Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique La présente invention a pour objet un pro cédé de préparation d'un nouvel antibiotique.
Ce nouvel antibiotique, que l'on appelle dans ce qui suit spiramycine , peut être ob tenu à partir des cultures par fermentation d'un micro-organisme particulier décrit ci-après. Il n'a pu être obtenu jusqu'ici à l'état cristallisé. En tant que base, il se présente sous forme d'une poudre amorphe, blanche ; ses sels d'ad dition acides, par exemple le sulfate et le chlor- hydrate, peuvent être isolés à l'état solide. La base est soluble dans le chloroforme, les sol vants chlorés, les alcools, l'hexane, le benzène, les cétones et les acétates d'éthyle et d'amyle.
Le sulfate est soluble dans l'eau et les alcools aliphatiques inférieurs tels que le méthanol, l'éthanol, le butanol. L'analyse élémentaire de la base montre qu'elle contient seulement les éléments<I>C, H,</I> O et<B>N;</B> plusieurs analyses ef fectuées sur des échantillons de base ont donné les valeurs suivantes
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Par distribution à contre-courant avec 60 tubes suivant la méthode de Craig,
en utilisant le cyclohexane et une solution aqueuse de spi- ramycine renfermant 1 % de phosphate diso- dique, on a pu mettre en évidence la présence de 3 constituants ; cependant, ces trois corps paraissent extrêmement voisins du point de vue composition, propriétés chimiques et activité antibactérienne.
Le poids moléculaire de la base, calculé à partir de son équivalent neutre ou par dosage des ions sulfate sur le sulfate, est compris entre (400)n et (450)n. La détermi nation du poids moléculaire par la méthode de Rast semble indiquer que n = 2. La teneur en azote donne également un chiffre compris dans ces limites, ce qui indique que tout l'azote est basique.
La base donne des tests négatifs dans les réactions suivantes : réaction de Sakaguchi, réaction de Molish, réaction à la ninhydrine, réaction à la ninhydrine après hydrolyse acide, réaction à la liqueur de Fehling, réaction du biuret, réaction du maltol ferrique, réaction du maltol ferrique après hydrolyse alcaline. Avec les acides fort concentrés, elle donne une colo ration rose violet.
La base est optiquement active et ses solutions dans le chloroforme ou l'alcool éthylique sont lévogyres = - 72o (c = 2 0/0, éthanol) pour un produit
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spéciale ment purifié. Son spectre d'absorption (solu tions dans l'alcool éthylique) dans l'ultra-violet présente un seul maximum à 231 m[, (E
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_ 346 pour un échantillon spécialement purifié), ce qui la différencie de l'érythromycine (280 m#t) et de la carbomycine (240 m#t), dont elle se rapproche par son spectre antibactérien.
Elle se différencie également de ces deux anti biotiques en ce sens que des germes rendus ré sistants à la spiramycine conservent une sensi bilité partielle à l'érythromycine et à la carbo- mycine. La spiramycine est surtout active vis- à-vis des germes Gram positifs, mais est peu active vis-à-vis des germes Gram négatifs ; elle possède également une certaine activité sur les mycobactéries.
Elle est très active vis-à-vis des germes anaérobies et, en particulier, de Clos- tridium septicum et Clostridium histolyticum. Le tableau I résume le spectre antibactérien d'un échantillon spécialement purifié, l'activité étant déterminée en milieu liquide.
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<I>In vivo</I> chez la souris, la spiramycine est très active, par voie orale et sous-cutanée, sur les infections à streptocoque, pneumocoque et staphylocoque, pour de faibles fractions des doses maxima tolérées.
Elle s'est révélée active comme antimalarique dans le traitement de l'infection à P. Berghei de la souris. Elle pos sède également une activité curative et préven tive sur les infections à rickettsies de la souris. Sa toxicité est très faible : chez la souris, elle est bien tolérée par voie orale à la dose de 5 g/kg. La dose léthale pour 50 % des animaux (DL5o) est de 1,5 à 2,5 g/kg par voie sous- cutanée et de 0,15 à 0,25 g/kg par voie intra veineuse.
L'organisme qui produit le nouvel anti biotique est une espèce du genre<I>Streptomyces</I> et il sera appelé ci-après S. 3486 ou<I> Strepto-</I> <I>myces 3486 </I> (de même que ses mutants).
