BE595396A - - Google Patents

Description

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  Nouvelles substances de croissance et leur procédé de préparation 
A partir des matières d'origine biologique, notamment à partir de plantes, d'organes d'animaux, et de micro-organismes, on a déjà isolé un grand nombre de sub-   stances   ayant une activité biologique et physiologique. 



  On ne savait toutefois rien de l'existence d'un groupe déterminé de substances de croissance, 

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On a maintenant trouvé qu'on pouvait, à partir d'organismes végétaux, notamment à partir d'actinomycètes et de leurs extraits, obtenir sous une forme   pure   ou enrichie des substances de croissance qui, dnns ce qui va suivre, seront dénommées "ferri-oxamines". 



   Les   ferri-oxamines   sont des composés organiques renfermant de l'azote et du fer. Elles possèdent une coloration rouge-brun et sont facilement solubles dans les acides et les solvants fortement polaires comme l'eau, le diméthylformamide, le glycol, l'éther monométhylique de l'éthylène-glycol, ainsi que dans des alcools aliphatiques inférieurs comne le méthanol. Elles présentent également une solubilité limitée dans des alcools aliphatiques supérieurs, ainsi que dans des alcools et des phénols aromatiques, par exemple dans le butanol, l'alcool benzylique, le phénol.

   Les hydrolysats des ferri-oxamines renferment des substances positives à la ninhydrineo Du point de vue chimique, les ferri-oxamines sont apparentées avec un groupe d'antibiotiques qui sont appelés "sidéramycines"o Font entre autres partie des   ridéramy-     cines   les antibiotiques renfermant du fer que sont la griséine, l'albomycine, les   ferrimycines,   l'antibiotique 1787 [H. Thrum, "Naturwiss". 44, 551   (195?27   et les substances L.A. 5352 et L.A. 5937 [P. Sensi et M.T. Timbal, "Antibiotics & Chemotherapy" 9, 160 (1959)]. 

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   La ferri-oxamine brute que l'on obtient par exemple lors de la fermentation de streptomycètes est habituellement un mélange de différents composantso  La   ferri- oxamine B est le produit principal des   ferri-oxamines   formées lors dé la fermentation du Streptomyces pilosus   d'Ettlinger   et ses Collaborateurs [NRRL   2857   (ETH 21748)7. 



  Il se forme à coté d'autres substances qui sont dénommées ferri-oxamines A, 0, D1, D2, E et F. En soumettant à une répartition de Craig le produit brut que l'on obtient en extrayant avec un mélange de phénol et de chloroforme (1 g : 1 cm3) le filtrat de culture obtenu après une fermentation de deux à dix jours à 27 , on peut obtenir cinq fractions dont l'extinction se situe à 425 m  dans la figo 1 des dessins annexésA partir de la fraction principale III, on obtient à l'état pur, par chromatographie sur la résine échangeuse d'ions qu'est le   Dowex   50 WX2, le chlorhydrate de la ferri-oxanine B, sous la forme d'une poudre rouge-brun (fig. 2, fractions 93 à 125). 



   Le chlorhydrate de la   ferri-oxamine   B est soluble dans l'eau et dans les solvants organiques fortement polaires. Lors d'une chromatographie sur papier et lors d'une répartition multiple, il se comporte comme une substance unitaire ayant la même polarité que les ferri-   mycines   Al et   A2,   mais il se différencie toutefois de 

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 ces dernières par sa stabilité notablement plus grande. 



   En solution faiblement acétique, il ne migre, lors d'une électrophorèse, qu'avec une vitesse de migration un peu plus faible,
Pour le chlorhydrate de la   ferri-oxamine   B sous forme fortement enrichie, on a trouvé les propriétés   suivantes :  micro'-analyse au bout de 48 heures à 20  sous une pression de   0,001   mm de mercure :C 48,04   % ;   H   7,41   % ;   N     11,21 % ;  Cl 5,25 % ; Fe 7,67   % ;   P 0 % ; S 0 %. Titrage : pK *MCS ("Helv." 37, 1872 [1954]) : 9,74 : équivalent-poids 704. Spectre d'absorption dans   l'eau : #max   430 m  avec E11 %cm = 39,0.

   Dans le spectre infre-rouge pris dans le nujol, on observe entre autres des bandes à 3400   . 3250,   2900, 1640, 1573, 1461,   1377,   1260, 1225, 1185, 1132, 1028 cm-1, une bande double à 989, 975, 935, 810, 750 cm-1, voir la fige 3. Répartition multiple, chromatographie sur papier et électrophorèse sur   pcpier   voir tableau 1, figo 4 et fig, 5. 



