Procédé de préparation de la psilocybine et de la psilocine
On savait déjà, à la lumière de quelques brèves relations transmises par les premiers voyageurs espagnols, sitôt après la conquête du Mexique par Cortès, puis récemment par les investigations de Valentina Pavlovna Wasson et R. Gordon Wasson, que tout un groupe d'espèces de champignons du Centre de ce pays étaient employées par les Indiens dans des buts rituels, leur absorption par l'homme provoquant des effets particuliers sur le corps et l'esprit.
On sait aujourd'hui que ces champignons dits hallucinogènes ou divinatoires sont des Basidiomycètes de l'ordre des Agaricales et de la famille des Strophariacées, la plupart appartenant au genre Psilocybe : Stropharia cubensis Earle, Psilocybe mexicana Heim, Ps. caeru- lescens Murrill var. Mazatecorum Heim, Ps. caerulescens var. nigripes Heim, Ps. Zapotecorum Heim,
Ps. Aztecorum Heim, Ps. Wassonii Heim [R. Heim,
Revue de Mycologie 22, 1 (1957) ; Compt. rend. hebd. Séances Acad. Sci. 245, 1761 (1957)].
La recherche de ces champignons, dont le temps de croissance est relativement bref, la venue rare, dont les habitats naturels sont très particuliers, est malaisée, et leur cueillette en général de faible rendement. Pour l'obtention des principes actifs, il était donc d'une importance décisive qu'on parvînt, à partir de cultures pures, à cultiver ces champignons au laboratoire. R. Heim et R. Cailleux [Compt. rend. hebd. Séances Acad. Sci. 244, 3109 (1957)] ont signalé le principe même de la méthode qui leur a permis d'obtenir un grand nombre des fructifications de ces champignons.
Il s'est avéré en outre, au cours d'expériences personnelles, que les carpophores obte- nus par cette voie manifestaient les mêmes propriétés organoleptiques et hallucinogènes que ceux de provenance naturelle [R. Heim, Compt. rend. hebd.
Séances Acad. Sci. 245, 597 (1957)].
Les résultats obtenus concernent l, a culture des espèces hallucinogènes, non seulement à l'état pur sur milieux nutritifs artificiels, en tubes ou en ballons d'Erlenmeyer, mais aussi en conditions non asepti- ques, en cages vitrées dans lesquelles étaient rassem- blées, pour chacune d'elles, une quinzaine de terrines de 16 cm de diamètre renfermant le compost con venable, préalablement ensemencé. Ces essais se sont appliqués à la presque totalité des espèces de Psilocybes hallucinogènes et au Stropharia cubensis récol- tés par R. Heim et R. G. Wasson au Mexique en 1956. Les résultats ont été plus particulièrement favorables avec le Psilocybe mexicana Heim [R.
Heim,
Compt. rend. hebd. Séances Acad. Sci. 244, 695 (1957)] qui a été choisi pour mener à bien les premières recherches d'ordre chimique et pharmacody- namique auxquelles conduisait la découverte des propriétés hallucinatoires de ces champignons. En effet, la production relativement abondante des carpophores en culture sur compost conservé en conditions non stériles, d'autre part, le fait que certaines souches de l'espèce mexicana ont fait apparaître des coussinets mycéliens aériens abondants, et surtout des sclérotes vrais, ouvraient la première fois une source particulièrement intéressante pour obtenir des substances hallucinogènes.
Les différences notables apparues dans les souches ainsi obtenues et même, pour certaines d'entre elles, leur caractère mutationnel ont été déjà signalés [R. Heim, Compt. rend. hebd.
Séances Acad. Sci. 245, 1761 (1957)] et permettaient d'espérer obtenir des lignées particulièrement riches en substances actives.
A partir de sporées ou de fragments de chair, provenant de spécimens sauvages du Psilocybe mexicana, apparemment et physionomiquement identi- ques, récoltés par R. Heim en pays mazatèque, en juillet 1956, des ensemencements ont conduit à la caractérisation de trois souches culturales quelque peut distinctes dont les particularités se sont maintenues approximativement en culture sur composts nu tri, tifs pailleux : N 1, 13, 14.
La souche No 1 de Psilocybe mexicana produit, sur maltea à 24}/o gélosé, un mycélium blanc, diffus, très fin, formant un. revêtement de 3 à 4 mm de haut.
Après un mois, on note l'apparition de petits cordonnets, constitués de filaments peu agrégés de couleur fauve. Au bout de 4 à 7 semaines, les premiers carpophores et les sclérotes, de 2 à 8 mm de diamètre, se constituent. Après 3 mois, culture, mycélium et milieu bleuissent légèrement.
Sur le compost ensemencé à partir du mycélium, les carpophores, caractérisés par la forme du chapeau, montrent celui-ci longtemps ogival, voire presque clos, son diamètre (jusqu'à 3 cm) atteignant le tiers ou la moitié de la hauteur et sa couleur se montrant brun sombre, ocre vif sur le mamelon ; puis la marge, étroitement blanche et finement laciniée, se relève, le chapeau s'étale, devenant horizontal, voire déprimé ; le pied, long, est entièrement et hélicoidalement fibro-tordu, contourné, blanchâtre en haut, brillant, crème ocré ailleurs, tacheté de gris-vert à la base ; les lames, triangulaires, restent longtemps ascendantes ; elles sont pourpré violacé foncé comme la sporée ; les spores, relativement petites, mesurent 7, 5-9 x 5, 5-7 x 5-6.
