JPH04158790A

JPH04158790A - ホスホリパーゼａ↓２阻害物質

Info

Publication number: JPH04158790A
Application number: JP2285597A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Yoshida; 正吉田; Shigeru Matsutani; 茂松谷; Yoshimi Kawamura; 川村　義巳; Koichi Matsumoto; 浩一松本
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1990-10-22
Filing date: 1990-10-22
Publication date: 1992-06-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】一産業上の利用分野；本発明は、新規なホスホリパーゼ、・＼、阻害物質に関
し、さらに詳しくは、チェラビア属に属する菌株、例え
ばチェラビア・テリフーラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅ
ｒｒｉｃｏｌａ）ＲＦ　−１４３株また：まその１７ａ
体を液中好気性条件下に培養することにより産生される
ホスホリバーセＡ、阻害作用を有する生理活性物質に関
するものである。また、本発明は、該化合物を産生ずる
チェラビア属に属する菌株、例えばチェラビア・テリコ
ーラＲＦ−１４３株またはその変異体を培養し、培養液
から該化合物を採取することを特徴とする該化合物の製
造方法に関するものである。

［従来技術および発明が解決しようとする課題二。

ホスホリパーゼＡ、は多くの生物の細胞や分泌液に含有
されており、リン脂質に特異的に作用するエステラーゼ
であって、１，２−ジアンルグリセロールリン脂質のｃ
−２位の脂肪酸エステルを特異的に加水分解し、リゾグ
リセロリン脂質と脂肪酸とを生成することが知られてい
る。その酵素活性に関連して、神経、筋肉、心臓への毒
性作用、抗凝固作用を有し、痙彎、低血圧、溶血、出頭
、浮腫などを誘発し得ることが指摘されており、その他
の疾患にも直接または間接的に関与している可能性があ
る。したがって、ホスホリパーゼＡ！の酵素活性に対す
る阻害物質が得られれば、該酵素の作用に起因または関
連する様々な病態を制限し、治療することができると考
えられる。従来知られているホスホリバーセＡ、阻害物
質には、メルクリン、ｐ−ブロモフェナシルプロミドな
どがあるが、新たな有効物質が待たれている。

［課題を解決するための手段］本発明者らは、先に、チェラビア・テリコーラＲＦ−１
４３株が産生ずるチエロジンαおよびβが優れたホスホ
リバーセＡ、阻害活性を有することを見い出し、これを
特許出願したが（特願平１−１０９９３９）、更に研究
を続けた結果、上記菌株かチエロジンとは構造を異にす
る新規なホスホリパーゼＡ、阻害物質を生産しているこ
とを見い出し、かつ、その構造を決定することにより、
本発明を完成したものである。

即ち、本発明は、チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３
株を培養することにより産生され得る、ホスホリパーゼ
Ａ、阻害作用を有する生理活性物質である化合物および
その製造方法を提供するものである。

本発明の化合物の構造式および物理化学的性状を以下に
列挙する。

構造式上記構造式で示される化合物には、以下の構造式で示さ
れる３種の立体異性体（１）〜（ＩＩＩ）が包含される
。

＜１）（以下余白）（ＩＩ）（以下余白）（ＩＩＩ）異性体（１）の物理化学的性状（１）分子式：Ｃ，、Ｈｌ。０，１（２）融点・２０３〜２０６°Ｃ（３）外観：無色粉末（４）Ｓ　ＩＭＳ（ｍ／ｚ）：　１１７５（ＭＨ’）（
５）ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）実測値：　１１７５．４４８８（ＭＨ’）計算値：１１
７５．４４８３（６）ＩＲ（ＫＢｒ）：３４４０，２９２０゜１７４０
．１６０５，１５７４，１４５６゜１３１６．１２８９
，１１５０，１０９０゜１０７２．９８５ｃｒ’（第１
図ａ参照）（７）　Ｕ　Ｖ　（ｎｍ（ε乃：２７４．．
６（２５１００）。

