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Lex nouvsl3.ee t1..tbetMC!-t15 Active* t,IT1rub1ne et <!te*f M'l.- ruolne produites {.ar 4àte ouche* 4e Pan1c111jum, et leliri dér1vé. et pr,-.el pour leur préparation.
A partir de matières d'origine biologique
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en particulier à partir de sicro-organismes, on a déjà isolé un assez grand nombre de substances de croissance renfermant du fer, par exemple les ferrichromes, le
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coprogèn3 et les ferri-oxem4..-.eB.
On a maintenait trouvé qu'on pouvait, a partir de souches de champignons -le la famille des
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aspergillacées, obtenir une nouvelle substance de croissance renfermant du fer, à savoir la ferrirubine, et la composé correspondant exempt de fer, la desterri- rubine. Lee souches formant la ferrirubine sont en particulier le Pénicillium variabile M 2733, le
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Spicaria Hp. M 4622 et le Paecilomyces varioti K 4646.
La présente invention a en conséquence pour objet un procédé de préparation de la ferrirubine, de la desferri- rubine, de leurs produits d'hydrogénation et des dérivés de ces composés.
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Les couches indiquée sont conservées à l'Ecole Folytechinque Fédérale, Institut de Botanique Spécial à Zurich, ainsi que dans les laboratoires de la Demanderesse sous la désignation indiquée. La déter- mination des souches a eu lieu suivant les indications fournies par K.B. Raper et Ch. Thom dans la publication intitulée "A Manual of the Penicillia", Baltimore, the Williams & Wilkings Co., 1949.
Le Pénicillium variablie M 2733 a été isolé à partir d'une prise d'essai faite dans le sol du Jardin Botanique à Zurich. La souche est à classer dans la section des biverticillées symétriques des Penicillia. Etant donné que les périthèces ou les scléroties font défaut, que les colonies présentent une surface veloutée typique et que la face dorsale des colonies est souvent d'une teinte orange-rouge à brune, la souche appartient aux séries du Pénicillium purpurogenum. Ce qui est en outre caractéristique pour la souche ETH M 2733, c'est la formation de parties jaunes stériles de mycélium aérien, ce qui fait que la souche isolée est à ranger dans la caté- gorie du Pénicillium variabile de Sopp, 1912.
La description de cette catégorie est explicite chez Râper et Thom (loc. cit., pages 642 à 644) et la souche M 2733 peut être très bien rangée dans le domaine de variation de cette espèce.
Le Spicaria sp. M 4622 a été isolé à partir d'un échantillon d'un moût non fermenté provenant de la "Zentralstelle für Obst- und Kartoffelverwertung", ayant son siège à Wädenswil, dans le canton de Zurich,
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L'organisme présente une sporulation de teinte jaunâtre à couleur sable ; les longs stérigmes effilés se forment en verticilles et présentent des tendances fortement divergentes ; les conidies se forment en chaînes, aux extrémités des stérigmes. De telles formes sont à classer dans la famille du Spicaria de Harz,
1871 (Râper et Thom, pages 24 et 25). Il n'est pas possible de déterminer avec sûreté une catégorie à l'intérieur de la famille du Spicaria, car les prin- cipes de différenciation de la catégorie ne sont pas immuables.
L'isolement est par suite à définir comme Spicaria species, scuche ETH M 4622.
Le Paecilomyces varioti M 4646 a été isolé par le "Eidg. Versuchsanstalt" à Wädenswil, canton de Zurich. L'organisme forme d'abondantes conidies de teinte jaune-brunâtre d'un ovale allongé, aux extrémités de porteurs de conidies longs et effilés qui sont disposés à la manière de verticilles et divergent fortement. L'organisme est à ranger dans la famille du Paccilomyces de Bainier, 1907 et dans cette famille, à la catégorie du Paecilomyces varioti de Bainier, 1907, qui est peut être l'unique catégorie fort variable de la famille (cf. Raper et Thom, pages 688 à 692). la ferrirubine est une substance brun-rouge qui jusqu'à présent n'a été obtenue qu'à l'état amorphe. Elle est très hygroscopique.
Les valeurs trouvées à l'analyse sont les suivantes : C= 49,01 % ; H= 6,57 % ; N - 12,70 % ; Fe - 5,25 % ; o ¯ 26,47 % (calculé ) ; acétyle - 0 %.
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Le spectre ultra-violet dans l'éthanol présente des maxima à 216 m (log E11% cm = 2,58) ; à 252 m (log E11%cm= 2,4) et à 450 m (log E11 %cm = 1,52). Le spectre infra-rouge, dans le bromure de potassium, présente entre autres des bandes à 842, 945 990 cm-1 (épaulement), à 1.040, 1.066, 1.125 cm-1 (épaulement), à 1.195 cm-1 (épaulement), à 1.239, 1.282 cm-1 (épaule- ment), à 1.341 cm-1 (épaulement), à 1.366, 1.460, 1.533, 1.647, 2.938, 3.085 cm-1 (épaulement),à 3.420 cm-1, cf. fig. 1.
Dans un chromatogra.nme sur papier, on obtient les valeurs de Rf suivantes : 0,42 dans un système (4:1:1) de butanol normal, d'acide acétique glacial et d'eau (système I) et 0,73 dans un système (2:1:1) de butanol tertiaire, d'acide chlorhydrique 0,004-normal et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (système II), le papier étant imprégné avec un mélange (6:3:1) d'acétone, d'eau et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium.