Dans la souche No 13 de-Psilocybe mexicana
Heim, le mycélium obtenu sur milieu au maltea gé- losé se montre d'abord au point d'ensemencement sous forme de filaments plus ou moins dressés, puis constituant un revêtement ras, opprimé sur le milieu, produisant de bonne heure des cordonnets blancs. Au sommet de la culture, sur la partie la plus sèche du biseau gélosé, on note très vite l'appa- rition d'oïdies qui donnent une, apparence poudreuse à cette partie de la culture. Après 4 à 7 semaines, fructifications et sclérotes apparaissent, après 8 ou 9 semaines quelques rhizomorphes fauves. Au bout de trois mois, une partie du mycélium et la totalité du milieu sont pénétrés d'un pigment bleu formé par dégénérescence des hyphes.
Sur le compost ensemencé à partir du mycélium, la souche No 13 ne forme généralement pas de masses mycéliennes comme dans le cas de la souche
Na 14, mais bien un mycélium se désarticulant en oïdies, comme sur malt gélosé. Ce mycélium oidien peut apparaitre en taches de 0, 5 à 4 cm de diamètre et même occuper peu à peu toute la surface de la terrine.
De très nombreux primordiums apparaissent sur le mycélium superficiel à oidies, mais la plupart de ceux-là avortent. Les autres achèvent leur développement à partir de l'état primordial de différenciation piléique durant environ 4 à 8 jours.
Les caractères essentiels de l'espèce sauvage restent maintenus : le chapeau, un peu plus petit qu'à l'état naturel, atteint 1, 7 cm de diamètre à l'état adulte ou presque étalé, mais ne dépasse pas le plus souvent 1 cm quand il est encore campanule-obtus ; jamais fermé, ni plan, ni déprimé, il reste convexe, muni au centre d'un mamelon peu individualisé ; hygrophane, glabre, dépourvu de voile floconneux ou fibrilleux, il est marqué par translucidité de longues stries atteignant le voisinage du sommet ;
sa teinte, paille, est relativement plus claire qu'à l'état sauvage (où, à l'état imbu, elle se montre brun roux ou brun fauve sublilacin). Le stipe long et grêle apparaît particulièrement fluet (jusqu'à 10 cm de haut sur 1, 5 mm d'épaisseur) et cassant, flexueux, égal sauf à la base à peine renflée, ocre rosé très pâle ou blanc crème, voire blanchâtre, fibreux, à fistulosité centrale, étroite, régulière, tomenteuse et blanche. Les lamelles moyennement serrées, à peine adnexées, d'abord crème ocré, puis brun olivâtre, finalement violet fuligineux, subconcolores sur l'arête, offrent une maturation centripète, progressant du bord piléique vers l'insertion du stipe.
La chair, très mince et ocracé sale dans le chapeau, crème dans le pied, ne bleuit ni naturellement, ni sous l'action de la teinture de gaiac, et offre une très forte odeur de farine, une saveur également de farine mais en outre d'une âcrescence particulière. La sporéa est violet pourpré noir. Les basidiospores mesurent 9, 5-10, 5 x 6-7 x 6-7tu ; elles sont ovoides, isodiamétriques, lisses, à contour subcontinu, non visiblement polygonal, à large pore germinatif d'environ 1, 5 R ; les basides sont tétraspores ; les poils formant l'arête substérile sont fusiformes-étroits, effilés au sommet où ils prennent intensément le bleu coton C 4 B.
Dans la souche No 14 de Psilocybe mexicana sur maltea gélosé à 24/o, le mycélium, très vigoureux, blanc d'abord atteint 3 à 4 mm de hauteur. Au bout d'un mois à 220 C, il a envahi complètement le biseau gélose et devient fauve, souvent agrégé en fins cordonnets. Au bout de 4 à 7 semaines, les premiers carpophores apparaissent, accompagnés souvent de sclérote. Après 12 à 13 semaines, un léger bleuissement de certaines parties de mycélium se manifeste parfois, mais aucun exopigment de cette couleur n'est sécrété dans le milieu.
Sur le compost ensemencé à partir du mycélium, la souche No 14 (comme la souche No 1), 4 à 5 semaines après l'ensemencement, c'est-à-dire 3 à 4 semaines après le revêtement, produit sur la terre de couverture des masses mycéliennes ouatées et blanches, puis crème à grisâtre sale, de taille très varia ble, occupant parfois à la fin toute la surface de la terrine, atteignant 0, 5cm à 1, 5cm de hauteur, formées de filaments très enchevêtrés qui donnent à ces productions une consistance un peu élastique mais non tenace, qui se maintient à la dessiccation. Les carpophores se forment parfois au travers de ces masses ou sur elles.
Ils se reconnaissent à la puissance relative du pied, moins fortement fibre-strié que dans les autres souches, grossièrement furùracé- tigré au sommet, de plus en plus brun vers la base, atteignant 11 cm de long sur 2, 9 mm de large, et jusqu'à 3, 8 mm à la base, à chair brun ocre clair ;
le chapeau, de taille moyenne (2, 2 à 4 cm de diamètre), campanule, longuement, finement et régulièrement sillonné, strié puis galériculé, jamais étalé, au profil un peu polygonal, offre une marge fortement enrou- lée, marquée d'un fin rebord annulaire blanc fimbrié, constituant la limite inférieure d'une zone fibrilleuse- pruineuse-arachnoide. Cette souche No 14 est encore caractérisée par le fait que les carpophores ne libè- rent jamais leurs spores quoique celles-ci mûrissent normalement sur les basides, dont elles ne se détachent pas. Les lamelles sont étroites, grises puis pourpre violacé foncé.
