<Desc/Clms Page number 1>
PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX PROCEDES DE PREPARATION DES COMPOSES
STEROIDES.
L'invention est relative à un procédé pour l'oxygénation de certains composés stéroides à l'aide de cultures choisies de micro-organismes ; et elle concerne, plus particulièrement, l'introduction d'un groupement hydroxyle à la position 11 du noyau stéroïde dans la configuration ss. Une réaction particulièrement utile, qui peut être effectuée par ce procédé, est la conversion du composé S (substance S de Reichtein ou 17-hydroxy- 11-desoxycorticostérone ) en composé F (composé F de Kendall ou 17-hydro- xycorticostérone).
La préparation de composés stéroïdes biologiquement actifs, tels que la ou le cortisone et le compose F, se fait avec de nombreuses difficultés sérieuses. Un des problèmes les plus difficile est l'introduction d'atomes d'oxygène à des positions essentielles du noyau stéroïde, surtout à la position 11 de ce noyau. Le composé S peut être obtenu par des voies synthétiques connues, à partir de diverses matières stéroïdes initiales, d'origine naturelle et relativement économiques, telles que des matières stéroïdes du type végétal. Par contre, le composé F est beaucoup plus difficile à obtenir et est un composé de grande valeur, qui est particulièrement utile pour le traitement de l'arthritisme rhumatismal et de certains états du corps humain.
Tout procédé par lequel le composé S peut etre converti en composé F avec un bon rendement et sans dépenses excessives a une valeur importante pour l'industrie pharmaceutique et pour le public en général.
Des méthodes ont déjà été proposées pour convertir le composé S en composé F par des organismes tout différents de ceux décrits ci-dessous pour la mise en oeuvre du procédé faisant l'objet de l'invention. Dans le brevet E.U.A. n 2.602.769 on a décrit l'usage de Cunninghamella blakesleena
<Desc/Clms Page number 2>
(de l'ordre des Mucorales) et dans un article paru dans le Journal of the .
American Chemistry Society (Vol. 77,-p. 2381, 1952) on décrit un procédé pour lequel on utilise le Streptomyces fradiae. Un grand nombre de microorganismes ont été essayés en ce qui concerne leur efficacité pour convertir le composé S en composé F. La plupart des ces micro-organismes ne donnent aucune indication relative à la 11-ss-hydroxylation. Un nombre considérable de cultures d'organismes, de l'ordre des Mucorales, ont été essayées pour la même réaction mais quelques unes seulement de celles-ci permettaient d'obtenir un degré réduit de conversion.
Contrairement aux méthodes publiées par les inventeurs du procédé faisant l'objet de l'invention et aux pauvres résultats obtenus avec une variété d'organismes étudiés par ces inventeurs, les micro-organismes-du genre Curvularia ont donné des résultats très favorables en ce qu'ils permettent de préparer des produits, tels que le composé F, avec des rendements atteignant 40 % ou davantage. Par ailleurs, on peut effectuer les réactions dans des conditions telles que les produits puissent être isolés assez aisément avec un degré de pureté élevé. Ceci permet, pour la première fois, la préparation pratique sur une grande échelle et par des méthodes biochimiques, de substances telles que le composé F.
On a découvert qu'en mettant en contact un composé- stéroïde, en particulier ceux qui comportent un groupement méthylène à la position 11, avec l'activité oxygénante de certains micro-organismes choisis, c'est-àdire avec les organismes eux-mêmes ou avec des systèmes?enzymes de ces organismes, on peut obtenir la 11- ss -hydroxylation sélective de ces composés stéroïdes. Parmi d'autres réactions, qui peuvent être effectuées, on peut citer la conversion du composé S en composé F. Les organismes en question sont des souches oxygénantes de champignons du genre Curvularia, ce genre appartenant à l'ordre des Moniliales de la classe des Fungi imperfecti.Ces idicatios sont basées sur la classification de Saccardo, P.A. Sylloge Fungorum Vol. 8.
