FR2508766A1 - Nouvelle substance antifongique obtenue a partir d'une souche de bacillus subtilis, son procede d'obtention et ses applications comme antifongique - Google Patents
Nouvelle substance antifongique obtenue a partir d'une souche de bacillus subtilis, son procede d'obtention et ses applications comme antifongique Download PDFInfo
- Publication number
- FR2508766A1 FR2508766A1 FR8113118A FR8113118A FR2508766A1 FR 2508766 A1 FR2508766 A1 FR 2508766A1 FR 8113118 A FR8113118 A FR 8113118A FR 8113118 A FR8113118 A FR 8113118A FR 2508766 A1 FR2508766 A1 FR 2508766A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- sep
- substance
- antifungal
- chloroform
- ethanol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENTION A POUR OBJET UNE SUBSTANCE ANTIFONGIQUE CARACTERISEE PAR LES PROPRIETES SUIVANTES: 1.COULEUR ET ETAT PHYSIQUE: POUDRE INCOLORE; 2.POINT DE FUSION: F 243C; 3.CARACTERISTIQUES CHROMATOGRAPHIQUES: R 0,47 DANS CHLOROFORME-METHANOL-EAU (65: 25: 4); R 0,63 DANS DIMETHYLFORMAMIDE-EAU-CHLOROFORME (44: 6: 50); 4.REACTION COLOREE: REACTION POSITIVE AU REACTIF DE PAULY ET A LA RHODAMINE, REACTION NEGATIVE A LA NINHYDRINE; 5.ABSENCE DE MIGRATION ELECTROPHORETIQUE A PH: 8,0 ET A PH: 4,0; 6.LE SPECTRE IR PRESENTE DES BANDES CARACTERISTIQUES A 3,0-3,1, 6,1 ET 6,5-6,6 MM; 7.LE SPECTRE UV EFFECTUE DANS L'ETHANOL A 95 PRESENTE DEUX MAXIMA, L'UN A 203NM, L'AUTRE A 275NM; 8.SOLUBILITE: SOLUBLE DANS ETHANOL A 95, INSOLUBLE DANS LE PROPYLENE GLYCOL.
Description
La présente invention est relative à une nouvelle substance antifongique obtenue à partir d'une souche de
Bacillus subtilise
La souche de Bacillus subtilis productrice de cette substance antifongique est déposée à 1'Institut
Pasteur sous le no
Elle présente les caractéristigues de la famille de bacillaceae, du genre Bacillus subtilis, décrit dans
Bergeys manual of determinative bacteriology, 8ème édition, P 531.
Bacillus subtilise
La souche de Bacillus subtilis productrice de cette substance antifongique est déposée à 1'Institut
Pasteur sous le no
Elle présente les caractéristigues de la famille de bacillaceae, du genre Bacillus subtilis, décrit dans
Bergeys manual of determinative bacteriology, 8ème édition, P 531.
Morphologie gros bacille à bouts carrés avec parfois endospore, prenant la coloration de Gram.
A l'état frais, le germe est mobile; sur milieu solide gélosé, les colonies sont plates, sèches, du type "rough", grisâtres.
Parfois, un pigment grisâtre diffuse dans la gélose. Sur milieu liquide, la culture aérobie-anaérobie facultative développe un voile, puis un dépôt grisâtre.
La température optimale de croissance est de 330C.
Biochimie : Les principaux sucres sont fermentés (glucose, galactose, saccharose). Le lactose n'est pas fermenté.
Pas d'uréase - Indole négatif.
La gélatine est liquéfiée.
La nouvelle substance antifongique selon la présente invention, qui est appelée Bacillomycine F, est caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes
1 - Couleur et état physique : poudre incolore;
2 - Point de fusion : F = 2430C;
3 - Caractéristiques chromatographiques = = 0,47 dans chloroforme-raéthanol-eau
(65:25:4)
RF = 0,63 dans diméthylformamide-eau-chloro
forme (44:6:50)
4 - Réactions colorées : réaction positive au
réactif de Pauly et à la rhodamine.
1 - Couleur et état physique : poudre incolore;
2 - Point de fusion : F = 2430C;
3 - Caractéristiques chromatographiques = = 0,47 dans chloroforme-raéthanol-eau
(65:25:4)
RF = 0,63 dans diméthylformamide-eau-chloro
forme (44:6:50)
4 - Réactions colorées : réaction positive au
réactif de Pauly et à la rhodamine.
: réaction négative à la
ninhydrine.
ninhydrine.
5 - Absence de migration électrophorétigue à pH = 8,0 et à pH = 4,0.
6 - Le spectre IR présente des bandes caractéristiques à 3,0-3,1; 6,1 et 6,5-6,6 m.
7 - Le spectre UV effectué dans méthanol à 95 % présente deux maxima, l'un à 203 nm, l'autre à 275 nm.
8 - Solubilité : soluble dans l'éthanol à 95 Oc,
insoluble dans le propylène
glycol.
insoluble dans le propylène
glycol.
