CH627784A5

CH627784A5 - Procede de preparation de nouvelles rifamycines.

Info

Publication number: CH627784A5
Application number: CH1118875A
Authority: CH
Inventors: Richard White; Giancarlo Lancini; Piero Antonini
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1974-08-30
Filing date: 1975-08-29
Publication date: 1982-01-29
Also published as: NO752973L; AT341083B; NL162429C; FI54327B; NL7509998A; ATA639275A; GB1470426A; SU578014A3; AU8392675A; HU173751B; IE42605L; IL47897A; DD119818A5; SE7509571L; NZ178519A; PH13481A; PL97788B1; US4263404A; NL162429B; DK137866C

Description

La présente invention a pour objet un procédé de préparation de nouvelles rifamycines par fermentation de souches mutantes de Streptomyces mediterranei dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies. On appelle désormais ces nouvelles rifamycines la rifamycine P, la rifamycine Q, la rifamycine R et la rifamycine U.

On a rapporté antérieurement que, pendant la fermentation dans des milieux de croissance normaux, Streptomyces mediterranei synthétise une famille d'antibiotiques appelée collectivement le complexe des rifamycines (P. Sensi et al., «Antibiotics Annual», 1959-1960, p. 262). Des travaux ultérieurs ont montré qu'en ajoutant le barbiturate de sodium diéthyle au milieu de culture, il résulte pratiquement la formation d'un seul produit de fermentation, la rifamycine B (Margalith P. et Pagani H., «Applied MIcrobiology»,

9, 325,1961). Selon une nouvelle découverte, on a trouvé une souche mutante de Streptomyces mediterranei qui élabore pratiquement la rifamycine B seulement en présence ou en l'absence de barbiturate de sodium diéthyle dans le milieu de fermentation, de sorte qu'il en 5 résulte un meilleur procédé de préparation de la rifamycine B. On a identifié la souche produisant la rifamycine B comme Streptomyces mediterranei ATCC 21789. Voir le brevet USA N° 3871965.

L'abréviation ATCC désigne l'American Type Culture Collection, 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA. io On prépare les nouvelles substances antibiotiques qui font l'objet de la présente invention au moyen de souches mutantes dérivées de Streptomyces mediterranei ATCC 13 685. On peut obtenir les nouvelles souches en traitant la souche ATCC 13685 accessible au public depuis 1974 avec des agents mutagènes chimiques communs tels que 15 l'acide nitreux ou des dérivés de nitrosoguanidine ou avec des agents mutagènes physiques tels que des rayons X et une radiation UV. On attribue les nouvelles souches mutantes au genre Nocardia plutôt qu'au genre Streptomyces mediterranei selon les propositions de J.E. Thiemann et al, «Arch. Mikrobiol.», 67,147-155 (1969). 20 On décrit maintenant l'isolement des souches ayant subi une mutation et qui produisent les nouvelles rifamycines.

On a traité une suspension de spores de Streptomyces mediterranei ATCC 13685 avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine à raison de 1 mg/ml dans un tampon au tris(hydroxyméthyl) 25 aminométhane à pH = 9,0 pendant 60 min à 28°C. On a alors lavé les spores traitées avec l'agent mutagène et on les a mises en plaque sur des boîtes de Pétri contenant de l'agar-agar de Bennett. Après 14 j d'incubation à 28°C, on a récolté les colonies survivantes et on les a examinées pour leur pouvoir d'inhiber la croissance de Bacillus 30 subtilis de la manière suivante: on a transféré un disque d'agar-agar (diamètre de 4 à 8 mm) portant ime seule colonie sur une boîte de Pétri contenant de l'agar-agar Penassay à pH = 7,2 préalablement ensemencée à 2% (v/v) avec Bacillus subtilis.

Dans ces conditions, la rifamycine B est pratiquement inactive et 35 une colonie normale produisant la rifamycine B ne donne pas d'inhibition de la croissance de Bacillus subtilis dans l'agar-agar sous-jacent, tandis que toute colonie produisant une nouvelle rifamycine avec une activité antimicrobienne cause la formation d'une zone nettement délimitée d'inhibition de la croissance autour du disque 40 d'agar-agar. On a isolé ainsi trois souches et on leur a attribué notre code intérieur: D-2, MM-18-6 et M-36. On a déposé des échantillons de ces micro-organismes avec ATCC où elles sont identifiées respectivement comme Nocardia mediterranea ATCC 31064, Nocardia mediterranea ATCC 31065 et Nocardia mediterranea ATCC 45 31066.

On décrit maintenant une nouvelle souche de Nocardia mediterranea. Le tableau I rapporte les résultats de l'examen macroscopique et microscopique des souches de Nocardia mediterranea identifiées respectivement comme ATCC Nos 31064,31065 et 31066, et le so tableau II rapporte les caractéristiques de culture des mêmes souches de Nocardia mediterranea.