Lors de l'hydrolyse acide de la ferrirubine, on n'obtient, pas à l'encontre de ce qui est le cas pour le ferrichrome, la ferrichrysine et la ferricrocine, d'acide acétique, mais 3 moles du trans-5-hydroxy-3- méthyl-pentène-(2)-olque.
Lorsqu'on traite la ferrirubine avec des bases ou des acides, ou avec des substances donnant lieu à la formation de complexes ferrifères, le fer est éliminé de la molécule, ce qui fait qu'il se forme une poudre incolore, à savoir la desferri-rubine.
Lorsqu'on hydrolyse cette dernière avec de l'acide
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chlorhydrique hexanormal, et hydrogène catalytiquement les produits de l'hydrolyse (en vue de réduire des groupes hydroxylaminogènes éventuellement présenta), on obtient trois produits qui sont positifs à la ninhydrine et qui, sur la base d'un examen chromato- graphique sur papier [éluant : mélange (8:2) de phénol )t d'eau et mélange (4:1:1) de butanol, d'acide acétique glacial et d'eau, et coloration avec de la ninhydrine], ainsi que sur la base d'une analyse effectuée suivant Moore et Stein, sont identifiés comme étant constitués par de l'ornithine, de la glycine et de la sérine.
La glycine et la sérine sont présentes dans une proportion moléculaire de 1:2. Le ferrichrome exempt de fer, lorsqu'il est hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique hexanormal et est hydrogéné catalytiquement, ne fournit pas trois,mais seulement deux produits qui sont positifs à la ninhydrine, à savoir la glycine et l'ornithine.
Le coprogène fournit, comme seul produit d'hydrolyse positif à la ninhydrine, de, l'ornithine.
Dans la ferrirubine, les acides aminés que sont la sérine (2 moles), la glycine (une mole) et la 6-hydroxy-ornithine (3 moles) sont reliés en un hexapeptide cyclique. L'hydroxy-ornithine est N(#)- acylée ; aux restes ainsi formés de l'acide hydroxamique, le fer est lié de manière complexe.
En supposant que les restes 6-N-hydroxy- ornithyles dans l'hexapeptide cyclique alternent régu- lièrement avec un reste neutre d'acide aminé (glycine, serine), on peut attribuer à la ferrirubine la formule suivante :
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dans laquelle R représente un reste HOCH 2-0 2 -C=CH- (trans).
CH3 L'acide lié avec les trois restes ornithyles a par
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suite la structure du trans---hydro-3-mt'.-Psntne- (2)-oïque
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La formule brute de la ferrirubine est par auite :
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C4lH64017N9Fe Lors de l'hydrogénation catalytiqu de la ferrirubine, le tran8-'5-hydroxy-3-méthyl-p<*ntàne-(2)" oique est hydrogéné sans que la partie restante de la molécule soit attaquée. On obtient l'hexahydro- ferrirubine dont le composant acide est l'acide 5-
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hydroxy-3-méthyl-valérianique. L1 hexahydro-f errirubiae est identique à l'hexahydro-ferrirhodine obtenue en hydrogénant la ferrirhodine. Le spectre d'absorption infra-rouge du composé dans le nujol est illustré à la fig. 3.
Dans le spectre d absorption ultra-violet
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de l'hexahydro-ferrirubine, la forte bande d'absorption observée à 250 m pour la ferrirubine disparaît et le large maximum observé à 450 m est déplacé dans une zone allant de 425 à 430 m . La courbe d'absorption est pratiquement superposée à celle de la ferrichrysine (cette dernière possède, à la place des trois restes de l'acide 5-hydroxy-3-méthyl-valérianique, trois restes acétyles, voir la demande de brevet déposée en France par la Demanderesse le 22 Novembre 1962 et ayant pour titre : "Nouvelles substances actives et procédé pour leur préparation").
Les valeurs de Rf de l'hexahydre- ferrirubine dans les systèmes I et II sont de 0,57 et de 0,80, tandis qu'elles sont respectivement de 0,52 et 'de 0,81 pour la ferrirubine ; (tache orange-jaune à l'encontre de la tache brun-rougeâtre de la ferri- rubine). Si l'on élimine le fer de l'hexahydro-ferri- rubine, par exemple à l'aide de 8-hydroxy-quineléine, si l'on scinde dans la desferri-hexahydro-feeirubine obtenue, par une hydroly&e acide modérée, les restes de ]'acide 5-hydroxy-3-méthyl-valérinaique, si l'on acétyle (sur l'azote et l'oxygène) et si l'on élimine sélectivement les groupes 0-acétyles, par exemple à l'aide d'ammoniac, on obtient alors la desferri- chrysine qui, avec un sel de fer-(III), peut être transformée en ferrichrysine.
La ferrichrysine ainsi obtenue à partir de la ferrirubine présente dans un chromatogramme sur papier, dans les systèmes 1 et II, les mêmes valeurs de Rf que la ferrichrysine authentique.
Lors de l'analyse élémentaire de la ferrirbine
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exempte de fer, on a trouvé les valeurs suivantes C = 5lxl2 ; H - 7,29 ; N = 13,00; acétyle . 0 %.
