Procédé de préparation de stéroïdes 11p-hydroxylés L'invention est relative à un procédé pour convertir un stéroïde non substitué en position 11 en dérivé 11(3-hydroxylé de ce stéroïde à l'aide de cultures choisies de micro-organismes.
La préparation de composés stéroïdes hydroxylés à la position 11 du noyau est très désirable et il est souvent difficile d'en obtenir la synthèse. Certains composés biologiquement actifs, notamment le composé F de Kendall (17a-hydroxy-corticostérone) et le composé E de Kendall (17a-hydroxy-11-déhydro-cortico- stérone) appartiennent à ce groupe de com posés.
Le composé S de Reichstein (17a-hydroxy- 11-désoxy-corticostérone) peut être préparé suivant certaines méthodes connues en partant de matières initiales facilement disponibles, tel les que des stérols de fèves de soja et d'autres substances de ce genre. La conversion dudit composé S de Reichstein en composé F de Ken dall est une application importante du procédé selon l'invention ; elle peut se faire plus aisé ment et d'une manière relativement économi que, comparativement aux méthodes chimi ques.
D'autres méthodes ont été proposées pour convertir ledit composé S en composé F à l'aide de micro-organismes différents de ceux décrits ci-dessous et utilisés pour le procédé faisant l'objet de l'invention. Dans le brevet suisse No 322066, on a décrit, à cet effet, l'uti lisation de certains micro-organismes du genre Curvularia. Dans le brevet USA No 2602769, accordé le 8 juillet 1952, on propose l'usage du Cunninghamella blakesleena, et dans le Journal of the American Chemical Society (Vol. 74, p.
2381, 1952) on cite, à cet effet, l'usage du Streptomyces fradiae.
On a découvert maintenant qu'on peut convertir un stéroïde non substitué en position 11 en dérivé 11(3-hydroxylé de ce stéroïde si l'on met le stéroïde en contact avec des enzy mes oxydantes produites par un micro-orga nisme Pycnosporium, espèce QM <I>703,</I> ou ses mutantes.
Le genre Pycnosporium est de l'or dre des Sphaeropsidales qui appartient à la classe des Fungi Imperfecti. On peut se pro curer l'organisme particulier, qui s'est montré comme étant extrêmement avantageux, auprès du Philadelphia Quartermaster Corps, Dépôt de l'armée américaine, sous le numéro de culture QM <I>703.</I> Il est à noter que l'on peut utiliser non seulement les organismes qui cor respondent exactement à la description du QM <I>703,
</I> mais également les espèces mutantes de ces organismes.
On a découvert, en mettant en contact un composé stéroïde non substitué en position 11 avec des cultures vivantes de Pycnosporium de l'espèce QM <I>703</I> ou avec des extraits appro priés ou des mycèles de cet organisme, que le composé stéroïde est converti en un dérivé 11P-hydroxylé de ce stéroïde. La réaction con vient particulièrement bien à la conversion du composé S ou de ses mono- ou di-esters (par exemple le di-acétate ou le 17- ou 21-mono- acétate) en composé F.
En général, la réaction doit se faire dans des conditions d'aérobiose. Si l'organisme est cultivé dans des solutions nutritives et si le substratum du stéroïde est ajouté au début de la croissance du micro organisme ou après que la croissance a débuté, on obtient une conversion rapide du stéroïde en un dérivé 11 [3-hydroxylé de ce stéroïde.
Une variété de stéroïdes peut être utilisée comme matière initiale pour le procédé selon l'invention. Ces composés peuvent comporter des substituants en diverses positions du noyau tels que des chaînes latérales en position 17 et des groupements céto ou hydroxyle, ou des groupements hydroxyle protégés en position 3. Des doubles liaisons peuvent être présentes dans le noyau, par exemple en position 3 (4) ou 5 (6).
Le rendement en dérivé 11(3-hy- droxylé obtenu par le procédé varie jusqu'à un certain degré avec la nature du stéroïde utilisé, avec les conditions choisies pour la réaction, telles que la température, la durée, le<I>pH,</I> le milieu nutritif et le moment auquel le composé est ajouté au milieu. Toutefois, ces diverses conditions peuvent être réglées et les conditions optima peuvent être déterminées, pour un sté roïde donné, par un minimum d'essais usuels.
La fermentation sous des conditions d'aéro biose à une température d'environ 25-30o pen dant au moins un jour environ après l'addition du stéroïde, et l'usage d'un milieu fournissant des hydrates de carbone, des matières favo risant la croissance, une source d'azote et des sels inorganiques, sont particulièrement favo rables.