Ce micro-organisme a été isolé d'un échan tillon de terre provenant d'un champ aux en virons de Péronne, dans le département de la Somme (France) ; la méthode d'isolement a été la suivante : un échantillon de terre a été mis en suspension dans de l'eau distillée stérile, la suspension a été diluée et une petite quantité de cette suspension étalée sur une boîte de Pétri renfermant de la gélose nutritive. Après incu bation de 7 jours à 280, la colonie de<I>Strepto-</I> <I>myces 3486</I> a été prélevée au moyen d'un fil de platine et utilisée pour ensemencer des tubes de gélose nutritive inclinée pour obtenir de plus grandes quantités de cet organisme.
Cette souche de<I>Streptomyces 3486</I> a été déposée au Northern Régional Research Labo- ratory (NRRL) à Peoria 5, Illinois, Etats-Unis, sous référence NRRL <I>2420.</I>
En utilisant la classification du Bergey's Manual of déterminative Bacteriology (6e édi tion 1949) pour le genre Streptomyces, cet or ganisme peut être rapproché du<I>Streptomyces</I> griseolus, primitivement décrit par Waksman sous le nom d'Actinomyces <I>96</I> [Soil Science<I>8,</I> 121 (1919)]. Comme on le verra par la suite, il existe certaines différences entre l'organisme décrit par Waksman et le S. 3486, de sorte qu'on ne peut assimiler les deux Streptomyces à une même espèce.
Quelques propriétés de S. 3486, en particulier la production d'un pig ment brun en milieu synthétique et sur pomme de terre, permettraient également de le classer près du<I>Streptomyces</I> fimicarius. Cependant, la production de pigment par S. 3486 est, dans ces deux cas, extrêmement faible et il diffère de <I>S.</I> Fimicarius par un certain nombre d'autres caractères. Enfin, la souche S. 3486a montré des propriétés variables au cours des essais d'identification et la description donnée ci-des sous correspond aux caractères les plus fré quemment observés.
<I>Morphologie microscopique</I> Cultivée sur gélose de Czapek au glucose, cette souche produit des filaments ramifiés. Dans des conditions favorables d'ensemence ment, on peut observer rapidement la forma tion de chaînes de spores qui se rattachent aux filaments principaux soit isolément, soit ras semblées en arborescences. La forme des fila ments sporulés peut être simplement recourbée, ou en vrille, ou irrégulièrement contournée. A l'aisselle des filaments sporulés on rencontre fréquemment des éléments non segmentés en forme de vrille à plusieurs spires serrées. Les spores ont en général une forme variable, d'ovale courte à sphérique.
<I>Forme des colonies</I> Des cultures monospores sur gélose à l'as paragine présentent des colonies rondes dont la taille peut varier selon le degré de dévelop pement.
Dans le cas d'ensemencement dense, les colonies restent petites, rondes, hémisphériques, et peuvent présenter dans certains cas une dé pression centrale plus ou moins accusée. La sporulation est rapide et s'étend en général sur la colonie entière ou sur le pourtour avec ten dance à former des arborescences autour de la colonie. La couleur du mycélium aérien, d'abord blanche, vire au gris au moment de la sporulation.
Dans le cas où les colonies sont peu nom breuses, leur forme peut être variable, mais l'aspect le plus fréquemment observé est celui d'une colonie ronde pouvant atteindre 10 mm de diamètre. Le mycélium végétatif jaunâtre, à bords lobés, forme des plis profonds suivant les rayons et plusieurs bourrelets concentriques laissant en général une dépression au centre de la colonie.
Des craquelures se produisent le long des plis, en particulier au centre de la co lonie, montrant l'envers du mycélium végétatif. Le mycélium aérien d'abord blanc (très légère ment teinté de jaune rosé pâle) prend rapide ment une teinte grise au moment de la sporula- tion qui peut se produire plus intensément sur la partie externe de la colonie.
<I>Caractères culturaux -</I> <I>Propriétés biochimiques</I> Les caractères culturaux et les réactions biochimiques sont donnés dans le tableau ci- dessous. Les milieux de culture utilisés ont été préparés pour la plupart d'après des formules publiées par S.A. Waksman dans The Actino- mycetes (1950. Chronica Botanica Company. Waltham. Mass. USA. p. 193 à 197). Les numéros donnés aux différents milieux dans The Actinomycetes ont été conservés ici.