３１６．７（５３８０）（希ＨＣ１２−ＭｅＯＨおよび
ＭｅＯＨ）２６０（肩）、３２３．３（５２８００）（希ＮａＯＨ
−ＭｅＯＨ）（８）溶解性ニジメチルスルホキシド、メタノール、ク
ロロホルムおよび酢酸エチルに可溶、ｎ−へキサン、エ
ーテル、石油エーテルおよび水に不溶（９）呈色反応ＦｅＣＱｓ：陽性ニンヒドリン：陰性坂ロ：陰性エールリッヒ：陰性（１０）Ｉ！クロマトグラフィーＲｆ［（シリカゲルＦ
　、、、（メルク））；クロロホルム：　　ＭｅＯＨ：　　ＨｔＯ（６２：２５
：２）溶媒系　、　　０４３クロロホルム゛　ＥｔＯＨ
：　　１４％　ＮＨ，０Ｈ（４：　７　：　２）溶媒系
　：　　　０．３７（１１）ガスクロマトグラフィー（
Ｒｔ（分））［カラム、ヌクレオノル５Ｃ，，４，６φ
ｘ１５０＋４移動相・ＣＨ、ＣＮ・０．１％８３ＰＯ，
（６９・３１）。

流速：２０貢Ｑ／分〕：９７（１２）元素分析（Ｃａ、Ｈ、、Ｏｆ、　−Ｈ、Ｏ、！
：　Ｌ、７）実測値・Ｃ，６４，０９；Ｈ，６，３５実
測値・Ｃ，６４，４３：Ｈ，６，０４異性体（Ｕ）の物
理化学的性状（１）分子式：Ｃ，４Ｈ，。○ｔ、（２）融点、２０４〜２０６°Ｃ（３）外観・無色粉末（４）Ｓ　ＩＭＳ（ｍ／ｚ）：　１１７５（ＭＨ’）（
５）ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）実測値　１１７５．４４７９（ＭＨ”）計算値・１１７
５．４４８３（６）ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２０，２９３０゜１７４Ｅ
ｒ−，１６０５，１５７２，１４６０゜１３２１．１２
９２，１１４７，１０９０゜１０７２、９８３ｃｒ’（
第１図す養魚）（７）（ＪＶ（ｎｍ（ε））：　２７４
．５（２２９０）。

３２１（４５２０）（希ＨＣＱ−ＭｅＯＨおよびＭｅＯ
Ｈ）２６０（肩）、３２３（５１３０）（希ＮａＯＨ−Ｍｅ
ＯＨ）（８）溶解性゛ジメチルスルホキンド、メタノール、ク
ロロホルムおよび酢酸エチルに可溶、ｎ−ヘキサン、エ
ーテル、石油エーテルおよび水に不溶（９）呈色反応ＦｅＣＱ、・陽性ニンヒドリン、陰性坂ロー陰性エールリッヒ：陰性（１０）１層りロマトグラフィーＲｆｆｉ（シリカゲル
Ｆ□、（メルク））：り０１１本にム：　　Ｍｅｎｕ　：　　）！、Ｏ（［１
２＋２５：２）溶媒系　：　　　０．４３クロロホルム
：　　ＥｔＯ）Ｉ　：　　１４％　Ｎ）１．０１（（４
ニア：２）溶媒系　：　　　０．３７（１１）ガスクロ
マトグラフィー（Ｒｔ（分））［カラム：ヌクレオシル
５Ｃ１ａ　４．６φＸ１５０＋ｕｔ。

移動相：ＣＨ，ＣＮ：Ｏ用％Ｈ，ＰＯ，（６９：３１）
。

流速：２゜ＯＲＱ／分］：５．６（Ｘ２）元素分析（Ｃ，、）（７，０，、−）１．０と
して）実測値：ｃ、　６４．．５４　；Ｈ，６，３８実
測値：Ｃ，６４，４３：Ｈ，６，０４異性体（１）　１
　、７１９をＤＭＳｏ　　１７０μＱに溶解し、２０ａ
ＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，３ＯＮ、　５３ｗＱを加え
た場合、および異性体（ＩＩ）０．８＋ｙｆ２をＤＭＳ
Ｏ８０μＱに溶解し、同じ緩衝液７２０μＱを加えた場
合の動態を高速液体クロマトグラフィー［カラム：ヌク
レオシル５Ｃ、、（０，４６φｘ１５Ｃｇ）、移動相：
　ＣＮ、ＣＮ−０，１％Ｈｓ　Ｐ　Ｏ４（６９：３１１
　検出：２５４ｎｍ］により調べた結果を以下の表に示
す。

