Cette invention concerne le procédé de production du mélange antibiotique A-42355 contenant les facteurs A, B, D et H de l'antibiotique A-30912, et des facteurs séparés, par culture de l'organisme nouvellement isolé, Aspergillus
<EMI ID=1.1>
contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions de fermentation aérobie en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique, séparation du mélange antibiotique et du milieu de culture et, si on le désire, isolement des différents facteurs à partir du mélange d'antibiotiques.
Le but de cette invention est de fournir le procédé de production du mélange antibiotique A-42355 comprenant les facteurs A, B, D et H de A-30912, et les différents facteurs séparés, par culture de l'organisme nouvellement isolé, Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique, séparation du mélange antibiotique et du milieu de culture, et isolement des différents antibiotiques. Le facteur H de A-30912 est un antibiotique nouvellement découvert ayant une. activité antifongique.
Cette invention fournit le procédé de production du mélange antibiotique A-42355 comprenant les facteurs A, B, D et H de A-30912, et du facteur A de l'antibiotique A-30912, du facteur B de l'antibiotique A-30912, du facteur D de l'antibiotique A-30912 et du facteur H de l'antibiotique A-30912, caractérisé en ce que :
a) on cultive Aspergillus nidulans var. roseus
NRRL 11440 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique ; b) on sépare éventuellement le mélange antibiotique A-42355 du milieu de culture ; et c) On isole éventuellement les facteurs A, B, D et H de l'antibiotique A-30912 à partir du mélange antibiotique A-42355.
L'invention fournit également une culture biologique-
<EMI ID=2.1>
NRRL 11440.
Le facteur A de l'antibiotique A-30912 (antibiotique A-22082) et son procédé de production utilisant Aspergillus nidulans NRRL 8112 sont décrits dans le brevet des E.U.A
<EMI ID=3.1>
<EMI ID=4.1>
ruaulosus NRRL 8113 sont décrits dans le brevet des E.U.A.
N[deg.] 4.024.245. Le facteur H de A-30912, facteur mineur nouvellement découvert du mélange A-30912, est décrit dans la demande de brevet N[deg.] déposée le même jour que la présente demande.
Le spectre d'absorption infrarouge du facteur H de A-30912 en pastilles de KBr est donné sur la Figure 1 des dessins annexés.
La Figure 2 des dessins annexés résume les déplacements relatifs des facteurs de A-30912 en chromatographie sur couche mince (CCM), en utilisant comme absorbant du gel de silice
(Merck-Darmstadt), un système solvant 3:2 d'acétate d'éthyle et de -méthanol et un bioautographe par Candida albicans pour la détection. La flèche indique le sens du déplacement du solvant ; le signe + indique le point de départ. La zone où l'on peut voir les facteurs mineurs E, F et G est indiquée par un crochet. On trouvera dans le brevet des E.U.A.
<EMI ID=5.1>
particuliers du facteur A et des facteurs mineurs E, F et G de l'antibiotique A-30912.
Cette invention fournit un nouveau procédé de production des antibiotiques A-30912. Les antibiotiques A-30912 sont produits sous forme d'un mélange comprenant plusieurs facteurs distincts.-
Le terme "mélange antibiotique" tel qu'utilisé dans le domaine de la fermentation et dans cette description désigne un mélange de facteurs antibiotiques distincts produits simultanément. Comme le verra la personne connaissant la production d'antiotiques par fermentation, le rapport des facteurs distincts produits dans un mélange antibiotique variera selon les conditions de fermentation utilisées.
Le mélange antibiotique de la présente invention est désigné arbitrairement ici comme le mélange antibiotique A-42355. Cependant, pour éviter toute confusion, les désigna-
<EMI ID=6.1>
mélange A-42355 qui sont identiques aux facteurs A-30912.
Comme c'est le cas avec le mélange antibiotique A-30912, le facteur A de A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355 ; les facteurs B, D et H de A-30912 sont de même des facteurs mineurs dans le mélange A-42355.
Le facteur A de A-30912 (antibiotique A-22082) est
<EMI ID=7.1>
Au moment de la délivrance de ces brevets, on pensait que le facteur A de A-30912 pouvait être différent de l'échinocandine B[ voir F. Benz et al., Helv. Chim. Acta 57, 2459-2477 (1974) et le brevet suisse ? 568.386 (Derwent Abstract 75884W)]. Par la suite, il a été montré que le facteur A de A-30912 est identique à l'échinocandine B. L'antibiotique SL 7810/F a également été identifié comme étant l'échinocandine B
[C. Keller-Juslen, et al., Tetrahedrcn Letters 1976 (46),
4147-4150, et le brevet belge N[deg.] 834.289 (Derwent Abstract
30159X)].
Keller-Juslen et al., ont proposé la formule développée 1 pour l'échinocandine B (SL 7810/F) :
<EMI ID=8.1>
<EMI ID=9.1>
L'Echinocandine B (antibiotique 32204) est produite
<EMI ID=10.1>
echinulatus A 32204 (NRRL 3860), comme décrit dans le brevet N[deg.] 568.386 (Derwent N[deg.] 75884W). L'antibiotique SL 7810/F est produit par une souche d'Aspergillus rugulosus, Thcm et Raper
(NRRL 8039) , comme décrit dans le brevet belge N[deg.] 834.289
(Derwent N[deg.] 30159X). Le procédé selon la présente invention pour produire le facteur A de A-30912 (échinocandine B ;
SL 7810/F) par culture d'Aspergillus nidulans var. roseus diffère des procédés de la technique antérieure. Pour des raisons de commodité, la désignation facteur A de A-30912
<EMI ID=11.1>
Les facteurs B et D de A-30912 sont décrits dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 4.024.245. Le facteur B de A-30912 est similaire à, et peut être identique à l'antibiotique
SL 7810/-II. Le facteur D de A-30912 est similaire et peut être identique à l'antibiotique SL 7810/-III. Les antibiotiques SL 7810/-II et SL 7810/-III sont produits par une souche d'Aspergillus rugulosus, Thom et Raper (NRRL 8039), comme décrit dans le brevet belge ? 834.289 (Derwent
N[deg.] 30159X).