Les produits obtenus par le procédé peu vent être analysés aisément, par exemple à l'aide des méthodes utilisant du papier chroma- tographique. Cette analyse permet l'étude de la variation des conditions sur une petite échelle puisque des échantillons très petits des produits peuvent être analysés de la manière en question. Des méthodes de ce genre sont déjà connues et des détails à leur sujet sont indiqués dans le brevet USA No 2602769, dont il est question plus haut, et dans un article de Shull et autres publié dans la revue des Archives of Bioehemistry, Vol. 37; p. 186, 1952.
Diverses matières peuvent faire partie du milieu nutritif utilisé pour la culture de l'espèce Pycnosporium dont on se sert pour le procédé. Les matières nutritives comprennent les hy drates de carbone, tels que le glucose, le sac charose, le maltose et d'autres sucres et ami dons. Des matières industrielles, connues comme contenant des substances nutritives tel les que la farine de soja, la farine d'arachides, les liqueurs de macération de maïs et d'autres substances de ce genre, peuvent également être utilisées avec avantage. Divers sels, y compris des nitrates, des sulfates et des phosphates, ainsi que des composés métalliques, tels que des composés du potassium, du sodium et du magnésium, peuvent être utilisés pour former des constituants supplémentaires du milieu.
En général, on préfère que la fermentation ait lieu à une température d'environ 24 à 30 . La crois sance du micro-organisme se fait généralement en un à trois jours. Comme indiqué plus haut, le stéroïde peut être ajouté quand la fermenta tion débute ou il peut être ajouté après que la croissance a nettement commencé, par exem ple après 16 à 24 heures. Suivant une variante, on peut enlever le mycélium formé pendant la croissance du micro-organisme dans le milieu nutritif, on peut le laver à l'eau, si on le désire, ou le remettre en suspension dans de l'eau con tenant le stéroïde. Une agitation de ce mélange en présence d'air donne lieu à la formation du stéroïde hydroxylé désiré.
Les 11 [3-hydroxy-stéroïdes fôrmés confor mément à l'invention peuvent être isolés par plusieurs méthodes différentes. La méthode la plus avantageuse est l'extraction du mélange de fermentation contenant le produit à l'aide de certains solvants non miscibles à l'eau. Parti- culièrement utiles sont les hydrocarbures infé rieurs halogénés, tels que le chloroforme, le chlorure de méthylène, le chlorure d'éthylène, etc.
D'autres solvants non miscibles à l'eau, tels que des alcools aliphatiques comme le butanol, le pentanol, etc., des cétones telles que la mé- thyl-isobutyl-cétone, et des esters tels que l'acé tate de butyle, peuvent être utilisés à cet effet. Les extraits obtenus de cette manière peuvent être concentrés jusqu'à siccité pour obtenir un produit brut solide. Toutefois, dans de nom breux cas, il peut être désirable de purifier da vantage ce produit, par exemple par recristalli- sation hors d'un solvant approprié, tels que des hydrocarbures halogénés inférieurs, des alcools inférieurs et des esters.
Suivant une variante, le produit peut être soumis à une purification par des méthodes telles que la chromatographie. L'usage des colonnes contenant un gel de silice traité avec un alcool inférieur, tel que l'éthanol (l'usage d'un gramme d'éthanol par gramme de gel de silice convient très bien) est particuliè rement efficace. Le produit peut être amené sur une colonne chromatographique, en solution dans un hydrocarbure aliphatique halogéné in férieur et la colonne peut ensuite être dévelop pée avec des quantités additionnelles du même solvant ou d'un solvant similaire contenant une proportion minime, par exemple de 1 à 5 0/0, d'un alcool aliphatique inférieur (méthanol ou éthanol).
On constate souvent qu'une partie de la matière initiale n'est pas convertie pendant le procédé usuel. Cette partie peut être récu pérée hors de la colonne et peut être utilisée dans d'autres préparations. Le produit peut ensuite être obtenu en le lavant avec un solvant, tel qu'indiqué plus haut, en choisissant des fractions appropriées, par une analyse à l'aide de papier chromatographique. La concentration des solutions du produit procure un produit purifié solide, généralement à l'état cristallisé et avec une grande pureté. Certains sous- produits peuvent être formés par la réaction et ceux-ci peuvent être séparés par la méthode de chromatographie sur colonne.
Ces sous-pro duits contiennent parfois certains autres com posés plus fortement oxydés. En général, des rendements d'au moins 25 % environ ou plus élevés peuvent être obtenus, pour le produit hydroxylé désiré, à l'aide du procédé faisant l'objet de l'invention.
<I>Exemple 1</I> Une culture du micro-organisme de l'es pèce Pycnosporium QM <I>703</I> a été cultivée dans des éprouvettes sur un milieu de culture à base d'agar. L'organisme est séparé, par rinçage, de la souche d'agar dans des conditions stériles et est cultivé dans un milieu stérile ayant la com position suivante extrait de malt . . . . . . . 5 % saccharose . . . . . . . . 1 nitrate de sodium. . . . . . . 0,2 chlorure de potassium . . . . .