（１）分子式：Ｃ，、Ｈ，。０１ｌ（２）融点：２０２〜２０５°Ｃ（分解）（３）外観：
無色粉末（４）　　Ｓ　　ＩＭＳ（ｍ／ｚ）　−目７５（ＭＨ’
）（５）ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）実測値：　１１７５．４４８８（ＭＨ’）計算値４１７
５．４４７０（６）ＩＲ（ＫＢｒ）：３４４０，１７４３゜１６５７
．１６０８，１５７６．１３２１゜１２９７．１１５２
，１０９７，１０７７゜９８９ｃｍ−’（第１図Ｃ参照
）（７）ｔＪＶ（ｎｍ（ε））：　２７４．５（２２，５
１２）。

３１８．６（５，２３２）（希ＨＣＱ−ＭｅＯＨおよび
ＭｅＯＨ）３２３．０（２９，８２５）、２５５（肩、１９，８８
０）（希ＮａＯＨ−Ｍｅｎ）（）（８）溶解性、ジメチルスルホキノド、メタノール、ク
ロロホルムおよび酢酸エチルに可溶、ｎ−ヘキサン、エ
ーテル、石油エーテルおよび水に不溶（９）呈色反応ＦｅＣＱ＝：陽性ニンヒドリン・陰性坂口、陰性エールリッヒ：陰性（ＸＯ）薄層クロマトグラフィーＲｆ値（シリカゲルＦ
　ｆ、、（メルク））クロロホルム：　　ＭｅＯＨ：　　Ｈ＊０（６２：２５
°２）溶媒系　：　　　０．０８りｏａ本ルム：　　Ｅ
ｔＯｌｌ　：　　１０％　ＮＨ，０Ｈ（４ニア：２）溶
媒系　：　　　０．５１りｏａｔルム：　　ＭｅＯＨ（
２：ｌ）溶媒系　：　　　０．０６（１１）ガスクロマ
トグラフィー（Ｒｖ（貢Ｃ））（１）［カラム、ヌクレ
オシル５Ｃ，ｅ４．６φ×５０ＪＩＬ移動相　０．１％　リン酸を含有する６０％水性ＣＨ３
ＣＮ流速　１　、８　ｆｆｃ／分検出：　ＵＶ２３０ｎｍ］：　１６．９（ｉｉ）Ｌカラ
ム゛ヌクレオンル５Ｃ，，４，６φＸ１５０　ＮＩＬ移動相：４０％ＣＨ３ＣＮ　　５０　ｍＭ　リン酸緩衝
液（ｐＨ６，９）流速：１．８ｆｆＣ／分検出　ＩＪＶ２３０ｎ５：　７．７４本発明化合物の塩としては、Ｎａ、になどアルカリ金属
、Ｍｇ、Ｃａなとアルカリ土類金属、アンモニアなどの
有機塩基など本発明化合物のカルボキシ基と塩を形成し
得るすべての塩基との塩が例示され、製薬上許容し得る
塩が好ましい。

ホスホリパーゼＡ、阻害物質である本発明化合物を産生
ずるチェラビア・テリフーラＲＦ　　１４３株は、通商
産業省工業技術院微生物工業技術研突所に、受託番号微
工研条寄第２１９６号の下で寄Ｊモされている（寄託日
　昭和６３年１２月１９日）。

本発明で使用されるチェラビア・テリコーラＲＦ−１４
３の菌学的性状は以下の通りである。

ＲＦ−１４３株の栄養菌糸はフーンミール寒天上で肉眼
的に白色を呈する。子のう果（Ｂｓｃｏｃａｒｐ）は寒
天培地の表面に形成され、その形は球形で茶黒色を呈す
る。その大きさは直径１００〜３００μｌで、外壁の表
面組織（ｔｅｘｕｔｒａ　ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄｅａ）
は茶色である。子のうは３０〜３５Ｘ１５〜１７μＩの
大きさで、洋ナン形を示し、その中に８個の子のう胞子
を有する。子のうは成熟時には溶解する。子のう胞子は
幅の広い紡錘形をしており、オリーブ色から茶灰色を呈
し、その一端に１個の発芽孔を有する。子のう胞子の大
きさは１２〜１８×６〜８μ肩である。車間の不完全世
代は認められない。

以上の性状からＲＦ−１４３株はチェラビア・テリコー
ラ（Ｔ　ｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒｒｉｃｏｌａ’〜５
）と同定された。

参考文献１）　シー・ダブリュー・エモンズ（Ｃ，Ｗ、　Ｅｍｍ
。

ｎｓ）、Ｂｕｌｌ、　Ｔｏｒｒｅｙ　Ｂｏｔ、　Ｃ１ｕ
ｂ　５７．　１２４２）　ジー・ドゲット（Ｇ、　　Ｄ
ｏｇｕｅｔ）、Ｒｅｖ、　　Ｍｙｃｏｌ。

２１、５ｕｐｐ１．　Ｃｏ１ｏｎｉａｌ　Ｌ　２（１９
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ｏｌ、　Ｐａｐ。

