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Les nouvelles substances actives ferricrocine et desferri- crocine produites par des souches d'Aspergillus,et leurs dérivés, et procédé pour leur préparation.
A partir de matières de provenance biologique, en particulier de micro-organismes, on a déjà isolé un assez grand nombre de substances de croissance ren- fermant du fer, par exemple les ferrichromes, le coprogène, les terri-examines.
On a maintenant trouvé qu'on peut, à partir de soucias d'Aspergillus, obtenir une nouvelle sub- stance de croissance renfermant du fer, à savoir la ferricrocine, et le compose correspondant exempt de fer, à savoir la desferricrocine. Les souches formant de la ferricrocine sont, en particulier, l'Aspergillus versicolor M 3636 et M 3620, l'Aspergillus fumigatus M 57 et M 3628, l'Aspergillus nidulans M 2734 et l'Aspergillus humicola M 3635. La présente invention a en conséquence pour objet un procédé de préparation de la ferricrocine, de la desfe.rricrocine et de dérivés de ces composés.
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Les souches indiquées ont été conservées à l'Ecole Polytechnique Fédérale, Institut de Botanique Spéciale, à Zurich, ainsi que dans les Laboratoires de la Demanderesse, sous la désignation indiquée. La détermination des espèces d'Aspergillus a eu lieu sui- vant les indications fournies par Ch. Thom et K.B.
Raper dans la publication intitulée "A Manual of Aspergilli", Baltimore, The Williams & Wilkings Co., 1945.
Les souches d'Aspergillus versicolor M 3620 et M 3636 ont été isolées à partir d'une prise d'essai faite dans un terrain d'épandage à MUnater, en Vestphalie. Par les petites têtes de conidies vertes, en partie aussi couleur chair, par les parois lisses non-teintées des supports de conidies et par la double série de stérigmes, par les vésicules sphériques et l'absence de périthëces, on a pu déterminer que les organismes étaient des représentante du groupe de l'Aspergillus versicolor. A cause des conidies en forme d'épines, les souches sont à ranger dans la catégories de l'Aspergillus versicolor (Vuill.) de Tiraboschi (1908). Cette espèce présente une grande variabilité (Loc. cit., page 192).
Les souches d'Aspergillus fumigatus M 57 et M 3628, celle citée en dernier lieu ayant été isolée à partir d'une terre à vignobles de l'Institut Fédéral de Recherches (Eidg. Versuchsanstalt) à Wëdenswil dans le canton de Zurich, présentent des petites têtes de conidies de teinte verte à gris-vert foncé, les vésicules sont en forme de bouteilles et pourvus d'une
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série de stérigmes ; les masses de conidies sont dis- posées en forme de longues colonnes et les porteurs de conidies sont à parois lisses et les conidies sont sphériques. Les deux organismes sont par suite à.placer dans le groupe de l'Aspergillus fumigatus.
Etant donné de plus que dans les deux souches il ne se forme pas de périthèces, elles sont à ranger dans la catégorie de l'Aspergillus fumigatus de Fresenius, 1850/53. Comme
Thom et Raper l'ont déterminé (loc. cit., pages 148 à
151), la possibilité de variation de la catégorie est considérable.
L'Aspergillus nidulans M 2734 a été isolé à partir d'une prise d'essai faite dans un terrain d'épan- dage à Münster en Vestphalie. La souche forme, en culture pure, des périthèces avec des asques brun- rouge, ce qui certifie son appartenance au groupe de l'Aspergillus nidulans. Les deux barrettes longitudi- nales, larges d'un micron environ, sur les asques lisses sont typiques pour la catégorie de l'Aspergillus nidulans (Eidam) Wint. in Rabh. 1884. La souche M 2734 diffère seulement de façon peu sensible de la des- cription faite par Thom et Raper, notamment dans la pigmentation la plupart du temps quelque peu plus pâle et dans les barrettes longitudinales un peu moins larges.
L'Aspergillus humicola M 3635 a été également isolé à partir de la terre à vignobles indiquée. Les petites têtes de conidies vertes, en partie de couleur chair, les parois lisses, non-teintées, des porteurs de conidies, la double série de stérigmes, les vésicules
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sphériques et le manque de formation de périthèces permettent de se rendre compte que la souche est un représentant du groupe de l'Aspergillus versicolor. A cause des spores lisses, on peut la ranger dans la catégorie de l'Aspergillus humicola de Chaudhuri et Sachar, 1934 (cf. " Ann. Myc. " 32, 90: 1934¯7).
La ferricrocine est une substance cristalline, de teinte rouge-orange, qui est bien soluble dans l'eau et le méthanol, même à froid. Le composé possède la composition élémentaire : C = 44,06 %, 44,00 % ; H = 5,99 %, 6,03 % ; N = 15,98 %, 15,77 % ; Fe = 7,38 %, 7,63 % ; 0 = 26,59 %, 26,57 % (calculé).
Ces valeurs correspondent à la formule brute :
C28H44O13N9Fe Le spectre en ultra-violet dans l'éthanol présente des maxima à 214 m (log E11 %cm= 2,44) et à 430 m (log E11 %cm = 1,52). Le spectre infra-rouge dans le bromure de potassium présente entre autres des bandes à 636, 725, 783, 976, 1.066, 1.146, 1.240, 1.278 cm-1 (épaulement), à 1.335 cm-1 (épaulement), à 1.372, 1.435 cm-1 (épaulement), à 1.466, 1.533, 1.586, 1.665, 2.918, 3. 026 cm-1 (épaulement), à 3.410 cm-1, cf. figure 1.
Les cristaux se décomposent à 260 C environ, sans fondre, en donnant une coloration noire. Dans un chromatogramme sur papier, on obtient les valeurs de Rf suivantes ; 0,29 dans un système (4: 1:1) de butanol normal, d'acide acétique glacial et d'eau (système I) et 0,28 dans un système (2: 1:1) de butanol tertiaire,
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d'acide chlorhydrique 0,004-normal et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (système II), le papier étant imprégné avec un mélange (6:3:1) d'acétone, d'eau et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium.
Dans les mornes condition d'essai, on a obtenu : pour le ferrichrome des valeurs de Rf de 0,28 (dans le système I) et de 0,30 (dans le système 11); pour le coprogène, des valeurs de Rf de 0,43 (dans le système I) et de 0,55 (dans le système Il) et, pour la ferrichrysine, des valeurs de Rf de 0,26 (dans le système I) et de 0,34 (dans le système II).
Lors de l'hydrolyse acide de la ferricrocine, il se forme 3 moles d'acide acétique.
La ferricrocine se différencie surtout du ferrichrome par sa solubilité aisée dans le méthanol.
Le ferrichrome est presque insoluble dans le méthanol froid et ne se dissout que lors d'uneébullition pro- longée dans une quantité environ mille fois plus grande de méthanol. Les autres différences résultent de la composition des acides aminés.
Lorsqu'on traite la ferricrocine par des bases ou des acides ou par des substances donnant lieu à la formation de complexes ferrifères, le fer est éliminé de la molécule, ce qui fait qu'il se forme une poudre incolore, à savoir la desferri-crocine.
