JPH04159251A

JPH04159251A - ホスホリパーゼａ↓２阻害物質

Info

Publication number: JPH04159251A
Application number: JP2285599A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Yoshida; 正吉田; Shigeru Matsutani; 茂松谷; Yoshimi Kawamura; 川村　義巳; Koichi Matsumoto; 浩一松本
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1990-10-22
Filing date: 1990-10-22
Publication date: 1992-06-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、新規なホスホリパーゼＡ、阻害物質に関し、
さらに詳しくは、チェラビア属に属する菌株、例えばチ
ェラビア・テリフーラ（Ｔ　ｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒ
ｒｉｃｏｌａ）ＲＦ−１４３株またはその変異体を液中
好気性条件下に培養することにより産生されるホスホリ
パーセＡ、阻害作用を有する生理活性物質に関するもの
である。また、本発明は、該化合物を産生ずるチェラビ
ア属に属する菌株、例えばチェラビア・テリコーラＲＦ
−１４３株またはその変異体を培養し、培養液から該化
合物を採取することを特徴とする該化合物の製造方法に
関するものである。

「従来技術および発明か解決しようとする課題１ホスホ
リパーセＡ、は多くの生物の細胞や分泌液に含有されて
おり、リン脂質に特異的に作用するエステラーゼであっ
て、１，２−ジアシルグリセロールリン脂質のＣ−２位
の脂肪酸エステルを特異的に加水分解し、リゾグリセロ
リン脂質と脂肪酸とを生成することが知られている。そ
の酵素活性に関連して、神経、筋肉、心臓への毒性作用
、抗凝固作用を有し、痙彎、低血圧、溶血、出血、浮腫
などを誘発し得ることが指摘されており、その他の疾患
にも直接または間接的に関与している可能性かある。し
たかって、十スホリパーセＡ。

の酵素活性に対する阻害物質か得られれば、該酵素の作
用に起因または関連する様々な病態を制限し、治療する
ことかできると考えられる。従来知られているホスホリ
バーセＡ、阻害物質には、メパクリン、ｐ−プロモフェ
ナノルブロミドなとがあるか、新たな有効物質が侍たれ
ている。

３課題を解決するための手段二本発明者らは、先に、チェラビア・テリコーラＲＦ−１
４３株か産生するチェロンンαおよびβか優れたホスホ
リパーセＡ２阻害活性を有することを見い出しこれを特
許出願したか（特騨平１−１０９９３９）、更に研究を
続けた結果、上記菌株がチェロ／ンとは構造を異にする
新規なホスホリパーセＡ、阻害物質を生産していること
を見い出Ｌ２かつ、その構造を決定することにより、本
発明を完成したものである。

即ち、本発明は、チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３
株を培養することにより産生され得る、ホスホリパーセ
Ａ２阻害作用を有する生理活性物質である化合物および
その製造方法を提供するものである。

本発明の化合物の構造式および物理化学的性状を以下に
列挙する。

構造式％式％（１）分子式：　ＣｓｚＨａｇｏ　ｔ。

（２）融点・１９４〜１９７°Ｃ（３）外観、無色粉末（４）Ｓ　ＩＭＳ（ｍ／ｚ）：　１１３１（ＭＨ”）（
５）ＨＲＭＳ（ａ＋／ｚ）実測値：　１１３１．４２２６（ＭＨ”）計算値：１１
３１．４２２２（６）ＩＲ（ＫＢｒ）：３４１０，１７４０゜１６５０
．１６１０．１５７５，１４６０゜１１４３．１０９４
，１０７４，９８６゜７９０ｃｙｔ−’（第１図参照ン（７）　ＵＶ（ｎｍ（ｇ））　：　２７６（３９，７６
０）。

３０６（肩、１１，６９０ＸＭｅＯＨ）；　２７６（４
０，２１０）、３０６（肩、１０，７１５Ｘ希ＨｃＩ２
−ＭｅＯＨ）（８）溶解性・ジメチルスルホキシド、メタノール、ク
ロロホルムおよび酢酸エチルに可溶、ｎｍへ牛サン、エ
ーテル、石油エーテルおよび水に不溶（９）呈色反応ＦＣＣ（２３・陽性ニンヒドリン：陰性坂ロ：陰性エールリッヒ：陰性（１０）薄層クロマトグラフィーＲｆ値（ノリ力ゲルＦ
　、５４（メルク））。