   Lors de l'hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique dilué, on peut en outre déceler de l'acide succinique, du 1-amino-5-hydroxylamino-pentane, de la   oadavérine   et de l'hydroxylamine.  Si   l'on utilise de l'acide iodhydrique pour l'hydrolyse, il ne se forme pas de   1-amino-5-hydro-     xylamino-pentane   et pas d'hydroxylamine.

   Avec le 2,4dinitro-fluorobenzène, la ferri-oxamine B forme un dérivé du 2,4-dinitrophényleo 

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A partir des fractions secondaires   II,   IV et V que l'on obtient en soumettant à une répartition de Craig 
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 le mélange brut des ferr1-#-I'I1t1i nes (cf. f1g 1), on peut, par chromatographie sur des échangeurs d'ions, obtenir d'autres composés renfermant du fer et ayant un effet 
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 réducteur, qui présentent l'activité de It:;ntis1déramycine (voir ci-dessous). D'après leur comportement dans un chro- 
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 ma'togramJ!l9 sur papier (fig. 4) et sur un échangeur d'ions (fig,b-9Î, on les désignera par ferri-oxem1nes A, C, Dl, D2, E et F. 



   Les   ferri-oxamines   A et C isolées à partir des fractions II et IV (cf. fige 1) ont du point de vue   physico-chimique   un comportement très semblable à celui 
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 de la ferr1-oxam1ne Bo La ferri-oxamina A s'avère être, lors d'un chromtogre sur papier et lors d'une répartition multiple, d'une polarité un peu plus faible que la ferr3-oxamine B. Pour la ferri-oganine C, c'est l'inverse.

   Cette constatation concorde aussi avec la basicité un 
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 peu plus forte de la ferr1-o1ne A par rapport à la feini-oxemme B, ainsi que sa vitesse de migration un peu plus forte lors d'une électrophorèse en solution faiblement acétique, de même que la basicité plus faible que la ferri-oxamine B et la mobilité électrique plus 
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 faible de 0 (figo 5)o De plus, les ferri-ogamines A et C présentent des spectres en infra-rouge et des   propriétés   

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 de solubilité identiques à ceux de la   ferri-oxamine   B;. et elles   n'ont   pu, comme celle-ci, être obtenues jusqu'à présent à l'état de chlorhydrates que sous forme amorphe. 



   Le chlorhydrate de la   ferri-oxamine   A est une poudre rouge-brun qui se dissout bien dans   l'eau-,   le méthanol, l'éthanol, l'acide acétique glacial et le 
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 diméthylfomamideo Il est insolu1ûe dans l'éther, l'acé- tone, l'acétate d'éthyle et le chloroforme. La valeur de Rf dans le système solvant I est de 0,35, et elle est 
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 de 0 ,27. dans le système solvant V ( cf tableau 1). Le coefficient de répartition dans le système   VI   est de 
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 0,111 (c. tableau 1). Electrophorèse sur papier : cfo fige 5o Micro-analyse s C 44,21 % ; H 7<52 %.

   N 12,63 %, J'e 7,95 . ai 5,93 90 Titrage s pX-x::s e 9,89, équivalent-poids g 63%o Spectre ultra-violet dans   l'eau :   max = 430 mu 
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 (È l = 37)o Dans le spectre infra-rouge pris dans le bromure de potassium, on observe entre autres les bandes suivantes (s = forte bande, m = bande moyenne,   w   fai- 
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 ble bande.) 2,92 u (s) ; 3,42 p (n) ; 6,10 p (s) ; 6,32 u i8) : 6,88 f1 Cm) ; 730 , (w), 7,92 p.

   (w) ; 8,10 p (w) ; 8,49 Il (w) ; s $.9$ u (W) : 9 55 p. ) : 10,15 p (w) ; 10,67     (w),   (cfo fig.   Il)0   
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 La ferr1-oxam1ne A fournit une réaction positive avec la   ninhydrineo   La liaison avec le fer dans la 

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 ferri-oxanine A est éliminée du complexe lorsqu'on traite ce dernier avec un acide minéral ou avec des alcalis forts. 



  La ferri-oxamine A exempte de fer est inco3ôreQ Elle peut être reconvertie en ferri-oxam.iae A avec le chlorure fer- rique. Elle réagit également sur d'autres ions métalliques en donnant lieu à la formation des complexes métallifères correspondants, par exemple à la formation du complexe cuprifère verdâtre. D'autres propriétés caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1. 