On rapporte aussi les caractéristiques de la souche mère de Streptomyces mediterranei ATCC 13685 (ME/83):

Tableau I

Colonies

Mycélium

Spores

N. mediterranea ATCC 31064 (D-2)

Colonies de structure cratériforme-coniques et enroulées, de 2-3 mm de diamètre, de couleur brun rougeâtre avec un pigment jaune ocre soluble

Grisâtre à rosâtre, ramifié, diamètre de 0,6-0,8 (un

Cylindrique (0,8-1 (jtm x 3,0-5,0 JA)

N. mediterranea ATCC 31065 (MM-18-6)

Colonies de structure cratériforme-coniques et enroulées, de 2-3 mm de diamètre, de couleur orange foncé avec un pigment orange-jaune foncé soluble

Rose à orange clair, ramifié, diamètre de 0,6-0,8 (im

Cylindrique (o,8-l (im x 3,0-5,0 fi)

3

Tableau I (suite)

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Colonies

Mycélium

Spores

N. mediterranea

Colonies de structure cratériforme-coniques et

Rose à orange rosé

Cylindrique

ATCC 31066

enroulées, de 2-3 mm de diamètre, de couleur brun-

ramifié, diamètre

(0,8-1 (im x 3,0-5,0 (i)

(M-36)

orange avec un pigment de couleur ambre soluble de 0,6-0,8 |xm

Streptomyces

Colonies de structure cratériforme-coniques et

Rosâtre, ramifié

Cylindrique mediterranei enroulées, de 2-3 mm de diamètre, de couleur jaune-

diamètre de 0,6-0,8 (im

(0,8-1 [im x 3,0-5,0 (i)

ATCC 13685 ME/83

orange avec un pigment de couleur ambre clair soluble

Tableau II

Milieu

N. mediterranea ATCC 31064 (D-2)

N. mediterranea ATCC 31065 (MM 18-6)

N. mediterranea ATCC 31066 (M-36)

Streptomyces meditarranei ATCC 13685 (ME/83)

Farine d'avoine, agar-agar

Croissance abondante avec une surface légèrement ridée, de couleur brun noisette avec des bords orange. Pigment soluble rose-beige.

Croissance abondante avec une surface lisse orange. Des traces de mycélium aérien rosâtre. Un certain nombre de spores. Pigment soluble rose-beige.

Extrait de levure, glucose —■ agar-agar (milieu N° 2 de Shirling et Gottlieb)

Glucose Emerson -agar-agar

Agar-agar de Bennett

Croissance abondante Croissance abondante avec avec une surface très une surface très ridée, couleur

Agar-agar de Penassay

Extrait de levure— mélasse—agar-agar ridée de couleur ambre. Mycélium aérien grisâtre. Pigment soluble de couleur rouille foncé.

Croissance abondante avec une surface très ridée et coûteuse de couleur rouge brique. Pigment soluble ambre.

Croissance abondante très ridée de couleur brun rougeâtre. Traces de mycélium aérien grisâtre. Pigment soluble ocre-jaune.

Croissance modérée légèrement ridée de couleur orange clair. Pas de pigment soluble.

Croissance abondante très ridée de couleur rouge brique. Pigment soluble de couleur rouille foncé.

rouge brique. Pigment soluble de couleur rouille foncé.

Croissance abondante avec une surface très ridée et croûteuse de couleur rouge brique. Pigment soluble ambre.

Croissance abondante avec une surface très ridée de couleur orange foncé. Pigment soluble jaune foncé.

Croissance modérée légèrement ridée de couleur orange clair. Pas de piment soluble.

Croissance abondante avec une surface très ridée de couleur rouge brique. Pigment soluble de couleur rouille foncé.

Croissance abondante avec une surface lisse couleur ambre foncé. Traces de mycélium aérien rose. Pigment soluble ambre brûlé.

Croissance abondante avec une surface ridée. Mycélium végétatif, couleur ambre brûlé. Pigment soluble de couleur ambre brûlé.

Croissance abondante avec une surface ridée de couleur ambre brûlé. Pigment soluble de couleur ambre brûlé.

Croissance abondante avec une surface ridée de couleur brun orange. Pigment soluble ambre.

Croissance modérée avec une surface lisse et mince de couleur orange clair. Pas de pigment soluble.

Croissance abondante avec une surface croûteuse de couleur ambre brûlé. Pigment soluble ambre brûlé.

Croissance modérée avec une surface lisse de couleur jaunâtre avec le revers rosâtre. Mycélium aérien blanchâtre légèrement teinté de rose. Des traces de pigment soluble jaunâtre.

Croissance abondante avec une surface rugueuse de couleur jaunâtre à rose-orange. Mycélium aérien rosâtre. Pigment soluble ambre pâle.

Bonne croissance de couleur jaunâtre qui devient orange-jaune. Mycélium aérien rosâtre. Pigment soluble ambre clair.

Croissance médiocre.

Croissance abondante avec une surface rugueuse incolore à jaunâtre. Mycélium aérien blanchâtre. Pigment soluble ambre foncé.

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4

Tableau II (suite)

Milieu

N. mediterranea ATCC 31064 (D-2)

N. mediterranea ATCC 31065 (MM 18-6)

N. mediterranea ATCC 31066 (M-36)

Streptomyces meditarranei ATCC 13685 (ME/83)

Saccharose Czapek-Dox — agar-agar

Croissance modérée avec une surface lisse et mince de couleur orange clair. Mycélium aérien rose pâle. Un certain nombre de spores. Pigment soluble jaune citron foncé.

Bonne croissance avec une surface lisse de couleur orange. Mycélium aérien orange clair.

Croissance abondante avec une surface lisse de couleur saumon. Mycélium aérien abondant rose-orange. Des traces de pigment soluble jaune clair.