８３、７（１９６１）４）ニス・ウダガワ（Ｓ、　ｔｌｄａｇａｗａ）、Ｔｒ
ａｎｓ。

Ｍｙｃｏｌ、　Ｓｏｃ、　Ｊａｐ、４．９９（１９６３
）５）　ジェイ・ニー・ボン・アークス（Ｊ、　Ａ、　
ｖａｎ＾ｒｘ）、５ｔｕｄ、　Ｍｙｃｏｌ、　８．８（
１９７５）チェラビア・テリコーラも菌類の特徴として
、突然変異を起こす可能性がある。そのような突然変異
体は、自然発生的にも出現するが、当業者周知の物理的
または化学的な方法で容易に誘導することができる。従
って、充分量の本発明化合物を産生ずる能力を保持して
いるチェラビア・テリコーラＲＦ　−１，４３の変異体
もまた本発明の範囲に包含されるということが当業者に
は理解されるであろう。

チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３の培養には、通常
の培養法を利用することかできる。適当な炭素源、窒素
源、無機塩、および微量金属等の存在下、好気性条件下
で液中培養することか好ましい。通常、チェラビア・テ
リコーラＲＦ−１４３を温度約２０〜４０°Ｃ１好まし
くは２８°Ｃで通気しながら振盪フラスコ培養すると、
約１〜１０日間培養すればよい。次いて、培養物からの
生成物の分離における当業者既知の方法で本発明化合物
を分離すればよい。即ち、培養物を濾過して濾液および
沈殿（菌体成分）をそれぞれ適当な溶媒で抽出し、得ら
れた抽出液を濃縮して溶媒抽出、クロマトグラフィー処
理等によって活性物質を単離する。

本発明に係る化合物は、後記実験例に示す様にホスホリ
パーゼＡ、阻害活性を有し、従って本発明の化合物は、
ホスホリパーゼＡ、の酵素活性に起因する様々な疾患の
予防および治療に有用と考えられる。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

実施例１　異性体（１）および（ロ）の製造下記種菌培
地８００ＪＩＱに、チェラビア・テリコーラＲＦ−１４
３の斜面培養物を接種する。

種菌培地の組成、グルコース２．０％、ポリペプトン１
．０％、ビーフ・エキストラクト（Ｄｉｒｃｏ）０３％
、酵母エキス（Ｄ　１ｒｃｏ）　０　、２％、塩化ナト
リウム０．１％。

接種した第１段階の培地を、２Ｌエルレンマイヤーフラ
スコ中、回転数１８０　ｒｐｍの７エーカー上、２８°
Ｃで３日間振盪培養する。

第１段階の熟成培地８００峠を用い、第１段階の培地の
組成と同一の組成を有する第２段階の種菌培地２ＯＬに
接種する。この第２段階の種菌培地を、３０Ｌジヤーフ
アメンター中、回転数２０Ｏｒｐｍ、通気量２ＯＬ／ａ
＋ｉｎ、２８°Ｃで２４時間培養する。熟成して得られ
た第２段階の培地１４Ｌを用い、下記生産培地３５０Ｌ
に接種する。

生産培地の組成、可溶性澱粉２．０％、シュークロース
２．０％、酵母エキス（Ｄ　１ｒｃｏ）　０　、５％、
ｐ”２０００／Ｆｌ泡剤０．０１％。

接種した生産培地を、５００Ｌ発酵タンク中、撹拌数２
７　Ｏｒｐｍ、２８°Ｃで７日間発酵させる。

上で得た発酵液３８７Ｌを希塩酸でｐＨ２，５に調整し
、フィルタープレスを通して濾過する。菌体をアセトン
１０８Ｌで抽出し、抽出液を減圧留去し、残った水層を
酢酸エチル２ＳＬで抽出する。

この抽出液を減圧留去して組物質４８９９を得る。

この組物質４８９ｇを３０％アセトン水（ｐＨ７，５）
に溶解し、この溶液をＣＨＰ２０Ｐ（三菱化成工業）２
０Ｌを充填したカラムに吸着させる。３％塩化ナトリウ
ム水：アセトン（７：３）から水：アセトン（３ニア）
の間でグラデイエンド溶出を行ない、活性物質を溶離す
る。各分画はＨＰＬＣで分析し、異性体（１）と異性体
（Ｉ［）に富む分画４．５Ｌを合し、減圧下に濃縮して
３０．１６９の粉末を得る。

