BE633630A

BE633630A -

Info

Publication number: BE633630A
Authority: BE

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Les nouvelles substances actives ferricrocine et desferri- crocine produites par des souches d'Aspergillus,et leurs dérivés, et procédé pour leur préparation. 



   A partir de matières de provenance biologique, en particulier de micro-organismes, on a déjà isolé un assez grand   nombre   de substances de croissance ren- fermant du fer, par exemple les ferrichromes, le coprogène, les   terri-examines.   



   On a maintenant trouvé qu'on peut, à partir de   soucias   d'Aspergillus, obtenir une nouvelle sub- stance de croissance renfermant du fer, à savoir la ferricrocine, et le compose correspondant exempt de   fer, à   savoir la desferricrocine. Les souches formant de la ferricrocine sont, en particulier, l'Aspergillus versicolor M 3636 et M 3620, l'Aspergillus fumigatus M   57   et M 3628, l'Aspergillus nidulans M 2734 et l'Aspergillus humicola M 3635. La présente invention a en conséquence pour objet un procédé de préparation de la ferricrocine, de la desfe.rricrocine et de dérivés de ces composés. 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 



   Les souches indiquées ont été conservées   à   l'Ecole Polytechnique Fédérale, Institut de Botanique Spéciale, à Zurich, ainsi que dans les Laboratoires de la Demanderesse, sous la désignation indiquée. La détermination des espèces d'Aspergillus a eu lieu sui- vant les indications fournies par Ch. Thom et K.B. 



  Raper dans la publication intitulée "A Manual of Aspergilli",   Baltimore,   The Williams & Wilkings Co.,   1945.   



   Les souches d'Aspergillus versicolor M 3620 et M 3636 ont été isolées à partir d'une prise d'essai faite dans un terrain d'épandage à   MUnater,   en Vestphalie. Par les petites têtes de conidies vertes, en partie aussi couleur chair, par les parois lisses non-teintées des supports de conidies et par la double série de stérigmes, par les vésicules sphériques et l'absence de périthëces, on a pu déterminer que les organismes étaient des représentante du groupe de l'Aspergillus versicolor. A cause des conidies en forme d'épines, les souches sont à ranger dans la catégories de l'Aspergillus versicolor (Vuill.) de Tiraboschi (1908). Cette espèce présente une grande      variabilité (Loc. cit., page 192). 



   Les souches d'Aspergillus fumigatus M 57 et M 3628, celle citée en dernier lieu ayant été isolée      à partir d'une terre à vignobles de l'Institut Fédéral de Recherches   (Eidg.   Versuchsanstalt) à Wëdenswil dans      le canton de Zurich, présentent des petites têtes de conidies de teinte verte à gris-vert foncé, les vésicules sont en forme de bouteilles et pourvus d'une      

 <Desc/Clms Page number 3> 

 série de stérigmes ; les masses de conidies sont dis- posées en forme de longues colonnes et les porteurs de conidies sont   à   parois lisses et les conidies sont sphériques. Les deux organismes sont par suite à.placer dans le groupe de l'Aspergillus fumigatus.

   Etant donné de plus que dans les deux souches il ne se forme pas de périthèces, elles sont à ranger dans la catégorie de l'Aspergillus fumigatus de Fresenius, 1850/53. Comme 
Thom et Raper l'ont déterminé (loc. cit., pages 148 à 
151), la possibilité de variation de la catégorie est considérable. 



   L'Aspergillus nidulans M 2734 a été isolé à partir d'une prise d'essai faite dans un terrain d'épan- dage à   Münster   en Vestphalie. La souche forme, en culture pure, des périthèces avec des asques brun- rouge, ce qui certifie son appartenance au groupe de l'Aspergillus nidulans. Les deux barrettes longitudi- nales, larges d'un micron environ, sur les asques lisses sont typiques pour la catégorie de l'Aspergillus nidulans   (Eidam)   Wint. in Rabh. 1884. La souche M 2734 diffère seulement de façon peu sensible de la des- cription faite par Thom et Raper, notamment dans la pigmentation la plupart du temps quelque peu plus pâle et dans les barrettes longitudinales un peu moins larges. 



   L'Aspergillus humicola M 3635 a été également isolé à partir de la terre à vignobles indiquée. Les petites têtes de conidies vertes, en partie de couleur chair, les parois lisses, non-teintées, des porteurs de conidies, la double série de stérigmes, les vésicules 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 sphériques et le manque de formation de périthèces permettent de se rendre compte que la souche est un représentant du groupe de l'Aspergillus versicolor. A cause des spores lisses, on peut la ranger dans la catégorie de l'Aspergillus humicola de Chaudhuri et Sachar, 1934 (cf. " Ann. Myc. " 32, 90:   1934¯7).   