L'analyse de la substance selon la présente invention a montré que cette substance, bien qu'elle soit homogène dans ses caractéristiques (telles que valeurs de Rf), est en fait un mélange de plusieurs constituants dont le constituant majoritaire répond à la formule
les autres constituants ne différant de celui-ci que par la longueur ou par la position de la ramification de la chaîne lipidique (c'est-à-dire que la partie peptidique cyclique est la mem.
les autres constituants ne différant de celui-ci que par la longueur ou par la position de la ramification de la chaîne lipidique (c'est-à-dire que la partie peptidique cyclique est la mem.
La nouvelle substance antifongique selon la présente invention peut être obtenue par culture de la souche de Bacillus subtilis dans les conditions habituelles de culture des souches de Bacillus subtilis.
Elle est isolée du milieu de culture par acidification et extraction du précipité formé par le méthanol ou l'éthanol.
On décrira ci-après plus en détail des conditions permettant d'obtenir la nouvelle substance antifongique, ainsi que les caractéristiques de cette substance.
I - Conditions de culture
Les précultures sont effectuées dans un milieu renfermant 37 g/l de "coeur-cervelle" (Bio Mérieux) pendant 15 heures à 33 0C. Elles sont utilisées pour l'ensemencement des cultures dans un rapport de volume 1/1 0.
Les précultures sont effectuées dans un milieu renfermant 37 g/l de "coeur-cervelle" (Bio Mérieux) pendant 15 heures à 33 0C. Elles sont utilisées pour l'ensemencement des cultures dans un rapport de volume 1/1 0.
La culture est effectuée pendant 5 jours à 330C, sous agitation, soit sur milieu synthétique, soit sur milieu semi-synthétique renfermant de l'extrait de le vure.
Les meilleurs rendements ont été obtenus avec les milieux suivants
1) Milieu synthétique : D glucose 20 g; acide Lglutamique 5 g; MgSO4 0,5 g; KCl 0,5 g; KH2P04 1 g;
Fe2(S04)3 1,2 mg; MnS04 0,4 mg; CuSO4, 5H20 1,6 mg pour 1 1, pH 7,2 ajusté avec NaOH.
1) Milieu synthétique : D glucose 20 g; acide Lglutamique 5 g; MgSO4 0,5 g; KCl 0,5 g; KH2P04 1 g;
Fe2(S04)3 1,2 mg; MnS04 0,4 mg; CuSO4, 5H20 1,6 mg pour 1 1, pH 7,2 ajusté avec NaOH.
2 - Milieu semi-synthétique : saccharose 100 g; acide citrique 11,7 g; Na2SO4 7 g; extrait de levure 5 g; (NH4)2 H P04 4,2 g; KCl 0,76 g; MgCl2, 6H20 0,42 g; ZnCl2 10,4 mg; FeCl31 6H20 24,5 mg; MnCl2, 4H20 18 mg pour 1 1, pH 6,8 ajusté avec NH4OH.
II - Extraction de la substance antifongique du milieu
de culture
La substance antifongique brute est obtenue après acidification par HCl 12 N jusqu'd pH 2 soit du milieu de culture renfermant les bactéries, soit du milieu de culture après élimination des bactéries par centrifugation.
de culture
La substance antifongique brute est obtenue après acidification par HCl 12 N jusqu'd pH 2 soit du milieu de culture renfermant les bactéries, soit du milieu de culture après élimination des bactéries par centrifugation.
Dans les deux cas, il se forme un précipité qui est récupéré par centrifugation. Ce précipité est traité différemment selon le mode de précipitation.
1) Précipité obtenu à partir du milieu de culture renfermant des bactéries
Le précipité est extrait directement sous agitation pendant 24 heures par l'éthanol à 95 % (1 litre d'éthanol par litre de culture). Cette extraction est répétée deux fois. Les extraits éthanoliques sont alors concentrés et séchés (rendement : 1,9 g d'extrait par litre de milieu). Cet extrait présente une activité antifongique sur Penicillium chrvsoqenum,
2) Précipité obtenu à partir du milieu de culture après élimination des bactéries
Le précipité est mis en suspension, neutralisé et lyophilisé (rendement : 1,7 g/litre de milieu).
Le précipité est extrait directement sous agitation pendant 24 heures par l'éthanol à 95 % (1 litre d'éthanol par litre de culture). Cette extraction est répétée deux fois. Les extraits éthanoliques sont alors concentrés et séchés (rendement : 1,9 g d'extrait par litre de milieu). Cet extrait présente une activité antifongique sur Penicillium chrvsoqenum,
2) Précipité obtenu à partir du milieu de culture après élimination des bactéries
Le précipité est mis en suspension, neutralisé et lyophilisé (rendement : 1,7 g/litre de milieu).
Le lyophilisat est extrait successivement, par l'acétone, puis par le méthanol, sous agitation, deux fois pendant 24 heures. Les extraits sont concentrés sous vide et leur activité antifongique est recherchée sur
Penicillium chrysogenum. Seul, l'extrait méthanolique renferme l'activité (rendement: 500 mg/litre de milieu).
