KR790001711B1 - 생리활성물질 a f 2562의 제조법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

생리활성물질 A F 2562의 제조법

제 1 도는 AF 2562 물질의 IN-HCl 및 1N-NaOH 중에서의 자외부 흡수 스펙트럼 곡선을 나타낸다.

제 2 도는 AF 2562 물질의 브롬화칼륨정으로 측정한 적외선 흡수 스펙트럼 곡선을 나타낸다.

제 3 도는 AF 2562 물질을 듀우테로화 메탄올 용액 중에서 측정한 핵자기 흡수 스펙트럼 곡선을 나타낸다.

단, 상부 곡선의 우단은 하부 곡선의 좌단에 연결된다.

본 발명은 AF 2562 물질이라고 칭하는 신규한 생리활성물질의 제조법에 관한 것이다.

본 발명자들은 신규한 생리활성물질을 얻을 목적으로 여러가지의 토양에서 미생물을 분리하고, 그 배양 생성물을 검색하는 일련의 연구를 진행하였던 바, 폐실로미세스(Paecilomyces)속에 속하는 미생물이 그 배양물 중에 도파민, 베타, 수산화 효소의 효소활성을 저해하는 신규한 생리활성물질, 즉 본 발명자들에 의하여 AF 2562 물질이라고 명명된 물질을 생성 축적함을 발견하고, 또 그 물질을 그 배양물에서 채취하는 방법에 대하여 연구하여, 본 발명을 완성했다.

AF 2562-물질을 생산하는 대표적인 균주(菌株)는 본 발명자들에 의하여 토양 중에서 분리된 것으로서 그 균학적 생상은 다음과 같다.

1) 각종 배지에 있어서 발육상태(27℃, 2주간)

(1) 맥아 엑기스 한천

발육이 양호하고 백색 내지 담다색의 면모상의 균사체

를 형성한다. 이면 및 한천은 담갈색으로 된다.

(2) 고구마, 포도당 한천

발육이 양호하고 백색 내지 담다색의 면모상 균사체를 형성한다. 이면은 갈색, 한천 중에 황색 색소를 생산한다.

(3) 투팩 한천

발육이 양호하고 집락 중심부는 백색 내지 담증색의 면모상이고 주변이 엷게 퍼져 있다. 이면은 다갈색이고 한천 중에 담황색 색소를 생산한다.

(4) 사브로 한천

발육이 양호하고 균사체를 면모상이고 백색 내지 조금 다색을 띈다. 이면은 갈색이고 주름이 있으며, 한천 중에 황각색 색소를 생산한다.

(5) 오오트밀 한천

발육은 조금 불량하고 한천 표면에 조금 소(疎)하게 백색 균사가 퍼져 있다. 이면 및 한천은 담황색으로 된다.

(6) YpSs 한천

발육이 양호하며 균사체는 면모상이고 백색 내지 조금 다색을 띈다. 이면은 다갈색이고 주름이 있고, 한천 중에 황갈색 색소를 생산한다.

상기의 어느 배지에 있어서도 포자형성은 양호하다. 기균사

는 잘 발달하고, 기균사 또는 영양균사에서 돌출하는 포자 자루에는 불규칙적인 분기가 보이고, 1 내지 5본의 선단의 미세하게 된 긴(10-20μ) 경자(梗子)가 점차 윤생(輪生)한다.

경자의 선단에서 포자(피아로스포어 : Phialospore)가 생성하고 불규칙적인 쇄상을 이루고 있는데, 일부에는 포자가 모인 구상체도 존재한다. 포자는 장원형이고 길이 3 내지 5μ, 폭 1.5 내지 2μ이고 그 내부에는 격벽이 존재하지 않는다.

2) 생리적 성질

(1)생육조건

PH : 2-12의 범위에서 생육하고, 5-6이 적당하다.

온도 : 10-35℃에서 생육 가능하고, 적정 범위는 20-27℃이다.

(2) 탄소원의 이용성

폴리펠톤 0.5%, 효모엑기스 0.1%로 된 액체배지에 각종 탄소원을 3%씩 첨가하고, 27°, 7일간 진탕배양한 것의 균체생육 상황은 다음과 같다.