Une différence essentielle vis-à-vis des aidé- ramines exemptes de fer que sont la ferrichrysine, la ferricrocine et le ferrichrome, réside dans la vitesse d'hydrolyse des liaisons de l'acide hydroxamique. Les trois composés indiqués en dernier lieu perdent complè- tement leur faculté de liaison complexe avec l'ion ferrique, au bout de 18 minutes environ, par chauffage Avec de l'acide chlorhydrique normal au bain-marie bouillant. Dans le cas de la ferrirubine exempte de fer, l'intensité de la réaction au chlorure ferrique ne diminue de façon notable qu'au bout de deux heures environ. Une résistance aussi élevée à l'acide n'a jusqu'à présent été observée, dans la série des sidéra- mines, que dans le cas du ferrichrome A biologiquement inactif.
Cependant, les autres propriétés de la ferri- rubine ne concordent pas avec celles du ferrichrome A.
Le ferrichrome A est un acide comportant trois groupes carboxyliques libres (restes de l'acide ss-méthyl- glutaconique), tandis que la ferrirubine ne possède pas de groupes pouvant être titrés.
Dans le spectre de résonance nucléaire magnétique, pris dans l'eau lourde avec un spectrographe de Varian, la desferri-rubine présente les signaux suivants (cf. figure 2) : 1,86 ppm (14 H) ; 2,38 ppm (4 H) ; 2,92 ppm ( 1 H) 3,79 ppm (10 H) ; 4,39 ppm (4 H) ; 6,03 ppm ( 2 H).
Indications des déplacements chimiques dans les valeurs de ô par rapport au tétaméthylsilane - 0.
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Les nombres de protons obtenus par intégration sont des nombres proportionnels purs, le plus petit signal étant pris pour unité. Tous les signaux forment de larges amoncellements sans résolution nette. Les amon- cellements de signaux à 3,79 et 6,03 ppm possèdent de nets maxima'doubles, mais ne sont apparemment pas des doublets purs.
A partir de la desferri-rubine, on obtient en retour de la ferrirubine en ajoutant du chlorure de fer à un pH neutre.
Les dérivés de la ferrirubine et de la desferri- rubine, et de leurs produits d'hydrogénation, sont par exemple des composés dans lesquels le groupe hydroxyle des restes séryles est estérifié, ou dans lesquels le groupe acyle des restes de l'acide hydroxamique est substitué par d'autres groupes acyles, par exemple par des groupes alcanoyles inférieurs ou des groupes alcénoyles inférieurs, ou par d'autres groupes -hydroxy- alcénoyles que le groupe 5-hydroxy-3-méthyl-penténoyle, par exemple par des groupes propionyle, butyryle, pentanoyle, penténoyle, 5-hydroxy-penténoyle. Les dérivés cités en premier lieu sont obtenus en traitant de la ferrirubine ou de l'hexahydro-ferrirubine par des agents d'acylation, par exemple par des anhydrides d'acide ou des halogénures d'acide,
comme l'anhydride acétique ou le chlorure d'acétyle, et en isolant les esters, puis, si on le désire, en éliminant le fer. On obtient le composé désacylé en désacylant la desferri.- rubine ou l'hexahydro-desferri-rubine dans un milieu modérément acide, par exemple en présence d'acides
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minéraux dilués. L'hexapeptide cyclique ainsi obtenu peut être acylé d'une manière connue ;les groupes 0- acyles qui se forment dans ce cas peuvent être éliminés avec de l'ammoniac, par exemple dans du méthanol.
L'analogue acylé de la desferri-rubine peut être trans- formé avec des sels de fer en le complexe ferrifère correspondant.
La ferrirubine, la desferri-rubine et leurs analogues sont des substances de croissance pour diffé- rents micro-organismes ; elles peuvent par suite être utilisées lors de la culture de tels organismes.
Ces composés possèdent des propriétés anti- anémiques et peuvent par suite être utilisés comme médi- caments. La desferri-rubine et ses dérivés possèdent également de précieuses propriétés pharmacologiques.
C'est ainsi qu'ils inhibent le dépôt de pigments ferri- fères dans les tissus ou qu'ils provoquent une élimina- tion du fer dans les cas d'un dépôt pathologique de fer dans l'organisme, par exemple dans le cas d'une hémo- chrmatose et d'une hémosidérose. Ils peuvent par suite être utilisés en thérapeutique.
Les préparations pharmaceutiques reniement les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, convenant pour une utilisation entérale ou parentérale.
Les préparations sont obtenues suivant les méthodes usuelles à partir de la matière de départ. Des matières de support appropriées sont des substances ne réagissant ,pas sur la desferri-rubine, comme la gélatine, le lactose, le glucose, le chlorure de sodium, l'amidon,
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le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyliques, des gommes, des polyalcoylène- glycols, la cholestérine ou d'autres supports médici- naux connus.
Tout comme d'autres sidéramines, la ferri- rubine est également en mesure de supprimer compétitive- ment, vis-à-vis des agents pathogènes à Gram positif, l'effet anti-bactérien des antibiotiques appartenant au groupe des sidéromycines (effet anti-sidéromycinique).