Penicillium chrysogenum. Seul, l'extrait méthanolique renferme l'activité (rendement: 500 mg/litre de milieu).
III - Purification de la substance antifongique
Les extraits éthanoliques ou méthanoliques peuvent être purifiés soit par chromatographie sur colonne d'acide silicique Bio Sil HA 325 mesh, soit sur colonne d'alumine 90 (activité II-III, 70-230 mesh). On dépose 1 g d'extrait sur 100 g d'adsorbant.
Les extraits éthanoliques ou méthanoliques peuvent être purifiés soit par chromatographie sur colonne d'acide silicique Bio Sil HA 325 mesh, soit sur colonne d'alumine 90 (activité II-III, 70-230 mesh). On dépose 1 g d'extrait sur 100 g d'adsorbant.
- Dans le premier cas, l'élution se fait par un gradient discontinu de méthanol dans le solvant hexanechloroforme-méthanol (25:45:10). Le produit est élué par le solvant hexane-chloroforme-méthanol (25:45:26).
- Dans le deuxième cas, l'élution se fait par le chloroforme, puis par un gradient discontinu de méthanol dans le chloroforme. Après passage de chloroforme, puis du mélange chloroforme-méthanol (8:2), le produit est élué par le mélange chloroforme-méthanol (6:4).
On obtient un produit coloré en jaune clair, sa pureté peut être évaluée à environ 90 %.
En vue d'une étude structurale une purification ultérieure a été effectuée par chromatographie préparative sur couches minces de gel de silice dans le solvant chloroforme-méthanol-eau (65:25:4).
Le produit est élué du gel par le solvant chloroforme-méthanol (2:1), puis reprécipité dans le méthanol, le précipité est lavé deux fois par le méthanol et séché.
Rendement en produit pur : 50 mg par litre de milieu.
Il faut noter qu'il existe d'autres possibilités de purification, en particulier la reprécipitation en milieu alcoolique, méthanol ou éthanol,du produit brut.
IV - Caractéristiques de la substance obtenue
Ce sont celles indiquées précédemment.
Ce sont celles indiquées précédemment.
Le spectre IR qui est représenté sur la Fig. 1 présente les bandes caractéristiques de la liaison peptidique à 3,0-3,1, 6,1 et 6,5-6,6 m.
Le spectre UV effectué dans méthanol 96 % présente deux maxima, l'un à 203 nm (= 25 200), l'autre à 275 nm (e= 920). Il est représenté sur les Fig. 2 et 3 avec des concentrations différentes.
Le produit provenant de la chromatographie sur colonne (pureté 90 %) est soluble dans l'éthanol 95, le mélange éthanol à 95%-eau (1:1), (1:2) et donne une solution opalescente dans l'éthanol à 95%au (1:3). Il est insoluble dans le propylène glycol et le mélange propylène glycol-eau (1:1) et donne une solution opalescente dans propylène glycol-eau (1:2).
V - Composition de la substance antifongique (Bacillo
mycine F)
L'hydrolyse par HCl 6 N, 8 h à 1500C donne une fraction liposoluble et une fraction hydrosoluble.
mycine F)
L'hydrolyse par HCl 6 N, 8 h à 1500C donne une fraction liposoluble et une fraction hydrosoluble.
A - Fraction hydrosoluble
Elle est constituée de 5 acides aminés qui ont été identifiés par chromatographie sur couches minces de cellulose dans différents solvants. Ce sont les acides aminés suivants : acide aspartique, acide glutamique, thréonine, proline, tyrosine.
Elle est constituée de 5 acides aminés qui ont été identifiés par chromatographie sur couches minces de cellulose dans différents solvants. Ce sont les acides aminés suivants : acide aspartique, acide glutamique, thréonine, proline, tyrosine.
L'analyse quantitative a été faite après formation des N-heptafluorobutyl n-butylesters et chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire de silicone SE 30 avec programmation de température.
Les résultats obtenus donnent la formule brute suivante
Asp31 Glu1, Pro1, Thr1, Tyr
1) Configuration des acides aminés
Les configurations optiques ont été déterminées par des méthodes enzymatiques avec la D-aminoacide oxydase pour Pro, Thr et Tyr, la L-glutamate décarboxylase pour
Glu et la 2-oxogutaate-aminotransférase pour Asp. Les acides aminés- sont dosés avant et après action de l'enzyme. Les résultats sont D-Asp2, L-Asp1, L-Glu1, L-Thr11
L-Pro1, D-Tyr1.
Asp31 Glu1, Pro1, Thr1, Tyr
1) Configuration des acides aminés
Les configurations optiques ont été déterminées par des méthodes enzymatiques avec la D-aminoacide oxydase pour Pro, Thr et Tyr, la L-glutamate décarboxylase pour
Glu et la 2-oxogutaate-aminotransférase pour Asp. Les acides aminés- sont dosés avant et après action de l'enzyme. Les résultats sont D-Asp2, L-Asp1, L-Glu1, L-Thr11
L-Pro1, D-Tyr1.