Facteur H de A-30912
Le facteur H de A-30912 (A-30912H), le composant nouvellement découvert du mélange antibiotique A-30912, est tout à fait similaire au facteur A de A-30912. Dans les conditions connues jusqu'à présent, A-30912H est un facteur mineur dans le mélange A-30912, étant présent en quantité - comprise entre environ 0,01 et 1,0 % du complexe total.
Un autre facteur mineur du mélange A-30912 a été découvert mais il n'a pas été isolé en quantité suffisante pour pouvoir le caractériser. Le facteur H de A-30912 est séparé pour le mieux de ce facteur par CCM sur gel de silice en utilisant un système de solvants 3:2 d'acétate d'éthyle et de méthanol ou
95:5 d'acétonitrile et d'eau. Dans l'un ou l'autre des systèmes, le facteur mineur non caractérisé est plus polaire que les autres facteurs de A-30912.
Le facteur H de A-30912 est un solide amorphe blanc. L'analyse élémentaire de A-30912H donne la composition approximative suivante en pourcentage : carbone, 58,27 % ;
<EMI ID=12.1>
Le facteur H de A-30912 a un poids moléculaire d'environ 1073. Ce poids moléculaire est obtenu sur la correspondance des pics (PD/FD) des ions quasi-moléculaires du
<EMI ID=13.1>
On a trouvé que l'ion quasi-moléculaire du facteur H de A-30912 (+Na) avait la masse 1096,5782, 1096,5814. La masse moyenne, 1096,5798,est dans les limites de l'erreur expéri-
<EMI ID=14.1>
C, 58,30 ; H, 7,79 ; N, 8,98 ; 0, 24,93).
Le spectre d'absorption infrarouge du facteur H de A-30912 en pastilles de KBr est donné sur la Figure 1 des dessins annexés. On observe les maxima d'absorption caractéristiques suivants : 2,9 (très fort), 3,4 (fort), 3,5 (moyen), 5,9-6,1 (très fort), 6,6 (fort), 6,9 (fort), 7,9-8,1
(moyen), et 9,1 (fort) microns.
<EMI ID=15.1>
A-30912 dans le méthanol neutre et dans le méthanol acide présente des maxima d'absorption à 223 nm (c 13,100) et
275 nm, pic large (e 2,100). Le spectre ultraviolet du facteur H de A-30912 dans le méthanol basique présente des maxima d'absorption à 245 nm (c 14,700) et 290 nm, pic large
(e 3,500) et également une absorption finale.
Le spectre de résonance magnétique nucléaire 13C du
<EMI ID=16.1>
caractéristiques suivantes :
<EMI ID=17.1>
Le facteur H de A-30912 a les pouvoirs rotatoires approximatifs suivants :
<EMI ID=18.1>
Le titrage électrométrique du facteur H de A-30912, dans le diméthylformamide aqueux à 66 %, indique la présence*'
<EMI ID=19.1>
(pH initial 7,12).
<EMI ID=20.1>
indique la présence, après hydrolyse, de la thréonine et de quatre autres amino-acides non encore identifiés.
Le facteur H de A-30912 est soluble dans divers
<EMI ID=21.1>
mais il est insoluble dans les solvants organiques non polaires comme l'éther diéthylique et l'éther de pétrole.
Le facteur H de A-30912 est également soluble dans les solutions aqueuses, en particulier celles ayant un pH supérieur à 7,0.
Le facteur H de A-30912 (poids moléculaire 1073) diffère du facteur A de A-30912 (poids moléculaire 1059) de seulement 14 unités de masse. Les deux composés sont très similaires en ce qui concerne leurs propriétés physicochimiques et les deux composés donnent de l'acide linoléique par hydrolyse. A-30912H a un groupement -CH2- supplémentaire qui est présent sous forme de -0-CH3 , remplaçant l'un des groupements -OH de la partie peptidique cyclique de la molécule.
A-30912H a la formule développée représentée par la formule suivante 2 :
<EMI ID=22.1>
2 R = linoléoyle
Le Microorganisme
Le procédé de production des antibiotiques A-30912 de cette invention consiste à cultiver, comme décrit ici,
une nouvelle culture qui est une variété d'Aspergillus nidulans. La nouvelle culture a été appelée Aspergillus nidulans var. roseus.
Le nouveau micro organisme de cette invention est une culture biclogiquement pure qui a été isolée d'un échantillon
<EMI ID=23.1>
caractéristiques principales est la production des antibioti-
<EMI ID=24.1> déposée le 26 février 1979 et fait partie de la collection permanente de cultures du Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604,
où elle est disponible au public scus le numéro NRRL 11440.
Comme c'est le cas avec d'autres organismes,
les caractéristiques d'Aspergillus nidulans var. rcseus
NRRL 11440 sont sujettes à variations. Par exemple, on peut obtenir des variants et des mutants artificiels de la souche NRRL 11440, par traitement par divers mutagènes connus, comme les rayons ultraviolets, les raycns X, les ondes de fréquence élevée, le rayonnement radioactif et les produits chimiques. Tous les variants et mutants naturels et artificiels d'Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 qui conservent la caractéristique de produire les antibiotiques A-30912, peuvent être utilisés dans cette invention. Taxonomie d'Aspergillus nidulans var. roseus
La nouvelle culture de cette invention a été étudiée et caractérisée par Thomas H. Sands des Lilly Research Laboratories.