   Le chlorhydrate de la ferri-oxamine C présente des propriétés de solubilité à peu près identiques à celles de A.Dans le système solvant I, la valeur de Rf est de 0,54, et elle est de 0,37 dans le système solvant V 
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 (et. tableau 1). Eleatrophorése sur papier, ct. figo 5 ; coefficient de répartition dans le système   VI :    0,489   
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 (etu tableau 1)o Micro-analyse: s C 48,33 %, H 7,92 %, If 10,20 %, 01 5,15 9, ]le 6,82 %0 Titrage : pK : 8988 ; équivalent-poids : 762. Dans le spectre ultra-violet (dans 1 "eau), = 430 mp. (B i c = 39)o Dans le spectre infra-rouge (pris dans le bromure de potassium), on ob- 
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 serve entre autres des bandes à : 2,92 P. (s), 33 }1 (s), 5,85 cl), 6slQ (s), 6133 ji (s), 6,8? j (s), ?,30 li (m), 7.95 p Cm), 8,23 C), 8,52 ex (m), 9,65 .

   (w), 13,23 u Cfo frigo 12). 

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   'La ferri-oxamine C fournit une réaction colorée positive avec la ninhydrine. La liaison aveo le fer est éliminée du coaplexe dans la ferri-oxamine 0, lorsqu'on traite ledit complexe avec un acide minéral ou avec des alcalis forts. La   ferri-oxamine   C exempte de fer est incolore. un peut la reconvertir en   ferri-oxamine   C avec le chlorure ferrique.   Elle   réagit également sur d'autres ions métalliques en donnant lieu à la formation des complexes métallifères correspondants, par exemple à la formation du complexe cuprifère verdâtre. 



   Les ferri-oxamines plus lipophiles D1, D2 et E qui sont obtenues par ohromatographie à partir de la fraction V (cf. fig. 1) et qui, dans les systèmes V et VI, présentent des valeurs de Rf supérieures à 0,5 et des coefficients de répartition supérieurs à l'unité, se comportent, lors de   :L'électrophorèse   et du titrage, comme des composés neutres (et. tableau 1, figo 4 et fig. 5). 



  La ferri-oxamine D   qui, -lors   d'une chromatographie avoc des échangeurs d'ions, est isolée à partir d'une bande d'apparence unitaire comme la substance migrant le plus vite   (or,,  fig. 8), peut, par une simple répartition entre du chloroforme et de l'eau, être scindée en la ferrioxamine Dl plus lipophile qui cristallise en   prisses   allongés dans un mélange de méthanol et d'éther, et en la ferri-oxamine D2 qui ne se forme qu'en quantité très faible., 

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 La ferri-oxasine Dl est bien aoltible dans l'eau, le aé- thanol, l'éthanol, l'acide acétique glacial, le néthyl-   cellosolve   et le chloroforme, difficilement soluble dans l'éther, l'acétone, l'acétate d'éthyle,

   la pyridine et le 
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 d1méthylformam1d80 Elle cristallise en aiguilles rouges dans un mélange de méthanol et d'éthero Après avoir été recristallisée à trois reprises, elle fond à 194-200 . 



  Dans le système solvant I, la valeur de Rf est de 0,73, et elle est de 0,72 dans le système solvant V   (cf.   tableau 1)o Dans le système solvant   VI,   le coefficient de répartition est de 1,80 (cf. tableau   1).   Electrophorèse, 
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 eut 0 fie; 50 Micro-analyse : 0 49,31 %, E 7,4? %, N 12.37 ; 01 0 %, Fe 7,66 9bu Titrage on ne peut pas déceler de fonctions acides ou de fonctions basiques. Spectre ultraviolet dans l'eau 1 À 118% = 430 mu CE 1 m = 44) Pris dans le bromure de potassium, le spectre infra-rouge présente entre autres des bandes à 2,95 )1 Cs)s 3,06 bzz (8) 3,25 . (w)g 3,43 u (s), 6,08 (s), 6,35 u (s), 6,86 u (s), ?s3o p (m), ?s94 ji (m), 8,20 . (w), 8,49 p (w), 8,83 p (w), 9,00 u (w), 9965 F (w), 10,00 cl (w), lO,317(w), 10,67 u (w), 12,20 li (w), 13,30 1 (m)9 1 Cf fido 13 . 