Croissance peu abondante avec une surface mince incolore à melon clair. Des traces de mycélium aérien blanc rosâtre.

Pomme de terre— agar-agar

Glucose, asparagine, agar-agar

Glycérol, asparagine, agar-agar (milieu N° 5 de Shirling et Gottlieb)

Agar-agar nutritif

Agar-agar de Pridham

Croissance peu abondante de couleur orange clair. Pigment soluble brun noisette clair.

Croissance abondante avec une surface lisse de couleur orange. Pigment soluble jaune clair.

Croissance abondante avec une surface lisse de couleur orange foncé. Des traces de pigment solubles jaunâtre.

Pas de croissance.

Croissance peu abondante avec une surface lisse de couleur orange clair. Pas de pigment soluble.

Croissance peu abondante de couleur orange foncé. Pas de pigment soluble.

Croissance modérée avec une surface ridée et mince de couleur orange clair. Pas de pigment soluble.

Croissance modérée avec une surface lisse. Orange clair. Pas de pigment soluble.

Croissance assez bonne de couleur or. Pas de pigment soluble.

Croissance modérée avec une surface légèrement ridée de couleur orange foncé. Des traces de pigment soluble jaune.

Croissance assez bonne avec une surface lisse et mince de couleur orange. Pas de pigment soluble.

Croissance médiocre avec une surface mince incolore. Des traces de mycélium aérien blanchâtre. Pas de pigment soluble.

Croissance assez bonne avec une surface lisse et mince de couleur rose-orange clair. Une certaine quantité de pigment soluble jaune clair.

Croissance modérée avec une surface lisse de couleur melon à orange. Mycélium aérien blanc rosâtre.

Croissance modérée Croissance abondante avec Croissance abondante Croissance modérée avec avec une surface lisse une surface lisse de couleur légèrement croûteuse une surface lisse incolore et mince de couleur ambre. Mycélium aérien orange rosâtre. Pigment soluble rosâtre.

Amidon — agar- Croissance modérée agar (milieu N° 4 de avec une surface lisse Shirling et Gottlieb) de couleur orange.

Mycélium aérien abondant rose. Production abondante de spores. Pigment soluble jaune. Hydrolyse de l'amidon: négative.

Dextrose—tripone — agar-agar

Croissance abondante avec une surface ridée de couleur melon. Pigment soluble melon orange.

rouge brique. Mycélium aérien rose. Pigment soluble jaune.

Croissance modérée avec une surface lisse de couleur orange foncé. Traces de pigment soluble de couleur paille. Hydrolyse de l'amidon: négative.

Croissance modérée ridée de couleur orange. Pigment soluble jaune-orange.

de couleur brun ambre. Des traces de mycélium aérien rosâtre. Pigment soluble brun ambre.

Croissance abondante avec une surface lisse de couleur orange. Des traces de mycélium aérien rosâtre.

Pigment soluble jaune clair. Hydrolyse de l'amidon: négative.

avec des tâches de couleur rouge homard. Mycélium aérien rose.

Croissance médiocre incolore à rose-orange clair. Mycélium aérien blanc peu abondant. Hydrolyse de l'amidon: douteuse.

Croissance abondante Croissance abondante de avec une surface ridée couleur orange-rose,

de couleur melon rose. Mycélium aérien rosâtre. Pigment soluble melon Pigment soluble jaune rose. d'or clair.

5

Tableau II (suite)

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Milieu

N. mediterranea ATCC 31064 (D-2)

N. mediterranea ATCC 31065 (MM 18-6)

N. mediterranea ATCC 31066 (M-36)

Streptomyces meditarranei ATCC 13685 (ME/83)

Cobalt — agar-agar de Hickey et Tresner

Tyrosine — agar-agar (milieu N° 7 de Shirling et Gottlieb)

Malate de Ca -agar-agar

Albumine d'ceuf— agar-agar

Peptone — glucose — agar-agar

Gelatine

Nitrate — bouillon Tournesol — lait

Peptone — extrait de levure — fer—agar-agar (milieu N° 6 de Shirling et Gottlieb)

Croissance modérée avec une surface lisse et mince incolore. Mycélium aérien blanchâtre. Pigment soluble beige.

Croissance abondante très ridée et croûteuse de couleur rouge brique. Pigment soluble jaune foncé. Réaction à la tyrosine: positive (bonne).

Croissance très peu abondante avec une surface lisse et mince de couleur jaune-orange clair. Pigment soluble jaune citron-chrome près de la croissance et rose corail dans le milieu. Hydrolyse: positive.

Croissance abondante avec une surface de couleur orange clair. Pigment soluble jaune clair.

Croissance abondante légèrement ridée de couleur orange foncé. Mycélium aérien rosâtre. Pigment soluble jaune.

Hydrolyse: positive.

Réduction: négative.

Pas de coagulation, pas de peptonisation.

Croissance modérée avec une surface lisse de couleur orange clair. Production de H2S: négative.

Milieu de Lœffler — sérum sanguin

H20 + agar-agar — Difco à 2%

Croissance abondante avec une surface lisse de couleur melon rose. Pigment soluble rose-beige clair.

Croissance abondante très ridée et croûteuse de couleur orange foncé. Pigment soluble de couleur tan rosâtre. Réaction de la tyrosine: fortement positive.

Croissance très peu abondante de couleur jaune clair. Hydrolyse du malate de Ca: négative.