Lorsqu' on hydrolyse celle-ci avec de l'acide chlorhy- drique hexanormal et hydrogène catalytiquement les produits d'hydrolyse (en vue de réduire des groupes hydroxylaminogènes éventuellement présents), on obtient
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trois produite qui sont positifs à la ninhydrine et qui, sur lu base d'un examen par chromatographie sur
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papier éluant : mélange (8:2) do phénol et d'eau et d'acide ensuite mélange (4:1:1) de butanol, / acétique glacial et d'eau 7 et, sur la base de la coloration avec la
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ninhydrine, peuvent être identifiés comme étant consti- tuas par de l'ornithine de la serine et de la glycine.
Lorsqu'on examine le mélange réactionnel suivant la méthode de Moore et Stein, on peut déceler les trois mêmes aciues aminés, et ce dans la proportion molécu-
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laire serine : glycinc : oznithine = 1 . 2 : 3. Le ferri- chrome exempt de fer, lorsqu'il est hydrolyse avec de
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l'acide chlorhydrique hexanormat et hydrogéné catalyti- quement, ne fournit pas trois, mais seulement deux
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produits positifs à la ninhydrine, à savoir la glycine et l' ornit2rine, Le coprogènc fournit, comme seul produit de scission positif à la ninhydrine, de l'ornithine.
Dans le.spectre de résonance nucléaire magnétique, pris c ur un spectromètre Varian, dans de l'eau lourde, la desferri-crocine présente les signaux suivants : I.,?4 ppm (b, 12 H ; si- et -CH2 de la b-N-hydroxy- ornithino) 2,12 " (s, 9 H ; 3 groupes acétyle)
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3,65 " (b, 6 H ,-CH2 de la 6-N-hydroxy-ornithine) 3,96 " (b, 6 H ; a-CH2de la glycine et p-CH2 de la serine) 4,35 " (b, 4 H ;Ó-CH de l'hydroxy-ornithine et de la serine).
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Dans ce qui précède : s :. vizyrulet, . b large amoncol-
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lement de signaux. Entre parenthèses, on a indiqué l'affectation probable des signaux.
Dans la ferricrocine, les acides aminés que sont la serine (une mole), la glycine (2 moles) et la #-hydroxy-ornithine (3 moles) sont liés en un peptide cyclique. L'hydroxy-ornithine est N(ô)-acétylée ; sur les trois restes ainsi formés de l'acide hydroxamique, le fer est lié de manière complexe. La formule globale de la ferrocrpcome exempte de fer est par suite : tro-(-N-acéthyl)-cyclo-[séryl, (glycyl)2, (6-hydroxy- ornityhl)3]. La séquence des restes d'acides aminés dans l'hexapeptide n'est pas encore déterminée.
Four une séquence alternée des restes *-hydroxy-orinthine, on pourrait attribuer à la ferricrocine la formule structurale suivante :
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A partir de la deferricrocine, on obtient en retour la ferricrocine en ajoutant du chlorure ferrique à un pH neutre.
Leu dérivés de la ferricrocine et de la desferrierocine sont, par exemple, des composés dans lesquels le groupe hydroxyle du reste séryle est
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estérifié, ou dans lesquels les groupes acétyles sont substitués par d'autres groupes acyles, par exemple par des groupes alcanoyles inférieurs comportant de 3 à 6 atomes de carbone ou par des groupes alcénoyles inférieurs ou par des groupes w-hydroxy-alcénoyles inférieurs, comme les groupes propionyle, butyryle, pentanoyle, penténoyle, 5-hydroxy-penténoyle, 5-hydroxy- 3-méthyl-penténoyle. Les dérivés indiqués en premier lieu sont obtenus en traitant de la ferricorcine par des agents d'acylation, par exemple avec des anhydrides d'acide ou des halogénures d'acide,
comme l'anhydride acétique ou le chlorure d'acétyle, et en isolant les esters, et, si on le désire, en éliminant le fer. Le composé désacétylé est obtenu en désacétylant le composé exempt de fer dans un milieu modérément acide, par exemple en présence d'acides minéraux dilués.
L'hexapeptide cyclique ainsi obtenu peut être acylé d'une manière connue ; les groupes C-acyles qui se forment alors peuvent être éliminés avec de l'ammoniac, par exemple dans le méthanol. L'analogue acylé de la desferri-crocine peut, avec des sels de fer,être transformé en le complexe ferrifère correspondant.
La ferricrocine, la desferri-crocine et leurs analogues sont des substances de croissance pour dif- férents micro-organismes et peuvent par suite être utilisés lors de la culture de tels organismes.
Ces composés possèdent des propriétés anti- anémiques et peuvent par suite être utilisés comme médicaments. La desferri-crocine et ses dérivés possèdent également de précieuses propriétés pharmacologiques.
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C'eut ainni qu'ils empêchent le dépôt de pigments
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forrifôi'en dans les tissus ou qu'ils provoquent, dans les cas d'un dépôt; pathologique de far dans l'organisme, une élimination du fer, par exemple dans l'hemochromato#
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et Ilh('ffio;ii(16rooc. Ils peuvent par suite être utilisés de. façon correspondante en thérapeutique.
Les préparations pharmaceutiques renferment les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, convenant pour une utilisation entérale ou parentérale.
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Les i,rfsi,:a rvrt. i on:3 sont obtenues à partir de matières de départ suivant les méthodes usuelles. Des substances de support appropriéts sont des substances ne réagis- sant pas sur la dcsferri-crocine, comme par exemple la gélatine, le lactose, le glucose, le chlorure de sodium, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc,
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<i,cf:: hu U p::'; v'-iétales, des alcools benzyliques, des dominée, rlo:; polyalcoyicne-clycols, la cholestérine et d'autre:.; supports médicinaux connus.
Tout comme d'autres sidéramines, la ferri-
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crocine '..;t. également en mesure de supprimer compéti- vomorxt vis-à-vis des agents pathogènes à Gram positif l'effet anti-bactérien des antibiotiques appar-
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tt'nqnt au groupe des sidéromycines (effet anti- ;.>iï:rcr.yc,ini,:ue).
La ferricrocine, la desferri-crocine, ainsi que leur-) dérivés sont obtenus en cultivant des souches il' 1 lits formant de la ferricrocine, dans des conditions aérobies, dans une solution nutritive aqueuse renfermant une source de carbone et d'azote, ainsi que
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des sels inorganiques, en isolant la ferricrocine et/ou
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la dcsferri-crocinc du filtrat de culture et, ai on le désire, en transformant la ferricrocine en le composé exempt de fer, ou en préparant dos dérivés de ces composés. Etant donné que la formation de la ferricrocine et/ou de la desferri-crocine est favorisée par un milieu nutritif pauvre en fer, il est avantageux d'effectuer la culture avec un manque de fer, de préférence avec une teneur en fer au plus égale à 10-7 mole par litre.
Pour la culture des souches, on envisage, comme sources de carbone et d'azote : des hydrates de carbone, par exemple du glucose, du saccharose, du lactose, de l'amidon, des alcools, comme le mannitol et le glycérol, des acides aminés, par exemple de
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l'crnithine, des peptides, desprotéines et leurs pro- duits de dégradation comme la peptone ou la tryptonc, des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le maïs ou le fro- ment, des résidus de distillation provenant de la fabrication de ]'alcool, des levures, des graines, en particulier de colza et de soja, de coton, deu sels d'ammonium, des nitrates.