La ferrirubine, la desferri-rubine, ainsi que les dérivés de ces composés, sont obtenus, en culti- vant dans des conditions aérobies, dans une solution nutritive aqueuse renfermant une source de carbone et d'azote, ainsi que des sels inorganiques, des souches de la famille des aspergillacées qui sont capables de former la ferrirubine, en isolant la ferrirubine et/ou la desferri-rubine du filtrat de culture et, si on le désire, en transformant la ferrirubine en le composé exempt de fer, ou on préparant des produits d'hydrogénation ou des dérivés de ces composés.
Etant donné que la formation de la ferrirubine et/ou de la desferri-rubine est favorisée par un milieu nutritif pauvre en fer, il est avantageux d'effectuer la culture avec un manque de fer, de préférence avec une teneur en fer au plus égale à 10-7 mole par litre.
Pour la culture des souches, on envisage, comme sources de carbone et d'azote, des hydrates de carbone, par exemple du glucose, du saccharose, du lactose, de l'amidon, des alcools, comme le mannitol et le glycérol, des acides aminés, par exemple de
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de l'ornithine, des peptides, des protéines et leurs produits de dégradation comme la peptone ou la tryptone, des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le maie ou le froment, des résidus de distillation provenant de la fabrication de l'alcool, des levures, des graines, en particulier de colza et de soja, de coton, des sels d'ammonium, des nitrates.
Comme sels inorganiques, la solution nutritive peut, par exemple, renfermer des chlorures, des carbonates, des sulfates, des nitrates de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux, du magnésium, du zinc et du manganèse, ainsi que des traces de fer.
La culture a lieu de manière aérobie, c'est- à-dire par exemple en culture de surface au repos, ou de préférence de manière immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans des flacons agités ou dans les fermenteurs connus.Comme température, convient une température comprise entre 18 et 40 C, de préférence une température de 27*0.
Dans ce cas, la solution nutritive présente en général au bout de 12 à 16 jours un important effet ferriru- binique..
L'activité de la ferrirubine peut être déterminée par voie microbiologique à l'aide du test de Bonifas modifié [cf. Zahner et ses collaborateurs,
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"Arch. Mikrobiol.", L6e pages 325 et suivantes (J.960)¯7.
Comme solution-test, on utilise une solution de ferri- mycined'une teneur de 0,1 mg par centimètre cube, et comme souche-test, le Staphylococcus aureus de
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Rosenbàuh.
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On peut également déterminer par voie optique la concentration en ferrirubine de la solution de culture. A cet effet, on secoue pendant 5 minutes 5 car du liquide de culture avec 1,5 g de chlorure de sodium, avec un centimère cube d'une solution à 0,1 % de sulfate ferrique et' avec 5 cm3 d'alcool benzylique, sépare par cdntrifugation, filtre la phase organique et détermine l'extinction de cette dernière à 440 m . Comme échan- tillon de comparaison, on se sert d'un extrait préparé de la même manière à partir d'une solution nutritive non- ensemencée.
Au bout de 12 à 16 jours, les cultures acquièrent une activité correspondant à une quantité de 50 à 200 mg de ferrirubine pure.
Lorsque la culture est terminée, on peut, par litre, ajouter un gramme de chlorure ferrique à la solution nutritive, la desferri-rubine présente étant transformée en ferrirubine. On sépare le mycélium du filtrat de culture, de préférence en présence d'un auxiliaire de filtration, par exemple en présence d'Hyflo-Supercel, après quoi la majeure partie de la ferrirubine se trouve dans le filtrat de culture.
Cependant, des quantités notables de cette substance restent adhérentes sur le mycélium. Il est en conséquence avantageux de bien extraire ce dernier par lavage.
Conviennent par exemple, à cet effet, l'eau ou des alcools aqueux, comme le méthanol aqueux.
Pour isoler la ferrirubine à partir du filtrat de culture, on peut procéder suivant des méthodes connues en elles-mêmes et utiliser, par exemple,
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l'une des méthodes opératoires ou combinaisons qui sont indiquées ci-après :
1) On peut utiliser des agents d'adsorption, par exemple des charbons actifs comme la norite, des terres activées comme la franconite, la terre à foulon ou la floridine, ou des adsorbants résineux comme l'asmite. L'élution des adsorbats a lieu avantageusement avec des mélanges aqueux de solvants organiques miscibles à l'eau, par exemple avec des mélanges d'eau et de méthanol, d'eau et de pyridine, d'acide acétique dilué et de méthanol, ou d'eau, de méthanol, d'acide acétique glacial et de butanol.
Un mélange de 4 parties en volume d'eau et d'une partie en volume de pyridine s'est avéré particulièrement approprié pour l'élution d'un adsorbat de franconite ou de norite.
2) On peut de plus soutirer la ferrirubine d'une solution aqueune à l'aide de solvants organiques.
Pour ce procédé d'extraction, des alcools organiques supérieurs, par exemple l'alcool benzylique ou l'alcool isopropylique, se sont avéré particulièrement appropriés.
Dans ce cas, on ajoute avantageusement à la phase aqueuse un sel inorganique, par exemple du sulfate d'ammonium ou du chlorure de sodium. A partir des extraits orga- niques obtenus, la ferrirubine peut être obtenue sous forme enrichie, soit par évaporation du solvant, soit par précipitation à l'aide d'un solvant organique convenable, par exemple l'éther, l'éther de pétrole ou l'acétate d'éthyle.