   La ferricrocine est une substance cristalline, de teinte rouge-orange, qui est bien soluble dans l'eau et le méthanol, même à froid. Le composé possède la composition élémentaire : C = 44,06   %, 44,00   % ; H   = 5,99   %,   6,03 % ;   N = 15,98   %, 15,77   % ; Fe = 7,38 %, 7,63   % ;   0 = 26,59 %, 26,57 % (calculé). 



  Ces valeurs correspondent à la formule brute : 
C28H44O13N9Fe Le spectre en ultra-violet dans l'éthanol présente des maxima à 214   m   (log E11 %cm= 2,44) et à 430   m   (log E11 %cm =   1,52).   Le spectre infra-rouge dans le bromure de potassium présente entre autres des bandes à   636,   725, 783, 976, 1.066, 1.146, 1.240,   1.278   cm-1 (épaulement), à 1.335 cm-1 (épaulement), à 1.372, 1.435 cm-1 (épaulement), à 1.466,   1.533,   1.586,   1.665,   2.918, 3. 026 cm-1 (épaulement), à 3.410 cm-1, cf. figure 1. 



   Les cristaux se décomposent à 260 C environ, sans fondre, en donnant une coloration noire. Dans un chromatogramme sur papier, on obtient les valeurs de Rf suivantes ; 0,29 dans un système (4: 1:1) de butanol normal, d'acide acétique glacial et d'eau (système I) et 0,28 dans un système (2: 1:1) de butanol tertiaire, 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 d'acide chlorhydrique 0,004-normal et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (système II), le papier étant imprégné avec un mélange (6:3:1) d'acétone, d'eau et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium.

   Dans les mornes condition d'essai, on a obtenu : pour le ferrichrome des valeurs de Rf de 0,28 (dans le système I) et de 0,30 (dans le système 11); pour le coprogène, des valeurs de   Rf de   0,43 (dans le système I) et de 0,55 (dans le système   Il)   et, pour la ferrichrysine, des valeurs de Rf de 0,26 (dans le système I) et de 0,34 (dans le système   II).   



   Lors de l'hydrolyse acide de la ferricrocine, il se forme 3 moles d'acide acétique. 



   La ferricrocine se différencie surtout du ferrichrome par sa solubilité aisée dans le méthanol. 



  Le ferrichrome est presque insoluble dans le méthanol froid et ne se dissout que lors d'uneébullition pro- longée dans une quantité environ mille fois plus grande de méthanol. Les autres différences résultent de la composition des acides aminés. 



   Lorsqu'on traite la ferricrocine par des bases ou des acides ou par des substances donnant lieu à la formation de complexes ferrifères, le fer est   éliminé   de la molécule, ce qui fait qu'il se forme une poudre incolore, à savoir la desferri-crocine. 



  Lorsqu' on hydrolyse celle-ci avec de l'acide   chlorhy-   drique hexanormal et hydrogène catalytiquement les produits d'hydrolyse (en vue de réduire des groupes   hydroxylaminogènes   éventuellement présents), on obtient 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 trois produite qui sont positifs à la   ninhydrine   et qui, sur lu base d'un examen par chromatographie sur 
 EMI6.1 
 papier éluant : mélange (8:2) do phénol et d'eau et d'acide ensuite mélange (4:1:1) de butanol,   / acétique   glacial et d'eau 7 et, sur la base de la coloration avec la 
 EMI6.2 
 ninhydrine, peuvent être identifiés comme étant consti- tuas par de l'ornithine de la serine et de la glycine. 



  Lorsqu'on examine le mélange réactionnel suivant la méthode de Moore et Stein, on peut déceler les trois mêmes   aciues   aminés, et ce dans la proportion   molécu-   
 EMI6.3 
 laire serine : glycinc : oznithine = 1 . 2 : 3. Le ferri- chrome exempt de fer, lorsqu'il est hydrolyse avec de 
 EMI6.4 
 l'acide chlorhydrique hexanormat et hydrogéné catalyti- quement, ne fournit pas trois, mais seulement deux 
 EMI6.5 
 produits positifs à la ninhydrine, à savoir la glycine et l' ornit2rine, Le coprogènc fournit, comme seul produit de scission positif à la ninhydrine, de l'ornithine. 