글루코우스 ++ (발육 양호)

가락토우스 ++ (발육 양호)

만노우스 ++ (발육 양호)

프락토우스 ++ (발육 양호)

삭카로우스 ++ (발육 양호)

말 토 우스 ++ (발육 양호)

락토우스 ++ (발육 양호)

덱스트린 ++ (발육 양호)

가용선전분 ++ (발육 양호)

글리세롤 ++ (발육 양호)

솔 비 톨 + (꽤 발육)

셀룰로오스 + (꽤 발육)

대 두 유 ++ (발육 양호)

주 석 산 ± (조금 발육)

구 연 산 ± (조금 발육)

호 박 산 ± (조금 발육)

프 말 산 ± (조금 발육)

이상의 것을 토대로 하여, H.L 바아네트(Barnett)의 알라스트레이티드 제네라 오브 임퍼펙트 펀지(Ulustrated Genera of lmperfect Fungi)제3판 1972년 발행 및 지엘 바론(G.L Barron)의 더 제네라 오브 하이포미세레스, 프롬, 소일(The Genera of Hyphomycetes from Soil) 1968년 발행된 것에 의하여 검색하면, 본균은 페실로미세스 속에 속하는 것이 명백하다.

다음에, 트랜섹숀브, 리티쉬, 미클로지칼, 소사이어티(Transactions British Mycological Society) 40권, 17-89면, 1957년 발행에 기재된 브라운 및 삭미스(Brown ＆ Smith)의 문헌 및 스터디스, 인, 미클로지(Studies in Mycology) No 6, 1974년 센트럴뷰로우, 뵐 쉼멜 칼츄어스, 바아름, 네델란드(enturalbureau Voor Schimmdl-Cultures Buarm, the Netheland) 발행에 기재된 삼손(Samson)의 문헌을 참조하여, 폐실로미세스 속(屬)의 종류에 대하여 검색하면, 본균에 가까운 종류로써 페실로미세스, 파리노사스 또는 체실로미세스, 푼토니가 발견된다. 그러나, 다음 표에 나타낸 것과 같이, 본균은 그 어느 것과도 많은 차이점이 있고, 특히 포자쇄

중의 포자의 배역상태에 중대한 차이가 있다. 포자배열의 상태에 주목하면, 본균은 페실로미세스 에레간스(별명 마리안나, 에레간스)에 유사하다. 그러나, 포자의 크기, 형상에 차이가 있고, 포자의 배열상태에서도 명백하게 차이가 인정된다. 즉, 폐실로미세스, 에레간스에서는 포자가 그 경사면에서 점하여 배열하여, 포자의 장측과는 경사의 방향에 포자쇄가 신장하는데 대하여, 본균에서는 포자가 장변(長邊)에서 접하고, 포자쇄는 포자의 단축방향으로 신장하고, 그리고도 인접하는 포자가 통상시는 서로 다르게 스쳐 지난다는 특징을 갖는다.

따라서 본 발명자들은 본 균을 새로운 종류로 판정하고, 페실로미세스, 알텔나타스(Paecilomyces alter-natus) AF 2562라고 명명하였다.

[표 1]

또 본 균은 통상 산업성 공업기술의 미생물공업 기술연구에 미생물 수탁번호 제2355호로 기탁되어 있다.

본 발명에 있어서 사용균으로써는 상기 기탁된 균이 대표적인 균주이고 이것 이외의 페실로미세스 속에 속하는 균이라도 AF 2562 물질을 생산하는 균은 모두 사용할 수 있다. 또 이들의 균주에 자외선을 조사하거나 또는 니트로속아니딘 등 미생물의 변이 때문에 통상 이용되는 변이 유기제에 의한 처리를 행하여 얻어진 변이주 및 자연 발생한 변이주 중에도 AF 2562 물질을 생산하는 것이 발견되어, 이들의 변이주도 본 발명에 사용할 수 있다.