3) Une autre méthode d'enrichissement de la ferrirubine consiste à la répartir entre une solution
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aqueuse et une solution de phénol dans le chloroforme, la teneur en phénol de la solution chloroformique pouvant varier.
4) Une autre méthode pour l'enrichissement de la ferrirubine est constituée par la chromatographie, par exemple une chromatographie d'adsorption sur dif- férentes matières, par exemple sur de la norite, de l'oxyde d'aluminium, des silicates de magnésium, du gel de silice, du sulfate de calcium, ainsi qu'une chromatographie de répartition avec de la cellulose, de l'amidon, du gel de silice, de la célite et analogues comme substances de support.
5) En outre, la ferrirubine peut être enrichie par une répartition à contre-courant suivant Craig entre deux phases solvantes non-miscibles. Le système solvant suivant s'est av4ré dans ce cas particulièrement approprié : n-butanol :alcool benzylique : acide chlorhydrique millinormal : solution aqueuse de chlorure
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de sodium saturée à 19 c(9:9:15;5).
La desferri-rubine est formée à côté de la ferrirubine par les souches indiquées et/peut par suite aussi être isolée directement du filtrat de culture.
On élimine avantageusement, lors de l'isolement, le fer présent dans le filtrat de culture, par exemple en ajoutant des substances formant des complexes ferri- fères, par exemple de la 8-hydroxy-quinoléine.
On peut directement à la fin de la fermentation ajouter à la bouillie de culture les substances formant des complexes ferrifères. Cette addition a lieu avanta- geusement dans un stade ultérieur du traitement pour
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éliminer également les ions de fer-(III) éventuellement entraînés par les agents utilisés.
L'isolement de la desterri-rubine à partir de la solution de culture a lieu suivant les méthodes mentionnées pour l'isolement de la ferrirubine.
L'invention concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus ,
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non-limitatifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centigrades.
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La souche de Pénicillium variabile M 2733 est cultivée de manière immergée, à 27 . en culture bien aérée. On utilise une solution nutritive renfer- mant, par litre d'eau distillée, 20 g de glucose (exempt de fer), 5 g de L-asparagine, un gramme de phosphate secondaire de potassium, un gramme de sulfate de magnésium cristallisé (MgSO 7 H2O) et 0,5 g de chlorure de calcium. On stérilise la solution nutritive à pendant 20 minutes/120*. On ensemence avec une suspen- sion de spores de cultures de riz dans de l'eau distillée + 5 % de Tween 80.
La teneur en ferrirubine du milieu de culture est déterminée comme suit : On secoue bien 10 cm3 du filtrat de culture, 3 g de chlorure de sodium et 10 cet d'alcool benzylique, puis centrifuge. On filtre la phase organique, l'extrait d'un avec un volume triple d'éther et d'un tampon d'un de 8, puis centrifuge à nouveau. Dans l'extrait aqueux, l'extinction est déterminée à 440 m et, sur la base d'une courbe de Eich, on lit les milligrammes de ferri- rubine brute.
Au bout de 12 à 16 jours, on ajoute aux cultures un gramme de chlorure ferrique par litre et filtre en ajoutant 2 % de célite. On sature alors le filtrat de culture avec du chlorure de sodium et extrait la solution limpide à deux reprises avec 1/10 volume d'alcool benzylique. On sèche la phase organique avec du sulfate de sodium, filtre et ajoute 3 volumes d' éther.
On extrait le mélange d'alcool benzylique et d'éther
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avec de l'eau distillée jusqu'à décoloration. On réunit les extraits aqueux, élimine avec de l'éther les restes d'alcool benzylique et lyophilise, ce qui fait qu'on obtient une poudre rouge.
On soumet 10,4 g de ce produit brut à une répartition de Craig en 154 stades. Comme système de répartition, on se sert d'un mélange constitué par de l'alcool benzyliqua, par de l'alcool butylique normal, par 'une psolution aqueuse saturée de chlorure de sodium et par une solution aqueuse millinormale d'acide chlor- hydrique dans un rapport volumétrique de 18:18:10:30.
Le colorant brun-rouge forme un seul maximum de répartition dans le stade 128. Cela correspond à des coefficients de répartition approximatifs de K = 5,0.
On rassemble les fractions 116-140. En ajoutant 2 volumes d'éther, on chasse la ferrirubine dans la phase aqueuse. On sépare cette dernière et extrait encore la couche organique à trois reprises avec peu d' eau. Après avoir réuni les solutions aqueuses, on les sature à demi avec du chlorure de sodium et les extrait à plusieurs reprises avec un mélange de phénol et de chloroforme (un kg de phénol par litre de chloro- forme), ce qui fait que le colorant passe dans la phase organique. On clarifie les extraits sur une colonne de célite, dilue avec un volume double d'éther et extrait à quatre reprises avec peu d'eau, le colorant rouge-brun passant alors dans la phase aqueuse.
On lave les solutions aqueuses à plusieurs reprises avec de l'éther pour éliminer complètement le phénol et les évapore sous vide. On purifie davantage le résidu
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amorphe (1,245 g) de teinte brun-rouge en le repréci- pitant dans un mélange de méthanol et d'éther. Le composé pur est fortement hygroscopique.
Lors de l'analyse élémentaire, on a trouvé :
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C - 49,01 % ; H . 6,57 % ; 3 N * 12,70 % ; Fe III 5,25 % ; O = 26,47 % (calculé) ; acétyle 811 0 %.