  Dans le.spectre de résonance nucléaire magnétique, pris c ur un spectromètre Varian, dans de l'eau lourde, la desferri-crocine présente les signaux suivants : I.,?4 ppm (b, 12 H ; si- et -CH2 de la b-N-hydroxy-   ornithino)   2,12 " (s, 9 H ; 3   groupes   acétyle) 
 EMI6.6 
 3,65 " (b, 6 H ,-CH2 de la 6-N-hydroxy-ornithine) 3,96 " (b, 6 H ; a-CH2de la glycine et p-CH2 de la serine) 4,35 " (b, 4 H ;Ó-CH de   l'hydroxy-ornithine   et de la serine). 
 EMI6.7 
 



  Dans ce qui précède : s :. vizyrulet, . b large amoncol- 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 lement de signaux. Entre parenthèses, on a indiqué l'affectation   probable   des signaux. 



   Dans la ferricrocine, les acides aminés que sont la serine (une mole), la glycine (2 moles) et la   #-hydroxy-ornithine   (3 moles) sont liés en un peptide cyclique.   L'hydroxy-ornithine   est   N(ô)-acétylée ;   sur les trois restes ainsi formés de l'acide   hydroxamique,   le fer est lié de manière complexe. La formule globale de la ferrocrpcome exempte de fer est par suite : tro-(-N-acéthyl)-cyclo-[séryl,   (glycyl)2,   (6-hydroxy- ornityhl)3]. La séquence des restes d'acides aminés dans l'hexapeptide n'est pas encore déterminée.

   Four une séquence alternée des restes *-hydroxy-orinthine,   on   pourrait attribuer à la ferricrocine la formule structurale suivante : 
 EMI7.1 
 
A partir de la   deferricrocine,   on obtient en retour la ferricrocine en ajoutant du chlorure ferrique à un   pH   neutre. 



   Leu dérivés de la ferricrocine et de la desferrierocine sont, par exemple, des composés dans lesquels le groupe hydroxyle du reste séryle est 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 estérifié, ou dans lesquels les groupes acétyles sont substitués par d'autres groupes acyles, par exemple par des groupes alcanoyles inférieurs comportant   de 3   à 6 atomes de carbone ou par des groupes   alcénoyles   inférieurs ou par des groupes w-hydroxy-alcénoyles inférieurs, comme les groupes propionyle,   butyryle,   pentanoyle, penténoyle,   5-hydroxy-penténoyle,   5-hydroxy-   3-méthyl-penténoyle.   Les dérivés indiqués en premier lieu sont obtenus en traitant de la ferricorcine par des agents d'acylation, par exemple avec des anhydrides d'acide ou des halogénures d'acide,

   comme   l'anhydride   acétique ou le chlorure d'acétyle, et en isolant les esters, et, si on le désire, en éliminant le fer. Le composé   désacétylé   est obtenu en désacétylant le composé exempt de fer dans un milieu modérément acide, par exemple en présence d'acides minéraux dilués. 



  L'hexapeptide cyclique ainsi obtenu peut être acylé d'une manière   connue ;   les groupes C-acyles qui se forment alors peuvent être   éliminés avec   de l'ammoniac, par exemple dans le méthanol. L'analogue   acylé   de la      desferri-crocine peut, avec des sels de fer,être   transformé   en le complexe   ferrifère   correspondant. 



   La ferricrocine, la   desferri-crocine   et leurs analogues sont des substances de croissance pour dif- férents micro-organismes et peuvent par suite être utilisés lors de   la   culture de tels organismes. 



   Ces composés possèdent des propriétés anti- anémiques et peuvent par suite être utilisés comme médicaments. La desferri-crocine et ses dérivés possèdent également de précieuses propriétés   pharmacologiques.   

 <Desc/Clms Page number 9> 

 



    C'eut     ainni   qu'ils   empêchent   le dépôt de pigments 
 EMI9.1 
 forrifôi'en dans les tissus ou qu'ils provoquent, dans les   cas d'un   dépôt; pathologique de far dans l'organisme, une élimination du fer, par exemple dans   l'hemochromato#   
 EMI9.2 
 et Ilh('ffio;ii(16rooc. Ils peuvent par suite être utilisés de. façon correspondante en thérapeutique. 