りｏｎネルム　：　　ＭｅＯＨ：　　Ｈ，０（６２：２
５：２）１媒系　：ｏ、ｏｇりａｎネルム　：　　Ｅｔ
ＯＨ（２：１）溶媒系　：　　　０．０６りａ吋ルＡ　
：　ＥｔＯＨ：　１０％酢酸（４：　７　：　２）溶媒
系：　　０．４９（１１）カスクロマトグラフィー（Ｒ
ｔ（分））Ｅカラム　ヌクレオンル５ｃ、、４６φＸ１
５０ｘｍ。

移動相　ＣＨ３ＣＮ：　０．１％Ｈ３Ｐ０．（７６・２
４）。

流速：２．Ｏｍ（１／分検出：ＵＶ２５４ｎｍ’ｊ：　７．７本発明化合物の塩としては、Ｎａ、になどアルカリ金属
、Ｍｇ、Ｃａなどアルカリ土類金属、アンモニアなどの
有機塩基なと本発明化合物のカルボキシ基と塩を形成し
得るすへての塩基との塩が例示され、製薬上許容し得る
塩が好ましい。

ホスホリパーセＡ２阻害物質である本発明化合物を産生
ずるチェラビア・テリコーラＲＦ−１４３株は、通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所に、受託番号微工
研条寄第２１９６号の下で寄託されている（寄託臼　昭
和６３年１２月１９日）。

本発明で使用されるチェラビア・テリコーラＲＦｉ４３
の菌学的性状は以下の通りである。

ＲＦ−１４３株の栄養菌糸はコーンミール寒天上で肉眼
的に白色を呈する。子のう果（ａｓｃｏｃａｒｐ）は寒
天培地の表面に形成され、その形は球形て茶黒色を呈す
る。その大きさは直径１００〜３００μｍで、外壁の表
面組織（ｔｅｘｕｔｒａ　ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄｅａ）
は茶色である。子のうは３０〜３５Ｘ１５〜１７μ肩の
大きさで、洋す／形を示し、その中に８個の子のう胞子
を有する。子のうは成熟時には溶解する。子のう胞子は
幅の広い紡錘形をしており、オリーブ色から茶灰色を呈
しその一端に１個の発芽孔を有する。子のう胞子の大き
さは１２〜１８Ｘ６〜８μ肩である。本閑の不完全世代
は認められない。

以上の性状からＲ１−１４３株はチェラビア・テリコー
ラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒｒｉｃｏｌａ”）と同
定された。

参考文献１）　シー・タブリュー・エモンズ（Ｃ，Ｗ、　Ｅｍｍ
。

ｎｓ）、Ｂｕｌｌ、　Ｔｏｒｒｅｙ　Ｂｏｔ、　Ｃ１ｕ
ｂ　５７．１２４２）　シー・トケノト（Ｇ、　Ｄｏｇ
ｕｅｔ）、Ｒｅｖ、　Ｍｙｃｏ１２１、　５ｕｐｐ１．
　　Ｃｏ１ｏｎｉａｌ　　１．　２（１９５６）３ン　
／−・フ゛−ス（Ｃ，Ｂｏｏｔｈ）、１ｌｙｃｏ１．　
　Ｐａｐ８３、　７（１９６０４）　ニス・ウタカワ（Ｓ、　Ｕｄａｇａｗａ）、Ｔｒ
ａｎｓＭｙｃｏｌ、　　Ｓｏｃ、　　Ｊａｐ、　　４．
　９９（１９６３）５）　シェイ・ニー・ホン・アーク
ス（Ｊ、Ａν○ｎＡｒｘ）、　５ｔｕｄ、　　Ｍｙｃｏ
ｌ、　　８．　８（１９７５）チェラビア・テリコーラ
も菌類の特徴として、突然変異を起こす可能性かある。