  La ferri-oxamine D1 ne donne pas de réaction colorée avec la ninhydrine? Dans la :ferr1-0"..camine Dl, la liaison avec le fer est éliminée du complexe lorsqu'on traite ce dernier avec un acide minéral ou avec des- alcalis 

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 forts La ferri-oxamine D1 est Incolore On peut la reconvertir en ferri-oxamine Dl aveo le chlorure   ferriqueo   Elle réagit également sur d'autres ions métalliques en donnant lieu à la formation des complexes métallifères 
 EMI10.1 
 correspondants, par exemple à la foxzation du cciyplexe cuprifère verdâtre. 
 EMI10.2 
 



  9erri-ommhe D2 : pris dans le bromure de potassium, le spectre infra-rouge présente entre autres des bandes à s 2,95 y (s), 3,43 (m), 6,08 x (s), 6,36 p (s), , 6,90 Ce). 8#49 F (w), 8,87 y (w), 9,65 )u (w), lO,05f(w), 10,70 P (w), 13,22 P (w), cfo frigo 160 Dans le système solvant I, la valeur de Rf est de   0,64,   
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 et elle est de 0 te dans le système solvant V (aia ta.. bleau 1). Eleotrophorèse sur papier, cf. fig. 5. 



   La   ferri-oxamine   E, qui présente un spectre 
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 infra-rouge différent de celui des autres ferri-o:#ninea (cf. fig. 14), se différencie également de ces dernières par sa mauvaise solubilité dans   l'eau   et le méthanol. 



    Micro-analyse :   0   49,80   %, H 7,37 %, N 12,48 %, Cl 0 %, Fe 8,14 %. 



  Titrage : on ne peut pas déceler de fonction acide ou de fonction basiqueo 
 EMI10.5 
 Spectre ultra-violet dans l'eau : Max = 430 T:l}l (B 1 cm=;-2 ) Le spectre infra-rouge (pris dans le bromure de potassium) présente entre autres des bandes à ') 0'> !01 ()? u tc ....,e ù t1lJ.\t.L.O c;UJ.f.lJ..Cg des ua..&..1.Ug g. 2,92 r 'UJ 9 ,./ ,¯c... r ,-" \1 

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 3,45 p (s), 5,96 C8), 6,15 u Cs}, 6,36 u (s), 6,9:> P (8), 7,10 n Cm). 7vl5   Cm), ?,39 U Cm), 7,82 F (w), 7 9 98 u (m). 8,45 J1 (w). 8,54 )1 (w) $!85 C), 9, 1 p (w), 9,20 J1 (v), 9,98 z Cm). 10,07 p (w), 10s23 h (w), 10,43 p (w), 10,71 J1 (w), 11#8? tu (V)g 13,20 p Cm),   13,66   (w), cf. fig. 14. 
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 La terrl-o%Rm1e E ne donne pas de réaction colorée avec la ninhydrine.

   Dans la ferri-oxamine E, la liaison avec le fer est éliminée du complexe lorsqu'on traite ce dernier avec un acide minéral ou avec des alcalis forts. La   ferri-oxamine   E exempte de fer est incoloreElle peut être reconvertie en 
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 ferri-oine E avec le chlorure ferrique. Elle réa- git également sur d'autres ions métalliques en donnant lieu à la formation des complexes métallifères correspondants, par exemple à la formation du complexe cuprifère verdâtre. 



   La   ferri-oxamine   F qui, d'après son comportement lors d'une chromatographie sur papier et lors d'une répartition à contre-courant, appartient également au groupe lipophile (D1, D2, E), présente toutefois, à rencontre de Dl' D2 et E, des propriétés basiques, et elle est isolée à l'état de chlorhydrate (cf. figo4 et fig. 5). 

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   La chlorhydrate de la ferri-oxamine F est bien soluble dans l'eau, le méthanol, la pyridine, l'acide acétique glacial, l'éthanol, le diméthylformamide : peu soluble dans le chloroforme. insoluble dans l'acétate d'éthyle, l'acétone et l'éther, Micro-analyse :C   50,44   %, H 7,29   %,   N 10,53 %, 01 4,10 %, Fe 5,57 %. Dans le système solvant V, la valeur de Rf est de 0,80 (cf. tableau 1). 



  Le coefficient de répartition dans le système VI est de 3,12 (cfo tableau 1). Electrophorèse, cf. fig. 50 Titrage : pKMCS 9,75, équivalent-poids 695. Pris dans le bromure de potassium, le spectre infra-rouge présente entre autres des bandes à 2,95  (s), 3,45   (m), 6,10   (a), 6,37 (s),   6,92   (m), 7,40 p (w),   7,97 p   (w), 8,50   (w),   8,88 u   (w), 9,72   (w), 10,10   (w), 10,70   (w), 13,75   (w), cf. fig. 15. 



  Spectre ultra-violet dans   l'eau   430 m . 