Une valeur particulière ont les souches des espèces Curvularia Falcata, C. brachyspora, C. lunate , C. pallescens et d'autres espèces de ce genre. D'autres microorganismes du genre Curvularia peuvent être choisis pour effectuer le procédé, faisant l'objet de l'invention, en faisant des essais simples qui sont décrits avec plus de détails plus loin.
On peut se procurer plusieurs de ces organismes dans les collections de culture publiques et d'autres peuvent être isolés à partir de matières naturelles, telles que du terreau, par des méthodes normalisées bien connues par les mycologistes.
Comme décrit plus haut, on peut se servir du procédé faisant l' objet de l'invention pour convertir le composé S en composé F. Toutefois, le procédé peut également être utilisé par la 11-ss -oxygénation d'une variété d'autres composés stéroïdes qui sont non substitués à la position 11 du noyau. Diverses chaînes latérales peuvent être présentées à la position 17 du noyau et des groupements céto ou hydroxyle peuvent se trouver à la position 3 du noyau. Les composés stéroïdes, utilisés comme supports pour la réaction, peuvent également comporter des liaisons doubles carbone-carbone en divers points du noyau, par exemple aux positions 3,4 ou 5,6.
Il est à noter que le rendement en produit oxygéné varie, jusqu'à un certain degré, avec la nature du composé stéroïde utilisé comme matière initiale ; avec la souche particulière de Curvularia utilisée et avec les conditions adoptées pour la réaction, c'est-à-dire la température, la durée , le pH, le milieu nutritif, le moment auquel le composé est ajouté au micro-organisme, etc.
Par ailleurs, un micro-organisme oxygénant donné, appartenant à l'espèce préférée, peut avoir des effets très variables sur des composés stéroïdes différents, c'est-à-dire qu'n bon rendement en dérive 11- ss -oxygéné correspondant peut être obtenu quand on se sert d'une souche oxygénànte donnée et d'un composé stéroïde déterminé alors qu'un autre composé stéroïde, utilisé dans des conditions qui, à part cela, sont absolument identiques, forment le composé désiré avec un rendement qui est seulement modéré ou faible.
La présence d'un groupement hydroxyle à la position 21 de la structure sté- roïde du type prégnène peut être partiulièrement utile pour fournir un bon
<Desc/Clms Page number 3>
rendement en compose 11 ss -hydroxy.Comme les composés stéroides du type cortical possèdent un tel groupement hydroxyle , le procédé est particu- librement utile pour préparer les composés 11- -hydroxylés de cette sé- rie. Parmi les produits qui peuvent être convertis en produits 11- ss -hy- droxylés correspondants on peut citer les composés S ou le desoxycorticos- térone. Diverses méthodes peuvent être utilisées pour évaluer les produits obtenus par c@s procèdes.
Par exemple, si l'on se sert d'un compo$4 stérpi- de avec une chaîne latérale appropriée, la proportion du produit obtenu peut être évaluée en détermi@ant l'effet sur des souris traitées par l'adré- nalectome ou en se basant sur le nombre d'ésinophiles qui se trouvent dans le sang des animaux ayant servi aux essais. Par ailleurs, les produits purs, obtenus par la réaction d'hydroxylation, peuvent être isolés comme décrit ci-dessous.
L'efficacité d'un micro-organisme choisi pour le procédé faisant l'objet de l'invention, peut être déterminée en cultivant l'organisme dans un milieu nutritif approprié contenant des hydrates de carbone, des sels, des sources d'azote organique, etc. Le composé stéroïde, à l'état solide ou en solution dans un solvant approprié tel que l'acétone ou l'éthanol,est ajouté, dans des conditions stériles, au micro-organisme cultivé et le mé- lange est agité et aéré pour provoquer la croissance du micro-organisme et l'oxygénation du support stéroide. Le stérol:de peut être ajouté quand le milieu est ensemencé, dans des conditoons stériles , avec une culture du micro-organisme ou aprs que la croissance de l'organisme à commen é.