そのような突然変異体は、自然発生的にも出現するか、
当業者周知の物理的または化学的な方法で容易に誘導す
ることかできる。従って、充分量の本発明化合物を産生
ずる能力を保持、しているチェラビア・テリコーラＲＦ
−１４３の変異体もまた本発明の範囲に包含されるとい
うことか当業者には理解されるであろう。

チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３の培養には、通常
の培養法を利用することかできる。適当な炭素源、窒素
源、無機塩、および微量金属等の存在下、好気性条件下
で液中培養することか好ましい。通常、チェラビア・テ
リコーラＲＦ−１４３を温度約２０〜４０°Ｃ１好まし
くは２８°Ｃて通気しなから振盪フラスコ培養すると、
約１〜１０日間培養すればよい。次いて、培養物からの
生成物の分離における当業者既知の方法で本発明化合物
を分離すればよい。即ち、培養物を濾過して濾液および
沈殿（菌体成分）をそれぞれ適当な溶媒で抽出し、得ら
れた抽出液を濃縮して溶媒抽出、クロマトグラフィー処
理等によって活性物質を単離する。

本発明に係る化合物のホスホリバー上Ａ２５０％阻害濃
度（ホスホリバーセＡ、活性を５０％阻害する濃度）は
、ブタ膵臓由来のホスホリパーゼＡ２に対しては３０μ
９／ｙＱ、ラット血小板由来のホスホリパーゼＡ、に対
しては０．０１４μ９／１ｇである。従って、本発明の
化合物は、ホスホリパーゼＡ、の酵素活性に起因する様
々な疾患の予防および治療に有用と考えられる。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

実施例１１）発酵チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３Ｋ（微工研条寄第
２１９６号）を７・レインヨブトウ糖寒天斜面で７〜１
０日間、２８°Ｃで培養し、−斜面の全菌体および胞子
を２Ｌ容量のエルシンマイヤーフラスコ中の培地８００
＋（（培地組成　ブドウ糖２０％、ポリペプトン１０％
、肉エキス０３％、酵母エキス０２％、食塩０１％、ｐ
Ｈ７，０）に植菌した。植菌されたフラスコを２８°Ｃ
て２日間振盪培養した。上記培養液（８００肩のを２Ｏ
Ｌの上記組成の培地を含む３０Ｌのンヤー・）７−メン
タ−に加え、２８°Ｃて１日間、通気撹拌培養を行った
（通気量２０Ｌ／分、撹拌１５０ｒｐ＋ｎ）。

次に上記の培養液６Ｌをバレイ／ヨ浸出液（２００ｇ／
　Ｌ　）およびショ糖（２０ｇ／Ｌ）組成の培地（ｐＨ
無修正）１５０Ｌを含む２５０Ｌ発酵タンクに移した。

発酵は、２８°Ｃて、開始時から１６時間までは１２　
Ｏｒｐｍ、その後は３７０　ｒｐｍで撹拌し、通気量は
１５０Ｌ／分（１，ＯＶＶＭ）て７日間通気撹拌培養を
行った。

２）単離上記１）で得た発酵液３５６Ｌを希塩酸でｐＨ２゜５に
調整し、ろ過した。菌体部分をアセトン１０８Ｌで抽出
、抽出液（ｐＨ３，８）を減圧下で濃縮した。水層（３
０Ｌ）をｐＨ２，５に調整し、酢酸エチル（２５Ｌ）で
抽出した。抽出液を減圧下で濃縮し、石油エーテル（２
Ｌ）を加えて沈澱を生じさせた。

得られた粗抽出物４４８９をアセトン（３，６Ｌ）に溶
解し、２００ｍＭ　リン酸バッフｙ−（ＰＢ）（ｐＨ７
５，８４Ｌ）を加え、これをＣＨＰ−２０Ｐカラム（２
ＯＬ）にかけた。アセトン　３％ＮａＣＱ−２０ｍＭ　
ＰＢ（ｐＨ７，５）−３：　７の混液（１０Ｌ）で洗浄
し、次いてアセトン：３％ＮａＣ（！−２０ｍＭ　ＰＢ
（ｐＨ７，５）−３：　７の混液（３０Ｌ）とアセトン
：　２０ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７，５）＝７　：　３の混液
（３０Ｌ）とのりニア−グラジェントにより溶出した。