Comme sels inorganiques, la solution nutritive peut, par exemple, renfermer des chlorures, des carbonates, des sulfates de métaux alcalins , de métaux alcalino-terreux, du magnésium, du zinc et du manganèse, ainsi que des traces de fer.
La culture a lieu de manière aérobie, c'est- à-dire par exemple en culture de surface au repos, ou de préférence de manière immergée avec secouage ou
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agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans des flacons agités ou dans les fermenteurs connus. Comme température, convient une température comprise entre
18 et 40 C, de préférence une température de 27 C.
Dans ce cas, la solution nutritive présente en général au bout de 8 à 12 jours un important effet analogue à celui de la sidéramine.
L'activité de La ferricrocine peut être déterminée par voie microbiologique à l'aide du test de Bonifas modifié [cf. Zahner et ses collaborateurs, "Arch. Mikrobiol.", 36, pages 325 et suivantes (1960)¯7.
Comme solution-test, on utilise une solution de ferri- mycinc d'une teneur de 0,1 mg par centimètre cube, et comme souche-test, le Staphylococcus aureus de Rosenbach.
On peut également déterminer par voie optique la concentration en ferricrocine de la solution de . culture. A cet effet, on secoue pendant 5 minutes 5 cm3 du liquide de culture avec 1,5 g de chlorure de sodium, avec un centimètre cube d'une solution à 0,1 % de sulfate ferrique et avec 5 cm3 d'alcool benzylique, sépare par centrifugation, filtre la phase organique et détermine l'extinction de cette dernière à 410 m . Comme échantillon de comparaison, on se sert d'un extrait préparé de la même manière nutritive à partir d'une solution Únon-ensemencée.
Au bout de 8 à 12 jours, les cultures acquièrent, une activité correspondant à une quantité de 100 à 200 mg par litre de ferricrocine pure.
Lorsque la culture est terminée, on peut,
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par litre, ajouter un gramme de chlorure ferrique à la solution nutritive, la desferri-crocine présente étant transformée en ferricrocine. On sépare le mycélium du filtrat de culture, de préférence en présence d'un auxiliaire de filtration, par exemple en présence d'Hyflo-Supercel, après quoi la majeure partie de la ferricrocine se trouve dans le filtrat de culture.
Cependant, des quantités notables de cette substance restent adhérentes sur le mycélium. Il est en consé- quence avantageux de bien extraire ce dernier par lavage. Conviennent par exemple, à cet effet, l'eau ou des alcools aqueux, comme le méthanol aqueux.
Pour isoler la ferricrocine à partir du filtrat de culture, on peut procéder suivant des méthodes connues en elles-mêmes et utiliser, par exemple, l'une des méthodes opératoires ou combinai- sons qui sont indiquées ci-après :
1) On peut utiliser des agents d'adsorption, par exemple des charbons actifs comme la norito, des terres activées comme la franconito, la terre à foulon ou la floridine, ou des adsorbants résineux comme l'asmite. L'élution des adsorbats a lieu avantageuse- ment avec des mélanges aqueux de solvants organiques miscibles à l'eau, par exemple avec des mélanges d'eau et de méthanol, d'eau et de pyridine, d'acide acétique dilué et de méthanol, ou d'eau, de méthanol, d'acide acétique glacial et de butanol.
Un mélange de 4 parties en volume d'eau et d'une partie on volume de pyridine s'est avéré particulièrement approprié pour l'élution ou .d'un adsorbat de franconite Úde norite.
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2) On peut de plus soutirer la ferricrocine d'une solution aqueuse à l'aide de solvants organiques.
Pour ce procédé d'extraction, des alcools organiques supérieurs, par exemple l'alcool benzylique ou l'alcool isopropylique, se sont avérés particulièrement appro- priés. Danst ce cas, on ajoute avantageusement à la phase aqueuse un sel inorganique, par exemple du sulfate d'ammonium ou du chlorure de sodium. A partir des extraits organiques obtenus, la ferricrocine peut être obtenue sous forme enrichie, soit par évaporation du solvant, soit par précipitation à l'aide d'un solvant organique convenable, par exemple à l'éther, l'éther le pétrole ou l'acétate d'éthyle.
3) Une autre méthode d'enrichissement de la ferricrocine consiste à la répartir entre une solution aqueuse et une solution de phénol dans le chloroforme, la teneur on phénol, de la solution chloroformique pou- vaut varier.
4) Une autre méthode pour l'enrichissement de la ferricrocine cet constituée par la chromatogra- phie, par exemple une chromatographie d'adsorption eur différentes matières, par exemple sur de la norite, de l'oxyde d'aluminium, des silicates de magnésium, du gel de milice, du sulfate de calcium, ainsi qu'une chromatogrphie de répartition avec de la cellulose, de l'amidon, du gel de silice , de la célite et analogues cornue substances de support.
5) En outre, la ferricrocine peut être enri- chie par une répartition à contre-courant suivant Craig entre deux phases solvantes non-miscibles. Le système
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solvant. au L vaut r-'er.t avéré dans ce cas particulièrement approprié : u-butanol : alcool búnzylique : acide -'h1 /'li,#'Îl'ilUe n:illLlhH'!n11 L solution aqueuse de chlorure >u- ..' l;Lll., :'..lt-',il'r.'E' ;t 19 (9 : 9 : 15 : 5).
La vie;;f errieroeine eut formée, à coté de la f ei'ravrociuo, par lou couches indiquées d'A:yeri,illuâf et peut par :3itc également être isolée directement du filtrat de culture. Loru de 1'1nolernenL, on élimine avantasvui'omoiit. 1<- for prirent, dans Il filtrat de "Ht.i...l'0, 1':.1" exemple par addition de :i111:ttC1l.Ct;:l formant, t1t': (' ('1':1') vXt:; t't.. 1'1' i r," r,';" comme la -Z11'il'OX;iü11101t:1I1C!t j.ar" t')it' :,t .
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On peut, directement après la fin de la fermen- tation, ajouter à la bouillie de culture le substances
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donnant lieu Ù la formation de complexe 1'l.:1'1'i a'l'(':1, L'addition Il lieu [lv:!ntht-:{'U;'t'::1fnt danr; un :'.tu.1c \11 t ,rieur j1 i rai t ##i.-.eni, peur /-Unj!wr t"inlfj1:o.:nt. den ion;3 de ,\:r-(Il1) éventuel! # ##.t.-iit ''ntruîné.3 par leu ogentlJ Llt;i 1:'st:;.=..
L'isolement -se la deyferri-erociue h partir de la solution de culture a lieu suivant le méthode mentionnée!? pour l'isolement de la ferricrocine.