Dans certains cas il peut être bon d'ajouter le composé stéroïde après que la croissance du micro-organisme a commencé dans le milieu nutritif et dans des conditions aérobiques. Ceci convient tout particulièrement'quand, pendant les phases initiales de la croissance du micro-organisme,, il existe une tendance à la formation de sous-produits non voulus à partir du support stéroide. L'acétate +.. un autre ester du stéroïde peut être utilisé à la place de l'alcool lui-même bien que ceci puisse parfois être la cause d'une diminution appréciable du rendement en produit hydroxylé.
Suivant une variante, on peut utiliser des préparations enzymes obtenues à partir de la culture d'un organisme oxygéné approprié du genre Curvularia pour la mise en oeuvre du procédé. Une autre méthode, tràs efficace, consiste à cultiver le micro-organisme sur un milieu nutritif approprié dans des conditions aérobiques et en l'absence du stéroïde. La culture mycellienne peut ensuite être séparée par filtration du bouillon et peut, si on le désire, être lavée à l'eau distillée. Le mycelium est alors mis en suspension dans l'eau distillée soutenant le support stéroïde. L'agitation et l'aération du mélange sont continuées pendant une période comprise entre environ 12 à 48 heures après quoi on récupère les produits résultant de la réaction.
Ce procédé présente l'avantage que le composé stéroïde peut être aisément récupéré car les diverses matières nutritives, utilisées à l'origine, pour obtenir la croissance du micro organisme sont alors absentes ainsi que les diverses matières excrétées par les organismes, au cours de leur croissance, pendant la période initiale. Avec certaines sou hes du genre Curvularia on obtient, par cette méthode, des rendements totaux, encore meilleurs en produits oxygénés que dans le cas cù le stéroïde est ajouté, au début ou à une période intermédiaire déterminée, à l'ensémble du bouillon de fermentation. D'autres méthodes, bien connues des chimistes qui s'occupent des enzymes, peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre du procédé d'oxygénation en question.
La proportion des produits et la vitesse d'oxy- génation ainsi que la nature que l'on se sert de l'ensemble du bouilloh de fermentation ou du mycelium lavé et isolé.
En général, une concentration qui ne dépasse pas 1 à 2% en poids total du support, par exemple de la matière du genre composé S, est adoptée pour la mise en oeuvre du procédé, mais parfois on peut juger qu'il est plus favorable d'utiliser d'autres concentrations. Comme la solubilité de la ma- tière initiale dans l'eau est très limitée, un excs de la matière peut être lentement converti en produit oxygéné. Toutefois, le degré de substitution
<Desc/Clms Page number 4>
du stéroïde, quand il est ajouté au système à oxygéner, cest-à-dire au mocro-organisme en cours de croissance ou du système enzyme, ne paraît pas affecter fortement le rendement et la nature des produits dans des conditions qui, à part cela, restent identiques.
Si l'on ajoute une solution du composé stéroïde dans un solvant miscible à l'eau au système de fermentation aqueux, le stéroïde est généralement précipité à l'état finement divisé en présence d'un grand excès d'eau. Ceci ne paraît pas améliorer d'une manière appréciable la vitesse de la réaction comparativement à celle obtenue par l'addition de cristaux secs et relativement grands du stéroïde.
Quand le traitement d'oxygénation est terminé, le produit peut être récupéré hors du mélange par extraction à l'aide d'un solvant approprié et non miscible à l'eau. Des hydrocarbures inférieurs chlorés, des cétones et des alcools peuvent être utilisés à cet effet.Ceux-ci comprennent le chloroforme, le chlorure de méthylène, le trichlorocéthane, le dichlorure d'éthylàne, etc. L'usage du dichlorure d'éthylène chaud, c'est-à-dire à une témpérature comprise entre environ 40 et environ 80 , convient tout particulièrement à l'extraction des produits stéroïdes. L'extrait du produit et les matières initiales n'ayant pas réagi peuvent être concentrés jusqu'à avoir un faible volume ou jusqu'à siccité pour obtenir un produit solide. La purification du produit peut se faire de différentes manières.