2) Détermination de la chaine peptique par coupure
a) Action du N-bromosuccinimide
63 mg de Bacillomycine F dans 6,3 ml d'acide acétique 70 % sont traités par 63 mg de N-bromosuccinimide 2 heures à température ambiante. On arrete la réaction par addition de quelques gouttes d'acide formique. On évapore sous vide.
a) Action du N-bromosuccinimide
63 mg de Bacillomycine F dans 6,3 ml d'acide acétique 70 % sont traités par 63 mg de N-bromosuccinimide 2 heures à température ambiante. On arrete la réaction par addition de quelques gouttes d'acide formique. On évapore sous vide.
Le produit est purifié par chromatographie sur colonne d'acide silicique Bio Sil HA 325 mesh. Le solvant d'élution est le mélange chloroforme-méthanoleau (65:25:4). L'oxydation de la Bacillomycine F par le
N-bromosuccinimide coupe la chaine au niveau du résidu tyrosyle et donne un nouveau peptide avec un acide aminé
N-terminal. Il donne une réaction positive à la ninhydrine.
N-bromosuccinimide coupe la chaine au niveau du résidu tyrosyle et donne un nouveau peptide avec un acide aminé
N-terminal. Il donne une réaction positive à la ninhydrine.
b) Détermination de la séquence peptidique
La séquence N-terminale est faite par la méthode d'Edman suivant la technique de Tarr appliquée à des microquantités. A chaque dégradation, l'acide aminé est identifié sous forme de phénylthiohydantolne (PTH) par chromatographie sur couches minces de gel de silice 60F254 dans le solvant chloroforme-méthanol(95:5) pour les PTH de la tyrosine et de la proline et avec le solvant chloroforme-méthanol (85:15) pour les PTH de l'asparagine , de la glutamine et de la thréonine. Après chaque cycle de dégradation la composition en acides aminés du peptide résiduel est déterminée. Les résultats sont présentés dans le tableau I.
La séquence N-terminale est faite par la méthode d'Edman suivant la technique de Tarr appliquée à des microquantités. A chaque dégradation, l'acide aminé est identifié sous forme de phénylthiohydantolne (PTH) par chromatographie sur couches minces de gel de silice 60F254 dans le solvant chloroforme-méthanol(95:5) pour les PTH de la tyrosine et de la proline et avec le solvant chloroforme-méthanol (85:15) pour les PTH de l'asparagine , de la glutamine et de la thréonine. Après chaque cycle de dégradation la composition en acides aminés du peptide résiduel est déterminée. Les résultats sont présentés dans le tableau I.
<SEP> PTH <SEP> Composition <SEP> en <SEP> acides <SEP> α <SEP> aminés <SEP> (rapports <SEP> molaires)
<tb> <SEP> acide
<tb> <SEP> aminé <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Tyr
<tb> Peptide <SEP> initial <SEP> 2,9 <SEP> 0,9 <SEP> 1,2 <SEP> 0,8 <SEP> forme
<tb> <SEP> osycée
<tb> 1ère <SEP> dégradation <SEP> Asn <SEP> 2,0 <SEP> 0,8 <SEP> 1,2 <SEP> 0,8 <SEP> 2ème <SEP> dégradation <SEP> Gln <SEP> 2,0 <SEP> 0,3 <SEP> 1,2 <SEP> 0,8 <SEP> 3ème <SEP> dégradation <SEP> Pro <SEP> 2,0 <SEP> 0,3 <SEP> 0,4 <SEP> 0,8 <SEP> 4ème <SEP> dégradation <SEP> Asn <SEP> 1,0 <SEP> 0,2 <SEP> 0,2 <SEP> 0,8 <SEP> 5ème <SEP> dégradation <SEP> Thr <SEP> 1,0 <SEP> 0,2 <SEP> 0,2 <SEP> 0,2 <SEP>
La séquence de ce peptide est donc la suivante
Asn # Gln # Pro # Ans # Thr # acide ss aminé # (Asp,Tyr oxydée)
Bien que la dégradation d'Edman ne permette pas de démontrer la séquence acide ss aminé # Asp # Tyr la coupure de la liaison peptidique du COOH de Tyr, spécifique du N-bromosuccinimide, implique cette séquence.