0,05 sulfate de magnésium heptahydraté . 0,05 sulfate ferreux heptahydraté . . . 0,05 diphosphate acide de potassium . . 0,1 eau distillée, le<I>pH</I> du mélange est réglé à 7,0 avec du KOH.
Des portions de 100 ml de ce milieu sont versées dans des flacons de 300 ml. Le contenu d'un flacon, après une croissance de 7 jours, est ajouté à deux litres d'un milieu stérile ayant la composition suivante saccharose . . . . . . . . 1% tryptone Difco . . . . . . . 1 nitrate de sodium . . . . . . 0,2 biphosphate acide de potassium . 0,1 sulfate de magnésium heptahydraté. 0,05 chlorure de potassium . . . . 0,05 sulfate ferreux heptahydraté . . .
0,001 le<I>pH</I> de ce mélange est réglé à 7,0 à l'aide d'acide sulfurique.
On ajoute 0,25 % de carbonate de calcium avant que le mélange soit stérilisé.
Au milieu inoculé on ajoute 0,5 g de composé S dissous dans 20 ml d'éthanol à 95 %. Le mélange est ensuite aéré avec un débit d'environ 1 volume d'air par volume de solution et par minute, à environ 28(l, pendant 24 heures. Un agitateur mécanique, fonctionnant à environ 1500 t/min., travaille dans la cuve de fermentation. La fer mentation est poursuivie pendant 24 heures.
L'ensemble du bouillon de fermentation et du mycélium est sorti de la cuve et est extrait trois fois avec un tiers en volume de chlorure de méthylène. Les phases organiques sont mé langées, filtrées et concentrées sous vide jusqu'à avoir un volume de quelques millilitres.
La so lution est amenée sur une colonne contenant du gel de silice préparé en traitant du gel de silice anhydre avec un millilitre d'éthanol à 95 % par gramme de matière solide. La co- lonne de gel de silice, contenant les stéroïdes,
est développée à l'aide d'une solution de trois volumes d'éthanol à 95 % dans 97 volumes de chlorure de méthylène. Des portions de la ma tière, prélevées dans la colonne, sont analysées à des intervalles réguliers par chromatographie sur papier. La première fraction, fournie par la colonne, est un peu du composé S récupéré. Une solution de cette fraction est concentrée jusqu'à ce qu'on obtienne le composé S à l'état solide pour être utilisé à nouveau. Dans les fractions suivantes, on trouve le produit cor respondant au composé F.
Des matières addi tionnelles, qui peuvent être plus fortement oxy dées ou qui sont oxydées à une position diffé rente, sont également formées au cours de la fermentation et sont séparées par purification chromatographique. On obtient un rendement d'environ 27 % en composé F cristallisé, par concentration des produits sélectionnés, fournis par la colonne, et par évaporation jusqu'à sic cité.
Le produit peut être recristallisé dans de l'acétate d'éthyle ou d'autres solvants appro priés et ses propriétés sont identiques aux échantillons normalisés du composé F.
<I>Exemple 2</I> Une culture de l'espèce Pycnosporium QM <I>703</I> est ajoutée à une portion stérile de 100 ml du milieu suivant dans un flacon à 300 ml saccharose . . . . . . . . 1% tryptone Difco . . . . . . . 1 nitrate de sodium . . . . . . 0,2 biphosphate acide de potassium . 0,1 sulfate de magnésium heptahydraté. 0,05 chlorure de potassium . . . . 0,05 sulfate ferreux heptahydraté . . 0,001 Au flacon, on ajoute 50 mg de progesté rone.
Le mélange de fermentation est agité à une température de 280 dans des conditions stériles pendant 7 jours. Le mélange est sorti du flacon et est extrait trois fois avec un demi- volume de dichlorure d'éthylène chauffé à 70(). Les couches de solvant sont mélangées et concentrées sous vide jusqu'à siccité. Les ma tières solides résiduelles sont dissoutes dans un petit volume d'éthanol et un échantillon de cette matière est soumis à la chromatographie sur papier. Cette analyse montre la présence de 11(3-hydroxy-progestérone et celle d'un peu de progestérone n'ayant pas réagi et d'autres pro duits oxydés.
<I>Exemple 3</I> L'expérience décrite dans l'exemple 2 est répétée en utilisant 50 mg de désoxycortico- stérone à la place de la progestérone. Le pro duit obtenu est soumis à la chromatographie sur papier qui montre que la matière initiale a été hydroxylée à la position 11 pour former la corticostérone.