     Les   préparations pharmaceutiques renferment les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, convenant pour une utilisation entérale ou parentérale. 
 EMI9.3 
 Les i,rfsi,:a rvrt. i on:3 sont obtenues à partir de matières de départ suivant les méthodes usuelles. Des substances de support   appropriéts   sont des substances ne réagis- sant pas sur la   dcsferri-crocine,   comme par exemple la gélatine, le lactose, le glucose, le chlorure de   sodium,     l'amidon, le   stéarate de magnésium, le talc, 
 EMI9.4 
 <i,cf:: hu U p::'; v'-iétales, des alcools benzyliques, des dominée, rlo:; polyalcoyicne-clycols, la cholestérine et   d'autre:.;   supports médicinaux connus. 



   Tout comme d'autres sidéramines, la ferri- 
 EMI9.5 
 crocine '..;t. également en mesure de supprimer compéti- vomorxt vis-à-vis des agents pathogènes à Gram positif l'effet anti-bactérien des antibiotiques appar- 
 EMI9.6 
 tt'nqnt au groupe des sidéromycines (effet anti- ;.>iï:rcr.yc,ini,:ue). 



   La ferricrocine, la desferri-crocine, ainsi que   leur-)   dérivés sont obtenus en cultivant des souches   il' 1 lits   formant de la ferricrocine, dans des conditions aérobies, dans une solution nutritive aqueuse renfermant une source de carbone et d'azote, ainsi que 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 des sels   inorganiques,   en isolant la ferricrocine et/ou 
 EMI10.1 
 la dcsferri-crocinc du filtrat de culture et, ai on le désire, en transformant la ferricrocine en le composé exempt de fer, ou en préparant dos dérivés de ces composés. Etant donné que la formation de la ferricrocine et/ou de la desferri-crocine est favorisée par un milieu nutritif pauvre en fer, il est avantageux d'effectuer la culture avec un manque de fer, de préférence avec une teneur en fer au plus égale à 10-7 mole par litre. 



   Pour la culture des souches, on envisage, comme sources de carbone et   d'azote :   des hydrates de      carbone, par exemple du glucose, du saccharose, du lactose, de l'amidon, des alcools, comme le mannitol      et le glycérol, des acides aminés, par exemple de 
 EMI10.2 
 l'crnithine, des peptides, desprotéines et leurs pro-   duits   de dégradation comme la peptone ou la   tryptonc,   des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le maïs ou le fro- ment,   des résidus   de distillation provenant de la fabrication de ]'alcool, des levures, des graines, en particulier de colza et de soja, de coton, deu sels   d'ammonium,   des nitrates.

   Comme sels inorganiques, la solution nutritive peut, par exemple, renfermer des chlorures, des carbonates, des sulfates de métaux alcalins , de métaux alcalino-terreux, du magnésium, du zinc et du manganèse, ainsi que des traces de fer. 



   La culture a lieu de manière aérobie,   c'est-   à-dire par exemple en culture de surface au repos, ou de préférence de manière immergée avec secouage ou 

 <Desc/Clms Page number 11> 

 agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans des flacons agités ou dans les fermenteurs connus. Comme température, convient une température comprise entre 
18 et 40 C, de préférence une température de 27 C. 



   Dans ce cas, la solution nutritive présente en général au bout de   8 à   12 jours un important effet analogue à celui de la   sidéramine.   



   L'activité de La ferricrocine peut être déterminée par voie   microbiologique à   l'aide du test de   Bonifas   modifié [cf.   Zahner   et ses collaborateurs, "Arch.   Mikrobiol.",   36, pages 325 et suivantes (1960)¯7. 



   Comme solution-test, on   utilise   une solution de ferri-   mycinc   d'une teneur de 0,1 mg par centimètre cube, et comme   souche-test,   le Staphylococcus aureus de   Rosenbach.   



   On peut également déterminer par voie optique la concentration en ferricrocine de la solution   de .   culture. A cet   effet,   on secoue pendant 5 minutes 5 cm3 du liquide de culture avec 1,5 g de chlorure de sodium, avec un centimètre cube d'une solution à 0,1 % de sulfate ferrique et avec 5 cm3 d'alcool benzylique, sépare par centrifugation, filtre la phase organique et détermine l'extinction de cette dernière à 410 m . Comme échantillon de comparaison, on se sert d'un extrait préparé de la même manière nutritive à partir d'une solution Únon-ensemencée. 



   Au bout de 8 à 12 jours, les cultures acquièrent, une activité correspondant à une quantité de 100 à 200 mg par litre de ferricrocine pure. 