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<I>1) <SEP> Caractères <SEP> culturaux</I>
<tb> Milieux <SEP> Mycélium <SEP> végétatif <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Sporulation <SEP> Exopigment
<tb> Gélose <SEP> synthéti- <SEP> Jaunâtre <SEP> à <SEP> grisâtre <SEP> se <SEP> Blanc <SEP> virant <SEP> au <SEP> Rapide <SEP> I <SEP> Très <SEP> faible, <SEP> brun
<tb> que <SEP> (milieu <SEP> de <SEP> développant <SEP> presque <SEP> gris <SEP> au <SEP> moment <SEP> jaunâtre
<tb> Czapek) <SEP> uniquement <SEP> sous <SEP> la <SEP> de <SEP> la <SEP> sporula (N. <SEP> 1) <SEP> surface.
<SEP> La <SEP> pousse <SEP> tion
<tb> au-dessus <SEP> de <SEP> la <SEP> sur face <SEP> est <SEP> limitée <SEP> pres que <SEP> entièrement <SEP> au
<tb> mycélium <SEP> aérien
<tb> Gélose <SEP> synthéti- <SEP> Jaunâtre <SEP> à <SEP> orangé <SEP> Blanc <SEP> jaunâtre <SEP> Plus <SEP> tardive <SEP> Très <SEP> faible, <SEP> brun
<tb> que <SEP> au <SEP> glucose <SEP> grisâtre <SEP> rougeâtre
<tb> Gélose <SEP> à <SEP> l'aspara- <SEP> Jaunâtre, <SEP> lobé <SEP> Blanc <SEP> Gris, <SEP> à <SEP> légère <SEP> ten- <SEP> Faible, <SEP> jaune <SEP> brun
<tb> gine <SEP> dance <SEP> jaune
<tb> (No <SEP> 3) <SEP> verdâtre.
<SEP> Peut
<tb> former <SEP> des <SEP> ar borescences <SEP> sur
<tb> les <SEP> bords <SEP> de <SEP> la
<tb> colonie <SEP> i
<tb> Gélose <SEP> au <SEP> malate <SEP> Développement <SEP> rapide <SEP> semblable <SEP> à <SEP> celui <SEP> sur <SEP> milieu <SEP> synthétique
<tb> de <SEP> calcium <SEP> (N <SEP> 1) <SEP> Pas <SEP> d'exopigment
<tb> Gélose <SEP> à <SEP> la <SEP> tyro- <SEP> Développement <SEP> à <SEP> peu <SEP> près <SEP> nul <SEP> Pas <SEP> d'exopigment
<tb> sine
<tb> (N <SEP> 4)
<tb> Bouillon <SEP> glucosé <SEP> Pousse <SEP> moyenne <SEP> jau- <SEP> Très <SEP> peu <SEP> Jaune <SEP> ambré <SEP> fai - <SEP> (N <SEP> 16) <SEP> nâtre <SEP> développé <SEP> ble <SEP> ou <SEP> pas <SEP> de
<tb> pigment
<tb> Bouillon <SEP> peptoné <SEP> Jaune <SEP> ambré <SEP> Blanc <SEP> sur <SEP> les <SEP> Jaune <SEP> brun,
<SEP> faible
<tb> gélosé <SEP> bords <SEP> de <SEP> la <SEP> ou <SEP> pas <SEP> de <SEP> pig (N- <SEP> 5) <SEP> culture <SEP> ment
<tb> Gélose <SEP> peptonée <SEP> Jaunâtre <SEP> Peu <SEP> développé <SEP> Présence <SEP> ou <SEP> ab- <SEP> Faible, <SEP> brun <SEP> jau glucosée <SEP> blanchâtre <SEP> sence <SEP> suivant <SEP> nâtre <SEP> ou <SEP> pas <SEP> de
<tb> les <SEP> cultures <SEP> ; <SEP> pigment
<tb> gris <SEP> jaunâtre <SEP> si
<tb> présence
<tb> Milieu <SEP> Jaune <SEP> orangé <SEP> à <SEP> jaune <SEP> Blanc <SEP> plus <SEP> déve- <SEP> Présence <SEP> ou <SEP> ab- <SEP> Faible, <SEP> brun <SEP> jau d'Emerson <SEP> brun <SEP> loppé <SEP> sur <SEP> les <SEP> sence <SEP> suivant <SEP> nâtre <SEP> ou <SEP> pas <SEP> de
<tb> bords <SEP> de <SEP> la <SEP> les <SEP> cultures <SEP> ;
<SEP> pigment
<tb> culture <SEP> gris <SEP> jaunâtre <SEP> si
<tb> présence
<tb> Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Brun <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> Surfacepoudreuse <SEP> Présence <SEP> ou <SEP> ab- <SEP> Variable, <SEP> brun <SEP> fai suivant <SEP> les <SEP> cultures <SEP> à <SEP> reflet <SEP> grisâtre <SEP> sence <SEP> suivant <SEP> ble <SEP> à <SEP> brun <SEP> rou les <SEP> cultures <SEP> ; <SEP> geâtre <SEP> pouvant
<tb> grisâtre <SEP> colorer <SEP> le <SEP> frag ment <SEP> de <SEP> pomme
<tb> de <SEP> terre <SEP> et <SEP> l'eau
<tb> du <SEP> fond <SEP> du <SEP> tube <I>20 Propriétés biochimiques</I> Lait - A 26,1 : culture formant voile. Pep- tonisation partielle en un mois sans coagulation apparente.