L'invention coiiccrne tr;c').fT;a:rit.t h titre de produite industriels nouveaux, le.1 \"vq)\1.t[) obtenus 1 al" la zicc f'r.. r,E'1.", în l,' -;"1.1/ d''fhJ .# : ¯-.; >;j'i;i : i.tS.-C:i:s)Il t..). Jt 1'lt('\ 1)11.J '-L i! #' ' a u i;is".;. # IftC "Xr"i.if;3 ?',:..^11.:.'.lt.t:l'=t '1'..1.., ,Ü vent, ùuuï ! '.#;; que l lèS :.:;;,;",:;1t1'::(." ir.l i j; i ;-; .#' oh ca de;-":"j ..:f'.t:<1(111c;:.
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EXEMPLE 1
La souche d'Aspergillus versicolor M 3636 est cultivée de manière immergée, à 27 , dans une culture bien aérée. On utilise une solution nutritive renfer- mant, par litre d'eau distillée, 20 g de glucose (exempt de fer), 5 g de L-asparagine, un gramme de phosphate secondaire de potassium, un gramme de sulfate de magnésium cristallisé (MgS04, 7 H20), et 0,5 g de chlorure de calcium. La solution nutritive est stéri- lisée pendant 20 minutes à 120 . On ensemence avec une suspension de spores renfermant de 100 à 200 millions de spores par litre.
Au bout de 8 à 12 jours, on ajoute aux cul- tures un gramme par litre de chlorure ferrique et filtre en ajoutant 2 % de célite. On sature alors le filtrat de culture avec du chlorure de sodium et extrait la solution limpide à deux reprises avec 1/10 volume d'alcool benzylique. On sèche la phase organique avec du sulfate de sodium, la filtre et y ajoute trois volume d'éther. On extrait le mélange d'alcool benzy- lique et d'éther avec de l'eau distillée jusqu'à décolo- ration. On réunit les extraits aqueux, élimine à l'éther les restes de l'alcool benzylique et lyophilise, ce qui fait qu'on obtient une poudre rouge.
On soumet 10,6 g du produit brut à une répar- tition de Craie; en 137 stades. Comme système solvant à deux phases, on se sert d'un mélange constitué par 1,8 litre d'alcool benzylique, par 1,8 litre d'alcool buty- lique normal, par 1,0 litre d'une solution aqueuse
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saturée de chlorure de sodium et par 3 litres d'une solution aqueuse millinormale d'acide chlorhydrique.
Au cours de la répartition, le colorant brun- rouge est essentiellement scindé en un composant prin- cipal et en un composant secondaire. Le composant prin- cipal possède un maximum dans le stade 52 (K 0,55), le composant secondaire dans le stade 123 (K 11 environ = ferrirhodine).
On réunit les fractions 40 à 60. En ajoutant deux volumes d'éther, on chasse la ferricrocine dans la phase aqueuse. On sépare cette dernière et extrait encore la couche organique à deux reprises avec de l'eau. Après avoir réuni les solutions aqueuses, on les sature à peu près à moitié de chlorure de sodium et extrait à plusieurs reprises avec un mélange de phénol et de chloroforme (un kg de phénol par litre de chloroforme). On clarifie sur une colonne de célite les extraits troubles, de teinte brun-rouge, obtenus avec le mélange de phénol et de chloroforme, ajoute un volume double d'éther et extrait à plusieurs reprises avec de l'eau distillée. On lave les solu- tions aqueuses à deux reprises avec de l'éther pour éliminer complètement le phénol, puis les évapore sous vide.
On obtient 1,29 g d'un résidu de teinte brun-rouge. Par recristallisation dans 15 cm environ d'alcool absolu, on obtient la ferricrocine sous la forme de fins cristaux brillants, de teinte rouge- orange, qui se décomposent à 260 environ.
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Analyse : trouvé C 44,06, 44,00 ; H 5,99, 6,03;
Fe 7,38 7,63 N 15,98, 15,77 % calculé pour C28H44O13N9Fe ;
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C 43, 64 ; H 5, 76 ; N 16, 36 ;
Fe 7,25% Spectre d'absorption dans l'éthanol : max = 214 mu fog El cm 2,44) j Àmax = 430 mu (log Et - f5)' Le spectre infra-rouge dans le bromure de potassium présente entre autres des bandes à 636, 725, 783, 976, 1.066, 1.146, 1.240, 1.278 cm-1 (épaulement), à 1.335 cm-1 (épaulement), à 1.372, 1.435 cm-1 (épaule- ment), à 1.466, 1.533, 1.586, 1.665, 2.918, 3.026 cm-1 (épaulement), à 3.410 cm-1, cf. figure 1.
Dans un chromatogramme sur papier, on a comparé la ferricrocine avec d'autres sidéramines, voir tableau 1. La méthode est la suivante : on imprègne une feuille de papier filtre Whatman n 1 avec un mélange d'acétone, d'eau et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (rapport volumétrique 6:3:1),puis le sèche à l'air pendant 10 à 15 minutes. Sur la ligne de départ, on apporte alter- nativement une goutte d'une solution méthanolique de la substance de comparaison (points de départ 1, 3, 5 et 7) et de la ferricrocine (points de départ 2, 4, 6 et 8). Le chromatogramme est développé pendant 20 heures environ avec, comme éluant, un mélange (2: 1:1) de butanol tertiaire, d'acide chlorhydrique 0,004-normal et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. 11 taches des sidéramines sont reconnues à leur couleur propre.
Malgré la différence relativement minime aans les valeurs de Rf de quelques
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sidéramines, il en résulte, d'après la méthode décrite, une différenciation indubitable.
Tableau 1
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<tb> Sidéramine <SEP> Rf <SEP> (système <SEP> I) <SEP> R <SEP> (système <SEP> II)
<tb>
<tb> Ferrichrome <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0,30
<tb> Ferricrocine <SEP> 0,29 <SEP> 0,28
<tb> Ferrichrysine <SEP> 0,26 <SEP> 0,34
<tb> Coprogène <SEP> 0,43 <SEP> 0,55
<tb> Ferrirubine <SEP> 0,42 <SEP> 0,73
<tb> Ferrirhodine <SEP> 0,43 <SEP> 0,88
<tb>
EXEMPLE 2
On cultive la couche d'Aspergillus versicolor M 3636 comme dans l'exemple 1, ajoute du chlorure ferrique au milieu de culture et filtre en ajoutant de la célite. On extrait le filtrat de culture obtenu à trois reprises avec 1/20 volume d'un mélange de chloro- forme et de phénol (une partie en volume : une partie en poids), sépare la phase organique et la filtre à travers de la célite.
On ajoute alors trois volumes d'éther à la solution organique et l'extrait à plusieurs reprises avec de l'eau distillée jusqu'à décoloration.
On réunit les extraits aqueux, les lave à l'éther pour éliminer les restes de phénol, les débarrasse de l'éther sous vide, puis lyophilise. Le produit brut obtenu est purifié comme dans l'exemple 1.
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De la même manière que celle décrite dans les exemples 1 et 2, on obtient la ferricrocine en cultivant l'une des souches Aspergillus fumigatus
M 57 ou M 3628, Aspergillus nidulans M 2734,
Aspergillus versicolor M 3620 ou Aspergillus humicola M 3635, puis en traitant le milieu de culture comme décrit.