Ce Psilocybe mexicana No 14 produit des sclérotes variant de 0, 60 cm à 2, 5 cm de diamètre et de 0, 25 g à 5, 25 g comme poids. Les spores, conformes à celles des autres souches et du type sau- vage, mesurent 8-10 x 6-7, 3 x 5, 5-7.
La culture des carpophores s'est effectuée en milieu naturel stérile. Les principaux milieux utilisés correspondent à la paille de blé fermentée, à un mé- lange formé de débris de feuilles et de tiges de maïs, aux chaumes de graminées sauvages. Ils sont lavés abondamment à l'eau courante, distribués dans des terrines et le tout stérilisé dans l'autoclave. On les ensemence avec mycélium des cultures initiales en tubes sur les mêmes milieux, à partir de l'une des souches Nos 1, 13 ou 14 de Psilocybe mexicana
Heim.
Après l'incubation pendant environ deux semaines à une température de 24 à 270, les cultures dans le compost sont revêtues d'une couche de sable et placées dans des cages vitrées, à la lumière du jour, à une température de 21-22 . Les fructifica- tions apparaissent après 4 à 5 semaines ; pendant ce temps l'humidité des cultures est strictement entretenue. La récolte se fait de temps en temps pendant 1 à 2 mois ; on prend les carpophores au commencement de leur sporulation.
L'ensemble des résultats obtenus montre que la moyenne générale de récolte pour chacune des souches Nos 1, 13 et 14 s'établit ainsi par terrine :
Pour la souche ? 1 : 12, 10 g à l'état frais
Pour la souche N 13 : 13, 95 g à l'état frais
Pour la souche N 14 : 15, 20 g à l'état frais
Comme l'obtention de matériel initial-cham- pignons frais ou socs-par'le procédé précédent est très laborieuse, on a tenté d'obtenir des rendements plus élevés en appliquant d'autres méthodes de culture. On a trouvé ainsi, sans l'avoir pu prévoir, que le Psilocybe mexicana Heim, dans certaines conditions de cultures in vitro, produit presque exclusivement un mycélium avec sclérotes, au lieu de mycélium avec carpophores.
Sur les milieux riches se forment principalement les sclérotes, sur les milieux pauvres, au contraire, les carpophores déjà obtenus d'autre part. La formation de ces derniers est opti mum, par exemple sur un milieu à 1, 5"/o de gélose, pour des concentrations en extrait de malt séché comprises entre 0, 3 et 0, 4 c/o, tandis que l'optimum pour la formation de sclérotes se situe à une concentration de 4, 5 /o. Par incubation à la lumière du jour, à des températures de 18 à 260 et selon des concentrations croissantes en extrait de malt, on a obtenu les formes de croissance caractéristique indiquées ciaprès :
EMI3.1
<tb> <SEP> Teneur <SEP> du <SEP> milieu <SEP> Formes <SEP> de <SEP> croissance <SEP> du <SEP> Psilocybe <SEP> mexicana
<tb> en <SEP> extrait <SEP> de <SEP> malt
<tb> <SEP> (substance <SEP> sèche) <SEP> Souche <SEP> No <SEP> 13
<tb> <SEP> Carpophores <SEP> normaux <SEP> avec <SEP> sporulation, <SEP> sur <SEP> un <SEP> mycélium <SEP> blanc <SEP> et <SEP> léger, <SEP> avec
<tb> <SEP> de <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> à <SEP> 0, <SEP> 7/o <SEP> maximum <SEP> distinct <SEP> à <SEP> 0, <SEP> 3-0, <SEP> 4 <SEP> 0/o <SEP> ; <SEP> pas <SEP> de <SEP> sclérotes.
<tb>
<SEP> Formation <SEP> incomplète <SEP> de <SEP> carpophores, <SEP> diminuant <SEP> rapidement <SEP> pour <SEP> des <SEP> concentra
<SEP> tions <SEP> croissantes <SEP> ; <SEP> par <SEP> contre, <SEP> début <SEP> de <SEP> la <SEP> formation <SEP> de <SEP> sclérotes, <SEP> cependant <SEP> encore
<tb> <SEP> de <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> à <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 10/o <SEP> trs <SEP> faible. <SEP>
<tb>
<SEP> Pratiquement <SEP> plus <SEP> de <SEP> carpophores <SEP> ; <SEP> formation <SEP> croissante <SEP> de <SEP> sclérotes <SEP> avec
<tb> <SEP> de <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> à <SEP> 7, <SEP> 0"/o <SEP> maximum <SEP> distinct <SEP> à <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> /o. <SEP>
<tb>
<SEP> Pas <SEP> de <SEP> carpophores <SEP> ; <SEP> pratiquement <SEP> plus <SEP> de <SEP> sclérotes, <SEP> croissance <SEP> très <SEP> abondante
<tb> <SEP> de <SEP> 11 <SEP> à <SEP> 17 <SEP> /o <SEP> du <SEP> mycélium.