La zone peptonisée prend une teinte orangé brun ou rougeâtre. Sur lait au bro- mocrésol pourpre<I>: pH</I> inchangé ou évoluant vers l'alcalinité suivant les cultures.
A 37 : développement moins bon. Floculation occasionnelle, peptoni- sation partielle.
Gélatine - (Formules N-fi 7 et 8 de Waksman). Liquéfaction moyenne. Voile jau nâtre et flocons jaunâtres dans la partie liquéfiée. Pigment : variable, brun orangé faible dans la partie liquéfiée, plus accusé sur le milieu glucosé.
Nitrites - La réduction des nitrates en nitrites se produit en milieu synthétique (en présence de saccharose). En milieu organique, les réactions de recher che des nitrites sont négatives. Utilisation de différentes sources de carbone Ces essais ont été effectués en utili sant la méthode de Pridham et Gottlieb [J. Bact. 56, 107 - 114 (1948)].
Eléments bien utilisés : glycérine, arabinose, glucose, galactose, lévu lose, mannose, lactose, rhamnose, amidon, mannitol.
Eléments utilisés plus lentement (cultures bien développées, mais plus tardives) ou de façon irrégu lière : xylose, saccharose, maltose, inositol.
Eléments non utilisés : raffinose, érythritol, dulcitol, sorbitol. Comparaison entre le<I>S.</I> Griseolus et le S. 3486- Le tableau ci-dessous réunit quelques-uns des caractères qui permettent de rapprocher ou de différencier la souche de<I>S.</I> Griseolus décrite par Waksman et la souche productrice de spi- ramycine.
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Ï
<tb> Streptomyces <SEP> griseolus
<tb> Souche <SEP> S. <SEP> 3486
<tb> Morphologie <SEP> Spirales <SEP> non <SEP> observées.
<SEP> Présence <SEP> de <SEP> spirales.
<tb> microscopique <SEP> Spores <SEP> ovales <SEP> à <SEP> sphériques. <SEP> Spores <SEP> ovales <SEP> à <SEP> sphériques.
<tb> Agar <SEP> synthétique <SEP> Prédominance <SEP> du <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> Prédominance <SEP> du <SEP> mycélium <SEP> aérien
<tb> gris. <SEP> Pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> soluble. <SEP> gris. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> très <SEP> faible,
<tb> jaune <SEP> brun.
<tb> Bouillon <SEP> glucosé <SEP> Pigment <SEP> brun <SEP> faible <SEP> ou <SEP> nul. <SEP> Pigment <SEP> jaune <SEP> ambré <SEP> ou <SEP> nul.
<tb> Gélatine <SEP> Liquéfiée. <SEP> Pellicule <SEP> jaunâtre. <SEP> Liquéfiée. <SEP> Pigment <SEP> jaune <SEP> brun <SEP> fai ble.
<tb> Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Crème <SEP> à <SEP> noir.
<SEP> Brun <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> foncé.
<tb> Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> devenant <SEP> brune. <SEP> Pomme <SEP> de <SEP> .terre <SEP> colorée <SEP> en <SEP> brun.
<tb> Lait <SEP> Coagulé, <SEP> peptonisé. <SEP> A <SEP> 261, <SEP> : <SEP> peptonisé <SEP> sans <SEP> coagulation
<tb> apparente.