Croissance abondante avec une surface lisse de couleur orange. Pas de pigment soluble.

Croissance abondante ridée de couleur orange foncé. Pigment soluble jaune or.

Hydrolyse: positive.

Réduction: négative.

Pas de coagulation, pas de peptonisation.

Croissance modérée avec une surface lisse de couleur orange pâle. Production de H2S: négative.

Tampon de pomme Croissance peu de terre abondante de couleur orange.

Pas de croissance.

Croissance peu abondante, incolore. Traces de mycélium aérien blanc. Production abondante de spores.

Croissance modérée avec une surface légèrement ridée de couleur melon rose. Pigment soluble beige clair.

Croissance abondante avec une surface croûteuse de couleur orange brûlé foncé. Pigment soluble ocre-jaune. Réaction de la tyrosine: fortement positive.

Croissance médiocre de couleur orange clair. Pas de pigment soluble. Digestion du malate de Ca: négative.

Bonne croissance avec une surface lisse de couleur jaune-orange. Pigment soluble jaune clair.

Croissance abondante avec une surface ridée de couleur ambre brûlé. Pigment soluble ambre brûlé.

Hydrolyse: positive.

Réduction: négative.

Pas de coagulation, pas de peptonisation.

Croissance médiocre avec une surface lisse incolore. Pas de pigment soluble. Production de H2S: négative.

Croissance médiocre

Croissance très peu abondante de couleur orange, de couleur orange clair.

Pas de croissance.

Croissance peu abondante incolore. Des traces de mycélium aérien blanc. Production abondante de spores.

Pas de croissance.

Croissance modérée de couleur orange rosâtre clair. Une certaine quantité de mycélium aérien rosâtre. Pigment soluble jaunâtre.

Croissance médiocre.

Croissance assez bonne incolore. Mycélium aérien rose blanchâtre. Digestion partielle du malate de Ca.

Croissance assez bonne de couleur rose.

Hydrolyse: positive.

Réduction: négative.

Pas de coagulation, pas de peptonisation.

Croissance médiocre incolore.

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Tableau //(suite)

Milieu N. mediterranea

N. mediterranea

Streptomyces meditarranei

ATCC 31064 (D-2)

ATCC 31065 (MM 18-6)

ATCC 31066 (M-36)

ATCC 13685 (ME/83)

Lait écrémé — agar- Croissance abondante

Bonne croissance, légèrement

Croissance abondante

agar avec une surface lisse ridée de couleur orange avec avec une surface ridée

de couleur orange.

une ombre brune. Pigment de couleur orange.

Pigment soluble de soluble brun noisette.

Pigment soluble brun-

couleur jaune

Hydrolyse de la caséine:

or. Hydrolyse de la

cadmium. Hydrolyse bonne.

caséine: fortement

de la caséine: bonne.

positive.

Shirling and Gottlieb: «Methods for characterization of Streptomyces species», «Intern. J. Syst. Bact.», 16, 313-338 (1966).

Tableau III

Le tableau III rapporte les caractéristiques physiologiques des nouvelles souches de Nocardia comparées à celles de la souche mère.

N. mediterranea (D-2)

N. mediterranea (MM 18-6)

N. mediterranea (M-36)

Streptomyces meditarranei (ME/83)

Hydrolyse de l'amidon

-

±

Hydrolyse de la tyrosine

+ +

+ + +

—

Hydrolyse de la caséine

+ +

+ + +

Hydrolyse du malate de Ca

+ +

—

+

Réduction du nitrate

-

Tournesol — lait

Pas de coagulation, pas de peptonisation.

Liquéfaction de la gélatine

+ +

+

Le tableau IV rapporte l'utilisation des souches de carbone examinées selon la méthode de Pridham et Gottlieb (J. Bact.», 56, 107, 1948).

Tableau IV

N. mediterranea (D-2)

N. mediterranea (MM 18-6)

N. mediterranea (M-36)

Streptomyces meditarranei (ME/83)

Arabinose

+

+ + +

+ +

+ + +

Xylose

+

+ +

Glucose

+ +

+ + +

+ +

Mannose

+

+ +

Fructose

+ +

+ + +

+ +

Lactose

+

+ + +

+ +

Saccharose

+

±

+ +

Inositol

+

+ +

Rhamnose

+

+ +

Rafïinose

-

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Tableau IV (suite)

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N. mediterranea (D-2)

N. mediterranea (MM 18-6)

N. mediterranea (M-36)

Streptomyces meditarranei (ME/83)