<tb>
La lumière du jour est absolument indispensable pour la formation des carpophores, mais non pour r celle des sclérotes. On a trouvé, au contraire, que, par incubation du champignon dans l'obscurité, la production des sclérotes est plus abondante et que, aux concentrations inférieures, il ne se forme encore que quelques sclérotes au lieu de carpophores.
Le tableau suivant indique les rendements en poids de sclérotes séchés, obtenus par incubation dans l'obscu- ri. té, à une température de 24"et avec des concentrations croissantes en extrait de malt (10 tubes de gélose) :
EMI4.1
<tb> <SEP> Extrait <SEP> de <SEP> malt
<tb> <SEP> (moût <SEP> de <SEP> bière) <SEP> Rendement <SEP> en <SEP> sclérotes
<tb> substance <SEP> sèche, <SEP> o/o <SEP> séchés, <SEP> gr.
<tb>
<SEP> 0, <SEP> 17 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP>
<tb> <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 05
<tb> <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> A <SEP> O, <SEP> IO <SEP>
<tb> <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 08
<tb> <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 30
<tb> <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 55
<tb> <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 24
<tb> <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> B <SEP> 1, <SEP> 90 <SEP>
<tb> <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 40
<tb> <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 11
<tb> <SEP> 17, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 00
<tb>
Les rendements dans le domaine de concentrations A correspondent aux rendements en carpophores obtenus par exposition à la lumière.
Il apparaît immédiatement qu'on obtient dans le domaine de concentrations B un rendement en matériel séché plus de dix fois supérieur.
On a constaté, au cours d'expériences personnelles, qu'il se forme dans les sclérotes le même principe actif que dans les carpophores. Le procédé selon lequel on cultive le champignon dans des conditions telles qu'il conduit à la production de mycé- lium, accompagné de sclérotes constitue un grand progrès, puisqu'il permet d'obtenir le produit de base pour l'obtention des principes actifs en peu de temps et avec peu de travail, selon un rendement plus de 10 fois supérieur.
La culture du champignon à grande échelle peut s'opérer comme suit : on part des spores d'un carpophore mûr et on prépare une culture pure sur malt gélose. Avec le mycélium ainsi produit, on ensemence un milieu intermédiaire dans des ballons d'Erlenmeyer, afin d'obtenir de grandes quantités de mycélium frais pour préparer le matériel d'ensemen- cement. On ne peut pas fragmenter finement ce mycélium de la façon habituelle, car il forme une couche étanche et cohérente.
Or on a trouvé qu'il est possible, de réduire cette couche de mycélium en très petits fragments, sans avoir à ouvrir le récipient de la culture et sans risquer ainsi une contamination. On ajoute au milieu intermédiaire des pièces de porcelaine selliformes, comme celles qu'on emploie habituellement au remplissage des colonnes à distiller. Avant d'ensemencer le milieu de culture, on introduit donc ces pièces de porcelaine en quantité telle qu'elles atteignent juste la surface du liquide, puis on stérilise le tout à l'autoclave. Après ensemencement et incubation, on réduit en menus fragments la couche de mycélium qui s'est formée à la surface, en agitant la culture avec la machine à mouvement rotatoire durant 30 à 60 minutes.
Par leur arêtes vives, les pièces de porcelaine fragmentent le mycélium et forment une suspension homogène de fins flocons, avec laquelle on peut ensemencer de manière très uniforme de grandes quantités de culture.
II est possible également de cultiver le champignon en culture immergée avec agitation : il ne se forme en ce cas que du mycélium. Il est préférable toutefois d'employer les cultures en surface qui donnent alors des rendements supérieurs. On obtient les meilleurs résultats avec un milieu à base d'extrait de malt, par exemple du moût de bière ou des préparations d'extrait de malt du commerce. On dilue le milieu à l'eau ordinaire de façon à obtenir une teneur en substance sèche de 4, 0 à 4, 5 /o et on ajoute des compléments déterminés en substances minérales. Il s'est avéré nécessaire d'ajouter des sels de fer ; d'autre part, l'addition d'ions Zn, Ca, K,
Mg, nitrate, phosphate et sulphate est avantageuse.
Il est avantageux en outre, pour obtenir une bonne croissance, d'ajouter au milieu 0, 2 /0 de gé- lose. Cette concentration en gélose, inhabituellement basse dans la technique des milieux de culture, donne un milieu encore presque liquide, mais dans lequel le champignon trouve juste assez de support pour r former rapidement une couche continue de mycélium.
L'addition supplémentaire de Cornsteep-liquor ou d'extrait de levure s'est avérée également très avantageuse.
Pour les cultures en surface, on stérilise le milieu dans des ballons de Fernbach ou dans des boîtes à pénicilline, à l'autoclave ; on ensemence avec la suspension décrite précédemment ; on agite et met à incuber à une température comprise entre 22 et 260.
Après 4 jours, apparaissent à la surface de très nombreuses colonies blanches ; le revêtement de mycé- lium est continu après 7 jours. Des sclérotes de couleur jaunâtre ou brune se forment après environ 14 jours sur ce revêtement. Après 3 à 8 semaines, on sépare de la culture et on sèche à l'étuve la couche de mycélium renfermant les nombreux sclérotes. Le filtrat de la culture contient également une certaine quantité de substances actives ; on le traite selon le procédé indiqué ci-dessous pour les champignons.