<tb> Nitrates <SEP> Réduits <SEP> en <SEP> nitrites. <SEP> Réduits <SEP> en <SEP> nitrites.
<tb> Pigment <SEP> Formation <SEP> d'un <SEP> pigment <SEP> brun <SEP> faible. <SEP> Formation <SEP> d'un <SEP> pigment <SEP> jaunâtre
<tb> à <SEP> brunâtre <SEP> faible.
Le milieu de culture du S. 3486 contient également un antibiotique déjà décrit dans la littérature [Cosar, Ninet, Pinnert, Preud'- homme, C. R. 234, 1498 (1952)] et auquel a été donné le nom de congocidine [Despois et Ninet, 6e congrès international de microbiolo gie, Rassunti delle communicazioni, vol. I, p.
162, (1953)], qui ne possède pas les mêmes propriétés intéressantes que la spiramycine et qui peut être isolé sous forme cristalline. La séparation des deux antibiotiques est faite faci lement, comme décrit en détail ci-après.
La culture par fermentation du S. 3486 peut être faite en surface, mais on préfère géné ralement faire la fermentation en culture sub mergée.
La fermentation peut en particulier être conduite suivant le schéma
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Le milieu nutritif contient, en commun avec les milieux dans lesquels sont cultivés d'autres champignons pour la préparation de substances antibiotiques, une source de carbone assimila ble, une source d'azote organique ou minéral assimilable, certains sels minéraux tels que, par exemple, des phosphates, et d'ordi naire des traces de différents métaux qui se trouvent normalement à l'état d'impuretés dans les autres constituants du milieu.
Comme source de carbone assimilable, on peut utiliser des lipides (huiles végétales ou ani males), différents polyols (glycérol) et de pré férence des hydrates de carbone assimilables, tel qu'amidon ordinaire, amidon soluble, des sucres tels que sucrose, glucose, maltose et dex trose et d'autres hydrates de carbone solubles ou partiellement solubles dans l'eau tels que les sucres-alcools.
Comme source convenable d'azote assimilable, on peut utiliser une grande variété de substances telles que aminoacides, caséine hydrolysée ou non, farine de poisson, farine de soja, extraits de viande, liver cake, distiller's solubles, extraits de levures ou auto- lysats et différentes autres substances azotées d'origine végétale ou animale. Comme source d'azote on peut également ajouter au milieu nutritif des substances chimiques comme l'urée, des nitrates et des sels d'ammonium. On a trouvé que le corn-steep, à cause de la grande variété des substances tant organiques que mi nérales qu'il contient, est un adjuvant intéres sant du milieu de fermentation.
Il est préférable également d'ajouter au milieu des sels minéraux essentiels, tels que sels de sodium (par exem ple chlorure), de calcium (carbonate), etc.
Le<I>pH</I> du milieu avant stérilisation est ha bituellement amené sensiblement à neutralité et de préférence entre 6 et 7. La fermentation est conduite avantageusement à une température de 24 à 28 et de préférence à 26 . L'évolution de la culture productrice n'est pas très rapide ; on peut, cependant, la considérer comme ter minée après 3 à 4 jours. Les principales carac téristiques sont : d'abord une baisse de<I>pH</I> jus que vers 6,4, puis, après 30 heures environ, une remontée du<I>pH</I> jusque vers 7,5 et parfois au delà. Il semble que cette remontée coïncide avec la fin de la consommation du glucose. L'activité antibiotique due à la spiramycine est régulièrement croissante dès le début de la fer mentation.
Bien que l'aération ne soit pas un facteur critique et puisse varier dans d'assez larges limites, il est préférable d'opérer avec une aération de 0,5 à 2 litres d'air par litre de bouillon et par minute.
La spiramycine peut être isolée des jus de fermentation par différentes méthodes. La mé thode qui s'est révélée jusqu'ici préférable est l'extraction par un solvant. On peut utiliser un solvant qui laisse dans le moût résiduaire les substances formées simultanément au cours de la fermentation telles que, par exemple, la con- gocidine. On peut également utiliser un solvant qui extrait une partie de ces impuretés que l'on élimine au cours des traitements suivants. Cette extraction est de préférence effectuée après fil tration du moût de fermentation en présence d'agents de filtration<I>à pH</I> compris entre 7 et 9.