La plus efficace-est la séparation, par chromatographie, du produit d'avec les matières initiales et d'avec d'autres produits, tels que des substances plus fortement oxygénées, qui peuvent être formés au cours de la réaction. Des adsôrbants, tels que du gel de silice ou d'autres matières adsorbantes appropriées, sont particulièrement utiles à cet effet. On a découvert qu'une colonne, préparée avec un mélange de gel de silice et d'un alcool inférieur, plus spécialement l'éthanol, est particulièrement utile pour la séparation des matières stéroides initiales.
Les mélanges stérol:des peuvent agir sur des colonnes d'adsorbants tels qu'un gel de silice, en solution concentrée dans du chloroforme ou du chlorure de méthylène. La colonne peu.ensuite être lavée avec des quantités additionnelles du solvant pour enlever certaines impuretés telles que des graisses et des pigments . Le mélange adsorbé est ensuite séparé par l'addition graduelle d'un mélange du solvant et d'un faible pourcentage, par exemple de 1 à 5 %, d'un alcool inférieur (méthanol, éthanol, etc. ) Les matières peuvent être séparées et les composés séparés peuvent être récupérés graduellement hors de la colonne en utilisant des mélanges de sol.. vants qui ont une polarité graduellement croissante.
Par exemple, un mélange de chlorure de méthylène et une quantité réduite mais graduellement croissante et très utile.
Des fractions de la matière récupérée hors des colonnes chromatographiques peuvent être vérifiées, en ce qui concerne la nature du produit, en soumettant des petites portions des solutions à des analyses au papier chromatographique. Des méthodes qui sont particulièrement utiles pour effectuer ce genre de séparation et d'analyse sont décrites en détail dans le brevet E.U.A. n 2.602.769 et dans un article de Shull et autres publié dans les Archives of Biochemistry, Vol. 37, p. 186 (1952). Ces méthodes sont également très utiles pour évaluer des nouvelles souches de micro-organismes en vue de déterminer leur efficacité pour le procédé faisant l'objet de l' invention.
La fermentation peut se faite sur une petite échelle, avec le stéroïde, le composé S ou un dérivé approprié du composé S comme support et l'extrait total du mélange de fermentation peut être concentré et soumis à l'essai au papier chromatographique. En'utilisant des échantillons connus du composé S, du composé F ou d'autres produits apparentés, à titre de comparaison, il est possible de déterminer si le micro-organisme choisi convient au procédé en question.
Des chromatogrammes décroissants sur papier, obtenus à l'aide de papier traité avec une solution à 35 % de glycol propylénique et développé
<Desc/Clms Page number 5>
avec un mélange de 78 volumes de toluène et 22 vplumes de dioxane, peuvent être utilisés pour l'évaluation rapide de diverses souches des micro-organis- mes préférés. Une telle séparation peut être terminée en une période aussi courte nue trois heures et le chromatogramme sur papier, après avoir été séché, peut être examiné avec de la lumière ultra-violette pour déterminer la position des diverses matières, telles que les composés S et F, par leur fluorescence. Les zones, dans lesquelles les diverses substances se présen- tent, peuvent être marquées et découpées dans la feuille ou bande de papier.
La matière peut ensuite être récupérée à l'aide d'un solvant, tel que l' éthanol, et obtenue sous la forme d'une matière solide et pratiquement pure par évaporation, Une analyse quantitative d'un mélange de ce genre peut être faite de cette manière. La quantité des produits peut être déterminée, par exemple, en mesurant le spectre d'absorption par l'ultra-violet de solutions de ces matiàres. Particulièrement utiles sont les caractéristiques d' absorption de ces composés quand ils sont dissous dans l'acide sulfurique concentré.