  E 1 %   = 340   
1 cm
La   ferri-oxamine   F fournit une réaction positive .avec la ninhydrine. Dans la ferri-oxamine F, la liaison avec le fer est éliminée du complexe lorsqu'on traite ce dernier avec un acide minéral ou avec des alcalis forts. 



  La ferri-oxamine F exempte de fer est incolore. Elle peut être reconvertie en   ferri-oxamine   F avec le chlorure fer-   rique   Elle réagit également sur d'autres ions métalliques en donnant lieu à la formation des complexes métallifères correspondants, par exemple à la fornation du complexe 

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 cuprifère verdâtre. 



   Dans le tableau 1 qui suit, on a rassemblé à titre comparatif les valeurs physiques qui sont   carac'-'   téristiques pour les   ferri-oxamines   qui ont été isolées jusqu'à présent : 

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   Tableau 1   
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 Ferr3. Blectrophorèse chromatographie Répartition Extinction ##############""l examine sur papier a) sur papier multiple à 43o V)l Titrage ¯¯¯¯ b) c) K d) VI 3 1 cil poids 13,6 0,35 0,21 otil 37 9,89 634 1390 0,444 0,29 0,23 39 9,74 704 12,3 0,54 0,37 0,49 39 8088 762 . 



  1 3,9 0,73 0,72 1,80 44 (neutre) D2 3,9 0,64 0948 (neutre) 3,9 0,68 0,59 1,59 42 (neutre) 12 , 5 0'80 3,12 34 9975 695 

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 a) Longueur de migration en centimètres, dans l'acide acétique 0,33-normal, au bout de 4 heures et dénie   sous   220 volts.

   A titre comparatif, le fructose migre de
3,9 cm. b) Rf I : valeur de Rf dans le système I : butanol normal/acide acétique glacial/eau   (4:1:5)   c) Rf V s valeur de Rf dans le système   V   butanol   tertiaire/eau/solution   aqueuse saturée de chlo- rure de sodium/acide chlorhydrique   décinormal   (50:25:25:1), papier imprégné avec un mélange   d'acétone,   d'eau et d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (6:3:1). d) K   VI  1 coefficient de répartition dans le   système VI s butanol normal/alcool benzylique/eau/solu-   tion aqueuse saturée de chlorure de sodium/acide chlor- hydrique décinormal   (200:100:300:60:

  3)o   Répartition de
10 milligrammes en 34 stades avec chaque fois 3 cm3 de phase organique et 3 cm3 de phase aqueuse, à   23-25 o  Es- timation par la mesure de l'extinction (2 cm3 des frac- tions diluées à 10 cm3 avec de l'alcool) à 425 m . e) Wo Simon et ses collaborateurs,   "Helvo"   37,
1872   (1954).   



   Dans le tableau 2, on a rassemblé à titre   compara-   tif les valeurs chimiques et physiques pour la ferri-oxa- mine B et les substances de croissance utilisées; ainsi que quelques antibiotiques du type de la   sidéramyoine     (griséine   A,   albomycine   et   ferrimycine   A)o 

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   TABLEAU 2    
 EMI16.1 
 SUb8t8nce valE>ur d'analyse () poids d) abaorp- Produits .'.) molécu- MC6 tion d'hydrolyse 0 H N Cl Fe laire & 1 y déoiés --¯¯¯¯¯¯¯..¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯ '1 os lerrimy- 48,65 gp(j9 12,95 6,1U 4,56 1106 a) 4.18,7,88 288 282 acide suc- cine A 1) ?,U9 12,95 6,W +,56 3I9 28,2 c ue, l..amino..

   U,3) 425 2296 ox;ylem1no- 425 22,6 Platane, acide pg vaiéria¯ - 6 valêr1a- 
 EMI16.2 
 
<tb> nique, <SEP> cadavérina
<tb> substance <SEP> cristallisée <SEP> avec
<tb> 
 
 EMI16.3 
 Xmax 22? !!9:1, 323 nu, proline 
 EMI16.4 
 
<tb> et <SEP> substances <SEP> non
<tb> identifiées <SEP> qui
<tb> sont <SEP> positives <SEP> à <SEP> 
<tb> 
 
 EMI16.5 
 ######.###..¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯ la ninhydrine Griséine 43995 5,65 12,97 5,14 1034 a) 265 1U8 méthyluracile 2) 420 28,9 ac ide glutamique 1\lb Ia1- 4 ' 16 12?pw méthyluracile cine 1346 b) sérine, ornitb',- 
 EMI16.6 
 
<tb> ne
<tb> 
 

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   TABLEAU 2 (suite)   
 EMI17.1 
 