Spectre d'absorption dans l'éthanol :
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xmax In 216 mJ.l. ilaB Eî m 811 2,58) ; "'max 811 252 m (log 4 m 811 2#34) ; "'max . 450 m (log El 96 m 1,52).
Le spectre infra-rouge dans le bromure de potassium présente entre autres des bandes à 842, 945, 990 cm-1 (épaulement), à 1.040, 1.066, 1.125 cm-1 (épaulement), à 1.195 cm-1 (épaulement), à 1.239, 1.282 cm-1 (épaulement), à 1.341 cm-1 (épaulement), à 1.366, 1.460, 1.533, 1.647, 2.938, 3.085 cm-1 (épaulement), à 3.420 cm-1,cf. fig. 1.
Dans un chromatogramme sur papier, on a comparé la ferrirubine avec d'autres sidéramines, voir tableau 1. La méthode est la suivante ; on imprègne une feuille de papier filtre Whatman N 1 avec un mélange d'acétone, d'eau et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (rapport volume- trique 6:3:1), puis la sèche à l'air pendant 10 à 15 minutes. Sur la ligne de départ, on apporte alter- nativement une goutte d'une solution méthanolique de la substance de comparaison (points de départ 1, 3, 5 et 7) et de la ferrirubine (points de départ 2, 4, 6 et 8). Le chromatogramme est développé pendant 20 heures environ avec, comme éluant, un mélange (2:1:1) de butanol tertiaire, d'acide chlorhydrique 0,004-
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normal et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium.
Les taches des sidéramines sont reconnues , à leur couleur propre. Malgré la différence relative- ment minime dans les valeurs de RF de quelques sidéra- mines, il en résulte, d'après la. méthode décrite, une différenciation indubitable.
Tableau 1
EMI20.1
<tb> Sidéramine <SEP> Rf <SEP> (système <SEP> I) <SEP> Rf <SEP> (système <SEP> II)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Ferrichrome <SEP> 0,28 <SEP> 0,30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Ferricrocine <SEP> 0,29 <SEP> 0,28
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Ferrichrysine <SEP> 0,26 <SEP> 0,34
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Coprogène <SEP> 0,43 <SEP> 0,55
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Ferrirubine <SEP> 0,42 <SEP> 0,73
<tb>
EXEMPLE 2
La souche de Pénicillium variabile M 2733 est cultivée, comme dans l'exemple 1 ;le milieu de culture est additionné de chlorure ferrique et filtré avec addition de célite. On extrait le filtrat de culture obtenu à trois reprises avec 1/20 volume d'un mélange de chloroforme et de phénol (une partie en volume :
une partie en poids), sépare la phase orga- nique et la filtre à travers de la célite. On ajoute ensuite à la solution organique trois volumes d'éther et l'extrait à plusieurs reprises avec de l'eau dis- tillée jusqu'à décoloration. On réunit les extraits aqueux, les lave avec de l'éther pour éliminer les restes de chloroforme, les débarrasse de l'éther sous'
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vide, puis lyophilise. Le produit brut obtenu est purifié comme dans l'exemple 1.
De la même manière que celle décrite dans l'exemple 1, on obtient la ferrirubine en cultivant la souche de Spicaria sp. M 4622 ou la souche de Paecilomyces variati M 4646 (à 33 ), et en traitant le mille.), de culture comme décrit.
EXEMPLE 3
Dans 30 cm3 d'eau, on dissout 435 mg de ferri- rubine et ajoute 1,0 g de 8-hydroxy-quinoléine en solution dans 15 cet de méthanol environ. Après avoir agité pendant 24 heures à la température ambiante, on sépare par filtration le précipité noir (complexe ferrifère de l'hydroxy-quinoléine) et extrait le filtrat jaunâtre pâle à trois reprises avec du chloroforme pour éliminer le réactif en excès. On évapore ensuite la solution aqueuse et obtient la ferrirubine exempte de fer sous la forme d'un résidu amorphe de teinte jaune pâle. Le rendement est de 390 mg.
Dans le spectre de résonance nucléaire magné- tique (pris avec un spectrographe de Varian, modèle A 60), un échantillon du composé dissous dans de l'eau lourde présente les signaux suivants 1,86 ppm (14 H) ; 2,38 ppm (4 H) ; 2,92 ppm (1 H) 3,79 ppm (10 H) ; 4,39 ppm (4 H) ; 6,03 ppm (2 H).
Indications des déplacements chimiques dans les valeurs
EMI21.1
de 6 vis-à-vis du tétraméthyl-silane <# 0. Les nombres de protons obtenus par intégration représentent des nombres proportionnels purs, le plus petit signal étant supposé égal à l'unité. Tous les signaux forment
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de larges amoncellements sans résolution nette. Les amoncellements de signaux à ',79 et 6,03 ppm possèdent de nets maxima doubles, mais ne sont apparemment pas des doublets purs.
Lors de l'analyse élémentaire, on a trouvé les
EMI22.1
valeurs suivantes : 0 - 5.,12 ; 1 E a 7,29 ; N - i3, Op ; acétyle - 0 %.