Aprss séparation des produits de réaction par chromatographie à l'aide d'une colonne, les fractions désirées peùvent être mélangées et concentrées jusqu'à avoir un petit volume. Le produit peut ensuite être cristallisé hors d'un solvant approprié, tel que l'acétate d'éthyle. Un produit, préparé par l'application du procédé en question, peut être comparé à des échantillons d'un composé F authentique et on a constaté qu'ils sont identiques à tous les points de vue. Le corticostérone, préparé par le procédé selon l'invention, a également été comparé à un échantillon normalisé et on a constaté qu'il est identique à celui-ci.
Les exemples ci-dessous sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif ni restrictif. En effet, des modes de réalisation de l'invention, apparemment très différents entre eux, peuvent être' envisa- gés sans sortir des limites de protection de l'invention.
EXEMPLE I.-
Une culture d'un organisme, provenant de la collection de culture du Quatermaster Corps à Philadelphie et désignée par eux comme étant le Curvularia falcata QM120h, a été propagé sur un milieu de culture à l' agar. La société demanderesse a établi que cet organisme appartient à l'espèce C. lunata plutôt qu'à l'espèce C. falcata et pour cette raison elle le désignera ci-après par Curvularia lunata (QM120h), Une culture vivante de cet organisme a été déposée à 'la Fermentation Division of the Northern Régional esearch Laboratory à Peoria (Illinois) et a été ajoutée à sa col- lection permanente de micro-organismes sous la désignation NRRL 2380.
L'organisme est séparé, par rinçage, de la souche d'agar dans des conditions stériles et dans un milieu stérile ayant la composition suivante
EMI5.1
<tb>
<tb> extrait <SEP> de <SEP> malt <SEP> 5 <SEP>
<tb> sucrose <SEP> 1 <SEP> %
<tb> nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,2 <SEP> % <SEP>
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb> sulfate <SEP> ferreux <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05 <SEP> % <SEP>
<tb> biphosphate <SEP> acide <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> % <SEP>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> réglée <SEP> pour <SEP> un <SEP> pH=
<tb> 7. <SEP> 0 <SEP> avec <SEP> de <SEP> la <SEP> potasse <SEP> caustique
<tb> restant.
<tb>
Cent millilitres de ce milieu sont versés dans chacun de plusieurs flacons de trois cents millilitres. A chaque flacon on ajoute 50 mg
<Desc/Clms Page number 6>
de composé S dissous dans un petit volume d'acétone. Pendant ces opérations, le mélange de fermentation est maintenu à des conditions stériles. Le mélange est ensuite agité pendant une période de sept jours à une température d'en vioron 28 . Les contenus de flacons sont mélangés et le mélange est extrait avec plusieurs portions de bichlorure d'éthylène en se servant chaque fois d'un cinquième du volume de la phase aqueuse. Le mélange des extraits au bichlorure d'éthylène est séché sur du sulfate de sodium anhydre et, après que le produit dessicateur a été enlevé, on sépare la solvant sous vide.
La solution est concentrée jusqu'à avoir un volume de 1 à 2 ml et un échantillon de cette solution est soumis à la chromatographie au papier en se servant d'un premier système de solvants contenant 50% en volume d'éther et 50% en volume d'hexane et d'un second système de solvants formé par un mélange eau-benzène. On a constaté que le produit contient le composé F en comparant des chromatogrammes sur papier avec un échantillon d'un composé F authentique, utilisé com'ne repàre.
On a également obtenu des indications au sujet de la présence de produits plus fortement oxygénés.