Salicine

±

+

Mannitol

+ +

+ + +

+ +

Glycine

+

±

+

-

Sorbitol

-

Succinate de Na

-

+

Citrate de Na

-

Acétate de Na

-

Inuline

+

-

Dulcitol

-

Cellulose

-

Maltose

+ +

+ + +

+ +

+

Galactose

+

+ +

+ + +

Glycérol

+ +

+ + +

+ +

+ + +

Le procédé de fermentation consiste essentiellement à cultiver un desdits mutants de Streptomyces mediterranei dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote assimilables et des sels 30 minéraux essentiels, jusqu'à ce qu'une activité antibiotique importante soit communiquée audit milieu, puis à extraire les rifamycines du milieu. Plus particulièrement, on cultive ces mutants dans des conditions submergées agitées et aérées à une température comprise entre 25 et 37°C, et de préférence à 28°C. Comme source de carbone, 35 on peut utiliser les hydrates de carbone et les dérivés du carbone suivants: le glucose, le galactose, le lactose, le saccharose, le maltose, le glycérol, le mannitol, etc. Des sources d'azote utiles sont par exemple des aminoacides et leurs mélanges, des peptides, des protéines et leurs hydrolysats tels que la peptone, un extrait de «o levure, de la farine de graines de soya, la liqueur corn steep, des substances solubles des poissons, des extraits de viande, des fractions aqueuses provenant des graines de céréale. On peut conduire la fermentation pendant 180 à 220 h. Le pH de départ qu'on ajuste généralement à environ 6,4 à 6,6 augmente à la fin de la fermentation « jusqu'à 7,0 à 8,5. En général, on observe les meilleurs résultats après 200 h de fermentation. A la fin de la fermentation, on peut isoler les rifamycines par le procédé suivant. On filtre le milieu de fermentation au pH final de 7,0 à 8,5. On acidifie rapidement le filtrat, de préférence jusqu'à un pH inférieur à environ 5 pour assurer la so meilleure stabilité pour la substance antibiotique. On extrait l'activité avec des solvants non miscibles à l'eau tels que le chloroforme, le butanol, l'acétate d'éthyle, de propyle, de butyle ou d'amyle. Le rapport entre le volume du milieu et celui du solvant change suivant le solvant choisi: en général, on utilise un rapport compris entre 2:1 55 et 10:1.

Le mycélium contient encore une activité microbiologique qu'on extrait de celui-ci au moyen d'un solvant non miscible à l'eau, puis on le réunit avec la phase organique qui contient déjà la majeure partie des rifamycines. Selon une variante, on peut conduire l'extraction de «> l'activité du mycélium au moyen d'un solvant miscible à l'eau tel que l'acétone. Dans ce cas, on filtre le liquide, on évapore l'acétone sous vide, on extrait les rifamycines avec un solvant non miscible, à l'eau puis on conduit le procédé comme indiqué plus haut.

Lorsque la majeure partie de l'activité antibiotique a été transfé- 65 rée dans le solvant, on distille celui-ci sous vide à sec de préférence à une température inférieure à 30° C.

On peut purifier l'extrait brut des rifamycines par Chromatographie sur une colonne de Silicagel. Avant la Chromatographie, il est commode de dissoudre l'extrait brut dans un tampon au phosphate ayant un pH de 7,0 à 8,0, puis de traiter avec un agent d'oxydation doux. On extrait alors la solution tampon avec un solvant non miscible à l'eau; cet extrait organique contient une nouvelle rifamycine appelée la rifamycine R. On acidifie la solution tampon extraite jusqu'à pH = 2-4, puis on l'extrait de nouveau avec un solvant non miscible à l'eau. Cet extrait organique contient trois nouveaux composés de la famille des rifamycines, qu'on appelle rifamycine P, QetU.

Une nouvelle purification de la rifamycine R est effectuée par Chromatographie sur une colonne de matière adsorbante appropriée telle que le Silicagel suivi de l'élution avec un mélange approprié de solvants organiques.

On purifie le deuxième extrait organique contenant les rifamycines P, Q et U de manière analogue à ce qui est décrit pour la rifamycine R.

Les exemples suivants illustrent l'invention.

Exemple 1:

On cultive les souches mutantes identifiées comme Nocardia mediterranea ATCC 31064 sur de l'agar-agar de Bennett, puis on l'incube à 28°C pendant 6 à 8 j.

Avec la culture obtenue à partir de la culture oblique d'agar-agar, on inocule deux flacons Erlenmeyer de 500 ml dans des conditions stériles. Les flacons contiennent 100 ml du milieu végétatif de composition suivante:

extrait de bœuf extrait de levure peptone hydrolysat de caséine glucose

NaCl

H20 jusqu'à

5g 5g 5g 3g

20 g 1,5 g 11

On ajuste le pH jusqu'à 7,3 avec NaOH.

On place les flacons ainsi inoculés sur un appareil alternatif à secouer à 28°C pendant 72 h. On utilise le contenu des deux flacons Erlenmeyer comme inoculum en le versant dans un préfermentateur de 101 contenant 41 du milieu végétatif précité. On conduit l'incubation à 28°C en agitant à 300 t/min et avec une aération de

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8

1 v/v/m. Après 48 h de croissance on obtient un volume de 7 à 10% de cellules tassées. Au stade suivant, on utilise un fermentateur en verre de 101 contenant 41 du milieu de fermentation ci-après:

farine d'arachide

25 g farine de graines de soya

5g

(NH4)2S04

9,5 g

MgS04-7H20

0,85 g glucose

95 g glycérol

40 g

KH2P04

1 g propylèneglycol

5g

CaC03

8,5 g diéthylbarbiturate de Na

1,7 g

CuS04-5H20

2,8 mg

FeS04-7H20

8,5 mg

ZnS04-7H20

42,5 mg

MnS04-4H20

3,4 mg

CaCl2-6H20

1,7 mg

(NH4)6Mo7024 • 4H 20

0,85 mg

H20 jusqu'à

11

On ajuste le pH à 7,8 avec NaOH. On stérilise pendant 60 min à 120'C. Après la stérilisation, le pH est égal à 6,4. On utilise comme inoculum une quantité du contenu du préfermentateur qui représente 5% du volume du fermentateur.