On extrait les principes actifs de la matière fongique avec de l'eau et/ou un dissolvant organique miscible à l'eau, dégraisse l'extrait obtenu ou la matière fongique de départ, élimine de l'extrait obtenu ou de la matière fongique de départ les composés inactifs par extraction avec du chloroforme et/ou du chloro- forme à 10 /o d'éthanol ou de l'acétone et soumet une solution aqueuse de l'extrait obtenu à une pré cipitation fractionnée à l'aide d'un solvant organique.
La séparation s'opère par chromatographie de préférence sur de la poudre de cellulose ; on emploie de préférence du butanol saturé d'eau ou un autre alcool non miscible à l'eau en procédant de façon continue. Des impuretés de couleur jaune passent d'abord à travers la colonne, suivies d'une série de fractions contenant les principes actifs. La plus grande quantité des matières inactives restent fixées à la colonne. Les fractions actives sont caractérisées par une réaction de Keller de couleur violette ou bleue.
On peut réunir les fractions contenant les substances actives et on les soumet, le cas échéant, à une nouvelle séparation par chromatographie sur une colonne de cellulose. Le développement continu du chromatogramme est suivi à l'aide de la réaction de
Keller : on obtient ainsi deux maxima. La zone à progression rapide contient une substance caractérisée par une réaction de Keller de couleur bleu pur, nommée Psilocine. On obtient de la zone à progression lente une seconde substance donnant une réaction violette et nommée Psilocybine. En quantité élevée, la psilocybine est la substance prépondérante.
Les substances éluées de la colonne sont dans un état de pureté relative : elles contiennent de l'halogène et, comme telles, ne cristallisent pas. C'est par un traitement chimique seulement qu'on parvient à éliminer l'halogène et à obtenir la psilocybine cris tallisée. A cet effet, on peut traiter une solution aqueuse contenant le principe actif avec du carbo- nate d'argent, on élimine l'excès d'ion argent à l'hy drogène sulfuré et on évapore le filtrat sous vide.
La substance active cristallise de la solution concentrée.
Pour l'analyse, on recristallise la psilocybine à partir de méthanol ou d'eau. On obtient, en utilisant l'eau, de fines aiguilles blanches comme là neige, en employant le méthanol, des prismes incolores contenant du solvant, qui se décomposent de 195 à 2200.
La substance est optiquement inactive. Elle se dissout dans 120 parties de méthanol bouillant ou dans 20 parties d'eau à l'ébullition. Le composé est difficilement soluble ou insoluble dans l'alcool ou d'autres solvants organiques.
Les résultats de l'analyse élémentaire répondent à la formule brute Cl,, Hl-
Le spectre ultraviolet (substance dissoute dans le méthanol) présente des maxima à 222, 267 et 290 me.
Cette substance active représente un composé de phosphore d'un genre nouveau.
La substance est de caractère amphotère et se dissout facilement dans les acides minéraux dilués ou dans les alcalis dilués.
Administrée par voie orale à doses de 4 à 8 mg., la psilocybine déploie sur l'homme la même activité et provoque exactement les symptômes qui ont été déjà décrits en détail à partir des champignons euxmêmes [R. Heim, Compt. rend. hebd. Séances Acad.
Sci. 245, 597 (1957)].
La psilocine est caractérisée par le spectre ultraviolet (substance dissoute dans le méthanol) avec des maxima à 222, 260, 267, 283 et 293 mt d'une part, et par la réaction de Keller d'autre part, qui donne -au contraire de la psilocybine-une coloration bleu pur.
Exemple 1
L'exemple suivant décrit en détail la culture des carpophores du basidiomycète Psilocybe mexicana
Heim et l'obtention des principes actifs.
Les souches utilisées pour les cultures et pour les extractions ont été les Nls 1, 13 et 14, décrits ailleurs (R. Heim et R. Cailleux, Compt. rend. hebd. Acad.
Sci. 244, 3109 [1957]) ; elles sont obtenues en partant de s-parées ou de fragments de chair, provenant des spécimens sauvages du Mexique.
Le milieu de culture est préparé de la paille de blé fermentée, ayant atteint l'état où les fibres se séparent naturellement. La paille fermentée est lavée abondamment à l'eau courante et à la température du laboratoire. Elle est répartie dans des terrines de 16 cm de diamètre en prenant la précaution de ménager un drainage dans le fond du récipient au moyen de sable à bâtir réparti en une couche peu cohérente.
L'ensemble est recouvert d'une large capsule de por celaine et soumis à l'autoclave, à une température de 120-122"durant deux heures. Après refroidissement, le compost ainsi stérilisé est ensemencé en surface, en conditions strictement stériles, à partir de mycélium d'une des trois souches mentionnées cultivé en tubes sur le même milieu. Les terrines sont placées dans une étuve à une température de 24 à 27 pendant environ deux semaines. Ensuite, le compost, envahi par la progression du mycélium, après léger tassage de la surface, est revêtu d'une couche mince, de 2 à 3 mm d'épaisseur, formée de grains de nature calcaire constituant une couverture discontinue et poreuse.
Les terrines sont ensuite placées dans des cages vitrées et soumises à une température de 21220, sous l'action d'une lumière solaire diffuse, répondant aux conditions d'une salle bien éclairée. Les premières fructifications apparaissent 4 à 5 semaines après l'ensemencement des terrines. Le développement complet des carpophores exige de 4 à 8 jours.
L'humidité des cultures est entretenue par un bassinage d'eau de la distribution urbaine, soumise préala- blemen, à à la stérilisation à 120 pendant 15 minutes.