Le concentrat au dichlorure d'éthylène est placé sur une colonne chromatographique constituée par du gel de silice mélangé avec un petit volume d'éthanol (un ml de solvant par g de gel de silice). La colonne est amplifiée à l'aide d'un mélange de 97 volumes de chlorure de méthylène et 3 volumes d'éthanol à 95 %. Le produit. fourni par la colonne, est recueilli sous la forme de petites fractions, ayant un même volume, qui sont examinées périodiquement à l'aide de papier chromatographique afin de séparer les fractions contenant le produit désiré. Toutes ces fractions sont combinées et concentrées sous vide jusqu'à siccité pour obtenir le produit solide.
On a constaté que ce produit est le composé F eh le comparant à un échantil- lon connu dé la même matière.
EXEMPLE II.-
Une culture de Curvularia lunata (QM 120h) est cultivée dans des flacons contenant le même milieu que celui décrit dans l'exemple I. Cent ml de cet inoculum sont ajoutés à deux litres du milieu suivant :
EMI6.1
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> 1%
<tb> Tryptone <SEP> Difco <SEP> 1%
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,2%
<tb> Biphosphate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> hydrogéné <SEP> 0,1%
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb> Sulfate <SEP> ferreux <SEP> heptahydraté <SEP> 0,001%
<tb>
Le pH de ce mélange est rendu égal à 7 avec de l'acide sulfurique et 0,25 % de carbonate de calcium sont ajoutés avant que le mélange soit stérilisé.
Le milieu inoculé est aéré avec un débit d'environ 0,5 à 1 volume d'air par volume de solution et par minute à 27 -28 pendant 24 heures. Pendant cette période, le mélange est agité à une vitesse d'environ 1700 t/m. Un demi-gramme du composé S, à l'état d'alcool, est dissous dans 20 ml d'éthanol à 95%. La solution est ajoutée au mélange de fermentation dans des conditions stériles. La réaction est ensuite poursuivie pendant encore 24 heures exactement dans les mêmes conditions que celles décrites plus haut.
La totalité du mélange de fermentation est sortie de la cuve de fermentation. Le mélange est extrait deux fois avec un volume égal de bichlorure d'éthylène à 70 . Les extraits sont mélangés et évaporés jusqu'à siccité. Les matières solides sèches sont dissoutes dans un petit volume de chlorure de méthylène et la solution est ajoutée à une colonne de gel de
<Desc/Clms Page number 7>
silice.. Cette colonne a été préparée préalablement en traitant chaque gramme de gel de sil@@ avec 1 ml d'éthanol à 95%. Ce mélange est mis en suspension dans du chlorure de méthylène et est versé dans une colonne chromatographi- que. Après que le mélange stéroïde a été introduit dans la colonne, il est lavé avec plusieurs portions de chlorure de méthylène, pour enlever les graisses et les pigments.
La colonne est ensuite amplifiée en y ajoutant un mélange de 97 volumes de chlorure de méthylène et 3 volumes d'éthanol. Le produit récupéré est subdivisé en une série de petites fractions. Des portions de cellesci sont analysées par chromatographie au papier et les fractions, contenant le même composée sont combinées. On a constaté que la matière, qui sort en premier lieu de la colonne, est le composé S récupéré. Cette matière peut être isolée et récupérée à nouveau. La matière, qui quitte la colonne en deu- xième lieu, est un stéroide non identifié.
La matière, quittant la colonne en troisième lieu, .peut être récupérée et on constate qu'il s'agit du composé F. En séparant le solvant des fractions mélangées contenant le composé F, on obtient un rendement dépassant 35 % d'un produit sec qui peut être facilement purifié davantage.
EXEMPLE III.-
Une culture de Curvularia lunata (QM 120h), comme celle utilisée pour l'exemple I, est cultivée sur le même milieu que celui décrit dans l' exemple I dans des conditions aérobiques. Le mycelium, fourni par deux litres de ce mélange et obtenu après une croissance de 22 heures, est filtré, il est lavé avec un petit volume d'eau distillée et est ensuite mis en suspension dans deux litres d'eau distillée.