On fait l'extraction à un<I>pH</I> compris entre 8 et 11 et de préférence<I>à pH 9</I> au moyen d'un solvant non miscible à l'eau appartenant aux groupes des alcools (et en particulier le buta- nol), des cétones aliphatiques (méthyléthyl- cétone, méthylisobutylcétone), des carbures aliphatiques halogénés (chloroforme), des car bures aromatiques (benzène) et d'esters comme l'acétate d'éthyle ou l'acétate d'amyle. La solu tion ainsi obtenue est ensuite extraite par de l'eau<I>à pH</I> acide (inférieur à 4 et de préférence entre 2 et 3). L'extrait aqueux est ensuite con centré, extrait<I>à pH 9</I> par du chloroforme ou du benzène.
La solution organique est ensuite concentrée, déshydratée, amenée<I>à pH 5</I> avec de l'acide sulfurique et le sulfate de l'antibioti que est précipité par l'éther.
On peut également concentrer directement l'extrait organique primaire, extraire à l'eau à <I>pH 2</I> et traiter ensuite cette solution aqueuse comme précédemment. Le sulfate brut ainsi ob tenu peut être ensuite purifié par extractions successives avec des solvants organiques ou avec de l'eau ou par chromatographie.
Les exemples suivants montrent comment le procédé selon l'invention peut être mis en aeuvre. L'unité arbitraire choisie est la plus pe tite quantité d'un certain produit purifié, qui, dissoute dans 1 cm3 d'un milieu de culture ap proprié, inhibe le développement du staphylo coque doré (souche F.D.A. 209 P) ; pour le pro duit considéré, cette quantité est égale à 1 microgramme.
<I>Exemple 1</I> 40 litres du milieu suivant
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en <SEP> poids
<tb> - <SEP> Corn-steep <SEP> (extrait <SEP> sec <SEP> 50 <SEP> 0/0 <SEP> . <SEP> . <SEP> 4 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5%
<tb> - <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5%
<tb> - <SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> 0/0 sont chargés dans un fermenteur de 75 litres. Le<I>pH</I> est ajusté à 7,0 et le mélange stérilisé à 1200 pendant 45 minutes.
Après refroidisse ment à 26o, le milieu est ensemencé avec 250 cm3 d'une culture en erlenmeyer agité de S. 3486. La culture en fermenteur est aérée et agitée pendant 25 heures et sert à ensemencer la culture productrice.
Celle-ci est effectuée en fermenteur de 350 litres chargé avec 200 litres du milieu suivant
EMI0007.0015
en <SEP> poids
<tb> - <SEP> Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> %
<tb> - <SEP> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 4 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Distiller's <SEP> solubles <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> %
<tb> - <SEP> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> % Le<I>pH</I> avant stérilisation est à 6,8.
L'évo lution de la culture productrice n'est pas très rapide, on peut cependant la considérer comme terminée après 3 à 4 jours à 26() avec une aéra tion de 12 m3/heure et une agitation de 400 tours/minute. On note d'abord une baisse du <I>pH</I> jusqu'à 6,4 puis, à partir de 30 heures en viron, une remontée du<I>pH</I> jusque vers 7,5. Au bout de 4 jours, l'activité obtenue est de 92 unités/cm-3.
<I>Exemple 2</I> Dans un fermenteur de 350 litres, on charge 200 1. du milieu suivant
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en <SEP> poids
<tb> - <SEP> Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Corn-steep <SEP> (50 <SEP> % <SEP> extrait <SEP> sec) <SEP> . <SEP> 3 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Phosphate <SEP> monopotassique <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,5% Le<I>pH</I> est ajusté à .7,0 avec de la soude et le milieu est stérilisé 45 minutes à 120 . Le milieu est ensuite amené à 26(), puis ensemencé comme dans l'exemple 1. La fermentation est alors aérée et agitée. L'activité maximum est obtenue en 60 heures et est de<B>129</B> u/cm3. <I>Exemple 3</I> Une fermentation est conduite comme dans l'exemple 2, mais le glucose est remplacé par 2 % de saccharose et la quantité de corn-steep ramenée à 2 0/0 (en poids).
Dans ces conditions, l'activité maximum est de 90 u/cm3 en 40 heures.