Pour des raisons de commodité, la nouvelle culture Aspergillus nidulans var. roseus sera appelée ici culture A42355. La base taxonomique d'après laquelle cette culture a été classée comme une nouvelle variété d'Aspergillus nidulans et appelée A. nidulans var. roseus, est décrite dans les paragraphes suivants. Dans cette discussion, les termes "ISCC-NBS" désignent les noms de couleurs selon la méthode ISCC-NBS (K. L. Kelly et D. B. Judd, "The ISCC-NBS Methcds of Designating Colors and A Dictionary cf Cclor Names", U.S.
<EMI ID=25.1>
Le terme "Maerz et Paul" désigne les blocs de couleur décrits
<EMI ID=26.1>
<EMI ID=27.1>
Les ccmparaisons sont basées sur le travail de K. B. Raper et D. I. Fennel, "The Genus Asperoillus", Williams and Wilkins, 1965.
La culture A42355 atteint un diamètre de 14 mm en sept <EMI ID=28.1>
gélose de solution de Czapek à 25[deg.]C. La surface de la colonie est radialement bombée, convexe et initialement veloutée à légèrement floculeuse. L'aspect de la surface change avec l'age en raison de la formation d'un exsudat rose qui,
après séchage, donne une surface grêlée. La bordure est fortement crénelée à lobée et nettement délimitée, ne présentant qu'une rare culture périphérique sous la surface.
Au fur et à mesure que la colonie viellit, la variation depigmentation provoque un effet de zones. La surface du verso apparaît concave et en contact avec la gélose seulement sur la périphérie. Un pigment soluble rose est produit. La nappe mycélienne est très tenace et ne produit pas d'odeur distinctive. La pigmentation chez les colonies jeunes est influencée par les ccnidies immatures qui sent jaune verdâtre pâle
(ISCC-NBS 101 et Maerz et Paul 11-K-1) . Cette couleur est éventuellement confinée à la périphérie de la colcnie.
<EMI ID=29.1>
enveloppes enfermant des cléistothécia pourpre noirâtre sont réparties dans toute la colonie, mais sont plus nettement rassemblées au centre. Au bout de 21 jours, la bordure étroite, légèrement aplatie est jaune verdStre grisâtre
(ISCC-NBS 105 et Maerz et Paul 12-1-2). A l'intérieur de cette bordure, la colonie est rose jaunâtre moyen (ISCC-NBS
29 et Maerz et Paul 11-A-6) , et la cculeur est influencée par l'exsudat. Au bout de 21 jours, le centre est foncé par des
<EMI ID=30.1>
6-F-9). En trois semaines ou plus, le verso a des teintes
de pourpre très foncé, presque noir.
La tête conidienne au début est rayonnante et jaune vif, puis devient vert foncé et nettement en ferme de colonne. Quand elles sont mûres, les têtes ont une longueur comprise
<EMI ID=31.1> une forme de poire et, comme le conidiophore, est brun clair. Les vésicules sont fertiles sur les deux tiers supérieure et
<EMI ID=32.1>
<EMI ID=33.1>
sinueux, lisses et à parois relativement épaisses. Ils ont
<EMI ID=34.1>
<EMI ID=35.1>
<EMI ID=36.1>
Les stérigmates sont bisériés, hyalins à brun clair
et sont à parois lisses. Les stérigmates primaires sont presque cunéiformes. Ils ont une longueur de 6,3 p à 10,3 p
et une largeur de 2 p x 3 p à leur endroit le plus large
<EMI ID=37.1>
ont une ferme comprise entre la forme ovoïde et la forme inverse d'une poire et ont une dimension comprise entre
<EMI ID=38.1>
<EMI ID=39.1>
dépclies à piquantes et vert foncé. Elles ont un diamètre
<EMI ID=40.1>
Sur une gélose d'extrait de malt à 35[deg.]C, il se produit
<EMI ID=41.1>
la colonie atteindra 30 mm en 21 jours. Initialement, la colonie comprend des hyphes aériens blancs. La formation de conidies se produit dans la première semaine et la colonie crénelée, veloutée et relativement plate devient vert jaunâtre foncé (ISCC-NBS 137 et Maerz et Paul 24-J-6). La colonie apparaît être divisée en zones en raison de la présence d'anneaux concentriques de masses sphériques jaunes de cellules enveloppes qui entourent eu enferment des cléistcthécia pourpre foncé. L'état conidicgène sur la gélose d'extrait de malt ressemble à cet état sur la solution gélosée de Czapek, à l'exception des dimensions.
Les têtes conidiennes ont une longueur comprise entre
<EMI ID=42.1>
Les ccnidiophores ont une longueur de 100 p à 210 � (182 p en
<EMI ID=43.1>
<EMI ID=44.1>
<EMI ID=45.1>
<EMI ID=46.1>
<EMI ID=47.1>
L'état asccgëne est similaire sur les deux géloses. De nombreuses cléistothécia prcupre foncé sont incrustées dans des cellules enveloppes globuleuses à sous-globuleuses, à parois épaisses de couleur hyalin à jaune pale qui ont un
<EMI ID=48.1>
thécia sont globoides à sous-globoides et ont des parois ayant jusqu'à trois ccuches d'épaisseur, la couche extérieure consistant en cellules pseudoparenchymateuses. Les cléisto-
<EMI ID=49.1>
<EMI ID=50.1>
<EMI ID=51.1>
<EMI ID=52.1>
façon irrégulière. Quand ils sont globoides, ils ont un
<EMI ID=53.1>
dimension. Les asques ellipsoïdaux ont une dimension de
<EMI ID=54.1>
<EMI ID=55.1>
de lentilles quand ils sent vus latéralement. On peut voir sur le grand axe de la vue lenticulaire deux crêtes équatoriales parallèles, entières, délicatement plissées. Sur la vue de la surface, en voit une seule crête qui est périphérique à la masse principale de spores, qui est lisse et de
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
Les conidies rugueuses vert jaunâtre, les têtes conidiennes en forme de colonne, les conidiophores et les vésicules brun clair à parois lisses, les stérigmates bisériés et la production de cellules envelcppes à parois épaisses glcboides placent la culture A42355 dans le groupe Aspergillus nidulans. Ces caractéristiques, combinées avec le fait que la culture a un état ascogène dans lequel des cléistothécia globoides pourpre foncé sont fortement associées
à des cellules enveloppes (comme précédemment) ou sont même enfermées dans ces cellules, et qu'elle a des ascospores lenticulaires rcuge orange qui sont ornés de deux crêtes équatoriales parallèles plissées, placent la culture A42355 dans le genre Emcricella, l'état parfait du grcupe