본 발명을 실시하는데 있어서는, 페실로미세스 속에 속하는 AF 2562 물질 생산균을 미생물을 배양하는 통상의 방법으로 배양한다. 배양방법은 액체 배양에서나 고체 배양에서도 지장이 없다. 액체 배양의 경우에는 정치하거나 교반 또는 통기하여도 좋다.

통상은 액체의 진탕 또는 통기 교반 배양이 사용된다.

배지에는 미생물의 배양에 사용되는 것이 널리 사용될 수 있다. 즉, 탄소원으로서는, 예를들면 글루코우스, 가락토우스, 프락토우스, 만노우스, 락토우스, 메리비오우스, 덱스트린, 전분, 글리세린, 솔비톨 등의 당류 및 대두유, 라아드 등의 식물성, 동물성 유지류가 사용된다. 질소원으로서는 예를들면 펩톤, 효모엑기스, 고기엑기스, 대두분, 면실분, 옥구구전분푸리커, 글루타민산, 아스파라긴산, 티로신, 페닐알라닌 등의 아미노산, 및 그 염류, 뇨소, 암모늄염류, 질산염류 등이 사용된다. 기타 인산, 마그네슘, 칼슘 나트륨, 칼륨, 철, 망간 등의 무기염류, 비타민 등의 미량 영양소를 적당히 가할 수 있다. 또 효모 등의 미생물균체, 식물, 동물의 생물체, 또는 그들의 추출물마저도 적당히 가할 수 있다. 이들 외에도 계피산, 파라히드록시계피산, 파라할로겐화계피산, 게피산알코올 및 이들의 염류 또는 에스테르 등의 간단한 유도체를 배지 중에 첨가하여, 목적물의 생산량을 증대시킬 수 있다. 물론 이들의 배지성분 내지는 첨가물은 배양도 중에도 첨가할 수 있다.

배지의 PH, 배양온도, 배양기간 등의 배양조건은 목적물을 생산하는 범위 내에서 적당히 변경할 수 있는데, 액체의 진탕 또는 통기교반 배양의 경우는 PH 3-7, 20-30℃, 2-10일간의 배양이 적당하다.

이와같이 하여 얻어지는 배양물 중에는 AF 2562물질이 생성 축적된다. 본 물질은 배양여액 및 균체의 어느 것에서도 채취 가능한데 액체 통기 교반 배양을 행한 배양물에서는 본 물질은 주로 배양물의 분리채취 조작은 예를들면 셀라이트 등을 여과조제로 하는 여과조작에 의하여 용이하게 행해진다. 이 배양액에서 목적물을 얻기 위해서는 예를들면 이온 교환수지에 의한 흡착,탈리, 유기용매에 의한 추출 또는 흡착 크로마토그라피 등 통상 미생물의 배양물에서 유기물질을 분리, 정제하는 수단이 적당히 조합되어 사용된다. 보다 구체적으로는, 다웩스 50W(H형), 앰버라이트 IRC-120(H형) 등의 강산성 양이온 교환 수지 또는 DEAF 셀룰로오스(OH형), 앰버라이트 IR-45(OH형) 등의 염기성 음이온 교환수지를 채운 칼럼에 배양 여액 또는 본 물질을 함유하는 액을 통하여 목적물을 흡착시킨 후 산, 알칼리 또는 염류용액을 사용하여 용출한다. 배양 여액 또는 상기의 용출액 또는 본 물질을 함유하는 수용액의 PH를 산성으로 보정하여 초산에틸, 부타놀 등의 유기용매를 사용하여 추출하면 목적물은 유기용매 층으로 전용(轉溶)한다. 이 유기용매층을 분리 채취하여 감압하에 농축하면 목적물은 갈색을 띈 거친 물질로서 얻어진다. 다음에 이 거친 물질을 알루미나, 실리카겔 등의 흡착제를 채운 칼럼에 흡착시키고, 벤젠, 클로로포름, 초산에틸, 메탄올, 묽은 암니아수 등을 단독으로 또는 적당히 조합시킨 혼합용매로 전재하면 목적물을 더욱 정제할 수 있다. 목적물을 포함하는 용출구분을 적당량까지 감압하에 농축하고, 한곳에 방치하면 목적물이 담황색의 조결정으로 얻어진다. 이 조결정을 메탄올 등의 적당한 용매로서 재결정하면 AF 2562 물질의 무색 결정이 얻어진다.