On ajoute un demi-gramme de composé S à ce mélange. Cette préparation est agitée et aérée avec un débit d'un demi-volume d'air par volume du mélange et par minute pendant 16 heures. Le mélange est ensuite extrait trois fois avec un demi-volume de chloroforme. Le mélange des extraits au chloroforme est concentré jusqu'à avoir un petit volume et le mélange des stéroïdes est purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice.
On obtient un rendement d'environ 35 % en composé F. pur. En outre, environ 10% du composé S, utilisé comme matière initiale, sont récupérés à l'état pur.
EXEMPLE IV.-
Une culture, fournie par les Philadelphia Laboratories du Quartermaster Corps sous la désignation Curvularia sp. QM 371d, est cultivée dans des flacons dans des conditions aérobiques sur le milieu décrit dans l'exemple I. Cet organisme a maintenant été définitivement déterminé comme appartenant à l'espèce C. pallescens et sera donc désigné spécifiquement ci-après comme étant'la Curvularia pallescens (QM 371d). Une culture vivante de cet organisme a été déposée à la Fermentation Division of the Northern Régional Research Laboratory à Peoria (Illinois) et a été ajoutée à sa collection permanente de micro-organismes sous le n NRRL-2381. Après une croissance pendant 24 heures, on utilise 100 ml de ce mélange pour ensemencer deux litres du milieu décrit dans 1''exemple II.
Après que le mélange de deux litres a continué à croître dans des conditoons aérobiques et pendant 24 heures, on ajoute un demi-gramme du composé S en mélange de fermentation dans des conditions stériles. Le mélange est agité à 28 pendant encore 20 heures en étant aéré et dans toute sa masse. Le mélange est sorti du récipient dans lequel la fermentation a eu lieu et est extrait trois fois, avec un demi-volume de chloroforme ,chaque fois. Les extraits sont mélangés et concen- tres jusqu'à avoir un petit volume. Le mélange est alors plané sur une co- lonne de gel de silice qui a été préparée de la manière indiquée plus haut.
La colonne de gel de silice est lavée avec du chlorure de méthylène et est ensuite amplifiée avec une solution d'éthanol dans du chlorure de méthylène.
A partir de la colonne, on récupère un peu de la matière initiale formée par le composé S ainsi que le produit 11- ss-oxygéné constituant le composé F. Le produit isolé est purifié et son point de fusion, ainsi que ses autres
<Desc/Clms Page number 8>
propriétés physiques, sont comparés à ceux d'un échantillon synthétique pur.
On constate que ces matières sont identiques. Par ailleurs, le composé F, préparé de cette manière, est essayé en ce qui concerne son activité pour la teneur en glycogène de l'organisme de souris adrénalectomisées. On a cônsta- té qu'il est très efficace, ce qui est une -autre preuve de la nature du produit.
EXEMPLE V.-
Une culture de Curvularia lunata (QM 120h) est cultivée comme décrit dans l'exemple I excepté que l'on utilise du desoxycorticostérone à la place du composé S. Quand la fermentation est terminée, le produit brut est extrait à l'aide de méthyl isobutyl cétone et le solvant est ensuite enlevé sous vide. Le produit résiduel est essayé en ce qui concerne son activité pour la teneur en glycogène du foie de souris adrénalectomisées et le résultat positif montre l'introduction d'un 11- ss -hydroxyle dans le stéroïde. La purification par chromatmgraphie sur colonne, comme décrite plus haut, donne un rendement approximatif de '28 % en un composé cristallisé et on constate qu'il s'agit du corticostérone par ses constantes physiques.
REVENDICATIONS .-
1.- Procédé pour la 11- -hydroxylation d'un composé stéroïde, dans lequel on met le composé stéroïde en contact avec la partie active oxygénante d'un organisme choisi parmi ceux faisant partie du genre Curvularia.