この溶出により下表のごとくＡ分画（２２０９）、Ｂ分
画＜２４．６９）、Ｃ分画（１０８９）およびＤ分画（
１７，６９）を得、Ｂ分画を更に次の様に処理した。

分画　　　Ｆｒ、Ｎｏ　　　　容量（Ｌ）−１〜　７　
　３．２八　　　　８〜１８　　８１８　　　１９〜２６　　３６Ｃ３０〜３３　　４８Ｄ　　　　３４〜３５　　　９．０Ｄ分画（８，８９）をセファデックスＬＨ−２０カラム
（１２６φ×９５Ｃ肩、５０４費Ｑメタノール充填、４
．５９／分画）にかけ、分画９６〜１１０を集め減圧下
で濃縮した。得られた残留物１４４ｍｇから１３Ｂｘｔ
ｉをとり、調製用高速液体クロマトグラフィーＥカラム
　ヌクレオシルアＣ，１Ｉ（２，０φＸ　２０　ｃｍ）
、溶出液・０．１％　リン酸含有６３％水性ＣＨ３ＣＮ
→０．１％　リン酸含有８７％水性ＣＨ３ＣＨによるリ
ニアーグラジェント、流速：１８Ｊｌ！＋２／分、検出
：ＵＶ２４０ｎｍ］にかけた。

保持時間９分（保持容量：３２４ｚのの分画を減圧下で
濃縮し、残留物を酢酸エチルで抽出し、抽出液を飽和食
塩水で洗浄した後Ｎａ、Ｓ０４で乾燥し、減圧下に蒸発
乾固して得られる残留物を酢酸エチル−石油エーテルか
ら沈澱させて本発明化合物８５ｚｇを得た。この化合物
は、先に示した物理化学的性状を示した。

以下の実験例に示す方法で本発明化合物のホスホリパー
ゼＡ、阻害活性を調べた。

実験例１方法基質には、Ｌ−３−ホスファチジルエタノールアミン、
］−］バルミトイルー２−１−”Ｃ］リルオイノ喧Ａ　
ｍｅｒｓｈａｒｆ１社、　　５９　ｍＣｉ／　ｍｍｏｌ
）を、Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン（Ｓ　
ｉｇｍａ社、卵白由来）により希釈（２，ＯＯＯｄｐｍ
／ｎｍｏυし、これをソニケートしたものを用いた。Ｐ
ＬＡ、には、豚膵臓由来およびラット血小板由来のもの
を使用した。反応は、トリスバッファー（０，１Ｍ。

ｐＨ７，４）、ＣａＣＱ−（３ｍＭ）の溶液中にＰＬＡ
、、および基質調整液を加え、３７°Ｃで２０分間反応
後にドールズ試薬１．２５ｆｆ（！を入れ直ちに撹拌し
反応を止めた。これに蒸留水０．５ｊｌＱとｎ−ヘプタ
ン０．８ｊ１１２を加え撹拌後遠心し、上層を別に分取
した。さらにｎ−ヘプタン０．８１と７リカケルを加え
撹拌後、遠心し上清をバイアル瓶に分取し、これにトル
エンカクテルを加え、液体シンチレーンヨンカウンター
によりＰＬＡ、によって遊離されてくる脂肪酸量を測定
した。

阻害活性を酵素対照（コントロール）の値に対するパー
セント（％）で表し、これより５０％阻害濃度を算出し
た。

結男ホスホリパーゼＡ、の活性を５０％阻害する濃度は、ブ
タ膵臓由来のホスホリパーゼＡ、に対しては３０μ９ｈ
Ｑ、ラット血小板由来のホスホリパーゼＡ、に対しては
０．０１４μ９／１１２であった。

【図面の簡単な説明】第１図は本発明化合物の赤外吸収スペクトルを示すグラ
フである。特許出願人　塩野義製薬株式会社代理人弁理士青山　葆（外１名）

Claims

【特許請求の範囲】１、以下の構造式で示される化合物またはその塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、チエラビア属に属する請求項１に記載の化合物を産
生する菌株を液中好気性条件下で培養し、培養液から該
化合物を採取することを特徴とする該化合物の製造方法
。