上で得た組物質１０ｇをメタノール１０峠に溶解し、セ
ファデックスＬＨ２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）２Ｌを
充填したカラムに付す。メタノールにて溶出し、各分画
をＨＰＬＣで試験する。異性体（Ｉ）に富む分画と、異
性体（ＩＩ）に富む分画、それぞれを合わし、減圧下に
濃縮する。

このセファデックスクロマト３回で得られた異性体（ｎ
）に富む分画２．　ｌ　２９と、異性体（１）に富む分
画４．６３９を、内径５Ｑｘｘ、長さ５００ｘ貢のＯＤ
Ｓカラム（山村化学Ａ　Ｐ　−３２４，）にて、０゜１
％リン酸含有の水ニアセトニトリル（３２：５８）ヲ用
イ、流速１００　ｘＱ／　ｌｌ１ｉｎでプレ７番テイブ
ＨＰＬＣを行なう。２２０ｏｍのＬＪＶ検出器を用いて
溶出液を監視し、各分画をＨＰＬＣで試験する。

減圧下に分画を濃縮することで異性体（ＩＩ）２９７１
ｇ、異性体（Ｉ’）１１０ｏを得た。これらの化合物は
先に示した物理化学的性状を示した。

実施例２　異性体（ＩＩＩ）の製造１）発酵チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３株（微工研条寄第
２１９６号）をバレインヨブドウ糖寒天斜面で７〜１０
日間、２８°Ｃで培養し、−斜面の全菌体および胞子を
２Ｌ容量のエルシンマイヤーフラスコ中の培地８００ｊ
Ｉσ（培地組成□ブドウ糖２．０％、ポリペプトン１．
０％、肉エキス０．３％、酵母ｚ＋ス０．２％、食塩０
．１％、ｐＨ７，０）に植菌した。植菌されたフラスコ
を２８°Ｃで２日間振盪培養した。上記培養液（８００
＋０を２ＯＬの上記組成の培地を含む３０Ｌのジャー・
ファーメンタ−に加え、２８°Ｃて１日間、通気撹拌培
養を行った（通気量２　ＯＬ／分、撹拌１５０　ｒｐｍ
）。

次に上記の培養液６Ｌをバレイショ浸出液（２００ｇ／
Ｌ）およびンヨ糖（２０９／Ｌ）組成の培地（ｐＨ無修
正）１５０Ｌを含む２５ＯＬ発酵タンクに移した。発酵
は、２８℃で、開始時から１６時間までは１２０ｒｐｍ
、その後は３７０　ｒｐｍで撹拌し、通気量は１５０Ｌ
／分（１，ＯＶＶＭ）で７日間通気撹拌培養を行った。

２）単離上記１）で得た発酵液３５６Ｌを希塩酸でｐＨ２゜５に
調整し、ろ過した。菌体部分をアセトン１０８Ｌで抽出
、抽出液（ｐＨ３，８）を減圧下で濃縮した。水層（３
０Ｌ）をｐＨ２，５に調整し、酢酸エチル（２５Ｌ）で
抽出した。抽出液を減圧下でａ縮し、石油エーテノ喧２
Ｌ）を加えて沈澱を生じさせた。

得られた粗抽出物４４８ｇをアセトン（３，６１）に溶
解し、２００ｍＭ　リン酸１＼、）ファ（ＰＢ）（ｐＨ
７，５，８，４Ｌ）を加え、これをＣＨＰ−２０Ｐカラ
ム（２ＯＬ）ｉこかけｔ二。アセトン・３％ＮａＣ（１
−２０ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７，５）＝３　：　７の混液（
１０Ｌ）で洗浄し、次いでアセトン　３％ＮａＣ＆−２
０ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７，５）−３：　７の混液（３０Ｌ
）とアセト７　：　２０１１Ｍ　ＰＢ（ｐＨ７，５）＝
７　：　３の混液（３０Ｌ）とのりニア−グランエンド
により溶出した。この溶出により下表のごとくＡ分画（
２２０９）、Ｂ分画（２４，６９）、Ｃ分画（１０８９
）およびＤ分画（１７，６９）を得、Ｂ分画を更に次の
様に処理した。