A. nidulans.
A42355 ne satisfait pas complètement à la description de l'une quelconque des espèces eu variétés publiées du groupe A. nidulans. L'espèce la plus similaire à A42355 est A. nidulans (Eidam) Wint., en se basant sur la culture type WB187 (NRRL 187). Ces 'cultures sont similaires par la couleur et le type des asccspores, mais diffèrent par la largeur des crêtes. T.es cléistothécia sont similaires, mais la paroi de A42355 est formée par plusieurs couches de cellules, au lieu d'une seule couche. Les deux cultures présentent un stade crnidien prédominant vert jaune sur la gélose d'extrait de malt, mais l'état ascogène de A42355 est plus fortement évident que ne l'est celui de la culture type oü il est partiellement caché par la culture et est de pigmentation terne.
Dans les deux cultures, les hyphes, les conidiophores et les vésicules sont à paroi lisse, sans incrustation ; cependant, le vésicule de A42355 a une forme de spathe à une forme de pcire, tandis que le vésicule de A. nidulans est hémisphérique. Des colonies de A42355 et de A. nidulans, quand elles sont cultivées sur de la solution gélosée de Czapek, diffèrent par la vitesse de croissance, la production d'exsudat, l'abondance et la dimension des têtes conidiennes et dans la majeure partie des autres dimensions mesurées.
Bien qu'il existe des similitudes entre A42355 et
A. nidulans (Eidam) Wint., il y a suffisamment de différences significatives pour que A42355 soit considéré comme une nouvelle variété que l'on a appelée A. nidulans var. roseus. Culture de A. nidulans var. roseus
Le milieu de culture utilisé pour cultiver Aspergillus nidulans var. rcseus peut être l'un quelconque d'un certain nombre de milieux. Pour des raisons d'économie dans la production, de rendement optimal et de facilité d'isolement du produit, on préfère cependant certains -milieux de culture. Ainsi, par exemple, une source de carbone préférée dans une fermentation à grande échelle est l'huile de coton ou le glucose, bien que l'on puisse utiliser la mélasse, l'amidon, la dextrine, le lactose, le saccharose, le maltose, le glycérol, les acides gras, etc... Les sources préférées d'azote sont la caséine hydrolysée par voie enzymatique,
la farine de soja et la peptone de viande soluble, bien que l'on puisse utiliser les grains de distillation, les nitrates, le glutamate monosodique, etc... Des sels minéraux nutritifs peuvent être incorporés dans les milieux de culture.
Ils comprennent les sels solubles habituels pouvant fournir des ions sodium, magnésium, zinc, fer, calcium, ammonium, chlorure, carbonate, sulfate, nitrate, phosphate, etc...
Des oligo-éléments essentiels pour la croissance et le développement de l'organisme doivent également être inclus dans le milieu de culture. Ces oligo-éléments se trouvent fréquemment sous forme d'impuretés dans les autres constituants du milieu, en quantités suffisantes peur satisfaire les besoins de croissance de l'organisme.
Il peut être nécessaire d'ajouter de petites quantités
(c'est-à-dire 0,2 ml/1) d'un agent antimcussant comme le pclypropylèneglycol au milieu de fermentation à grande échelle si la formation de mousse pose des problèmes.
Pour la production d'une quantité substantielle du
<EMI ID=59.1>
aérobie en immersion dans des réservoirs. De petites quantités du mélange antibiotique A4 2355 peuvent être obtenues par culture en flacons agités. En raison du temps de latence de la production d'antibiotique couramment associé à l'inoculation de réservoirs importants avec la forme spore de l'organisme, il est préférable d'utiliser un inoculum végétatif. On prépare l'inoculum végétatif en inoculant un petit volume de milieu de culture avec la forme spore ou avec des fragments mycéliens de l'organisme pour obtenir <EMI ID=60.1>
L'inoculum végétatif est ensuite transféré dans un réservoir plus grand. Le milieu utilisé pour la culture de l'incculum végétatif peut être le même que celui utilisé pour les fermentations à plus grande échelle, mais en peut également utiliser d'autres milieux.
A. nidulans var. roseus NRRL 11440 peut être cultivé à des températures comprises entre 20[deg.] et 43[deg.]C ; l'organisme se développe le mieux à des températures d'environ 30 à 37[deg.]C. La prcduction optimale du mélange antibiotique A30912 se produit à des températures inférieures à 30[deg.]C.