<tb> Substance <SEP> Valeur <SEP> d'analyse <SEP> (%) <SEP> poids <SEP> pK*@CSd) <SEP> absorp- <SEP> Produits <SEP> e)

  
<tb> 
 
 EMI17.2 
 M016eu- LXIS tien d'hydrolyse 
 EMI17.3 
 
<tb> laire <SEP> #max <SEP> décelée
<tb> 
 
 EMI17.4 
 ¯¯¯¯¯¯ N 01 Fe E 1 cm chlorhy- 48.0 7,41 11,21 5.25 7,67 X4 9174 430 39 aaide auodrate de 0 uet 1-aminooxaaine 5-hYdroxylam1nooxamine pentane, oadayA- (1.2) 
 EMI17.5 
 
<tb> rine, <SEP> acide <SEP> #-
<tb> 
 
 EMI17.6 
 amin va16riani- 
 EMI17.7 
 
<tb> que, <SEP> hydroxylaminé, <SEP> pas <SEP> de
<tb> glycine, <SEP> d'ornithine <SEP> ou <SEP> de <SEP> sé-
<tb> 
 
 EMI17.8 
 -#####¯¯¯¯¯¯¯.¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯ rine 4) 44,Q'i 5,9Q 16,55 7.35 725 425 39 , hrome 4) 11,18 5,3 l1Ù0 %4Q 3994 IM orni-bhine Ferri- ' ' 11,18 5,3 1100 0) 4q() 33,8 sér1ne, glYOitL8. 3.01 omithine l.) Coprogène 5J , 9(1 6983 10,26 6,61 4.40 3696 

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 a) Par titrage b) Suivant la teneur en Fe,SO4 et NH2. c) Déterminé par deux méthodes Indépendantes.

   
 EMI18.1 
 d) W. Simon, E. Kovats, LoRo Chopard-dtt-Jeaa et Se Heilbronner, "Bel?." 1572 (195). 



  Hellbronner, "Halvo" 22, 1872 (195%). e) Valeurs en h)"dro::cylam1ne par atome de fer, déterminées par voie colorjmétrique suivant 
Csaky 6). Les valeurs indiquées entre paren- thèses sont non corrigées 1) Demande de brevet déposée en France par la demanderesse le 27 Mai 1960 et ayant pour titre: 
 EMI18.2 
 "Procédé de purification de la "èrrimycoEe", antibiotique obtenu à partir de Streptomyces 
 EMI18.3 
 griseoflavue A 9578 ou de Streptomyces galilaeus 1#BL 2722". 



  2) F.Ao 0 Kuehl et ses collaborateurs, "Jo -4,mer, Ohemo Soc. , 197ù (1951). 



  3) Gogo Cause, "Brito Medo Du" 1955. 1177. 



  4) JoBo   Nellands,     "Bact.   Rev." 21, 101   (1957)   5) C.W.   Hesseltine   et ses collaborateurs, "Jo Amero   Chem.     Soc,"   74,   1362     (1952)0   
 EMI18.4 
 6) T.Z. 0aaky, "Acta Chem, Scanda n 2, 450 (1948). 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 



   Les sels des   terri-oxamines     basiques   A, B, C   et ?   dérivent des sels inorganiques et organiques connus, par exemple de l'acide chlorhydrique, des acides sulfuriques -et phosphoriques, des acides   acétique,   propionique, valérianique, palmitique ou oléique, des acides succinique, citrique, tartrique,   mandélique,   glutamique ou pento-   thénique.   Ils constituent des sels neutres ou acides, On les prépare par double décomposition de sels, par exemple du sulfate de ferri-oxamine avec du   pentothénate   de calcium, ou par échange d'anions sur un échangeur d'ions, par exemple du chlorure de   ferri-oxamine   sur un échangeur d'ions fortement basique comme le   "IRA-400"   sous la forme du sulfate,,

  
Les ferri-oxamines possèdent pour un grand nombre d'organismes la propriété de stimuler leur croissanceo 0'est ainsi qu'elles possèdent un tel effet sur le Bacillus subtilis, le Micrococcus   pyogenes   var. aureus, le Saccharomyces cerevisiae, l'Ustilago   sphaerogena   et le   Chlamydomonas   eugametoso Comme exemple, on a rassemblé dans le tableau trois résultats d'essais of-   fectués   avec   l'Ustilago   sphaerogena (ustilaginée) et avec du Chamyfdomonas eugametos (algue verte), en utilisant une préparation enrichie de   ferri-oxamine   B :

   