본 발명 방법에 의하여 얻어진 AF 2562 물질의 이화학적 성질은 다음과 같다.

정제된 AF 2562 물질은 무색결정으로 얻어지고, 융점은 222°-6℃이다.

본 물질은 탄소, 수소, 질소 및 산소를 함유하며, 원소분석은 C, 68.06; H, 5.13; N, 6.20이었다. 메틸화물의 매스 스펙트럼 분석에서 분자량은 229로 결정되고, 분자식은 C₁₃H₁₁O₃N으로 나타낸다.

자외부 흡수 스펙트럼은 제 1 도와 같고, 1NHCℓ 중에서는 270mμ(ε, 10.1×10°)에 흡수가 극대이고, 1NN∼OH 중에서는 270mμ과 300mμ 부근에 쇼울더(Shoulder)가 존재한다.

적외부 흡수 스펙트럼은 제 2 도와 같으며, 3030, 1655, 1590, 1515, 1440, 1385, 1305, 1280, 1245, 1230, 1220, 1175, 1120, 825, 800㎝^-1의 각 파수에서 흡수를 나타낸다.

광학활성은 없다.

핵자기공명(NMR) 스펙트럼은 제 3 도와 같다.

각종의 용매에 대한 용해성은, 메탄올, 물에 가용, 아세톤, 초산에틸, 클로로포름에 난용, 벤젠, n-헥산에 불용이다.

정색 반응으로서는, 과망간산칼륨을 탈색하고, 닌히드린반응, 미론반응, 염화 제1철(1% 초산용액) 반응에 양성을 나타낸다.

수용액 중에서는 무색이고 산성을 나타낸다.

이상의 이화학적 성질에서 명확한 바와 같이 본 물질은 신규 생리 활성 물질인 것이 확인되어 AF 2562 물질이라고 명명되었다.

본 물질은 소의 부신수질(副腎髓質)의 도우파민, 베타, 수산화 효소의 활성을 현저하게 저해하는 생기 활성을 가진다. 그 저해의 강도는 케미칼 엔드 파마슈티칼 불리틴(Chemical and Phramaceutical bucletin)17권, 2377페이지, 1969년에 기재된 나가츠씨의 방법에 의하여 측정하면, 50% 저해농도는 8.9×10^-9/ml(3.9×10^-3몰 농도)이다. 이 저해는 칠라민에 불길항적(불길항적)이지만, 아스코르빈산에는 길항적이고, 그 저해정수는 5×19^-9몰 농도이다. 또, 본 물질의 dd-계 생쥐의 복강내 투여에 의한 급성독성(LD50)은 354mg/kg이다.

[실시예 1]

AF 2562균을 투팩 한천의 사면 배지에 3주간 배양하여 잘 발육시킨다. 500ml들이의 사카구치(坂口) 코르벤 50개에 포도당 3%, 폴리펩톤, 0.5%, 효모엑기스 0.1%(PH 6.6)로 된 배지를 100ml씩 나누어 붓고, 120℃에서 15분간 고압 멸균한다.