EXEMPLE 4
Dans un tube en verre, on scelle 150 mg de ferrirubine exempte de fer avec 4 car d'acide chlorhy- drique hexanormal, puis chauffe pendant 24 heures à 110 . On dissout le résidu d'évaporation du produit d'hydrolyse daneu d'eau, dilue avec de l'alcool absolu jusqu'à avoir 30 cm3 environ et hydrogène pendant une nuit en présence de 50 mg d'oxyde de platine préalable- ment hydrogéné. On contrôle un échantillon du résidu d'évaporation en procédant à une chromatographie bidimen- sionnelle sur du papier -mélange (8:2) de phénol et d'eau et mélange (4:1:1) de butanol, d'acide acétique glacial et d'eau ; ninhydrino¯7, ainsi qu'en procédant à une analyse suivant Moore et Stein, pour déterminer les acides aminés.
Les deux méthodes indiquent la pré- sence d'ornithine, de sérine et de glycine. La serine et la glycine sont présentes dans une proportion moléculaire de 2:1.
EXEMPLE 5
Avec 25 mg de chlorure ferrique dans 2 car de méthanol, on mélange 28 mg de ferrirubine exempte de fer en solution dans un centimètre cube de méthanol.
Il se produit aussitôt une coloration d'un noir-violet
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foncé, qui vire au brun-roage lorsqu'on a tamponné la solution avec un peu d'acétate de sodium cristallisé.
Après avoir laissé reposer pendant une heure, on évapore à sec sous vide, dissout le résidu dans 5 cm3 d'eau, sature à peu près à moitié de chlorure de sodium et extrait la ferrirubine avec de l'alcool benzylique. On lave les extraits avec une solution saturée de chlorure do sodium et sèche avec du sulfate de sodium. On dilue la solution avec de l'éther et extrait à nouveau la sidéramine avec de l'eau. En évaporant les extraits lavés à l'éther, on obtient la ferrirubine, à savoir 25 mg environ d'une poudre rouge-orange. En procédant à une chromatographie sur papier dans les systèmes I et II (voir tableau 1), on peut voir que le complexe ferrifère obtenu de cette manière est identique à celui isolé directement.
EXEMPLE 6
A une suspension de 100 mg d'un charbon à 10 % de palladium dans 5 cm3 de méthanol, on ajoute une solution de 149 mg de ferrirubine dans 5 cm3 de méthanol et agite le mélange à la température ambiante
EMI23.1
dans une atmosphèrçydhydrogèiie. L'absorption d'hydrogène est très rapide au 'début. Au bout d'une heure environ, 3 moles à peu près d'hydrogène sont absorbées et l'hydrogénation s'arrête. On sépare alors le cataly- seur par filtration. On ajoute au filtrat de teinte brun-orange une solution de 100 mg de chlorure de fer-(III) dans le méthanol, pour remplacer le fer éventuellement réduit , puis tamponne la solution en ajoutant un peu d'acétate de sodium cristallisé.
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Après avoir laissé reposer pendant 4 heures, on évapore la solution sous vide, reprend le résidu dans de l'eau et extrait la solution à plusieurs reprises avec un mélange de phénol et de chloroforme (un gramme :un centimètre cube) . Après avoir filtré à travers de la célite l'extrait obtenu avec le mélange de phénol et de chloroforme, on le dilue avec deux volumes d'éther, l'extrait à trois reprises avec de l'eau distillée, puis évapore sous vide les solutions aqueuses lavées A l'éther. On obtient l'hexahydro-ferrirubine sous la forme d'une poudre amorphe de teinte jaune-orange ; le rendement est de 132 mg.
Maxima d'absorption en ultra-violet dans l'alcool absolu une forte absorption finale à 220 m (log e supérieur à 4) ; maximum à 425-430 m (log #= 3,5). En ce qui concerne le spectre , infra-rouge dans le nujol, voir la figure 3. Dans une chromatographie sur papier, les valeurs de Rf dans les systèmes I et II sont les suivantes :
Système 1 Système II
Ferrirubine 0,52 0,81 Hexahydro-ferrirubine 0,57 0,80 La ferrirubine fournit une tache brun-rougeâtre et le produit d'hydrogénation une tache orange-jaune,
EXEMPLE 7
Dans 40 car d'eau, on dissout un gramme d'hexahydro-ferrirubine brute et mélange avec 1,5 g de
EMI24.1
8-hydroxy-qrïnoléina en solution dans 15 cm3 de méthanol.
Après avoir agité pendant 24 heures à 20 , on sépare par filtration l'oxinate de fer-(III) qui s'est formé. On extrait le filtrat à 5 reprises avec
<Desc/Clms Page number 25>
du chloroforme et évapore ensuite sous vide jusqu'à siccité. On obtient 900 mg de la desferri-hexahydro- ferrirubine de formule
EMI25.1
sous la forme d'une poudre incolore, presque amorphe, qui fournit une réaction de coloration violette avec le chlorure ferrique (un pour cent dans du méthanol).