 <Desc/Clms Page number 20> 

   Tableau    
 EMI20.1 
 
<tb> Croissance <SEP> relative <SEP> en <SEP> comparaison <SEP> d'un <SEP> milieu <SEP> de
<tb> contrôle <SEP> non-traité
<tb> addition <SEP> de <SEP> terri-oxamine <SEP> B <SEP> (ug/cm3)
<tb> 
 
 EMI20.2 
 0 100 10 1 0,1 0,01 0,001 
 EMI20.3 
 
<tb> Ustilago
<tb> sphaerogena
<tb> (culture <SEP> pendant <SEP> 100% <SEP> 540% <SEP> 405% <SEP> 247% <SEP> 158 <SEP> % <SEP> 111%
<tb> 24 <SEP> heures)
<tb> Chlamydomonas
<tb> eugametos
<tb> 
 
 EMI20.4 
 (culture pendant 100b 280% 271% 136% 989 98 & 
 EMI20.5 
 
<tb> 4 <SEP> jours)
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 21> 

 
D'autres organismes, par exemple des   représen-     tants   de la famille de   l'Arthrobacter,

     comme   l'Arthro-     baoter terregens et l'Arthrobacter flavescens, ne se dé- ( la   
 EMI21.1 
 )veloppent surtout qu'en57éBence de ferr1-oxamineso Dans ces cas, les   ferri-oxamines   possèdent donc un caractère analogue aux vitamines, comme on l'a montré pour les substances actives que sont le ferrichrome, le facteur de 
 EMI21.2 
 Terregens et le OOprOglieo ('Bàcto RBYo" 2-19 101 (195727, 
Une autre propriété biologique des ferri-oxamines réside dans le fait qu'elles sont en mesure de supprimer 
 EMI21.3 
 compétit3vement vis-à-vis des excitateurs gram-positifs l'action antibactérielle d'antibiotiques appartenant au groupe des sidéramycines.

   
 EMI21.4 
 L'action antisidéramyciniqne des ferri-oxamines s'exerce vis-à-vis des antibiotiques que sont l'alhomycine, la   griséine,   l'antibiotique A 1787, la   ferrinycine   et l'antibiotique A 22765 qui présentent également tous une résistance croisée avec la griséine, Ce qui est sur- 
 EMI21.5 
 prenant c'est que les terri-oxamines suppriment vis.-à- .via des bactéries   gram-positives   l'effet des   sidéramycines   du genre de la griséine, mais pas   vis-à-vis   des bactéries   gram-négatives.   



   L'antagonisme entre les ferri-oxamines d'une part, et les idéramycines, d'autre part, antagonisme 
 EMI21.6 
 qu'on nommera activité antisidénamycinique, peut être 

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 décelé aussi bien "in vitro" que "in vivo". L'effet antagoniste exercé par la ferri-oxamine B   vis-à-vis   de différents antibiotiques ressortira du tableau ciaprès. On a utilisé comme organismes-tests : l'Escherichia 
 EMI22.1 
 coli, le Haofllns subtilis et le Staphylococcus aureus. Les antibiotiques à   contrôler   ont été examinés suivant le test modifié de   Bonifas   qui est décrit ci-dessous, 
 EMI22.2 
 vis..àr.vis de la ferr11I1i B (un milligramme par centimètre cube). 

 <Desc/Clms Page number 23> 

 



    TABLEAU 4   
 EMI23.1 
 Déf3inhibition des organ1saes-tests Antibiotiques -¯¯¯¯  "  Bacillus staphylocccous Escherichia subtilis aureus coli 9errimycme compétitive compétitiire ##### 
 EMI23.2 
 
<tb> Griséine
<tb> (40000 <SEP> IB/mg) <SEP> compétitive <SEP> compétitive <SEP> aucune
<tb> Albomycine <SEP> compétitive <SEP> compétitive <SEP> aucune
<tb> A <SEP> 1787 <SEP> 2) <SEP> conpétitive <SEP> compétitive <SEP> aucune
<tb> A <SEP> 22765 <SEP> compétitive <SEP> compétitive <SEP> #
<tb> Néomycine <SEP> aucune <SEP> aucune <SEP> aucune
<tb> Streptomycine <SEP> aucune <SEP> aucune <SEP> aucune
<tb> 
 
 EMI23.3 
 Stroptothricine aucune aucune aucune 
 EMI23.4 
 
<tb> Viomycine <SEP> aucune <SEP> aucune <SEP> aucune
<tb> Pénicilline <SEP> aucune <SEP> aucune
<tb> 
   1)

   Le signe # signifie que l'antibiotique correspondent ne présente presque pas d'action vis-à-vis de cet organisme-test, 2) Souche de Staphylococcus aureofaciens Duggar A 22765.   