Les contaminations, notamment de Penicillium, sur la partie extérieure de la poterie, sont écartées par l'emploi d'un lait de chaux additionné d'un fongicide convenable, de préférence non volatil et agissant par contact. L'ensemencement doit être réalisé dans une pièce stérile et les précautions les plus sévères à ce propos seront prises durant tout le temps de l'incubation. Une légère aération doit être ména- gée dans les cages vitrées et toutes précautions prises à l'égard des contaminations extérieures possibles.
Les carpophores développés sur les terrines ont tous les caractères essentiels de l'espèce sauvage ; le chapeau, un peu plus petit qu'à l'état naturel, atteint 1, 7 cm de diamètre mais ne dépasse pas le plus souvent 1 cm. Ils sont récoltés de temps en temps, le rendement moyen variant entre 12 et 15 gr à l'état frais par terrine. Après la. récolte, il est avantageux de sécher les champignons à l'air.
On pulvérise finement 54 gr de champignons séches provenant des souches Nos 1, 13 et 14, en quantité équivalente et agite une fois avec 600 cm3 et trois fois avec 300 cmS de méthanol du, rant une demi heure chaque fois. On réunit les extraits et évapore à sec au vide.
Le résidu (12 gr) est dégraissé quatre fois par 250 cm3 d'éther de pétrole, puis broyé encore trois fois avec 100cm3 de chloroforme à 10 /o d'alcool.
Le matériel restant (environ 10 gr) est alors dissous dans 10 cm3 d'eau et traité lentement par 100cm3 d'alcool absolu ; la solution s'enrichit en substance active. On répète cette opération 2 à 3 fois, décante, évapore les solutions à siccité au vide, dissout le résidu à nouveau dans du méthanol et traite la solution par 20 gr de poudre de cellulose à 5 /0 d'eau.
On évapore le méthanol au vide et porte la poudre de cellulose chargée de substance active sur une colonne de 100 gr de poudre de cellulose à 5 /o d'eau ; on purifie au préalable la colonne par lavage avec du butanol saturé d'eau. On élue avec du butanol saturé d'eau et recueille par fractions de 20 cm3. On soumet le résidu d'évaporation de chaque fraction à la réaction de coloration de KelIer, en traitant des prises d'essai de 0, 25 mg du résidu par 2 cm3 du réactif de Keller.
On réunit les fractions à réaction positive, dissout la poudre amorphe dans 20 cm3 d'eau et agite la solution avec 0, 5 gr. de carbonate d'argent. On essore le précipité, élimine l'argent en traitant la solution à l'hydrogène sulfuré et réduit le volume de façon ménagée. La psilocybine cristallise de la solution concentrée en fines aiguilles incolores (. rendement : 200 mg.). On n'obtient à partir des carpophores que des traces de psilocine.
On obtient la psilocybine à l'état de pureté analytique par recristal, lisation à partir de méthanol ou d'eau. La psilocybine se dissout dans 120 parties de méthanol bouillant ou dans 20 parties d'eau à ébul lition. On l'obtint du méthanol en prismes incolores fondant à 195-2200 avec décomposition.
L'analyse correspond à la formule brute CI Ht, ONgP.
Le spectre ultraviolet pris dans le méthanol présente des maxima à 222, 267 et 290 mR. La nouvelle substance active est de caractère amphotère ; elle se dissout en formant des sels dans les solutions aqueuses diluées des alcalis et des acides. La solution de psilocybine dans de l'alcool à 20 a/o d'eau donne une réaction acide (pH 5, 2).
Exemple 2
Cet exemple décrit la culture in vitro du champignon Psilocybe mexicana Heim et l'obtention à l'état pur des principes actifs à partir du mycélium et des sclérotes formées.
On dilue à l'eau ordinaire du moût de bière blonde non houblonné, de façon à obtenir une teneur de 4, 0 à 4, 5 /0 en substance sèche. On ajoute par litre de solution :
FeSO4. 7HO O 0, 00417 gr
ZnS04. 7HzO 0, 00172 gr
gélose 2, 0 gr
On place cette solution, par portions de 500 cm3, dans des ballons à cultures de Fernbach de 1, 61. et stérilise en autoclave à 1080 durant 25 minutes.
Après refroidissement, on ensemence chacun des ballons avec 2 cm3 d'une supension mycélienne fine de
Psilocybe mexicana Heim, souche No 13. On prépare le matériel d'ensemencement comme décrit ci-dessous, en partant des basidiospores du champignon. On recueille à cet effet sur une plaque stérile les spores tombant des lamelles d'un carpophore mûr, on les introduit sur un milieu au moût de bière gélose et on met à incuber. On obtient ainsi des cultures primaires qui servent à préparer le matériel d'ensemencement proprement dit. Avec une spatule rugueuse et sous de l'eau ordinaire stérile, on gratte le mycélium formé par les cultures primaires de façon à produire une suspension fine de flocons de mycélium.
On ensemence avec cette suspension des ballons d'Er- lenmeyer contenant un milieu de culture et des pièces de porcelaine en forme de selle. Nous avons obtenu les meilleurs résultats avec des ballons de 300 om3 contenant 50 gr de pièces de porcelaine (grandeur 1 cm, poids environ 0, 9 gr) et 80 cm3 d'un milieu constitué de moût de bière à environ 4 0/o de substance sèche et 0, 2 /0 de gélose. II s'est formé à la surface, après une incubation de 2 semaines à 24 , une couche compacte de mycélium.