<tb> <SEP> acide
<tb> <SEP> aminé <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Tyr
<tb> Peptide <SEP> initial <SEP> 2,9 <SEP> 0,9 <SEP> 1,2 <SEP> 0,8 <SEP> forme
<tb> <SEP> osycée
<tb> 1ère <SEP> dégradation <SEP> Asn <SEP> 2,0 <SEP> 0,8 <SEP> 1,2 <SEP> 0,8 <SEP> 2ème <SEP> dégradation <SEP> Gln <SEP> 2,0 <SEP> 0,3 <SEP> 1,2 <SEP> 0,8 <SEP> 3ème <SEP> dégradation <SEP> Pro <SEP> 2,0 <SEP> 0,3 <SEP> 0,4 <SEP> 0,8 <SEP> 4ème <SEP> dégradation <SEP> Asn <SEP> 1,0 <SEP> 0,2 <SEP> 0,2 <SEP> 0,8 <SEP> 5ème <SEP> dégradation <SEP> Thr <SEP> 1,0 <SEP> 0,2 <SEP> 0,2 <SEP> 0,2 <SEP>
La séquence de ce peptide est donc la suivante
Asn # Gln # Pro # Ans # Thr # acide ss aminé # (Asp,Tyr oxydée)
Bien que la dégradation d'Edman ne permette pas de démontrer la séquence acide ss aminé # Asp # Tyr la coupure de la liaison peptidique du COOH de Tyr, spécifique du N-bromosuccinimide, implique cette séquence.
c) Hydrolyses partielles de la Bacillomycine F
Deux peptides sont obtenus après hydrolyse partielle . Le peptide P1 est obtenu après hydrolyse à 1050C par HCl 6N pendant 15 heures et le peptide P2 après hydrolyse à 1050C par HCl 6N pendant 1 heure.
Deux peptides sont obtenus après hydrolyse partielle . Le peptide P1 est obtenu après hydrolyse à 1050C par HCl 6N pendant 15 heures et le peptide P2 après hydrolyse à 1050C par HCl 6N pendant 1 heure.
Ils sont purifiés par chromatographie sur couches minces préparatives de gel de silice dans le solvant chloroforme-méthanol-eau (65:25:4). La révélation est faite soit par la nihydrine, soit par le réactif de Pauly spécifique des groupements tyrosyles libres.
L'acide aminé N-terminal est déterminé sous forme de dinitrophényl-dérivé et l'acide aminé C-terminal est identifié après hydrazinolyse par chromatographie sur couches minces.
Les résultats sont donnés dans le tableau Il. T A B L E A U I I
RF et composition des peptides liposolubles P1 et P2
RF et composition des peptides liposolubles P1 et P2
<SEP> RF <SEP> dans <SEP> Détection <SEP> Acide <SEP> Composition <SEP> en <SEP> acides <SEP> α <SEP> aminés
<tb> <SEP> chloroforme- <SEP> par <SEP> le <SEP> (rapports <SEP> molaires)
<tb> Peptide <SEP> méthanol- <SEP> réactif <SEP> ss <SEP> aminé
<tb> <SEP> eau <SEP> de <SEP> Pauly <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Tyr
<tb> <SEP> (65:25:4)
<tb> P1 <SEP> 0,29 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> 1,0
<tb> P2 <SEP> 0,56 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 1,0 <SEP> 0,8 <SEP> 0,8
<tb>
Le peptide P1 a pour acide aminé N-terminal la thréonine. Après une dégradation d'Edman on obtient les acides B aminés. Il a donc la séquence LThr acidess aminé.
<tb> <SEP> chloroforme- <SEP> par <SEP> le <SEP> (rapports <SEP> molaires)
<tb> Peptide <SEP> méthanol- <SEP> réactif <SEP> ss <SEP> aminé
<tb> <SEP> eau <SEP> de <SEP> Pauly <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Tyr
<tb> <SEP> (65:25:4)
<tb> P1 <SEP> 0,29 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> 1,0
<tb> P2 <SEP> 0,56 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 1,0 <SEP> 0,8 <SEP> 0,8
<tb>
Le peptide P1 a pour acide aminé N-terminal la thréonine. Après une dégradation d'Edman on obtient les acides B aminés. Il a donc la séquence LThr acidess aminé.
Le peptide P2 a pour acide aminé N-terminal la thréonine. L'acide aminé C-terminal est la tyrosine.
La configuration de Asp est faite sur un hydrolysat du peptide P2, elle est L. La séquence Thr acides aminé étant déjà établie, le peptide P2 est donc LThr + acidess aminé + LAsp + DTyr.
L'ensemble des résultats précédents permet d'écrire la séquence suivante
DAsn + LGln # LPro + DAsn # LThr + acide ss aminé + LAsp DTyr.
DAsn + LGln # LPro + DAsn # LThr + acide ss aminé + LAsp DTyr.
3) Structure cyclique
L'absence de carboxyle a été démontrée par électrophorèse à pH 8,2 et par méthylation de laB acillomycine F par le diazométhane gazeux. En effet par électrophorèse à pH 8,2 il n'y a pas de migration du produit et après méthylation on obtient un seul dérivé méthylé correspondant à la méthylation de l'hydroxyle de la tyrosine.
L'absence de carboxyle a été démontrée par électrophorèse à pH 8,2 et par méthylation de laB acillomycine F par le diazométhane gazeux. En effet par électrophorèse à pH 8,2 il n'y a pas de migration du produit et après méthylation on obtient un seul dérivé méthylé correspondant à la méthylation de l'hydroxyle de la tyrosine.
L'absence de NH2 libre a été démontrée.