   Lorsque la culture est terminée, on peut, 

 <Desc/Clms Page number 12> 

 par litre, ajouter un gramme de chlorure ferrique à la solution nutritive, la desferri-crocine présente étant transformée en ferricrocine. On sépare le mycélium du filtrat de culture, de préférence en présence d'un auxiliaire de filtration, par exemple en présence d'Hyflo-Supercel, après quoi la majeure partie de la ferricrocine se trouve dans le filtrat de culture. 



  Cependant, des quantités notables de cette substance restent adhérentes sur le mycélium. Il est en consé- quence avantageux de bien extraire ce dernier par lavage. Conviennent par exemple, à cet effet, l'eau ou des alcools aqueux, comme le méthanol aqueux. 



   Pour isoler la ferricrocine à partir du filtrat de culture, on peut procéder suivant des méthodes connues en elles-mêmes et utiliser, par exemple, l'une des méthodes opératoires ou combinai- sons qui sont indiquées ci-après : 
1) On peut utiliser des agents d'adsorption, par exemple des charbons actifs comme la   norito,   des terres activées comme la franconito, la terre à foulon ou la floridine, ou des adsorbants résineux comme   l'asmite.   L'élution des   adsorbats   a lieu avantageuse- ment avec des mélanges aqueux de solvants organiques miscibles à l'eau, par exemple avec des mélanges d'eau et de méthanol, d'eau et de pyridine, d'acide acétique dilué et de méthanol, ou d'eau, de méthanol, d'acide acétique glacial et de butanol.

   Un mélange de 4 parties en volume d'eau et d'une partie on volume de pyridine s'est avéré particulièrement approprié pour l'élution ou .d'un adsorbat de franconite Úde norite. 

 <Desc/Clms Page number 13> 

 



   2) On peut de plus soutirer la ferricrocine d'une solution aqueuse à l'aide de solvants organiques. 



  Pour ce procédé d'extraction, des alcools organiques supérieurs, par exemple l'alcool benzylique ou l'alcool isopropylique, se sont avérés particulièrement appro- priés. Danst ce cas, on ajoute avantageusement à la phase aqueuse un sel inorganique, par exemple du sulfate d'ammonium ou du chlorure de sodium. A partir des extraits organiques obtenus, la ferricrocine peut être obtenue sous forme enrichie, soit par évaporation du solvant, soit par précipitation à l'aide d'un solvant organique convenable, par exemple à l'éther, l'éther le pétrole ou l'acétate d'éthyle. 



   3) Une autre méthode d'enrichissement de la ferricrocine consiste à la répartir entre une solution   aqueuse   et une solution de phénol dans le chloroforme, la   teneur     on     phénol,   de la solution   chloroformique   pou- vaut varier. 



   4) Une autre méthode pour l'enrichissement de la ferricrocine   cet   constituée par la chromatogra- phie, par exemple une chromatographie d'adsorption eur différentes matières, par exemple sur de la norite, de l'oxyde d'aluminium, des silicates de magnésium, du gel de milice, du sulfate de calcium, ainsi qu'une chromatogrphie de répartition avec de la cellulose,   de   l'amidon, du gel de silice , de la célite et analogues cornue substances de support. 



   5) En outre, la ferricrocine peut être enri- chie par une répartition à contre-courant suivant Craig entre deux phases solvantes non-miscibles. Le système 

 <Desc/Clms Page number 14> 

 
 EMI14.1 
 solvant. au L vaut r-'er.t avéré dans ce cas particulièrement approprié : u-butanol : alcool búnzylique : acide -'h1 /'li,#'Îl'ilUe n:illLlhH'!n11 L solution aqueuse de chlorure >u- ..' l;Lll., :'..lt-',il'r.'E' ;t 19  (9 : 9 : 15 : 5). 



  La vie;;f errieroeine eut formée, à coté de la f ei'ravrociuo, par lou couches indiquées d'A:yeri,illuâf et peut par :3itc également être isolée directement du filtrat de culture. Loru de 1'1nolernenL, on élimine avantasvui'omoiit. 1<- for prirent, dans Il filtrat de "Ht.i...l'0, 1':.1" exemple par addition de :i111:ttC1l.Ct;:l formant, t1t': (' ('1':1') vXt:; t't.. 1'1' i r," r,';" comme la -Z11'il'OX;iü11101t:1I1C!t j.ar" t')it' :,t . 
 EMI14.2 
 



  On peut, directement après la fin de la fermen- tation, ajouter à la bouillie de culture le  substances 
 EMI14.3 
 donnant lieu Ù la formation de complexe  1'l.:1'1'i a'l'(':1, L'addition Il lieu [lv:!ntht-:{'U;'t'::1fnt danr; un :'.tu.1c \11 t ,rieur j1 i rai t ##i.-.eni, peur /-Unj!wr t"inlfj1:o.:nt. den ion;3 de ,\:r-(Il1) éventuel! # ##.t.-iit ''ntruîné.3 par leu ogentlJ Llt;i 1:'st:;.=.. 