On conduit la fermentation à 28°C avec une agitation de 750 t/min et une aération à raison de 1 v/v/m. On utilise la silicone A comme agent antimoussant. Le bouillon de culture prend une couleur caractéristique rouge-brun pendant la fermentation. Après 200 h de croissance, on obtient un certain volume de cellules tassées. Le pH du bouillon égale 7,5 et à ce moment on récolte le bouillon.

Exemple 2:

On prépare une culture de Nocardia mediterranea ATCC 31064 obtenu comme il est divulgué dans l'exemple 1 dans un flacon, en agitant comme il est décrit dans l'exemple 1. Pour la préculture, on le verse dans un fermentateur de verre de 101 contenant 41 du milieu suivant:

glucose

5g farine d'arachide

7,5 g

CaC03

1,65 g

MgS04-7H20

0,33 g kh2po4

0,33 g

FeS04-7H20

3,3 mg

ZnS04-7H20

16,5 mg

MnS04-4H20

1,3 mg

H2Ojusqu'à

11

On ajuste le pH jusqu'à 7,5. On stérilise pendant 50 min à 120°C. Après la stérilisation, le pH égale 6,4. Après 48 h de croissance, le volume des cellules tassées représente 6 à 8% du volume total. On utilise un inoculum égal à 10% pour un fermentateur de verre de 201 contenant 101 du milieu de fermentation suivant:

liqueur corn steep

20 g farine de graines de soya

15 g

(NH4)2S04

6g

MgS04-7H20

0,85 g glucose

100 g kh2po4

lg

CaC03

6g

FeS04-7H20

8,5 mg

ZnS04-7H20

42,5 mg

MnS04-4H20

3,4 mg

CuS04-5H20

2,8 mg

CoC12-6H20

1,7 mg

H20 jusqu'à

11

On ajuste le pH jusqu'à 7,8 avec NaOH. On stérilise pendant

50 min à 120°C. Après la stérilisation, le pH égale 6,4. On conduit la fermentation à 28° C pendant 200 h. Le pH du bouillon de fermentation au moment de la récolte égale 7,5.

On purifie les bouillons de fermentation obtenus dans les exemples 1 et 2 de la manière suivante: on sépare le mycélium par filtration et on l'abandonne, on ajuste le pH du filtrat à 2,0 avec de l'acide chlorhydrique à 10% (v/v) et on l'extrait trois fois avec un volume égal d'acétate d'éthyle. On concentre à sec cet extrait organique sous vide à 35°C et on dissout le résidu (4 g provenant de l'exemple 1 et 11 g de l'exemple 2) dans un tampon au phosphate de sodium 0,05M à pH 7,5 et on ajoute du nitrite de sodium pour obtenir une concentration finale de 0,2% (poids/volume). Après avoir agité pendant 30 min à la température ordinaire, on extrait la solution tampon trois fois avec un même volume d'acétate d'éthyle. On concentre à sec sous vide les extraits organiques réunis à 35°C (premier extrait à l'acétate d'éthyle). On ajuste le pH de la solution tampon épuisée à 2,0 avec de l'acide chlorhydrique à 10%, puis on l'extrait avec un même volume d'acétate d'éthyle trois fois. On concentre à sec sous vide les extraits organiques réunis à 35°C (deuxième extrait d'acétate d'éthyle).

On dissout la poudre sèche provenant du premier extrait d'acétate d'éthyle (1,4 g de l'exemple 1 et 4,2 g de l'exemple 2) dans le chloroforme et on Chromatographie sur une colonne de Silicagel (tamis de 70-230 mesh ASTM) en utilisant du chloroforme contenant 2% (v/v) d'alcool méthylique comme éluant.

La rifamycine R est le premier produit majeur qui est élué de la colonne et qu'on reconnaît à sa couleur brun-orange.

Après une Chromatographie sur couche mince en utilisant des plaques de Silicagel (Merck 60 F254) avec un mélange de chloroforme/alcool méthylique (95/5) comme solvant, la rifamycine R a une valeur Rf de 0,59. On réunit les fractions contenant la rifamycine R, on les reprend à sec sous vide à 35°C, on les redissout dans de l'acétate d'éthyle qu'on lave alors avec de l'acide chlorhydrique 0,01N et finalement avec de l'eau. On concentre l'extrait organique jusqu'à un petit volume et la rifamycine R se sépare par cristallisation de la solution à 4°C (on a obtenu 600 mg de l'exemple 1 et 1,6 g de l'exemple 2). On purifie le deuxième extrait d'acétate d'éthyle par Chromatographie sur colonne sur du Silicagel de manière analogue à la rifamycine R. On dissout le résidu sec (2,4 g de l'exemple 1 et 4,2 g de l'exemple 2) dans le chloroforme et on l'applique au Silicagel.