Comme il est habituel dans les procédés de culture aérobie en immersion, on insuffle de l'air stérile dans le milieu de culture. Peur une production efficace de l'antibiotique, il doit y avoir une aération et une agitation suffisantes pour maintenir un taux d'oxygène dissous d'au moins 40 % de la saturation de l'air à la pression atmosphérique. L'agitation est également utile pour briser la
<EMI ID=61.1>
La prcduction du mélange antibiotique A42355 peut être suivie pendant la fermentation en analysant des échantillons du bouillon fermenté ou des extraits alcooliques de la biomasse ou du bouillon entier pour déterminer l'activité antibiotique vis-à-vis d'un organisme dont on sait qu'il est sensible aux antibiotiques A30912. Un organisme d'essai utile peur tester la présence des antibiotiques A-30912 est Candida albicans. Le dosage biologique est commodément
<EMI ID=62.1>
gélose sur des plaques de gélose ensemencées.
En général, on peut détecter l'activité antibiotique dès le second jour de la fermentation. La production maximale d'activité antibiotique se produit généralement entre environ le 6ème et le 8ème jour.
Les différents facteurs de A-30912 peuvent être séparés du mélange A42355 et identifiés en utilisant la CCM
(vcir la Figure 2 des dessins). Le gel de silice est un adsorbant préféré.
Les Rf des facteurs A-G de A-30912, en utilisant la CCM sur gel de silice (Merck, Darmstadt), un système de solvants 7:3 de benzène et de méthanol et un bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau I.
<EMI ID=63.1>
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant la CCM sur gel de silice (plaque N[deg.] 60 de gel de silice MerckDarmstadt, 20 x 20 cm) et un bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau II.
TABLEAU II
<EMI ID=66.1>
Systèmes solvants
<EMI ID=67.1>
b : acétate d' éthyle :méthanol (7:3)
[pound] : acétonitrile:eau (95:5)
d : acétate d'éthyle:éthanol:acide acétique (40:60:0,25) Récupération des antibiotiques A-30912
Les antibiotiques A-30912 peuvent être recueillis du milieu de fermentation par des procédés connus dans le domaine de la fermentation. Les antibiotiques A-30912 se trouvent généralement dans la partie mycélienne du milieu de fermentation. Une récupération maximale est obtenue par extraction du bouillon entier. Il est préférable d'ajouter au bouillon entier un volume égal d'un solvant comme le méthanol et d'abaisser le pH du bouillon filtré à un pH d'environ 4-6, avant extraction. Un autre procédé d'isolement consiste à séparer le mycélium, à extraire le mycélium avec du méthanol et à recueillir les antibiotiques par extraction de l'extrait méthanolique. Le chloroforme est un solvant particulièrement avantageux pour extraire les antibiotiques A-30912 sous
forme du mélange A-42355, bien que l'on puisse utiliser d'autres solvants similaires.
Les différents antibiotiques A-30912 peuvent être isolés du mélange A-42355 séparé, par chromatographie en utilisant divers adsorbants. Les adsorbants appropriés comprennent le gel de silice ; les résines à phases inversées, comme le gel de silice/C8, le gel de silice/C18, Quantum LP-1, ou LiChroprep RP-8 et RP-18 ; Florisil ; Sephadex G-25, LH-20 et G-15 ; l'alumine ; Diaion HP-20 ; Amberlite XAD-4 et X-384. Diaion est disponible chez Mitsubishi Chemical Industries, Tokyo, Japon ; les résines de type Amberlite sont disponibles chez Rohm et Haas Co. , Philadelphie, Pensylvanie , USA ;
les résines Sephadex sont disponibles chez Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Suéde ; Florisil est disponible chez Floridin Co., Tallahassee, Florida, USA, et les gels de silice C/8 et C/18 sont disponibles chez E. Merck, Darmstadt,
<EMI ID=68.1>
chargement élevée à partir de gel de silice LP-1 (Whatman) est décrite dans l'Exemple 8.
La chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevées en phase inversée (CLFP CE) en uti-
<EMI ID=69.1>
préféré pour la purification final des antibiotiques A-30912. Dans ce procédé, le mélange A-42355 (obtenu par exemple par extraction du bouillon filtré avec du chloroforme), dissous dans un solvant, est placé sur une colonne équilibrée avec le même solvant. La colonne est ensuite éluée avec le solvant.
Le mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile est un système solvant préféré. Les fractions recueillies sont contrôlées par bioautographe par Candida albicans et/ou par UV (en se basant sur les temps de rétention relatifs).
On réunit les fractions contenant le facteur A-30912 désiré . Il est parfois nécessaire d'effectuer une séparation chromatographique supplémentaire pour obtenir le facteur de A-30912 sous une forme purifiée.
Les facteurs A, B, D et H de A-30912 peuvent être séparés par CLFPCE en utilisant les conditions suivantes :
<EMI ID=70.1>
Les durées de rétention approximatives pour les facteurs A, B, D et H de A-30912 dans ces conditions sont résumées dans le Tableau III.
TABLEAU III
<EMI ID=71.1>
Pour illustrer cette invention plus complètement, en donne les exemples suivants :
EXEMPLE 1
Préparation du mélange antibiotique A-42355
<EMI ID=72.1>
<EMI ID=73.1>
roseus NRRL 11440 et on la maintient sur une gélose inclinée de 18 x 150 ml, préparée avec un milieu ayant la composition suivante :
<EMI ID=74.1>
� Jus V-8, Campbell Soup Co., Camden, N.J.
<EMI ID=75.1>
La culture inclinée est inoculée avec Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 puis on fait incuber la
<EMI ID=76.1>
la culture inclinée mûre et on la gratte avec une anse
stérile pour libérer les spores. La suspension résultante est ensuite mise en suspension dans 10 ml d'eau désionisée stérile.
On utilise 1 ml de la culture inclinée en suspension pour inoculer 55 ml de milieu végétatif dans un flacon de
250 ml. Le milieu végétatif a la composition suivante :
<EMI ID=77.1>
*N-Z-Case, Huinko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J., U.S.A.