이 플라스크 1개에 사면 배제에서 균사체를 절취하고 접종하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양한다(종배양). 이와같이 하여 얻어진 배양물 1ml씩을 나머지의 사카구치 코르벤 49개에 무균적으로 접종하고 배양을 개시한다. 배양은 30℃ 7일간 전량 배양한다. 배양액을 여과하여 균체를 제거하고, 얻어진 배양여액 4.4ℓ를 다웩스 50W(H형) 칼럼 1ℓ에 흡착시킨다. 물로써 충분히 세정한 후 1N 암모니아수로 용리한다. 활성획분 1.7ℓ를 감압하에서 농축한다. 이 농축물을 100ml의 물에 녹여 PH 2.0으로 조절하고, 등량의 초산에틸로 3회 추출하여 초산에틸층을 모아 감압하 농축한다. 이 농축물을 소량의 메탄올에 용해하고 실리카겔(마린 크록토사제품) 2g에 흡착시키고, 건조한다. 이미 클로로포름으로 충전한 실리카겔 칼럼 300ml에 상기의 실리카겔을 중층하고, 클로로포름 1.5ℓ를 흘려 세정한다. 그후 클로로포름-메탄올(19 : 1)로서 전개하여 분획한다. 활성획분을 모아 농축한다. 농축물을 소량의 메탄올에 녹이고, 메탄올로 충전한 중성 알루미나(메르크사제품) 칼럼 200ml에 흡착시킨다. 메탄올 500ml를 흘려 충분히 세척한 후, 메탄올-4N 암모니아수(4 : 1)로써 전개하여 분획한다. 활성획분을 모아, 감합하에 농축한다. 농축물을 300ml의 물에 용해하고, PH 2.0으로 조절하고, 등량의 초산에틸로 3회 추출한다. 초산에틸층을 모아 감압하 농축하면, 담황백색 결정이 얻어진다. 이 조결정을 모아, 메탄올로써 재결정하여 정제하니 약 4mg의 AF 2562 물질을 무색의 결정으로 얻었다.

[실시예 2]

30ℓ의 스텐레스제 발효조 10기에 각각 포도당 3%, 폴리펩톤 0.5%,효모엑기스 0.1% 소포제 KM 70(노부코시 화학제품) 0.05%로 된 배지 20ℓ를 넣고, 120℃ 30분간 가압 멸균한다. 냉각 후 실시예 1과 같이 진탕 배양에 의하여 얻어진 배양물을 1기에 대하여 2플라스크분을 각각 무균적으로 접종하여 배양을 개시한다. 배양은 배양액의 용량에 대하여 매분 25%, 통기매분 250회전의 교반하 30℃에서 행해진다. 필요에 따라 소포제가 첨가된다.

3일간 배양한 후, 배양물을 취하고 균체를 여과하여 분리한 배양액 160ℓ를 다웩스 50W(H형) 칼럼 10ℓ에 흡착시켜, 40ℓ의 물로 충분히 세정하여, 1N 암모니아수로 용리한다. 활성획분 60ℓ를 모아 염산으로써 PH 2.0으로 조절하여 1/2량의 초산에틸로 3회 되풀이하여 추출한다. 초산에틸층을 모아 감압하에서 농축한다. 이 농축물을 소량의 메탄올에 녹이고, 메탄올로서 충전한 알루미나 칼럼 1ℓ에 흡착시킨다. 메탄올 -4N 암모니아수(9 : 1) 5ℓ를 흘려 세정한 후 메탄올-4N 암모니아수(4 : 1)로서 전개하고, 분획한다. 활성획분을 농축하고, 300ml의 물에 녹여 PH 9.5로 조절하고, 등량의 초산에틸로 추출한다. 초산에틸층은 버리고, 수층을 PH 2.0으로 보정하여, 등량의 초산에틸로 3회 추출한다. 초산에틸층을 모아 감압하에서 농축한다. 농축물을 소량의 메탄올에 녹이고, 실리카겔 20g에 흡착시켜 건조한다. 미리 클로로포름으로 충전한 실라카겔 칼럼 1ℓ에 상기 실리카겔을 중층하고, 클로로포름 3ℓ를 흘린 후 클로로포롬-메탄올(19 : 1)로 전개하고, 분획한다.

할성획분을 모아 감압하 농축하면, 담황백색 결정이 얻어진다. 이 조결정을 모아 에탄올로써 재결정하여 정제하니 AF 2562 물질을 무색의 결정으로서 약 200mg 얻었다.

Claims (1)

1. 페실로미세스 속에 속하는 페실로미세스알텔나타스 AF 2562균(일본 통상산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소 기탁번호 제2355호)을 배양하고, 그 배양물에서 생리활성물질 AF 2562를 채취함을 특징으로 하는 AF 2562의 제조법.

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