Après dinitrophénylation du produit par le 2,4 dinitrofluorobenzène puis hydrolyse, on obtient uniquement de la O-Dnp tyrosine.
D'autre part, l'absence de fonctions ester a été démontrée après oxydation chromique . La disparition de la thréonine et de la tyrosine indique que ces deux acides aminés ont leur hydroxyle non substitué.
L'ensemble de ces résultats indique une structure cyclique pour la molécule de Bacillomycine F et l'absence de résidu aspartyle ou glutamyle dans la channe peptidique.
B - Partie liposoluble
La partie lipidique est analysée par chromatographie sur couches minces de gel de silice 60 dans chloroforme-méthanol-eau (65:25:4). On observe un composé révélable à la ninhydrine de R F 0,63 identique aux acides aminés déjà identifiés dans les antibiotiques peptidolipidiques du groupe de l'iturine.
La partie lipidique est analysée par chromatographie sur couches minces de gel de silice 60 dans chloroforme-méthanol-eau (65:25:4). On observe un composé révélable à la ninhydrine de R F 0,63 identique aux acides aminés déjà identifiés dans les antibiotiques peptidolipidiques du groupe de l'iturine.
La structure de ces acides -aminés a été étudiée après formation des N-acétyl méthylesters et chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire de silicone WCOT SE 30 à 1400C couplée avec la spectrométrie de masse.
Le chromatogramme obtenu renferme deux pics principaux X2 (58 %), X5 (23 ) et trois pics de plus faible intensité X1 (6 %), X3 (3 %) et X4 (10 %).
L'étude des spectres de masse et des temps de rétention a permis de conclure aux structures suivantes
X1 : est l'acide 3-amino 12-méthyl tétra décanoique
X2 : est l'acide 3-amino 14-méthyl penta décanoique
X3: est l'acide 3-amino hexadécanoique
X4 : est un acide en C17
X5 : est l'acide 3-amino 14-méthyl hexadécanoïque.
X1 : est l'acide 3-amino 12-méthyl tétra décanoique
X2 : est l'acide 3-amino 14-méthyl penta décanoique
X3: est l'acide 3-amino hexadécanoique
X4 : est un acide en C17
X5 : est l'acide 3-amino 14-méthyl hexadécanoïque.
On donnera ci-après les résultats d'une étude de l'activité de la substance antifongique selon l1in- vent ion ou Bacillomycine F sur divers moisissures et levures.
Ces résultats sont rassemblés dans le tableau
III.
III.
T A B L E A U I I I
Activité antifongique mesurée par la méthode de dilution dans la gélose* après trois jours, ou cinq jours pour les champignons phytopathogènes (phyt), d'incubation à 28C.
Activité antifongique mesurée par la méthode de dilution dans la gélose* après trois jours, ou cinq jours pour les champignons phytopathogènes (phyt), d'incubation à 28C.
<SEP> C <SEP> O <SEP> N <SEP> C <SEP> E <SEP> N <SEP> T <SEP> R <SEP> A <SEP> T <SEP> I <SEP> O <SEP> N <SEP> ( g/ml)
<tb> <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 20 <SEP> 40 <SEP> 80 <SEP> 160 <SEP> 320
<tb> Champignons
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP>
Botrytis <SEP> cinerea <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Fusarium <SEP> oxysporum <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> +
<tb> Mycosphaerella <SEP> pinodes <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Neurospora <SEP> crassa <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP>
Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP> ~ <SEP> - <SEP> - <SEP>
Pleospora <SEP> herabarum <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP> ~ <SEP> - <SEP> - <SEP>
Rhodotorula <SEP> pillimanae <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP>
Sclerotinia <SEP> fructigena <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP>
Sclerotinia <SEP> sclerotinum <SEP> (phyt) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> # <SEP> - <SEP>
Stemphylium <SEP> radicinum <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP>
Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> # <SEP>
Levures
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP>
Candida <SEP> tronpicalis <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP>
Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> - <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> * <SEP> Pour <SEP> S.<SEP> cerevisiae, <SEP> l'activité <SEP> a <SEP> été <SEP> déterminée <SEP> après <SEP> 17 <SEP> heures <SEP> d'incubation <SEP> à <SEP> 28 C.
<tb>
<tb> <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 20 <SEP> 40 <SEP> 80 <SEP> 160 <SEP> 320
<tb> Champignons
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP>
Botrytis <SEP> cinerea <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Fusarium <SEP> oxysporum <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> +
<tb> Mycosphaerella <SEP> pinodes <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Neurospora <SEP> crassa <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP>
Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP> ~ <SEP> - <SEP> - <SEP>
Pleospora <SEP> herabarum <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP> ~ <SEP> - <SEP> - <SEP>
Rhodotorula <SEP> pillimanae <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP>
Sclerotinia <SEP> fructigena <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP>
Sclerotinia <SEP> sclerotinum <SEP> (phyt) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> # <SEP> - <SEP>
Stemphylium <SEP> radicinum <SEP> (phyt.) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP>
Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> # <SEP>
Levures
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP>
Candida <SEP> tronpicalis <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP>
Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> - <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> * <SEP> Pour <SEP> S.<SEP> cerevisiae, <SEP> l'activité <SEP> a <SEP> été <SEP> déterminée <SEP> après <SEP> 17 <SEP> heures <SEP> d'incubation <SEP> à <SEP> 28 C.