  L'isolement -se la deyferri-erociue h partir de la solution de culture a lieu suivant le  méthode  mentionnée!? pour l'isolement de la ferricrocine. 



  L'invention coiiccrne tr;c').fT;a:rit.t h titre de produite industriels nouveaux, le.1 \"vq)\1.t[) obtenus 1 al" la zicc f'r.. r,E'1.", în l,' -;"1.1/ d''fhJ .# : ¯-.; >;j'i;i : i.tS.-C:i:s)Il t..). Jt 1'lt('\ 1)11.J '-L i! #' ' a u i;is".;. # IftC "Xr"i.if;3 ?',:..^11.:.'.lt.t:l'=t '1'..1.., ,Ü vent, ùuuï ! '.#;; que l lèS :.:;;,;",:;1t1'::(." ir.l i j; i ;-; .#' oh ca de;-":"j ..:f'.t:<1(111c;:. 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 



   EXEMPLE 1 
La souche d'Aspergillus versicolor M 3636 est cultivée de manière immergée, à 27 , dans une culture bien aérée. On utilise une solution nutritive renfer- mant, par litre d'eau distillée, 20 g de glucose (exempt de fer), 5 g de L-asparagine, un gramme de   phosphate   secondaire de potassium, un gramme de sulfate de magnésium cristallisé (MgS04, 7 H20), et 0,5 g de chlorure de calcium. La solution nutritive est stéri- lisée pendant 20 minutes à 120 . On ensemence avec une suspension de spores renfermant de 100 à 200 millions de spores par litre. 



   Au bout de   8   à 12 jours, on ajoute aux cul- tures un gramme par litre de chlorure ferrique et filtre en ajoutant 2 % de célite. On sature alors le filtrat de culture avec du chlorure de sodium et extrait la solution limpide à deux reprises avec 1/10 volume d'alcool benzylique. On sèche la phase organique avec du sulfate de sodium, la filtre et y ajoute trois volume d'éther. On extrait le mélange d'alcool benzy- lique et d'éther avec de l'eau distillée jusqu'à décolo- ration. On réunit les extraits aqueux, élimine à l'éther les restes de l'alcool benzylique et lyophilise, ce qui fait qu'on obtient une poudre rouge. 



   On soumet 10,6   g   du produit brut à une répar-   tition   de Craie; en 137 stades. Comme système solvant à deux phases, on se sert   d'un   mélange constitué par 1,8 litre d'alcool benzylique, par 1,8 litre d'alcool buty- lique normal, par 1,0 litre d'une solution aqueuse 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 saturée de chlorure de sodium et par 3 litres d'une solution aqueuse millinormale d'acide chlorhydrique. 



   Au cours de la répartition, le colorant brun- rouge est essentiellement scindé en un composant prin- cipal et en un composant secondaire. Le composant prin- cipal possède un maximum dans le stade 52   (K  0,55), le composant secondaire dans le stade 123 (K 11 environ = ferrirhodine). 



   On réunit les fractions   40   à 60. En ajoutant deux volumes d'éther, on chasse la ferricrocine dans la phase aqueuse. On   sépare   cette dernière et extrait encore la couche organique à deux reprises avec de l'eau. Après avoir réuni les solutions aqueuses, on les sature à peu près à moitié de chlorure de sodium et extrait à plusieurs reprises avec un mélange de phénol et de chloroforme (un kg de phénol par litre de chloroforme). On clarifie sur une colonne de célite les extraits troubles, de teinte brun-rouge, obtenus avec le mélange de phénol et de chloroforme, ajoute un volume double d'éther et extrait   à   plusieurs reprises avec de l'eau distillée. On lave les solu- tions aqueuses à deux reprises avec de l'éther pour éliminer complètement le phénol, puis les évapore sous vide.