Dans le spectre de résonance nucléaire magnétique pris dans d'eau lourde, on trouve les signaux suivants : (ppm) Scission Nombre H Affectation
EMI25.2
oe93 d CI '" 5 cps) 9 groupes méthyles des rostes du
5-hydroxy-3- méthyl-pentane- olque 1,2 - 2,2 b 21 ss- et -CH des restes de la N- hydroxy-orni- thine : #-CH2 des restes du
EMI25.3
S¯h,Ydz,oY¯3¯ j¯ méthyl-pentane-
EMI25.4
osque :
p--CH i des restes du 5-hydroxy-3- méthyl-pentane- oïque
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<tb> (ppm) <SEP> Scission <SEP> Nombre <SEP> H <SEP> Affectation
<tb>
<tb> 2,4 <SEP> b <SEP> 6 <SEP> Ó-CH2 <SEP> des <SEP> restes <SEP> du
<tb>
EMI26.2
5-hydroxy -5 -mé thyl-
EMI26.3
<tb> pentane-oique
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,4- <SEP> 4,1 <SEP> b <SEP> 18 <SEP> #-CH2 <SEP> des <SEP> restes <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> la <SEP> N-hydroxy-orni-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> thine <SEP> ; <SEP> CH2 <SEP> du <SEP> reate
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> la <SEP> glycine <SEP> ; <SEP> CH2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> des <SEP> restes <SEP> de <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> serine <SEP> ;
<SEP> #-CH2 <SEP> des
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> restes <SEP> du <SEP> 5-hydroxy-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3-méthyl-pentane--
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> oïque
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4,3 <SEP> b <SEP> 5 <SEP> a-CH <SEP> des <SEP> restes <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> la <SEP> N-hydroxy-orni-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> thine <SEP> et <SEP> de <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sérine
<tb>
EXEMPLE 8
Avec 30 cm3 d'acide chlorhydrique normal, on chauffe au bain-marie, à 95 environ, 900 mg de desferri-hexahydro-furrirubine. A des intervalles de 5 minutes environ, on ajoute, à une goutte de la solu- tion, sur une plaque à faire des touches, 2 gouttes d'une solution méthanolique à 2 % de chlorure de fer- (III). Au début, il se produit une forte réaction colorée de teinte violette.
Au bout de 50 minutes, la réaction colorée n'est plus que très faible. On interrompt l'hydrolyse et évapore sous vide la solution
EMI26.4
renfermant la cyclo-(L-6-hydroxy-ornithyl-glycyl-L-Ô- hydroxy-ornithyl-L-séryl-L-6-h,ydroxy-ornithyl-L-sérine).
On acétyle le résidu avec 10 cm3 d'anhydride acétique et 10 car de pyridine, pendant 5 heures à la température ambiante. On évapore à nouveau le mélange réactionnel sous vide. Pour l'ammonolyse partielle des liaisons 0-acétyle formées, on laisse le produit réactionnel
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reposer pendant 4 heures dans 60 cm3 d'une solution méthanolique d'ammoniac saturée à froid.
Après avoir évaporé cette solution, on obtient un résidu qui renferme de la desferri-chrysine et des sous-produits, et qu'on fait ensuite réagir en solution méthanolique sur un gramme de chlorure de fer-(III) ; on tamponne la solu- tion violet-foncé avec de l'acétate de sodium cristal- lisé jusqu'à ce qu'il se produise un virage au brun- orange, puis on évapore la solution après l'avoir issée reposer pendant 4 heures. On dissout le résidu dans de l'eau, ajoute au tout 10 % environ de chlorure de sodium et extrait à plusieurs reprises avec un mé- lange de phénol et de chloroforme (un gramme : un centi- mètre cube), puis filtre à travers une colonne de 10 g de célite la solution de phénol et de chloroforme qui est trouble au début. On dilue le filtrat limpide avec de l'éther et l'extrait à trois reprises avec de l'eau distillée.
Après avoir bien lavé à l'éther les extraits aqueux, on les évapore sous vide et purifie le produit brut en procédant à une répartition de Craig en 50 stades. Comme système solvant, on utilise un mélange constitué par 9 parties de butanol normal, par 9 parties d'alcool benzylique, par 15 parties d'acide chlorhydrique millinormal et par 5 parties d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium.
Le composant principal du mélange est enrichi le plus fortement dans le stade 19, ce qui correspond à un coefficient de répartition de 0,62 (ferrichrysine authentique : k=0,63).
On traite les fractions 12 à 25 d'une manière
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usuelle avec un mélange de phénol et de chloroforme. On obtient 202 mg de ferrichrysine qu'on purifie davantage par cristallisation dans de l'alcool éthylique. Tout comme la ferrichrysine authentique, les cristaux de teinte orange-rouge se décomposent lentement sans fondre, à partir d'une température de 250 à 2600 environ.
Lors d'une chromatographie sur papier dans les systèmes I et II, le produit se comporte exactement comme la ferrichrysine authentique (voir tableau 2), et le spectre d'absorption infra-rouge concorde totalement avec celui de la ferrichrysine authentique. Chromato- graphie sur papier :
Tableau 2
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<tb> Système <SEP> I <SEP> Système <SEP> II
<tb>
<tb> plaque <SEP> au <SEP> Papier- <SEP> papier-
<tb>
<tb> gel <SEP> de <SEP> silice <SEP> filtre <SEP> filtre
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Ferrichrysine
<tb>
<tb> authentique <SEP> Rf= <SEP> 0,129 <SEP> 0,39 <SEP> 0,32
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Produit <SEP> de <SEP>
<tb>
<tb> transformation <SEP> Rf <SEP> - <SEP> 0,129 <SEP> U,39 <SEP> 0,32
<tb>
Dans le test antagoniste vis-à-vis de la ferrimycine A, le produit se comporte comme la ferri- chrysine naturelle.