, c) 15, d) 21, e) 13, f) 2, g) 30, h) 22, i) 18, j) 2 et k) 2. Ainsi, la variotine fut pro duite par culture d'une souche No K-5201, dans laquelle les hydrates de carbone énumérés plus haut sont employés comme source de carbone.
<I>Exemple 2</I> A un milieu de base contenant 3,0 % de sucrose, 0,2 % de biphosphate de potassium, 0,05 % de sul fate de magnésium, 0,05 % de chlorure de potassium et 0,001 % de sulfate ferreux et ayant un pH de 6,0, on ajouta respectivement a) 3 % de nitrate de so dium, b) 0,3 % de nitrate d'ammonium, c) 0,5 % de sulfate d'ammonium, d) 0,5 % de farine de soja, e) 0,5 % de farine d'arachides, f) 0,5 % de farine de graines de coton, g) 0,5 % d'extrait de viande, h) 0,5 % de peptone et i)
1 % en poids de liqueur de corn steep. Une souche No K-5201 fut inoculée à chacun des milieux de culture ainsi préparés, qui avaient été introduits dans des ballons à agitation d'un volume de 500 ml à raison de 100 ml par ballon, puis stérilisés et cultivés à la façon d'une culture agitée à<B>250</B> C. Après culture pendant 2 à 6 jours, la production maximum de variotine fut obtenue.
La teneur en variotine fut la suivante a) 35, b) 28, c) 28, d) 12, e) 10, f) 10, g) 12, h) 10 et i) 15, ces valeurs étant exprimées en #t/ml. Ainsi, la variotine fut produite par culture d'une souche No K-5201, dans laquelle les matières énumérées plus haut furent employées comme source d'azote.
<I>Exemple 3</I> Une souche No K-5201 fut inoculée dans 101 du milieu de culture contenant 3,0 % de suorose, 0,3 % de nitrate de sodium, 0,2 % de biphosphate de potas sium, 0,05 % de sulfate de magnésium, 0,05 % de chlorure de potassium et 0,001 % de sulfate ferreux et ayant un pH de 6. La culture fut poursuivie pen dant 60 heures, la production de variotine en 30 unités fut accomplie. A la fin de ce laps de temps, le bouillon de fermentation fut séparé du mycélium par filtrage et le filtrat fut extrait deux fois avec 31 d'acétate d'éthyle.
Les extraits combinés furent con centrés sous pression réduite. Le concentré fut dis sous dans 100 ml de méthanol et après séparation par filtrage des matières insolubles qui se formèrent lors du refroidissement de la solution résultante, la solution méthanolique fut concentrée sous pression réduite. Ainsi, 1,8 g de variotine ayant une activité de 120 [./mg fut obtenue.
D'autre part, le mycélium séparé par filtrage fut additionné d'un litre de méthanol et fut soumis, après broyage et agitation, à une centrifugation. La couche de méthanol séparée fut distillée sous pres sion réduite, puis extraite avec de l'acétate d'éthyle. L'extrait fut concentré sous pression réduite, et le concentré obtenu fut dissous dans environ 100 ml de méthanol.
Après avoir enlevé les matières insolu bles qui se formèrent lors du refroidissement, la solu tion méthanolique fut concentrée sous pression ré duite, et l'on obtint 0,8 g de variotine ayant une activité de 90 #t/mg. <I>Exemple 4</I> 1001 du milieu décrit dans l'exemple 3 furent introduits dans une cuve de fermentation ayant un volume de 2001.
50 g de riz étuvé inoculé avec une souche No K-5201 et entièrement sporulé après cul ture pendant une semaine, furent introduits dans la cuve et cultivés avec aération et agitation à une température de 26 ou<B>270</B> C pendant 90 heures, ladite aération étant effectuée en projetant de l'air stérilisé avec un débit de 901/min. A la fin de ce laps de temps, le bouillon de fermentation accusa une teneur en variotine de 16 #t/ml. <B>811</B> de la solu tion cultivée, comprenant le mycélium, furent extraits deux fois avec 301 d'acétate d'éthyle, une centrifu geuse Sharples étant employée pour séparer le sol vant.
L'extrait combiné fut concentré sous pression réduite et environ 55 g de sirop brunâtre furent obtenus. Ce sirop fut dissous dans 250 ml de métha nol, puis fut refroidi. Les matières insolubles qui se formèrent furent enlevées par filtrage. La solution méthanolique ainsi traitée fut concentrée sous pres sion réduite, puis le sirop obtenu fut dissous dans de l'éther et les matières insolubles furent séparées par filtrage. La solution d'éther fut concentrée sous pression réduite jusqu'à un volume d'environ 25 ml, puit fut additionnée de dix fois son volume d'éther de pétrole et refroidie.
Les matières huileuses qui se précipitèrent furent séparées du solvant par décanta tion et lavées avec un faible volume d'éther de pétrole. Après séchage, les matières huileuses ainsi traitées furent dissoutes dans 300 ml de tétrachlorure de carbone, puis refroidies. Les matières huileuses rouge brunâtre qui s'étaient formées furent enlevées par décantation et la solution dans le tétrachlorure de carbone fut concentrée sous pression réduite ; on obtint ainsi 6,6 g d'une substance huileuse légèrement jaune, ayant une activité de 145 [t/mg.
1 g de la substance huileuse obtenue ci-dessus fut soumis à une distribution à contre-courant com prenant 47 tubes, en employant comme solvant du méthanol à 70 % et du tétrachlorure de carbone dans le rapport 1 : 1. Les résultats du titrage biolo gique,
de l'absorption ultraviolette et les mesures de poids montrèrent que le composant biologiquement actif était réparti principalement dans les tubes Nos 12 à 32 et que le tube No 21 présentait la con- centration la plus élevée en composants actifs. Les échantillons des tubes Nos 15 à 26 furent combinés et distribués de nouveau à contre-courant, dans un appareil comprenant 130 tubes.
La variotine fut ainsi réparties dans les tubes Nul, 47 à 73, le tube No 61 accusant la plus grande teneur en variotine. Chacune des courbes de distribution correspondant au titrage biologique, à l'absorption ultraviolette et aux mesures de poids concordait bien avec la courbe théorique, et il fut prouvé que la variotine est une substance simple.
Les échantillons des tubes Nos 58 à 63 furent combinés et concentrés sous pression réduite, et l'on obtint 110 mg d'une substance huileuse inco lore ayant une activité de variotine de 166 [./mg.