   On obtient 1,29 g d'un résidu de teinte brun-rouge. Par recristallisation dans 15 cm environ d'alcool absolu, on obtient la ferricrocine sous la forme de fins cristaux brillants, de teinte rouge- orange, qui se décomposent à 260  environ. 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 Analyse : trouvé C 44,06, 44,00 ; H 5,99, 6,03; 
Fe 7,38 7,63 N   15,98,     15,77   % calculé pour C28H44O13N9Fe ; 
 EMI17.1 
 C 43, 64 ; H 5, 76 ; N 16, 36 ;

   Fe 7,25% Spectre d'absorption dans l'éthanol : max = 214 mu fog El cm   2,44) j Àmax = 430 mu (log Et - f5)' Le spectre infra-rouge dans le bromure de potassium présente entre autres des bandes à 636, 725, 783, 976, 1.066, 1.146, 1.240,   1.278   cm-1 (épaulement), à   1.335   cm-1 (épaulement), à   1.372,   1.435 cm-1 (épaule- ment), à   1.466,     1.533,   1.586, 1.665, 2.918,   3.026   cm-1 (épaulement), à   3.410   cm-1, cf. figure 1. 



   Dans un chromatogramme sur papier, on a comparé la ferricrocine avec d'autres sidéramines, voir tableau 1. La méthode est la suivante : on imprègne une feuille de papier filtre Whatman n  1 avec un mélange d'acétone, d'eau et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (rapport volumétrique 6:3:1),puis le sèche à l'air pendant 10 à 15 minutes. Sur la ligne de départ, on apporte alter- nativement une goutte d'une solution méthanolique de la substance de comparaison (points de départ 1, 3, 5 et 7) et de la ferricrocine (points de départ 2, 4, 6 et 8). Le chromatogramme est développé pendant 20 heures environ avec, comme éluant, un mélange (2: 1:1) de butanol tertiaire, d'acide chlorhydrique 0,004-normal et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium.   11 taches des   sidéramines sont reconnues à leur couleur propre.

   Malgré la différence relativement minime aans les valeurs de Rf de quelques 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 sidéramines, il en résulte,   d'après la   méthode décrite, une différenciation indubitable. 



   Tableau 1 
 EMI18.1 
 
<tb> Sidéramine <SEP> Rf <SEP> (système <SEP> I) <SEP> R <SEP> (système <SEP> II)
<tb> 
<tb> Ferrichrome <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0,30
<tb> Ferricrocine <SEP> 0,29 <SEP> 0,28
<tb> Ferrichrysine <SEP> 0,26 <SEP> 0,34
<tb> Coprogène <SEP> 0,43 <SEP> 0,55
<tb> Ferrirubine <SEP> 0,42 <SEP> 0,73
<tb> Ferrirhodine <SEP> 0,43 <SEP> 0,88
<tb> 
 
EXEMPLE 2 
On cultive la couche d'Aspergillus versicolor M 3636 comme dans l'exemple 1, ajoute du chlorure ferrique au milieu de culture et filtre en ajoutant de la célite. On extrait le filtrat de culture obtenu à trois reprises avec 1/20 volume d'un mélange de chloro-      forme et de phénol (une partie en volume : une partie en poids), sépare la phase organique et la filtre à travers de la célite.

   On ajoute alors trois volumes d'éther à la solution organique et l'extrait à plusieurs reprises avec de l'eau distillée jusqu'à décoloration. 



  On réunit les extraits aqueux, les lave à l'éther pour éliminer les restes de phénol, les débarrasse de l'éther sous vide, puis lyophilise. Le produit brut obtenu est purifié comme dans l'exemple 1. 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 



   De la même manière que celle décrite dans les exemples 1 et 2, on obtient la ferricrocine en cultivant l'une des souches Aspergillus fumigatus 
M 57 ou M 3628, Aspergillus nidulans M 2734, 
Aspergillus versicolor M 3620 ou Aspergillus humicola M 3635, puis en traitant le milieu de culture comme décrit. 



   A partir du filtrat de culture d'Aspergillus nidulans M 2734, on obtient le même composant secon- daire que dans le cas de l'Aspergillus versicolor M 3636, à savoir la ferrihodine. Les souches d'Asper- gillus fumigatus M 57 et M 3628 fournissent un composant secondaire dont les valeurs de R,. dans les systèmes I et II sont respectivement de 0,67 et d'environ 0,9. 



   EXEMPLE 3 
Dans 30 cm3 d'eau, on dissout 740 mg de ferri- crocine cristallisée et ajoute un gramme de 8-hydroxy- quinoléine en solution dans 10 cm3 de méthanol environ. 



  Après avoir agité pendant 20 neures, on pare le préci- pité noir par filtration et élimine le réactif en excès du filtrat en extrayant à plusieurs reprises avec du chloroforme. On évapore sous vide la solution aqueuse de teinte jaunâtre pâle et obtient la ferri- crocine exempte de fer sous la forme d'une poudre amorphe presque incolore. Le rendement est de 675 mg. 