<EMI ID=78.1>
<EMI ID=79.1>
de type rotatif. Après 24 heures, on homogénéise le milieu pendant une minute à faible vitesse dans un mélangeur
(de type Waring), puis on le fait incuber à nouveau pendant les 24 heures restantes. Ou bien, on peut faire incuber le* milieu végétatif inoculé pendant 48 heures puis l'homogénéiser pendant 15 secondes à faible vitesse.
Ce milieu végétatif incubé peut être utilisé pour incculer un milieu de culture de fermentation en flacon agité ou pour inoculer un milieu végétatif de second stade. On peut également le conserver pour une utilisation ultérieure,
en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour cette conservation dans
de nombreuses petites ampoules, comme suit :
<EMI ID=80.1>
une solution de suspension ayant la composition suivante :
<EMI ID=81.1>
On répartit les suspensions préparées dans de petits tubes stériles à bouchon vissé (4 ml par tube) . On conserve ces tubes dans la phase vapeur de l'azote liquide.
On peut utiliser une suspension conservée ainsi
<EMI ID=82.1>
d'ensemencement liquide. On fait incuber les cultures inclinées à 25[deg.]C à la lumière pendant 7 jcurs.
B. Fermentation en réservoir
Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml de la culture végétative de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végétatif de second stade ayant la même composition que celui du milieu végétatif. Le milieu de second stade est incubé dans un flacon Erlenmeyer à large ouverture de deux litres, à 25[deg.]C pendant 24 heures, sur un agitateur tcurnant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.
<EMI ID=83.1>
comme décrit ci-dessus, est utilisé pour inoculer 100 litres d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants :
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
U.S.A.
<EMI ID=89.1>
MILIEU II
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
<EMI ID=92.1>
<EMI ID=93.1>
On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un
<EMI ID=94.1>
pendant 7 jours. On aère le milieu de fermentation avec de' l'air stérile, en maintenant le niveau d'oxygène dissous supérieur à environ 50 % de la saturation en air.
C. Milieu végétatif de troisième stade
Si l'on effectue la fermentation dans des réservoirs plus grands que ceux utilisés pour la fermentation par
100 litres, il est recommandé d'utiliser une culture végétative de troisième stade pour ensemencer le réservoir plus grand. Un milieu végétatif de troisième stade préféré a la composition suivante :
<EMI ID=95.1>
<EMI ID=96.1>
EXEMPLE 2
<EMI ID=97.1>
On agite soigneusement le bouillon de fermentation entier (4127 litres), obtenu par le procédé décrit dans l'Exemple 1 en utilisant le milieu de production II,
avec 4280 litres de méthancl pendant une heure, puis on filtre, en utilisant un adjuvant de filtration (Hyflo Supercel, une terre de diatomées, Johns-Manville Products Corp.). On ajuste le pH du filtrat à 4,0 par addition d'HCl 5 N.
On extrait le filtrat acidifié deux fois avec des vclumes égaux de chloroforme. On réunit les extraits chloroformiques et on les concentre sous vide jusqu'à un volume de 20 litres. On ajoute ce concentré à 200 litres d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355. On sépare le précipité par filtration et l'on obtient 2775 g du mélange A-42355 sous forme d'une poudre blanc gris.
EXEMPLE 3
Séparation du facteur A de A-30912
On dissout 1 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans l'Exemple 2, dans 7 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit dans une colonne en verre de
3,7 cm de diamètre intérieur et de 35 cm de longueur (Colonne de Chromatographie CLFPCE Michel-Miller, Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ 08360) garnie de résine à phase inverse de
<EMI ID=98.1>
décrit dans l'Exemple 7, par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie dans le
<EMI ID=99.1>
du mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans l'Exemple 8. Une pompe F.M.I. avec une conception de piston sans vannes (débit maximal 19,5 ml/minute) est utilisée pour déplacer le solvant dans la colonne à un débit de 9 ml/minute à 7 bars, des fractions étant recueillies toutes les minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6).
<EMI ID=100.1>
20 ml d'eau. On ajuste le pH de cette solution à 4,0 avec HC1 N. On extrait la solution résultante deux fois avec des volumes égaux de chloroforme. On réunit les deux extraits chloroformiques et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans du buthanol tertiaire et on lyophilise cette solution, ce qui donne 524 mg du facteur A de A-42355 (facteur A de A-30912 ; A-22082).
EXEMPLE 4
Séparation du facteur B de A-30912
On sépare le mélange A-42355 ccmme décrit dans l'Exemple 2, mais on chromatographie les extraits chlorcformiques concentrés (285 1) sur une colonne de gel de silice
(150 1 de gel de silice Grace, qualité 62) à un débit de
2 1/minute. On lave la colonne avec 200 litres de chloroforme, on l'élue avec 500 litres d'acétonitrile, puis on l'élue continuellement avec un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau à un débit de 1 1/minute. On recueille des fractions ayant un volume de 200 litres et on les analyse séparément pour déterminer leur activité biologique. L'analyse biologique est effectuée par une analyse sur disque de papier sur plaque de gélose, ensemencée par Candida albicans . On réunit les fractions 77 à 103 (1365 litres) et on les concentre sous vide. La solution concentrée (4,5 litres) contient un précipité qu'on enlève par filtration et l'on obtient 119 g de mélange A-42355 enrichi en facteur B. On concentre le filtrat à siccité. On redissout le résidu obtenu dans un volume approprié de méthanol.
On ajoute la solution méthanolique à
10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le complexe antibiotique contenant le facteur B. On sépare également ce précipité par filtration et on le sèche,
et l'on obtient 24 g supplémentaires de mélange A-42355 enrichi de facteur B sous forme d'une poudre grise.