<tb>
++ <SEP> pas <SEP> d'inhibition <SEP> ++ <SEP> croissance <SEP> normale
<tb> + <SEP> faible <SEP> inhibition <SEP> ou <SEP> + <SEP> croissance <SEP> nettement <SEP> diminuée
<tb> # <SEP> forte <SEP> inhibition <SEP> # <SEP> très <SEP> faible <SEP> croissance
<tb> - <SEP> inhibition <SEP> totale <SEP> - <SEP> croissance <SEP> nulle
<tb>
Ainsi, la Bacillomycine F peut être utilisée pour lutter contre les champignons dans différents milieux tels que par exemple les eaux des circuits de refroidissement. La Bacillomycine F peut en général être Jncorpo- rée à raison de 0,001 à 10 % en poids selon l'usage spécifique envisagé.
<tb> + <SEP> faible <SEP> inhibition <SEP> ou <SEP> + <SEP> croissance <SEP> nettement <SEP> diminuée
<tb> # <SEP> forte <SEP> inhibition <SEP> # <SEP> très <SEP> faible <SEP> croissance
<tb> - <SEP> inhibition <SEP> totale <SEP> - <SEP> croissance <SEP> nulle
<tb>
Ainsi, la Bacillomycine F peut être utilisée pour lutter contre les champignons dans différents milieux tels que par exemple les eaux des circuits de refroidissement. La Bacillomycine F peut en général être Jncorpo- rée à raison de 0,001 à 10 % en poids selon l'usage spécifique envisagé.
Deplus, la Bacillomycine F présente une faible toxicité. Ainsi, par administration intrapéritonéale chez la souris, on n'observe aucune mortalité à la dose de 10 mg/kg.
En conséquence, la Bacillomycine F peut être utilisée en particulier en thérapeutique pour lutter contre, notamment, les affections mycosiques des tégumentis, muqueuses, phanères.
L'application se fait alors par voie externe à l'aide de formes galéniques adaptées, telles que crèmes ou laits dermiques, pulvérisations ou lotions. La concentration en principe actif peut alors varier de 0 > 1 à 1 % en poids, selon la forme pharmaceutique.
La substance antifongique selon la présente invention peut également être utilisée pour lutter contre le développement des champignons phytopathogènes sur les plantes cultivés.
Claims (7)
1. Substance antifongique caractérisée par lespropriétés suivantes
1 - Couleur et état physique : poudre incolore:
2 - Point de fusion : F = 2430C;
3 - Caractéristiques chromatographiques :
RF = 0-,47 dans chloroforme-méthanol-eau (65:25:4);
RF = 0,63 dans diméthylformamide-eau-chloroforme (44:6:50);
4 - Réaction colorée : réaction positive au réactif de Pauly et à la rhodamine,
réaction négative à la ninhydrine;
5 - Absence de migration électrophorétique à pH : 8,0 et à pH : 4,0;
6 - Le spectre IR présente des bandes caracté- ristiques à 3,0-3,1, 6,1 et 6,5-6,6 m;
7 - Le spectre UV effectué dans l'éthanol à 95 % présente deux maxima, l'un à 203 nm, l'autre à 275 nm;
8 - Solubilité : soluble dans éthanol à 95 % insoluble dans le propylène glycol.
3. Substance antifongique selon la revendication 2, caractérisée en ce que les autres constituants pos sèdent la même partie peptidique et ne diffèrent que par la n a t u r e de la channe lipidique.
4. Procédé d'obtention de la substance antifongique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on cultive une souche de Bacillus subtilis productrice de la substance antifongique et l'on isole la substance du milieu de culture.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la substance est isolée par acidification et extraction du précipité formé par le méthanol ou l'éthanol.
6. Utilisation d'une substance antifongique telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour lutter contre les champignons.