On agite la culture entière durant 30 minutes avec la machine à mouvement rotatoire : les pièces de porcelaine broient le mycélium en formant une fine suspension de flocons de mycélium Le matériel préparé ainsi suffit à ensemencer 251. de culture.
Les cultures ensemencées sont mises à incuber dans l'obscurité à 24-260. Comme on l'a décrit plus haut, il se forme une couche de mycélium avec de très nombreux sclérotes, qui atteignent en général un diamètre d'environ 1 cm, mais certains peuvent être notablement plus volumineux. Pour séparer le mycélium et les sclérotes, on filtre les cultures entiè- rement développées sur une gaze, on presse et sèche à l'étuve à 35-40 . Un essai opéré avec 134 ballons à cultures de Fernbach contenant 671. de milieu nutritif a donné après 62 jours 1149gr. de matériel desséché (sclérotes et mycélium), c'est-à-dire 17, 14 gr par litre de culture mis en jeu.
Pour obtenir les substances actives, on pulvérise finement, par exemple 612 gr de sclérotes et de mycélium séchés et extrait ce matériel à trois reprises avec 11. de chloroforme chaque fois, puis à trois reprises de nouveau avec chaque fois 11. de chloroforme à 10 /o d'éthanol. On élimine ainsi 5, 6 gr de substance inactive. Après cette extraction prélimi- naire, on épuise le matériel une fois avec 61., puis à trois reprises encore avec 31. de méthanol chaque fois. Les extraits de méthanol sont réunis et éva- porés à siccité à pression réduite : on obtient 35 gr. d'un résidu brun clair.
Pour écarter des impuretés de nature grasse, on suspend le résidu dans 35 cm3 d'eau et extrait une fois avec 11., puis deux fois avec Va L d'éther de pétrole chaque fois ; l'éther de pétrole contient 1, 5 gr. de produit inactif. La solution aqueuse restante est. réduite au vide à un volume d'environ 50 cm3 et etraitée. par 500 cm3 d'éthanol absolu en agitant vigoureusement. Il se forme un précipité collant ; on sépare la solution contenant les principes actifs par décantation. On dissout le précipite dans une petite quantité d'eau et traite par la quantité décuple d'alcool absolu. On opère cette précipitation deux fois encore sur le résidu, réunit les solutions et les évapore à siccité au vide.
Le résidu solide (23, 4 gr.) contient la quantité totale des substances actives.
On dissout ce résidu dans le moins possible de méthanol à 50 e/o, mélange intimement cette solution à 80 gr. de poudre de cellulose et sèche ce matériel au vide. La poudre de cellulose chargée ainsi de substance est portée sur une colonne de cellulose qu'on a préparée en suspendant 700 gr de poudre de cellulose dans du butanol saturé d'eau. On déve- loppe le chromatogramme avec du butanol saturé d'eau de. façon continue ; an recueille par fractions de 200 cm8 et évapore chaque fraction au vide poussé, à une température du bain de 500 au plus. On obtient la séparation suivante :
Table 1
Nos. des fractions Résidu, gr.
Réaction de Keller
1-14 2, 170 négative
15-34 6, 660 positive
35-40 3, 540 négative
12, 370
Le reste d'environ 11 gr. demoure attaché à la colonne. Les fractions 15 à 34 donnent un résidu total de 6, 660 gr. qui contient la quantité entière des principes actifs. On soumet ces fractions à une nouvelle purification par chromatographie. A cet effet, on dissout le résidu (6, 660 gr.) dans le moins possible de méthanol et imprègne de cette solution 20 gr. de poudre de cellulose. On sèche et porte ce matériel sur une colonne de 600 gr. de cellulose comme décrit t plus haut.
On développe le chromatogramme avec du butanol saturé d'eau, en recueillant par fractions de 100 cm3. Après évaporation de chaque fraction au vide poussé, on soumet le résidu à la réaction de
Keller. On obtient ainsi la séparation suivante :
Table 2
Nos. des fractions Résidu, mg. Réaction de Keller
1-8 2950 négative
9-17 180 bleu intense
18-21 155 négative
22-31 912 violette
32-45 1510 négative
Après traitement au carbonate d'argent comme à l'exemple 1, le résidu (180mg.) des fractions 9 à
17 donne 90 mg. de psilocine pure.
Les fractions 22 à 31 (Table 2) donnent, après traitement au carbonate d'argent comme à l'exemple 1, 619 mg. de psilocybine pure présentant les propriétés décrites à l'exemple 1.
On extrait les principes actifs du filtrat de la culture selon le procédé décrit précédemment pour les sclérotes. Le filtrat est réduit au vide à 1/10 environ de son volume. On précipite par le volume décuple de méthanol, essore et extrait le résidu à trois repri- ses par la quantité décuple de méthanol. On évapore à siccité les extraits de méthanol et en poursuit la purification comme décrit précédemment. On a obtenu, par exemple, 220 mg. de psilocybine et 12 mg. de psilocine à partir de 10, 1. de filtrat de culture.
Exemple 3
Le milieu de culture est préparé comme suit : on dilue à l'eau ordinaire du moût de bière blonde non houblonné, de façon à obtenir une teneur en substance sèche de 4, 0 à 4, 5 /o. On ajoute à chaque litre de cette solution
FeSO4. 7H2O 0, 00209 gr.