Le mélange A-42355 enrichi en facteur B ainsi obtenu
(1,0 g) est dissout dans 8 ml d'un mélange de 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette sclution et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (Colonne Michel-Miller de 3,7 cm de diamètre intérieur x 33 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie d'une résine à phase inversée de gel de
<EMI ID=101.1>
méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme 'décrit dans l'Exemple
3. Le sclvant se déplace dans la colonne à un débit de
10 ml/minute à environ 7 bars comme dans l'Exemple 3.
On recueille une fraction toutes les minutes. On contrôle <EMI ID=102.1>
On réunit les fractions 102-110 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on la lyophilise, ce qui dcnne 22 mg du facteur B de A-30912.
EXEMPLE 5
Isolement du facteur D de A-30912
Or. réunit et on chromatographie sur une colonne de gel de silice comme décrit dans l'Exemple 4 les extraits chloroformiques concentrés de deux essais de fermentation (3800 1
<EMI ID=103.1>
On recueille des fractions ayant un volume d'environ 200 1 et on les soumet à une analyse biologique comme dans l'Exemple 4. On réunit les fractions 47-63 (850 1) et on les concentre sous vide. On ajoute la solution concentrée (0,7 1) à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355 enrichi en facteur D. On enlève ce précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 32 g de mélange A-42355 enrichi en facteur D sous forme d'une poudre grise.
On dissout le mélange A-42355 enrichi en facteur D ainsi cbtenu (1,0 g) dans 5 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de gel de silice, (colonne MichelMiller, 3,7 cm de diamètre intérieur x 30 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes.
La colonne a été garnie de résine à phase inversée de gel de
<EMI ID=104.1>
dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, comme décrit dans l'Exemple 3. Le solvant se déplace dans la
<EMI ID=105.1>
décrit dans l'Exemple 3. On recueille une fraction toutes les 2 minutes. L'éluticn de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm comme décrit dans l'Exemple 3. On réunit les fractions 96-108 et on les concentre sous vide peur obtenir une huile.
On dissout cette huile dans un petit volume de t-butanol et lyophilise pour obtenir 89 mg du facteur D de A-30912.
EXEMPLE 6
Séparation du facteur H de A-30912
On dissout 5,0 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans l'Exemple 2, dans 35 ml du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, on filtre la solution résultante et on l'introduit sur une colonne de verre de 3,7 cm de diamètre intérieur x 42 cm (colonne MichelMiller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système de vannes. La colonne est garnie de résine à phase inversée
<EMI ID=106.1>
7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme décrit dans l'Exemple 3. Le solvant se déplace dans la cclonne à un débit de 13 ml/minute à environ 8,3 bars, comme décrit dans l'Exemple 3, et l'on recueille une fraction toutes les 2 minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à- 280 nm comme décrit dans l'Exemple 3. On réunit les fractions 112-132 avec les fractions 106-117 d'une seconde purification similaire. Les fractions réunies sont concentrées sous vide jusqu'à une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et nn lyophilise pour obtenir 173 mg du facteur H brut de A-30912.
On dissout le facteur H brut de A-30912 (150 mg) dans
8 ml d'un mélange 7:2:1 de mëthanol, d'eau et d'acétonitrile ; on filtre la solution résultante et on la réintroduit sur une colonne de verre de 2,0 cm de diamètre intérieur x 32 cm, comme décrit ci-dessus. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 5,5 bars, comme décrit
<EMI ID=107.1>
minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans l'Exemple 3. On réunit les fractions 17 et
18 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile.
On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 29 mg du facteur H de A-30912.
EXEMPLE 7
<EMI ID=108.1>
Etape 1 : Hydrolyse
On ajoute 1000 g de gel de silice LP-1 (de Quantum <EMI ID=109.1>
sulfurique concentré et de 1650 ml d'acide nitrique concentré dans un ballon à fond rond de 5 1 et on agite pour obtenir
une suspension appropriée. On chauffe le mélange sur un bain de vapeur pendant une nuit (16 heures) avec un réfrigérant à refroidissement d'eau fixé sur le ballon.
On refroidit le mélange dans un bain de glace et on la filtre soigneusement en utilisant un entonnoir en verre fritté. On lave le gel de silice avec de l'eau désionisée jusqu'à pH neutre. Puis, on lave le gel de silice avec 4 1 d'acétone et on le sèche sous vide à 100[deg.]C pendant 2 jours.
Etape 2 : première Silylation
Le gel de silice sec de l'Etape 1 est transféré dans
un ballon à fond rond et mis en suspension dans 3,5 1 de toluène. On chauffe le ballon au bain de vapeur pendant 2 heures pour chasser toute l'eau résiduelle par distillation azéotrope. On ajoute 321 ml d'o ctadécyltrichlorosilane
(Aldrich Chemical Company), et on chauffe le mélange réactionnel à reflux pendant une nuit (16 heures) avec une lente
<EMI ID=110.1>
l'agitateur ne soit trop près de la partie inférieure du ballon, pour éviter un broyage des particules de gel de silice.
On laisse le mélange refroidir. On recueille le gel de silice silanisé, on le lave avec 3 1 de toluène et 3 1 d'acétone, puis on le sèche à l'air pendant une nuit (16-20 heures). On met le gel de silice séché en suspension dans
3,5 1 d'un mélange 1:1 d'acétonitrile et d'eau dans un ballon de 5 1, on agite soigneusement à la température ambiante pendant 2 heures, on filtre, on lave avec 3 1 d'acétone et
on sèche à l'air pendant une nuit.