A partir du filtrat de culture d'Aspergillus nidulans M 2734, on obtient le même composant secon- daire que dans le cas de l'Aspergillus versicolor M 3636, à savoir la ferrihodine. Les souches d'Asper- gillus fumigatus M 57 et M 3628 fournissent un composant secondaire dont les valeurs de R,. dans les systèmes I et II sont respectivement de 0,67 et d'environ 0,9.
EXEMPLE 3
Dans 30 cm3 d'eau, on dissout 740 mg de ferri- crocine cristallisée et ajoute un gramme de 8-hydroxy- quinoléine en solution dans 10 cm3 de méthanol environ.
Après avoir agité pendant 20 neures, on pare le préci- pité noir par filtration et élimine le réactif en excès du filtrat en extrayant à plusieurs reprises avec du chloroforme. On évapore sous vide la solution aqueuse de teinte jaunâtre pâle et obtient la ferri- crocine exempte de fer sous la forme d'une poudre amorphe presque incolore. Le rendement est de 675 mg.
Le spectre de résonance nucléaire magnétique de ce composé, pris avec un spectromètre de Varian, modèle A 60, dans de l'eau lourde, présente les signaux suivants (cf. fig. 2) :
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1,74 ppm (b, 12 h ; ss- et -CH2 de la ô-N-hydroxy- ortithine) 2,12 " (s, 9 H ; 3 groupes acétyles) 3,65 " (b, 6 H ; -CH2 de la ô-N-hydroxy-ornithine) 3,96 " (b, 6 H ; Ó-CH2 de la glycine et (3-CH2 de la serine) 4,35 " (b, 4 H ; a-CH de l'hydroxy-ornithine et de la sérine) Dans ce qui précède : s = singulet ; b large amoncel- lement de signaux.
EXEMPLE 4
Dans un tube en verre, on scelle 90 mg de ferricrocine exempte de fer avec 2 cm3 d'acide chlor- hydrique hexanormal, puis chauffe pendant 20 heures à 110 . On évapore le mélange d'hydrolyse sous vide jusqu'à siccité, dissout le résidu dans peu d'eau et dilue à 20 cm3 avec de l'alcool absolu. On hydrogène cette solution pendant une nuit sous la pression atmosphérique en présence de 50 mg d'oxyde de platine préalablement hydrogéné, puis sèche le mélange de réduction sous vide. On soumet un échantillon du pro- duit réactionnel à un examen chromatographique sur papier, en développant d'abord avec un mélange de phénol et d'eau (8:2) et ensuite dans la seconde dimension avec un mélange de butanol, d'acide acétique glacial et d'eau (4:1:1).
En teintant avec de la ninhydrine, on obtient trois taches qu'on peut, par comparaison avec les préparations authentiques, attribuer aux acides aminés que sont l'ornithine,
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la sérine et la glycine. Lorsqu'on examine le mélange réactionnel suivant la méthode de Moore et Stein, on peut déceler les trois mêmes acides aminés et ce dans la proportion moléculaire serine : glycine : ornithine 1: 2: 3 (arrondi à des nombres entiers).
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The new active substances ferricrocin and desferricrocin produced by strains of Aspergillus, and their derivatives, and process for their preparation.
A fairly large number of iron-containing growth substances have already been isolated from materials of biological origin, in particular microorganisms, for example ferrichromes, coprogen, terri-examines.
It has now been found that, from Aspergillus marigolds, a new growth substance containing iron, namely ferricrocin, and the corresponding iron-free compound, desferricrocin, can be obtained. The ferricrocin-forming strains are, in particular, Aspergillus versicolor M 3636 and M 3620, Aspergillus fumigatus M 57 and M 3628, Aspergillus nidulans M 2734 and Aspergillus humicola M 3635. The present invention has in particular Consequently, the object is a process for the preparation of ferricrocine, desfe.rricrocine and derivatives of these compounds.
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The strains indicated were stored at the Federal Polytechnic School, Institute of Special Botany, in Zurich, as well as in the laboratories of the Applicant, under the indicated designation. The determination of Aspergillus species took place according to the indications given by Ch. Thom and K.B.
Raper in the publication entitled "A Manual of Aspergilli", Baltimore, The Williams & Wilkings Co., 1945.
The strains of Aspergillus versicolor M 3620 and M 3636 were isolated from a test sample taken in a spreading ground in MUnater, Westphalia. By the small green conidial heads, partly also flesh-colored, by the smooth, non-tinted walls of the conidial supports and by the double series of sterigmas, by the spherical vesicles and the absence of perithecia, it was possible to determine that the organisms were representative of the Aspergillus versicolor group. Because of the thorn-shaped conidia, the strains are to be placed in the category of Aspergillus versicolor (Vuill.) Of Tiraboschi (1908). This species presents a great variability (Loc. Cit., Page 192).
The strains of Aspergillus fumigatus M 57 and M 3628, the one mentioned last having been isolated from a vineyard land of the Federal Research Institute (Eidg. Versuchsanstalt) in Wëdenswil in the canton of Zurich, show small heads of conidia, green to dark gray-green in color, the vesicles are bottle-shaped and have a
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series of sterigmas; the masses of conidia are arranged in the form of long columns and the carriers of conidia are smooth-walled and the conidia are spherical. The two organisms are therefore to be placed in the Aspergillus fumigatus group.
Since, moreover, in the two strains no perithecia is formed, they are to be classified in the category of Aspergillus fumigatus of Fresenius, 1850/53. As
Thom and Raper determined this (loc. Cit., Pages 148 to
151), the possibility of variation of the category is considerable.
Aspergillus nidulans M 2734 was isolated from a test sample taken in a water treatment site in Münster, Westphalia. The strain forms, in pure culture, perithecia with red-brown asci, which certifies that it belongs to the Aspergillus nidulans group. The two longitudinal bars, about a micron wide, on the smooth asci are typical for the Aspergillus nidulans (Eidam) Wint category. in Rabh. 1884. The strain M 2734 differs only slightly from the description made by Thom and Raper, especially in the mostly somewhat paler pigmentation and in the slightly narrower longitudinal bars.
Aspergillus humicola M 3635 has also been isolated from the indicated vineyard. The small heads of green conidia, partly flesh-colored, the walls smooth, unstained, of the carriers of conidia, the double series of sterigmas, the vesicles
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spherical and the lack of formation of perithecia makes it possible to realize that the strain is a representative of the Aspergillus versicolor group. Because of the smooth spores, it can be classified in the category of Aspergillus humicola of Chaudhuri and Sachar, 1934 (cf. "Ann. Myc." 32, 90: 1934¯7).
Ferricrocin is a crystalline substance, red-orange in color, which is well soluble in water and methanol, even when cold. The compound has the elemental composition: C = 44.06%, 44.00%; H = 5.99%, 6.03%; N = 15.98%, 15.77%; Fe = 7.38%, 7.63%; 0 = 26.59%, 26.57% (calculated).
These values correspond to the raw formula:
C28H44O13N9Fe The ultraviolet spectrum in ethanol shows maxima at 214 m (log E11% cm = 2.44) and at 430 m (log E11% cm = 1.52). The infrared spectrum in potassium bromide shows, among others, bands at 636, 725, 783, 976, 1.066, 1.146, 1.240, 1.278 cm-1 (shoulder), at 1.335 cm-1 (shoulder), at 1.372, 1.435 cm-1 (shoulder), at 1.466, 1.533, 1.586, 1.665, 2.918, 3.026 cm-1 (shoulder), at 3.410 cm-1, cf. figure 1.