On élue la colonne avec un mélange 98:2 de chloroforme et d'alcool méthylique. Le premier composé qui apparaît est la rifamycine U, puis la rifamycine P, et finalement la rifamycine Q. Ces trois composés ont tous une couleur jaune orange dans la solution d'éluant et on peut les identifier d'après leur mobilité lors de la Chromatographie sur couche mince. Sur des plaques de Silicagel (Merck 60 F254) en utilisant un mélange 95:5 de chloroforme: méthanol comme solvant, les valeurs Rf sont les suivantes:

rifamycine U : 0,63 rifamycine P: 0,57 rifamycine Q: 0,32 On réunit les fractions appropriées contenant les rifamycines U, P et Q, on les reprend à sec sous vide et on les cristallise à partir d'acétate d'éthyle. A partir du premier exemple, on obtient 80 mg de rifamycine U, 400 mg de rifamycine P et 280 mg de rifamycine Q; à partir du deuxième exemple, on obtient 190 mg de rifamycine U, 900 mg de rifamycine P et 750 mg de rifamycine Q.

En procédant pratiquement comme dans les exemples ci-dessus, mais en utilisant respectivement Nocardia mediterranea ATCC 30065 ou Nocardia mediterranea ATCC 31066 comme souches productrices, on obtient des rendements du même ordre que ci-dessus.

On décrit maintenant les caractéristiques physico-chimiques des nouvelles rifamycines:

Analyse élémentaire pour rifamycine P:

Trouvé: C60,6 H 6,2 N 3,8 0 25,2 S 4,1%

Bandes d'absorption UV et visibles:

Le composé présente les valeurs suivantes:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

627784

Méthanol

HC10.1N

Xmax. (mjjim)

E1%

Xmax. (m(xm) 1%

**1 cm

1 cm

406

197

416

183

350

(épaulement)

300

319

297

344

225

521

257

423

224

550

La fig. 1 donne la représentation complète du spectre. On a enregistré le spectre avec l'instrument Perkin Elmer Spectracord 4000 A.

Spectre infrarouge:

Les pointes d'absorption les plus importantes dans le Nujol ont lieu aux fréquences suivantes: (cm-1) 3700-3150 (m, br); 3100 (w); 3060-2800 (vs); 1465 (s); 1380 (b); Nujol; 1722 (m); 1645 (m, br); 1580 (m); 1510(m); 1325 (m); 1250(s,br); 1160 (m); 1130 (w); 1070 (m, br); 1030 (w); 982 (m); 960 (m); 925 (w); 890 (m); 818 (w); 770 (w); 735 (w).

La fig. 2 donne la représentation complète du spectre IR. Le spectre a été enregistré avec un instrument Perkin Elmer Mod. 421.

Spectre de masse:

Le spectre de masse obtenu à 70 eV présente la pointe d'ion moléculaire M+ à la valeur m suivante: 738.

On a enregistré le spectre avec un instrument Hitachi Perkin Eimer RMU-6L.

Spectre de résonance magnétique nucléaire:

La représentation complète du spectre RMN à 100 MHz dans CDC13 est donnée dans la fig. 3.

Ce composé ne présente pas le comportement polarographique caractéristique des rifamycines possédant un fragment chromophore avec une structure quinonique.

Analyse élémentaire pour rifamycine Q:

Trouvé: C 60,7 H 6,3 N 3,60 O 25,3 S 4,2%

Bandes d'absorption UVet visibles:

Le composé présente les valeurs suivantes dans le méthanol:

Xmax. (m|j.m)

E1% ßl cm

406

178

350

(épaulement)

297

305

257

405

224

518

Spectre infrarouge:

Les spectres d'absorption les plus significatifs dans le Nujol se présentent aux fréquences suivantes (cm-1): 3700-3300 (s, br); 3300-3080 (m, br); 3040-2780 (vs); 1460 (s); 1378 (s); Nujol; 1740 (m); 1700 (m); 1650 (s, br); 1605 (s, br); 1555 (s); 1510 (m, br); 1315 (w); 1275 (m); 1240 (m); 1220 (m); 1160 (m); 1090 (m); 1050 (m, br); 1020 (w); 970 (m); 945 (w); 910 (m); 808 (m); 765 (w); 720 (w). La figure complète du spectre IR est donnée dans la fig. 4.

Spectre de résonance magnétique nucléaire:

La figure complète du spectre RMN à 60 MHz dans CDC13 est donnée dans la fig. 7.

Analyse élémentaire pour rifamycine R:

Trouvé: C62,0 H 6,4 N 2,2 0 29,6%

Bandes d'absorption UV et visibles:

Le composé présente les valeurs suivantes dans du HCl 0,1N dans le méthanol:

Xmax. (m|xm)

C

1 cm

219

444

281

415

340

114

410

72

Spectre infrarouge:

Les pointes d'absorption les plus significatives dans le Nujol se présentent aux fréquences suivantes (cnr1): 3700-3100 (s, br); 3040-2780 (vs); 1465 (s); 1380 (s); Nujol; 1745 (s); 1710 (m); 1640 (s); 1600 (s); 1505 (s); 1415 (m); 1325 (s); 1260 (s, br); 1220-1130 (s, br); 1120 (w); 1075 (s); 1020 (w); 975 (s); 950 (w); 920 (w); 888 (m); 823 (m); 785 (w, br); 735 (w, br); 650 (w, br).

La figure complète du spectre IR est donnée dans la fig. 5.

Spectre de masse:

Le spectre de masse obtenu à 70 eV présente la pointe d'ion moléculaire M+ à la valeur m suivante: 711.

Spectre de résonance magnétique nucléaire:

La figure complète du spectre RMN à 60 MHz dans CDC13 est donnée dans la fig. 6.

Le composé présente le comportement polarographique caractéristique des rifamycines possédant un fragment chromophore avec une structure quinonique.