ZnSO. 7tLO 0, 00086 gr.
Ca {NO3) 2 0, 25 gr.
KH2PO, 0, 0625 gr.
MgSO4 0, 0625 gr.
KC1 0, 031 gr.
gélose. 2, 0 gr.
Le milieu de culture est stérilisé et ensemencé comme décrit à l'exemple 2. Après une incubation de 48 jours à 24", on obtient à partir de 55 1. un rendement de 924 gr. en sclérotes et mycélium (substance sèche), c'est-à-dire 16, 6 gr. par litre. L'obten- tion des principes actifs peut être conduite comme à l'exemple 2. Rendement : 0, 018 /o psilocine, 0, 12'0/o psilocybine (calculé à partir du matériel séché).
Exemple 4
Le milieu de culture est préparé comme suit : on dilue à l'eau ordinaire du moût de bière blonde non houblonné, de façon à obtenir une teneur en substance sèche de 4, 0 à 4, 5 /o. On ajoute à chaque litre de cette solution :
FeSOd. 7H20 0, 00209 gr.
ZnSO4. 7H2O 0, 00080 gr.
Ca (NO3) 2 1, 0 gr.
gélose 2, 0 gr.
On stérilise, ensemence et fait incuber ce milieu comme à l'exemple 2. Après 48 jours, on obtient 20, 5 gr. de sclérotes et de mycélium secs par litre de solution. On en isole les substances actives comme à l'exemple 2. Rendement : 0, 011 /o psilocine et 0, 140/o psilocybine (calculé à partir du matériel séché).
Exemple 5
Le milieu de culture est préparé comme suit : on dilue à l'eau ordinaire du moût de bière blonde non houblonné, de façon à obtenir une teneur en substance sèche de 4, 0 à 4, 5 t/o. On ajoute à chaque litre de cette solution :
FeSO4. 7HO 0, 00209 gr.
ZnSO4. 7H2O 0, 00086 gr.
KHRO4. 0, 25 gr.
gélose. 2, 0 gr.
On opère ensuite comme à l'exemple 2. Le rendement en sclérotes et mycélium sèches après 48 jours est de 15, 9 gr. par litre de solution. On isole les substances actives comme à l'exemple 2. Rendement : 0, 02 /o psilocin$ et 0, U < '/e psilocybine (calculé à partir du matériel séché).
Exemple 6
Le milieu de culture est préparé comme suit : on dilue à Peau ordinaire du moût de bière blonde non houblonné, de façon à obtenir une teneur en substance sèche de 4, 0 à 4, 5 e/e. On ajoute à chaque litre de cette solution :
FeSO. 7H20 0, 00209 gr.
ZnSO4. 7H2O. 0, 00086 gr.
Cornsteep-Solids 20, 0 gr.
gélose. 2, 0 gr.
On opère ensuite comme à l'exemple 2. Le rendement en sclérotes et mycélium sèches après 48 jours est de 29, 8 gr. par litre de solution. On isole les substances actives comme à l'exemple 2. Rendement : 0, 012 e/o psilocine et 0, 22 zozo psilocybine (calculé à partir du matériel séché).
Exemple 7
Le milieu de culture est préparé comme suit :
extrait de malt. 45 gr.
FeSO4. 7HaO 0, 00417 gr.
ZnSO. 7HgO 0, 00172 gr.
eau ordinaire. 1000 cl3
Le milieu de culture est stérilisé à l'autoclave à 1080 durant 25 minutes. On ensemence un litre avec 10 cm3 d'une suspension mycélienne, provenant d'une culture de Psilocybe mexicana. On prépare cette suspension comme décrit à 1'exemple 2. Après ensemencement, on cultive le champignon selon le procédé en profondum à 240 avec agitation. II se forme des boules de mycélium à l'aspect de sagou, comme c'est le cas pour les cultures immergées de champignons inférieurs. Après 30 jours, on sépare le mycé- lium en essorant : le rendement en mycélium séché est de 7, 0 gr. par litre de solution.
On agite à tem pérature ordinaire, durant 1/2 heure, 430 gr. de mycélium séché et finement pulvérisé avec 4, 51. d'etha- nol aqueux à 80 /o. On essore le résidu et l'extrait encore trois fois de la même façon. On réunit les extraits, évapore et extrait le résidu (41 gr.) successivement avec 2 portions de 500 cm3 d'éther de pé- trole, 2 portions de 400 cm3 de chloroforme et 2 portions de 200 cm3 d'acétone pour éliminer le matériel inactif. On dissout le résidu (25 g) dans 25 cm3 d'eau, traite cette solution lentement par 250 cm3 d ? acétone en agitant vigoureusement et sépare le liquide du précipité.
On redissout le précipité dans une faible quantité d'eau, précipite à nouveau. par la quantité décuple d'acétone et répète deux fois cette opération sur le matériel insoluble dans l'acétone. La quantité entière des substances actives a passé alors dans les extraits d'acétone aqueux. On évapore ces extraits au vide et fractionne le résidu (9, 8 gr.) par chromatographie sur une colonne de cellulose comme à l'exemple 2.
Après une seconde chromatographie, on obtient 32 mg. de psilocine et 225 mg. de psilocybine cris tallisée, correspondant respectivement au rendement de 0, 007 et 0, 05 /o (calculé à partir du mycélium séché).