The crystals decompose at around 260 C, without melting, giving a black color. In a chromatogram on paper, the following values of Rf are obtained; 0.29 in a system (4: 1: 1) of normal butanol, glacial acetic acid and water (system I) and 0.28 in a system (2: 1: 1) of tertiary butanol,
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0.004-normal hydrochloric acid and a saturated aqueous solution of sodium chloride (system II), the paper being impregnated with a mixture (6: 3: 1) of acetone, water and an aqueous solution saturated with sodium chloride.
Under the poor test conditions, the following were obtained: for the ferrichrome Rf values of 0.28 (in system I) and 0.30 (in system 11); for coprogen, Rf values of 0.43 (in system I) and 0.55 (in system II) and, for ferrichrysin, Rf values of 0.26 (in system I) and of 0.34 (in system II).
During the acid hydrolysis of ferricrocin, 3 moles of acetic acid are formed.
Ferricrocin differs above all from ferrichrome by its easy solubility in methanol.
Ferrichrome is almost insoluble in cold methanol and only dissolves on prolonged boiling in about a thousand times the quantity of methanol. The other differences result from the composition of amino acids.
When ferricrocin is treated with bases or acids or with substances that give rise to the formation of iron complexes, the iron is removed from the molecule, resulting in a colorless powder, namely the desferri- crocin.
When this is hydrolysed with hexanormal hydrochloric acid and catalytically hydrogenated the hydrolysis products (in order to reduce any hydroxylaminogenic groups present), one obtains
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three products which are ninhydrin positive and which on the basis of chromatographic examination on
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eluent paper: mixture (8: 2) of phenol and water and acid then mixture (4: 1: 1) of butanol, / glacial acetic and water 7 and, on the basis of the coloring with the
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ninhydrin, can be identified as serine and glycine ornithine.
When the reaction mixture is examined according to the method of Moore and Stein, the same three amino acids can be detected in the molecular proportion.
EMI6.3
serine laire: glycinc: oznithine = 1. 2: 3. Ferri-chromium free from iron, when hydrolyzed with
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hydrochloric acid hexanormat and catalytically hydrogenated, does not furnish three, but only two
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ninhydrin positive products, namely glycine and ornithine. The coprogen provides, as the only ninhydrin positive cleavage product, ornithine.
In the nuclear magnetic resonance spectrum, taken in a Varian spectrometer, in heavy water, desferri-crocin shows the following signals: I.,? 4 ppm (b, 12 H; si- and -CH2 of bN-hydroxy-ornithino) 2.12 "(s, 9 H; 3 acetyl groups)
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3.65 "(b, 6 H, -CH2 from 6-N-hydroxy-ornithine) 3.96" (b, 6 H; a-CH2 from glycine and p-CH2 from serine) 4.35 "( b, 4 H; Ó-CH of hydroxy-ornithine and serine).
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In the above: s:. vizyrulet,. b large heap
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lement of signals. In parentheses, the probable assignment of the signals has been indicated.
In ferricrocin, the amino acids serine (one mole), glycine (2 moles) and # -hydroxy-ornithine (3 moles) are linked in a cyclic peptide. The hydroxy-ornithine is N (6) -acetylated; of the three residues thus formed of hydroxamic acid, iron is bound in a complex manner. The overall formula of iron-free ferrocrpcoma is therefore: tro - (- N-acetyl) -cyclo- [seryl, (glycyl) 2, (6-hydroxy-ornityhl) 3]. The sequence of amino acid residues in the hexapeptide has not yet been determined.
For an alternating sequence of * -hydroxy-orinthine residues, ferricrocin could be attributed the following structural formula:
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From deferricrocin, ferricrocin is returned by adding ferric chloride at neutral pH.
Leu derivatives of ferricrocin and desferrierocin are, for example, compounds in which the hydroxyl group of the seryl residue is
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esterified, or in which the acetyl groups are substituted by other acyl groups, for example by lower alkanoyl groups having from 3 to 6 carbon atoms or by lower alkenoyl groups or by w-hydroxy-lower alkenoyl groups, such as propionyl, butyryl, pentanoyl, pentenoyl, 5-hydroxy-pentenoyl, 5-hydroxy-3-methyl-pentenoyl groups. The derivatives indicated in the first place are obtained by treating ferricorcin with acylating agents, for example with acid anhydrides or acid halides,
such as acetic anhydride or acetyl chloride, and isolating esters, and, if desired, removing iron. The deacetylated compound is obtained by deacetylating the iron-free compound in a moderately acidic medium, for example in the presence of dilute mineral acids.
The cyclic hexapeptide thus obtained can be acylated in a known manner; the C-acyl groups which then form can be removed with ammonia, for example in methanol. The acylated analogue of desferri-crocin can, together with iron salts, be transformed into the corresponding iron complex.
Ferricrocin, desferri-crocin and their analogues are growth substances for various microorganisms and can therefore be used in the cultivation of such organisms.
These compounds have anti-anemic properties and can therefore be used as medicaments. Desferri-crocin and its derivatives also have valuable pharmacological properties.
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So they prevent the deposition of pigments
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forrifôi'en in the tissues or that they cause, in the cases of a deposit; pathological of far in the body, elimination of iron, for example in the hemochromato #
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and Ilh ('ffio; ii (16rooc. They can therefore be used correspondingly in therapy.
Pharmaceutical preparations contain the indicated compounds in admixture with a pharmaceutical carrier material, organic or inorganic, suitable for enteral or parenteral use.
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The i, rfsi,: a rvrt. i on: 3 are obtained from starting materials according to the usual methods. Suitable carrier substances are substances which do not react with dcsferri-crocin, such as, for example, gelatin, lactose, glucose, sodium chloride, starch, magnesium stearate, talc, etc.
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<i, cf :: hu U p :: '; v'-iétales, benzyl alcohols, dominated, rlo :; polyalkyl-clycols, cholesterin and other:.; known medicinal carriers.
Like other sideramines, ferri-
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crocin '..; t. also able to suppress competi- vomorxt vis-à-vis Gram-positive pathogens the anti-bacterial effect of the antibiotics involved.
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tt'nqnt in the group of sideromycins (anti- effect;.> iï: rcr.yc, ini,: ue).
Ferricrocin, desferri-crocin, as well as their-) derivatives are obtained by culturing ferricrocin-forming strains 11, under aerobic conditions, in an aqueous nutrient solution containing a source of carbon and nitrogen, thus than
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inorganic salts, isolating ferricrocin and / or
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removing ferricrocin from the cultured filtrate and, if desired, converting ferricrocin to the iron-free compound, or preparing derivatives thereof. Since the formation of ferricrocin and / or desferri-crocin is favored by a nutrient medium poor in iron, it is advantageous to carry out the culture with a lack of iron, preferably with an iron content at most equal at 10-7 mole per liter.