分画　　　Ｆｒ、Ｎｏ、　　　　容量（Ｌ）−１〜　７
３，２Ａ　　　　８〜１８　　　８．１Ｂ　　　　１９〜２６　　３６Ｃ３０〜３３　　　４．８Ｄ　　　　　３４〜３５　　　　９．０Ｂ分画（１２，
１９９）をセファデックスＬＨ−２０カラム（４，５Ｘ
９２ｃ贋、１４６０ｘＱメタノール充填、１６ｇ／分画
）にかけ、分画７７−８１を集めて濃縮し、固形物１１
３９を得た。これを再びセファデックスＬ　Ｈ−２０カ
ラム（２，６φＸ９５Ｇ肩、　５０４１Ｑメタノール充
填、５ｇ／分画）にかけ、分画５７−６５を集めて濃縮
し、固形物０．８９を得た。これを調製用高速液体クロ
マトグラフィーにかけ［カラム：ケムコソルブａｏｃ、
ｓ（２φＸ２５ｃｚ）、溶出液＝１％１％リン酸含有６
０性ＣＨ，ＣＮ、流速：Ｌ８ｉｄ／分、検出　ＵＶ２７
０ｎｍ］、保持容量６６１−８００ｘＱの溶出液を集め
、減圧下に濃縮し、残留物を酢酸エチルで抽出した。抽
出液を濃縮し、残留物を酢酸エチル−石油エーテルから
沈澱させ、固形物１０５＋＋ｙを得た。この固形物を調
製用高速液体クロマトグラフィーにかけしカラム：ヌク
レオシルＩＯＣ、、（２φＸ　２５　ＣＩ）、溶出液二
〇　１％リン酸含有６０％水性ＣＨ３ＣＮ、流速：ＩＭ
！／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ］、保持時間３０．６分
の分画を分取し、異性体（ＩＩＩ）２８ｚ９を得た。こ
の化合物は、先に示した物理化学的性状を示した。

以下の実験例に示す方法で本発明化合物のホスホリパー
ゼＡ、阻害活性を調べた。

実験例１ｕ法基質には、Ｌ−３−ホスファチジルエタノールアミン、
１−バルミトイル−２−［１−１４Ｃ］リルオイル（Ａ
　ｍｅｒｓｈａｍ社、　　５９　ｍｃ　ｉ／ｍｍｏｌ）
を、し−α−ホスファチジルエタノールアミン（Ｓ　ｉ
ｇｍａ社。

卵白由来）により希釈（２、０００ｄｐｍ／　ｎｍｏｌ
）　Ｌ、これをソニケートしたものを用いた。ＰＬ−Ａ
、には、ヘビ毒およびラット血小板由来のものを使用し
た。反応は、トリスバッファー（０，１Ｍ、ｐＨ７，４
）、ＣａＣＱ−（３ｍＭ）の溶液中にＰＬＡ、および基
質調整液を加え、３７°Ｃで２０分間反応後にドールズ
試薬１．２５１Ｑを入れ直ちに撹拌し反応を止めた。こ
れに蒸留水０．５ｘＱとｎ−ヘプタン０゜８ＩｌＩＱを
加え撹拌後遠心し、上層を別に分取した。

ざらにｎ−へブタンＯ，ＢＩＱとシリカゲルを加え撹拌
後、遠心し上清をバイアル瓶に分取し、これにトルエン
カクテルを加え、液体／ンチレーションカウンターによ
りＰＬＡ、ｉこよって遊離されてくる脂肪酸量を測定し
た。

阻害活性を酵素対照（コントロール）の値に対するパー
セント（％）で表し、これより５０％阻害濃度を算出し
た。

周里本発明に係る化合物のホスホリパーゼＡ！５０％阻害濃
度（ホスホリパーゼＡ、活性を５０％阻害する濃度（μ
９／酎乃は以下の通りであった。

【図面の簡単な説明】

第′Ｌ図は本発明化合物の赤外吸収スペクトルを示すグ
ラフであり、（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）はそれぞれ異
性体（１）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のスペクトルを
示す。特許出願人　塩野義製薬株式会社代理人弁理士青山　葆（外１名）七帽針ｔ　　　　　　　　　塑鳴叶ｔ；　　　　　　　　　　　　；呵　咀叶　こ；

Claims

【特許請求の範囲】１、以下の構造式で示される化合物またはその塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、チエラビア属に属する請求項１に記載の化合物を産
生する菌株を液中好気性条件下で培養し、培養液から該
化合物を採取することを特徴とする該化合物の製造方法
。