   Le spectre de résonance nucléaire magnétique de ce composé, pris avec un spectromètre de Varian, modèle A 60, dans de l'eau lourde, présente les signaux suivants (cf. fig. 2) : 

 <Desc/Clms Page number 20> 

 1,74 ppm (b, 12 h ; ss- et   -CH2   de la   ô-N-hydroxy-   ortithine) 2,12 " (s, 9 H ; 3 groupes acétyles) 3,65 " (b, 6 H ;   -CH2   de la   ô-N-hydroxy-ornithine)      3,96 " (b, 6 H ; Ó-CH2 de la glycine et (3-CH2 de la serine)   4,35 " (b, 4 H ;   a-CH   de l'hydroxy-ornithine et de la sérine) Dans ce qui précède : s = singulet ;   b    large   amoncel- lement de signaux. 



   EXEMPLE 4 
Dans un tube en verre, on scelle 90 mg de ferricrocine exempte de fer avec 2 cm3 d'acide chlor- hydrique hexanormal, puis chauffe pendant 20 heures à 110 . On évapore le mélange d'hydrolyse sous vide jusqu'à siccité, dissout le résidu dans peu d'eau et dilue à 20 cm3 avec de l'alcool absolu. On hydrogène cette solution pendant une nuit sous la pression atmosphérique en présence de 50 mg d'oxyde de platine préalablement hydrogéné, puis sèche le mélange de réduction sous vide. On soumet un échantillon du pro-      duit réactionnel à un examen chromatographique sur papier, en développant d'abord avec un mélange de phénol et d'eau (8:2) et ensuite dans la seconde dimension avec un mélange de butanol, d'acide acétique glacial et d'eau (4:1:1).

   En teintant avec de la ninhydrine, on obtient trois taches qu'on peut, par comparaison avec les préparations authentiques, attribuer aux acides aminés que sont l'ornithine, 

 <Desc/Clms Page number 21> 

 la sérine et la glycine. Lorsqu'on examine le mélange réactionnel suivant la méthode de Moore et Stein, on peut déceler les trois mêmes acides aminés et ce dans la proportion moléculaire serine : glycine :   ornithine   1: 2: 3 (arrondi à des nombres entiers).

Claims

Revendications .

I. - Un procède de préparation de nouvelles substances actives, caractérisé par le fait que dans une solution nutritive aqueuse renfermant une source de carbone et d'azote, ainsi que des sels inorganiques, on cultive, dans des conditions aérobies, une souche d'Aspergillus formant de la ferricrocine, qu'on isole EMI22.1 la ferriepocine et/ou la desferrrocine du filtrat de culture et, si on le désire, qu'on transforme la ferricrocine en le composé exempt de fer, ou qu'on prépare des dérivés de ces composés.

Le présent procédé peut encore être caracté- risé par les points suivants : 1) On cultive l'Aspergillus versicolor M 3636 ou M 3620.

2) On cultive l'Aspergillus fumigatus M 57 ou M 3628.

3) On cultive l'Aspergillus nidulans M 3734.

4) On cultive l'Aspergillus humicola M 3635.

5) La teneur en fer du milieu nutritif est au plus égale à 10-7 mole par litre.

6) Lorsque la culture est terminée, on ajoute des sels de fer.

7) On extrait les substances actives du fil- trat de culture à l'aide d'alcool benzylique.

8) On extrait les substances actives à l'aide d'une mélange de phénol et de chloroforme. <Desc/Clms Page number 23>

9) On purifie les substances actives brutes à l'aide d'une répartition à contre-courant effectuée dans un système constitué par un mélange (9:9:5:15) d'alcool benzylique, de butanol normal, d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium et d'acide chlorhydrique millinormal.

10) Eu vue d'obtenir de la desferri-crocine, on ajoute au filtrat de culture des substances donnant lieu à la formation de complexe ferrifères.

11) On ajoute au filtrat de culture de la 8- EMI23.1 hydroxy-yuino î é ine .

12) On élimine le fer de la ferricrocine à l'aide d'acidesou de bases, ou de substances donnant liuu à. la formation de complexes ferrifères.

II.- A titre de produits industriels nouveaux: 13) La rferricrecine et ses dérivés. EMI23.2

14) La de,ferri-çroci:e et ses dérivés. fi ,14 ¯..; -