For the culture of the strains, the following sources of carbon and nitrogen are considered: carbohydrates, for example glucose, sucrose, lactose, starch, alcohols, such as mannitol and glycerol, amino acids, for example
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crnithin, peptides, proteins and their degradation products such as peptone or tryptonc, meat extracts, water-soluble fractions of cereal seeds such as corn or fro- nium, residues of distillation from the manufacture of alcohol, yeasts, seeds, in particular rapeseed and soybean, cotton, ammonium salts, nitrates.
As inorganic salts, the nutrient solution may, for example, contain chlorides, carbonates, alkali metal, alkaline earth metal sulphates, magnesium, zinc and manganese, as well as traces of iron.
The culture takes place aerobically, that is to say for example in surface culture at rest, or preferably in an immersed manner with shaking or
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stirring with air or oxygen in stirred flasks or in known fermenters. As temperature, a temperature between
18 and 40 C, preferably a temperature of 27 C.
In this case, the nutrient solution generally exhibits after 8 to 12 days an important effect similar to that of sideramine.
The activity of ferricrocin can be determined microbiologically using the modified Bonifas test [cf. Zahner et al., "Arch. Mikrobiol.", 36, pages 325 and following (1960) ¯7.
As the test solution, a ferrimycinc solution with a content of 0.1 mg per cubic centimeter is used, and as the test strain, Rosenbach's Staphylococcus aureus.
The ferricrocin concentration in the solution can also be determined optically. culture. For this purpose, 5 cm3 of the culture liquid are shaken for 5 minutes with 1.5 g of sodium chloride, with one cubic centimeter of a 0.1% solution of ferric sulphate and with 5 cm3 of benzyl alcohol, separates by centrifugation, filters the organic phase and determines the extinction of the latter at 410 m. As a comparison sample, an extract prepared in the same nutrient manner from an unseeded solution is used.
After 8 to 12 days, the cultures acquire an activity corresponding to an amount of 100 to 200 mg per liter of pure ferricrocin.
When the culture is finished, we can,
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per liter, add one gram of ferric chloride to the nutrient solution, the desferri-crocin present being converted into ferricrocin. The mycelium is separated from the culture filtrate, preferably in the presence of a filter aid, for example in the presence of Hyflo-Supercel, after which most of the ferricrocin is in the culture filtrate.
However, significant amounts of this substance remain adherent to the mycelium. It is therefore advantageous to extract the latter well by washing. For example, water or aqueous alcohols, such as aqueous methanol, are suitable for this purpose.
To isolate ferricrocin from the cultured filtrate, one can proceed according to methods known per se and use, for example, one of the operating methods or combinations which are given below:
1) Adsorption agents can be used, for example activated carbons like norito, activated earths like franconito, fuller's earth or floridin, or resinous adsorbents like asmite. Elution of the adsorbates advantageously takes place with aqueous mixtures of organic solvents miscible with water, for example with mixtures of water and methanol, water and pyridine, dilute acetic acid and methanol. , or water, methanol, glacial acetic acid and butanol.
A mixture of 4 parts by volume of water and 1 part by volume of pyridine has been found to be particularly suitable for the elution or adsorbate of franconite from norite.
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2) The ferricrocin can also be withdrawn from an aqueous solution using organic solvents.
For this extraction process, higher organic alcohols, for example benzyl alcohol or isopropyl alcohol, have been found to be particularly suitable. In this case, an inorganic salt, for example ammonium sulfate or sodium chloride, is advantageously added to the aqueous phase. From the organic extracts obtained, the ferricrocin can be obtained in enriched form, either by evaporation of the solvent, or by precipitation using a suitable organic solvent, for example with ether, petroleum ether or l. 'ethyl acetate.
3) Another method of enriching ferricrocin consists in dividing it between an aqueous solution and a solution of phenol in chloroform, the phenol content of the chloroform solution may vary.
4) Another method for the enrichment of ferricrocin is constituted by chromatography, for example an adsorption chromatography on different materials, for example on norite, aluminum oxide, magnesium silicates , militia gel, calcium sulphate, as well as partition chromatography with cellulose, starch, silica gel, celite and the like retort carrier substances.
5) In addition, ferricrocin can be enriched by a countercurrent distribution along Craig between two immiscible solvent phases. The system
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solvent. au L is r-'er.t proved in this case particularly suitable: u-butanol: búnzyl alcohol: acid -'h1 / 'li, #' Îl'ilUe n: illLlhH '! n11 L aqueous chloride solution> u- .. 'l; Lll.,:' .. lt - ', il'r.'E'; t 19 (9: 9: 15: 5).
The life ;; f errieroeine had formed, next to the f ei'ravrociuo, by the indicated layers of A: yeri, illuâf and can by: 3itc also be isolated directly from the culture filtrate. Loru of 1'1nolernenL, avantasvui'omoiit is eliminated. 1 <- for took, in He filtrate of "Ht.i ... l'0, 1 ':. 1" example by addition of: i111: ttC1l.Ct;: l forming, t1t': ('(' 1 ': 1') vXt :; t't .. 1'1 'ir, "r,';" like -Z11'il'OX; iü11101t: 1I1C! T j.ar "t ') it':, t.
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Immediately after fermentation has ended, the substances can be added to the culture slurry.
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giving rise to the formation of 1'l.: 1'1'i a'l '(': 1, The addition takes place [lv:! ntht -: {'U;' t ':: 1fnt danr; a: '. tu.1c \ 11 t, laughing j1 i rai t ## i .-. eni, fear / -Unj! wr t "inlfj1: o.: nt. den ion; 3 de, \: r- ( Il1) possible! # ##. T.-iit '' ntruîné.3 by leu ogentlJ Llt; i 1: 'st:;. = ..
Isolation of deyferri-erociue from the culture solution takes place according to the method mentioned !? for the isolation of ferricrocin.
The invention relates to tr; c '). FT; a: rit.th title of new industrial products, the.1 \ "vq) \ 1.t [) obtained 1 al" la zicc f'r .. r, E '1. ", în l,' -;" 1.1 / d''fhJ. #: ¯- .; >; i i; i: i.tS.-C: i: s) He t ..). Jt 1'lt ('\ 1) 11.J' -L i! # '' aui; is ".;. # IftC" Xr "i.if; 3? ',: .. ^ 11.:.'.lt.t:l'=t' 1 '.. 1 .., , Ü wind, ùuuï! '. # ;; que lèS:.: ;;,; ",:; 1t1': :(." Ir.lij; i; -;. # 'Oh ca de; - ": "j ..: f'.t: <1 (111c;:.
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EXAMPLE 1
Aspergillus versicolor strain M 3636 is grown submerged, at 27, in a well-aerated culture. A nutrient solution is used containing, per liter of distilled water, 20 g of glucose (iron-free), 5 g of L-asparagine, one gram of secondary potassium phosphate, one gram of crystallized magnesium sulfate (MgS04 , 7 H2O), and 0.5 g of calcium chloride. The nutrient solution is sterilized for 20 minutes at 120. It is inoculated with a spore suspension containing 100 to 200 million spores per liter.