<I>Exemple 4</I> Dans un fermenteur de 30 litres, on charge 15 litres du milieu suivant
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en <SEP> poids
<tb> - <SEP> Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Autolysat <SEP> de <SEP> levure <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> %
<tb> - <SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> 0/0
<tb> - <SEP> Phosphate <SEP> monopotassique <SEP> . <SEP> , <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb> - <SEP> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,5% Le<I>pH</I> est ajusté à 7,0 avec de la soude et, après stérilisation et refroidissement à 26o, le milieu est ensemencé avec 1 litre d'une culture inoculum en fermenteur sur le milieu au corn- steep précédemment décrit. On obtient 144 u/ ce en 4 jours de culture.
<I>Exemple 5</I> 210 litres de moût de culture<I>à pH 8</I> sont additionnés de 10 kg d'adjuvant de filtration ( Supercel Hyflo ) et filtrés sur filtre-presse. Le gâteau de filtration est lavé par 50 litres d'eau. Le filtrat, représentant 230 litres, conte nant 15,8 millions d'unités,
est alcalinisé à pH <I>9</I> au moyen de solution de soude à 10 % et extrait par 46 litres de méthylisobutylcétone. Le solvant est séparé et la phase aqueuse ré- extraite par 23 litres de méthylisobutylcétone. Après décantation, les deux extraits sont mé langés et lavés par 6 litres d'eau alcalinisée à <I>pH 9.</I> L'antibiotique contenu dans le solvant est extrait par de l'eau à la température de 50,
le<I>pH</I> étant abaissé à 3 par de l'acide phospho rique en solution à 5 0/0 ; en réalisant cette ex traction par 8 litres et 3 fois 4 litres d'eau, la totalité de l'antibiotique est retrouvée dans la phase aqueuse. La solution aqueuse ajustée à <I>pH</I> 6,5 par de la soude diluée est concentrée sous vide à une température ne dépassant pas 350. On obtient alors 1750 ce de solution renfermant 14,6 millions d'unités. L'antibioti que est extrait de la solution aqueuse alcalinisée <I>à pH 9</I> successivement par 1 litre et deux fois 0,5 litre de benzène.
L'extrait benzénique est concentré sous vide à température ne dépas sant pas 300 jusqu'à<B>100</B> ce, on ajoute 100 ce d'alcool butylique normal et ajuste le <I>pH à 5</I> par addition de solution demi-normale d'acide sulfurique dans le butanol. La solution est concentrée à nouveau à 100 cm-' et le sul fate de l'antibiotique précipité par 2 litres d'éther. Le sulfate précipité sous forme de pou dre blanche est essoré, lavé à l'éther et séché.
On obtient 9,6 g de sulfate titrant 1320 u/ mg, ce qui correspond à un rendement de 80 010. <I>Exemple 6</I> 185 litres de moût de culture sont filtrés comme dans l'exemple 5. Le filtrat, représen tant 155 litres, contenant 12,4 millions d'uni tés, est alcalinisé<I>à pH 9</I> par addition de lessive de soude à 10 % et extrait successivement par 40 litres et 20 litres de butanol normal.
Les extraits butyliques réunis sont concentrés sous vide à 10 litres, la température ne dépassant pas 30o. La solution butylique est extraite suc cessivement par 8 litres et deux fois 3 litres d'eau, le<I>pH</I> étant abaissé à 2 par de l'acide sulfurique. La solution aqueuse ajustée<I>à pH</I> 6,5 par une solution de soude diluée est con centrée sous vide à 1500 ce à une température ne dépassant pas 300 ; la solution aqueuse ren ferme alors 8 millions d'unités.
La solution aqueuse alcalinisée<I>à pH 9</I> est extraite par le chloroforme (3 fois 700 cm"). Les extraits chloroformiques sont concentrés sous vide et traités comme dans l'exemple 1.
On obtient 7,4 g d'antibiotique sous forme de sulfate titrant 746 u/mg, soit un rendement de 44 0/0.
<I>Exemple 7</I> 30 g de sulfate d'antibiotique brut sont dis sous dans 700 cms d'eau, le<I>pH</I> est amené à 9 par addition de soude et l'extraction effectuée avec trois fois 300 cm' de benzène. Les extraits benzéniques réunis sont lavés par 200 cm-3 d'eau<I>à pH 9</I> et la solution évaporée à sec à basse température.
On obtient 24,2 g de spiramycine base ti trant 2150 u/mg.