Les données ci-dessus concordent avec la structure suivante pour

Analyse pour rifamycine U :

Bandes d'absorption UV et visibles:

Le composé présente les valeurs suivantes dans le méthanol:

Xmax. (mjxm)

E1% ßl cm

412

163

353

(épaulement)

299

265

258

389

220

451

Spectre infrarouge:

Les pointes d'absorption les plus significatives dans le Nujol se présentent aux fréquences suivantes (cm-1): 3700-3100 (m, br); 3060 (vw); 3040-2740 (vs); 2720 (vw); 1460 (s); 1378 (m); Nujol;

1750-1705 (m, br); 1680-1620 (m, br); 1600 (s); 1558 (s); 1490 (w, épaulement); 1308 (w); 1270 (w, épaulement); 1245 (m, épaulement); 1225 (m); 1160 (m); 1120 (w); 1090 (vw); 1070 (w); 1030 (vw); 1020 (vw); 1000 (vw); 975 (w); 960 (w, épaulement); 905 (m); 850 (m); 802 (w); 800 (vw, épaulement); 777 (vw); 760 (vw); 720 (vw); 685 (vw); 670 (vw).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

627 784

10

On décrit maintenant l'activité biologique des composés. Le spectre d'activité in vitro des rifamcycines P, Q et R est rapporté dans le tableau suivant:

Souches

Concentration inhibitrice minimale (ng/ml)

Rifamycine P

Rifamycine Q

Rifamycine R

Rifamycine U

Staphylococcus aureus ATCC 6538

0,00235

0,039

0,019

0,05-0,1

Staphylococcus aureus ATCC 6538

(20% de sérum bovin)

0,00235

0,078

0,0047

—

Staphylococcus aureus Tour

0,0035

0,06

0,00235

—

Staphylococcus aureus Tour

résistant à la rifamycine

25-50

>100

100

—

Streptococcus hemolyticus C 203

0,0047

0,019

0,00312

—

Streptococcus faecalis ATCC 10541

0,0035

0,312

0,19

—

Diplococcus pneumoniae UC 41

0,0047

0,039

0,00625

Proteus vulgaris X 19 H ATCC 881

0,78

12,5

Escherichia coli ATCC 10536

3,12

12,5

50

> 50

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

12,5

50

Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145

12,5

50

100

Mycobacterium tub. H 37 Rv ATCC 9360

1

2,5

0,1

2.5

— indique que l'activité n'a pas été déterminée.

Les nouveaux composés sont actifs aussi chez les animaux de laboratoire auxquels on a injecté Staphylococcus aureus et Escherichia coli. Le tableau suivant rapporte les résultats d'expériences représentatives sur des souris comparé à une rifamycine naturelle connue, c'est-à-dire la rifamycine SV.

Tableau enfin de brevet) —»

La rifamycine P, qui se montre être la rifamycine naturelle la plus active isolée jusquà présent, a aussi une valeur faible de la toxicité, du moment que sa valeur DL50 chez les souris est supérieure à 500 mg/ kgi.p.

Composé

Souche d'infection

DES0 s.c.

mg/kg

* o.s.

Rifamycine P

Staphylococcus aureus

0,3

0,8

Rifamycine P

Escherichia coli

40

—

Rifamycine Q

Staphylococcus aureus

8

—

Rifamycine SV

Staphylococcus aureus

17

74

R

7 feuilles dessins

Claims

627 784 REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de nouvelles rifamycines identifiées comme étant la rifamycine P, la rifamycine Q, la rifamycine R et la rifamycine U, caractérisé en ce qu'on fermente dans des conditions aérobies, en présence d'une source de carbone assimilable, d'une source d'azote assimilable et de sels minéraux essentiels, une souche mutante de Nocardia mediterranea choisie parmi Nocardia mediterranea ATCC 31064 (D-2), Nocardia mediterranea ATCC 31065 (MM 18-6) et Nocardia mediterranea ATCC 31066 (M-36) et leurs équivalents, jusqu'à ce que le milieu de fermentation présente une activité antibiotique importante, en ce qu'on isole les nouvelles rifamycines du milieu de fermentation puis en ce qu'on sépare chacune d'elles en tant que produit distinct.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on conduit la fermentation à une température comprise entre 25 et 37° C pendant 180-200 h à un pH compris entre 6,4 et 8,5.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on isole les nouvelles rifamycines par l'extraction du bouillon de fermentation avec un solvant non miscible à l'eau à un pH inférieur à 5.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on sépare les nouvelles rifamycines en tant que composant distinct par Chromatographie sur colonne.

5. Application du procédé selon la revendication 1 à la préparation des rifamycines P, Q, R et U à partir d'une souche mutante de Nocardia mediterranea choisie parmi Nocardia mediterranea ATCC 31064 (D-2), Nocardia mediterranea ATCC 31065 (MM18-6), Nocardia mediterranea ATCC 31066 (M-36) et leurs équivalents, obtenue par traitement d'une suspension de spores de Streptomyces mediterranei ATCC 13685 avec un agent mutagene pendant 14 j à 28°C sur de l'agar-agar Bennett et isolement des colonies survivantes qui sont capables d'inhiber la croissance de Bacillus subtilis.

6. Application selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'agent mutagène est le N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine et en ce qu'on conduit le traitement avec ledit agent mutagène à pH = 9,0 et à 28°C.