After 8 to 12 days, one gram per liter of ferric chloride is added to the cultures and filtered by adding 2% celite. The culture filtrate is then saturated with sodium chloride and the clear solution extracted twice with 1/10 volume of benzyl alcohol. The organic phase is dried with sodium sulfate, filtered and added to it three volumes of ether. The mixture of benzyl alcohol and ether is extracted with distilled water until discoloration. The aqueous extracts are combined, the residues of the benzyl alcohol are removed with ether and lyophilized, which gives a red powder.
10.6 g of the crude product are subjected to a chalk distribution; in 137 stages. As the two-phase solvent system, a mixture consisting of 1.8 liters of benzyl alcohol, 1.8 liters of normal butyl alcohol, 1.0 liters of an aqueous solution is used.
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saturated with sodium chloride and 3 liters of a millinormal aqueous solution of hydrochloric acid.
During partitioning, the red-brown dye is essentially split into a main component and a secondary component. The main component has a maximum in stage 52 (K 0.55), the secondary component in stage 123 (approximately K 11 = ferrirhodin).
Fractions 40 to 60 are combined. By adding two volumes of ether, ferricrocin is removed in the aqueous phase. The latter is separated and the organic layer is further extracted twice with water. After combining the aqueous solutions, they are saturated approximately halfway with sodium chloride and extracted several times with a mixture of phenol and chloroform (one kg of phenol per liter of chloroform). The turbid, red-brown extracts obtained with the mixture of phenol and chloroform are clarified on a celite column, a double volume of ether is added and extracted several times with distilled water. The aqueous solutions were washed twice with ether to completely remove the phenol, then evaporated in vacuo.
1.29 g of a residue of brown-red color are obtained. By recrystallization from about 15 cm of absolute alcohol, ferricrocin is obtained in the form of fine shiny crystals, of red-orange tint, which decompose at about 260.
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Analysis: Found C 44.06, 44.00; H 5.99, 6.03;
Fe 7.38 7.63 N 15.98, 15.77% calcd for C28H44O13N9Fe;
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C 43, 64; H 5.76; N 16, 36;
Fe 7.25% Absorption spectrum in ethanol: max = 214 mu fog El cm 2.44) j Àmax = 430 mu (log Et - f5) 'The infra-red spectrum in potassium bromide presents among others bands at 636, 725, 783, 976, 1.066, 1.146, 1.240, 1.278 cm-1 (shoulder), at 1.335 cm-1 (shoulder), at 1.372, 1.435 cm-1 (shoulder), at 1.466, 1.533, 1.586, 1.665, 2.918, 3.026 cm-1 (shoulder), at 3.410 cm-1, cf. figure 1.
In a chromatogram on paper, ferricrocin was compared with other sideramines, see Table 1. The method is as follows: a sheet of Whatman No. 1 filter paper is impregnated with a mixture of acetone, water and a saturated aqueous solution of sodium chloride (volume ratio 6: 3: 1), then air dry for 10 to 15 minutes. A drop of a methanolic solution of the comparison substance (starting points 1, 3, 5 and 7) and ferricrocine (starting points 2, 4, 6 and 8) is alternately added to the starting line. ). The chromatogram is developed for about 20 hours with, as eluent, a mixture (2: 1: 1) of tertiary butanol, 0.004-normal hydrochloric acid and a saturated aqueous solution of sodium chloride. 11 sideramine spots are recognized by their own color.
Despite the relatively small difference in the Rf values of a few
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sideramines, according to the method described, there results an unmistakable differentiation.
Table 1
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<tb> Sidéramine <SEP> Rf <SEP> (system <SEP> I) <SEP> R <SEP> (system <SEP> II)
<tb>
<tb> Ferrichrome <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0.30
<tb> Ferricrocine <SEP> 0.29 <SEP> 0.28
<tb> Ferrichrysin <SEP> 0.26 <SEP> 0.34
<tb> Coprogenic <SEP> 0.43 <SEP> 0.55
<tb> Ferrirubin <SEP> 0.42 <SEP> 0.73
<tb> Ferrirhodine <SEP> 0.43 <SEP> 0.88
<tb>
EXAMPLE 2
The layer of Aspergillus versicolor M 3636 is cultivated as in Example 1, ferric chloride is added to the culture medium and filtered by adding celite. The resulting culture filtrate is extracted three times with 1/20 volume of a mixture of chloroform and phenol (one part by volume: one part by weight), the organic phase is separated and filtered through Celite. .
Three volumes of ether are then added to the organic solution and extracted several times with distilled water until discoloration.
The aqueous extracts are combined, washed with ether to remove the phenol residues, freed from the ether in vacuo, then lyophilized. The crude product obtained is purified as in Example 1.
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In the same way as that described in Examples 1 and 2, ferricrocin is obtained by cultivating one of the Aspergillus fumigatus strains
M 57 or M 3628, Aspergillus nidulans M 2734,
Aspergillus versicolor M 3620 or Aspergillus humicola M 3635, then treating the culture medium as described.
From the culture filtrate of Aspergillus nidulans M 2734 the same secondary component is obtained as in the case of Aspergillus versicolor M 3636, namely ferrihodine. Aspergillus fumigatus strains M 57 and M 3628 provide a secondary component with values of R i. in Systems I and II are 0.67 and about 0.9, respectively.
EXAMPLE 3
In 30 cm3 of water, 740 mg of crystallized ferricrocin are dissolved and one gram of 8-hydroxyquinoline dissolved in approximately 10 cm3 of methanol is added.
After stirring for 20 neurons, the black precipitate is filtered off and the excess reagent removed from the filtrate by extracting several times with chloroform. The pale yellowish aqueous solution was evaporated in vacuo to give the iron-free ferricrocin as an almost colorless amorphous powder. The yield is 675 mg.
The magnetic nuclear resonance spectrum of this compound, taken with a Varian spectrometer, model A 60, in heavy water, shows the following signals (see fig. 2):
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1.74 ppm (b, 12h; ss- and -CH2 of ô-N-hydroxyortithin) 2.12 "(s, 9H; 3 acetyl groups) 3.65" (b, 6H; - CH2 from ô-N-hydroxy-ornithine) 3.96 "(b, 6 H; Ó-CH2 from glycine and (3-CH2 from serine) 4.35" (b, 4 H; a-CH from hydroxy-ornithine and serine) In the above: s = singlet; b large accumulation of signals.
EXAMPLE 4
In a glass tube, seal 90 mg of iron-free ferricrocin with 2 cm3 of hexanormal hydrochloric acid, then heat for 20 hours at 110. The hydrolysis mixture is evaporated in vacuo to dryness, the residue is dissolved in little water and diluted to 20 cm3 with absolute alcohol. This solution is hydrogenated overnight at atmospheric pressure in the presence of 50 mg of previously hydrogenated platinum oxide, then the reduction mixture is dried under vacuum. A sample of the reaction product is subjected to chromatographic examination on paper, developing first with a mixture of phenol and water (8: 2) and then in the second dimension with a mixture of butanol, acid. glacial acetic and water (4: 1: 1).
By tinting with ninhydrin, we get three spots that can, by comparison with the authentic preparations, attribute to the amino acids that are ornithine,
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serine and glycine. When the reaction mixture is examined according to the method of Moore and Stein, the same three amino acids can be detected in the molecular ratio serine: glycine: ornithine 1: 2: 3 (rounded to whole numbers).