7. Composition pharmaceutique ayant une activité antifongique, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif une substance selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8113118A FR2508766A1 (fr) | 1981-07-03 | 1981-07-03 | Nouvelle substance antifongique obtenue a partir d'une souche de bacillus subtilis, son procede d'obtention et ses applications comme antifongique |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8113118A FR2508766A1 (fr) | 1981-07-03 | 1981-07-03 | Nouvelle substance antifongique obtenue a partir d'une souche de bacillus subtilis, son procede d'obtention et ses applications comme antifongique |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2508766A1 true FR2508766A1 (fr) | 1983-01-07 |
FR2508766B1 FR2508766B1 (fr) | 1984-01-06 |
Family
ID=9260171
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR8113118A Granted FR2508766A1 (fr) | 1981-07-03 | 1981-07-03 | Nouvelle substance antifongique obtenue a partir d'une souche de bacillus subtilis, son procede d'obtention et ses applications comme antifongique |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FR (1) | FR2508766A1 (fr) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0084826A2 (fr) * | 1982-01-15 | 1983-08-03 | Bristol-Myers Company | Composé antibiotique |
EP0276132A2 (fr) * | 1987-01-21 | 1988-07-27 | Agricultural Genetics Company Limited | Souche micro-organisme ayant une activité antimicrobienne |
US5061495A (en) * | 1988-03-07 | 1991-10-29 | Agricultural Genetics Company Limited | Antibiotic derived from b. subtilis |
EP0536455A1 (fr) * | 1990-10-31 | 1993-04-14 | Korea Research Institute Of Chemical Technology | Nouveaux micro-organismes (Bacillus subtilis), peptides antifungiques et procédés pour leur préparation |
-
1981
- 1981-07-03 FR FR8113118A patent/FR2508766A1/fr active Granted
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
EXBK/79 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0084826A2 (fr) * | 1982-01-15 | 1983-08-03 | Bristol-Myers Company | Composé antibiotique |
EP0084826A3 (en) * | 1982-01-15 | 1983-09-21 | Bristol-Myers Company | Antibiotic compound |
EP0276132A2 (fr) * | 1987-01-21 | 1988-07-27 | Agricultural Genetics Company Limited | Souche micro-organisme ayant une activité antimicrobienne |
EP0276132A3 (en) * | 1987-01-21 | 1989-04-26 | Agricultural Genetics Company Limited | Strain of microorganism having antimicrobial activity strain of microorganism having antimicrobial activity |
US5344647A (en) * | 1987-01-21 | 1994-09-06 | Agricultural Genetics Company Limited | Strain of microorganism having antimicrobial activity |
US5061495A (en) * | 1988-03-07 | 1991-10-29 | Agricultural Genetics Company Limited | Antibiotic derived from b. subtilis |
EP0536455A1 (fr) * | 1990-10-31 | 1993-04-14 | Korea Research Institute Of Chemical Technology | Nouveaux micro-organismes (Bacillus subtilis), peptides antifungiques et procédés pour leur préparation |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2508766B1 (fr) | 1984-01-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5700670A (en) | Method for producing optically active ester of γ-substituted-β-hydroxybutyric acid | |
KR830002801B1 (ko) | 고(高) 콜레스테롤혈증치료제, 모나콜린 k의 제조방법 | |
FR2640641A1 (fr) | Procede microbien pour la production du complexe antibiotique de cyclosporines | |
FR2517204A1 (fr) | Nouvelle substance physiologiquement active ch-1 et procede pour sa production | |
FR2508766A1 (fr) | Nouvelle substance antifongique obtenue a partir d'une souche de bacillus subtilis, son procede d'obtention et ses applications comme antifongique | |
JP3099365B2 (ja) | シクロスポリンaおよび/またはcの製造法 | |
US4014860A (en) | Plasminostreptin (enzyme inhibitor) and method for producing it from streptomyces | |
EP0231234B1 (fr) | Procede d'hydroxylation par voie microbiologique de la quinine, de la quinidine, et de derives | |
FR2518546A1 (fr) | Dihydro- et tetrahydromonacolines l, leur procede de preparation et leur application en therapeutique | |
DE2528984A1 (de) | Bestatin und verfahren zu dessen herstellung | |
FR2497230A1 (fr) | Procede de preparation d'esters monoalkyliques optiquement actifs d'acide b-(s)-aminoglutarique | |
US4332902A (en) | Antibiotic substance | |
JP3026864B2 (ja) | 新規セスキテルペン誘導体 | |
FR2489691A1 (fr) | Antibiotique am-3603 et procede pour sa production | |
FR2579599A1 (fr) | Substance physiologiquement active tpi et procede de preparation | |
JP2842613B2 (ja) | フォスフォリパーゼa▲下2▼阻害物質 | |
CH623566A5 (en) | Process for producing the new depsipeptide antibiotics neoviridogrisein I, II, III | |
EP0325534B1 (fr) | Procédé de synthèse de mononitrates de glycéryle par bioconversion de la nitroglycérine | |
FR2616800A1 (fr) | Production d'une enzyme du type bglucuronidase, hydrolyse de la glycyrrhizine et production d'acide 18 b-glycyrrhetinique | |
JP3638341B2 (ja) | 新規生理活性物質AHPA−Val−Phe、その製造法およびその用途 | |
FR2499855A1 (fr) | Nouvelles substances a action carcinostatique et immuno-stimulante, procede pour les preparer a partir de bacteries du genre fusobacterium, et agent carcinostatique contenant de telles substances | |
JP2858939B2 (ja) | 抗生物質ab3217a、ab3217b及びab3217cとそれらの製造法 | |
JPH02119786A (ja) | L―カルニチンの製造法 | |
CH389830A (fr) | Procédé pour la préparation d'un nouvel antibiotique | |
JPH04159251A (ja) | ホスホリパーゼa↓2阻害物質 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ST | Notification of lapse |