Etape 3 : Deuxième Silylation
On répète le mode opératoire de la première silylation en utilisant 200 ml d'octadécyltrichlorosilane. On chauffe la
<EMI ID=111.1>
soigneusement. On recueille le produit final par filtration, on lave avec 3 1 de toluène et 6 1 de méthanol, puis on le
<EMI ID=112.1>
EXEMPLE 8
Mode opératoire de garnissage en suspension pour les colonnes Michel-Miller
Renseignements généraux
A. On peut garnir par ce mode opératoire des colonnes analytiques ou prêparatives.
B. On recommande les garnissages par gel de silice et à
phase inversée de gel de silice (par exemple, Quantum LP-1, granulométrie 10-20 microns, LiChoprep RP-8 et RP-18, granulométrie 25-40 microns). Cependant, d'autres gels de silice (par exemple, Shandons ODS Hypersil, granulométrie
5 microns) ainsi que d'autres types de résines ont été utilises comme garnissage avec succès à l'aide de ce mode opératoire.
C. En général, une pression inférieure à 14 bars et des débits compris entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette technique de garnissage en suspension ; ceci dépend du volume et des dimensions de la colonne. Il est important de noter que : la pression de garnissage doit être supérieure à la pression utilisée pendant la séparation réelle de 2 à 3,5 bars; ceci assure qu'il ne se produit pas de tassement ultérieur de l'adscrbant pendant les séparations. Les colonnes garnies selon ce mode opératoire avec du gel de silice à phase inversée peuvent fonctionner pendant plusieurs années, sans perte d'efficacité.
D. Une diminution soudaine de la pression peut provoquer des
<EMI ID=113.1>
ce qui réduirait de façon importante l'efficacité de la colonne. Il est donc important de laisser la pression descendre lentement jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe.
E. Volume approximatif des colonnes (Colonnes en verre de Ace, Catégorie No., non garnies) : 5795-04, 12 ml ; 5795-10, 1.10 ml;
5795-16, 300 ml ; 5795-24, 635 ml ; et 5796-34, 34 ml.
F. Le temps nécessaire pour garnir une colonne en verre peut varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimension de la colonne et l'expérience d� 'opérateur.
Exemple :
1. Relier la colonne de verre à une colonne réservoir par un accouplement (le volume de la colonne réservoir doit être deux fcis celui de la colonne) . Placer les deux colonnes verticalement avec la colonne réservoir au-dessus.
<EMI ID=114.1>
colonne) .
3. Ajouter 5 volumes de solvant au matériau de garnissage ; utiliser un mélange de 70-80 % de méthanol et de 20-30 % d'eau.
4. Bien agiter jusqu'à ce que toutes les particules soient mouillées, laisser reposer pendant une nuit ou plus longtemps pour assurer une imprégnation complète,des particules par le solvant. Décanter la liqueur surnageante.
5. Délayer la résine avec suffisament de solvant pour remplir la colonne réservoir. Verser rapidement dans le réservoir. NB : La colonne doit être pré-remplie avec le même solvant et
<EMI ID=115.1>
solvant avant de verser la suspensicn. L'utilisation de volumes de suspension plus grands peut également donner de bons résultats ; cependant, ceci nécessite (a) un réservoir plus grand ou (b) plusieurs remplissages du réservoir pendant l'opération de garnissage.
6. Fermer le réservoir avec le bouchon de Teflon en dessous de la colonne (voir la Figure 1 du brevet des E.U.A.
N[deg.] 4.131.547, bouchon ? 3) ; relier à la pompe ; et ccmmencer immédiatement le pompage du solvant dans les dispositifs au débit maximum si l'on utilise une pompe Ace Cat. No. 13625-
25, ou un système de distribution de solvant similaire
(20 ml/minute).
7. Continuer jusqu'à ce que la colonne soit complètement remplie de l'adsorbant. La pression ne doit pas dépasser la tolérance maximale de la colonne pendant cette opération
(14 bars pour les colonnes importantes et 21 bars pour les colonnes analytiques). Dans la plupart des cas, des pressions inférieures à 14 bars seront suffisantes.
8. Si la pression dépassait les valeurs maximales, réduire le débit et la pression diminuera.
9. Après remplissage de la colonne par l'adsorbant, arrêter la pompe ; laisser la pression tomber à zërc ; débrancher le réservoir ; remplacer le réservoir par une pré-colonne ; remplir la pré-colonne de solvant et d'une petite quantité d'adsorbant, et pomper à la pression maximale jusqu'à ce que la colonne soit complètement garnie. Pour une information supplémentaire, voir le mode opératoire général.
N.B. : Toujours laisser la pression descendre lentement après arrêt de la pompe ; ceci empêchera la formation de toutes craquelures cu canaux préférentiels dans le matériau de garnissage.
10. Supprimer la pression et débrancher soigneusement la pré-colonne. Avec une petite spatule, enlever quelques millimètres (2-4) de garnissage au sommet de la colonne : placer
1 ou 2 filtres au sommet de la colonne ; appuyer doucement jusqu'au sommet du matériau de garnissage, et placer un
<EMI ID=116.1>
de l'étanchéité. Relier la colonne à la pompe, introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par la paroi de verre au sommet de la colonne si la résine se tasse davantage. Si le matériau de garnissage doit continuer à se déposer (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions importantes), un certain espace mort apparaîtra ou bien, il se formera des canaux préférentiels et l'étape 9 doit être répétée.
REVENDICATIONS
1. Procédé de production du mélange antibiotique A-42355 comprenant les facteurs A, B, D et H de A-30912 ;
et du facteur A de l'antibiotique A-30912, du facteur B de l'antibiotique A-30912, du facteur D de l'antibiotique A-30912 et du facteur H de l'antibiotique A-30912, caractérisé en ce que :
a) cn cultive Aspergillus nidulans var. roseus NRRL
11440 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucides, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion, jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique ; b) on sépare éventuellement le mélange antibiotique
A-42355 du milieu de culture ; et c) en sépare éventuellement les facteurs A, B, D et H de l'antibiotique A-30912 à partir du mélange antibiotique A-42355.