 <Desc/Clms Page number 24> 

 D'autres antibiotiques non-indiqués dans le ta- 
 EMI24.1 
 bleau et non influencés par les ferri-oxaraines sont les suivants :

   1 l'aoétoI!11cine, les actinomycines, C, X, I et Z, l'angolamycine, la carbomycine, la chartreusine, la ahlorotétraayclme, la cycicsérine, les ciné2bine. la désertomycine, l f 6l.'1rthromycina, l'exfoliatine, la grana-   ticine,   l'holomycine, la leucomycine, la   négacidine,   la   méthymycine,   la narbomycine, la   novobiocine,   l'oléando- 
 EMI24.2 
 myoine, l'ozytétracycline, la pieronycine,, la rhodomycine, la   spiramycine,   la streptogramine, les tétriomycines et la thiolutineo
L'effet antisidéramycinique exercé in vitro par les ferri-oxamines convient bien pour reconnaître qualitativement et pour déterminer quantitativement les   ferri-oxamines,   tandis qu'on peut à cet effet utiliser le test de   Bonifas   [V.

   Bonifas, "Experientia" 8, 234   (19527   étudié en soi pour la détermination des   aubstan-   ces exerçant un effet   synergique.   A cet effet on ensemence des plaques-tests, par exemple des coupelles de Petri renfermant une couche d'un milieu nutritif gélosé convenable, en utilisant du Bacillus subtilis Cohn   enend,   de   Prazmowski   ou du Staphylococcus aureus de   Rosenbach.   



  Sur la couche de gélose, on place des bandes de papier filtre de 5 mm de large, par exemple en papier Whatman N  1, qui sont imprégnées avec une solution d'un anti- 

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 biotique du type des sidéramycines, par exemple avec une   solution 110 '1   par car de   ferrimycine   dans le mé- thanol. Perpendiculairement à ces bandes, on place des bandes de même largeur qui sont imprégnées avec une so- 
 EMI25.1 
 lution dont on veut détezzir.,,-,r '1- teneur en ferri-oxsmine. 



   Après une incubation à 36  pendant 9 à 15 heures, on peut facilement se rendre compte de l'effet antibiotique de la ferrimycine :dans le champ d'inhibition qui se forme sur les bandes comportant l'antibiotique il se forme au point de croisement des deux bandes un ressè-   rement   cunéiforme dont la forme et les dimensions sont utilisées dans des conditions standard pour la détermi- 
 EMI25.2 
 nation quantitative des ferri-oxamtnes (et, figo 10)0 Lorsqu'une solution renferme aussi bien de la ferri- 
 EMI25.3 
 oxamine que de la ferrÙ1Jc1ne. elle doit 8tre chauffée pendant 30 minutes à 60  à un pH neutre. On détruit de ce fait l'effet antibiotique de la ferrimycine, tandis que'l'effet de la ferri-oxamine reste conservé et peut ensuite être estimé quantitativement. 



   Dans le test antisidéramycinique, la ferri-oxamine B s'avère la plus active de toutes, Avec le Staphylococcus aureus comme organisme-test, les autres   ferri-oxamines   présentent vis-à-vis de B les activités suivantes 
 EMI25.4 
 À 51 %, 0 16 %, Dl 8 %, 2 3 ib, 4 7 ex x ivo 

 <Desc/Clms Page number 26> 

 
Les substances qui ont été déjà indiquées, à savoir le   ferrichrome,   le facteur de Terregens et le coprogène sont, en ce qui a trait à leur caractère de vitamine vis-à-vis de   l'Arthrobacter   terregens et de l'Arthrobacter   flavescens,   identiques aux ferri-oxamines. 



  Par contre l'action accélératrice de croissance exercée sur le Bacillus subtilis, sur le Micrococcus   pyogenes,   sur le.Saccharomyces cerevisiae, sur l'Ustilago sphae-   rogena   et sur le Chlamydomonas eugametos, action accélératrice qui est décrite ci-dessus et est typique pour les ferri-oxamines, n'est pas connue pour les trois substances que sont le ferrichrome, le facteur de Terregens et le coprogène.

   On ne connaît rien non plus quant à un effet antagoniste de ces substances sur l'activité   antibactérielle   des antibiotiques du type des   sidéramycineso  
Lors d'une chromatographie   sur   papier, le ferrichrome se différencie nettement, dans une comparaison directe dans le système V (cfo tableau 1) des ferri-   oxamines   B à P, nais il présente dans ce système une valeur de Rf identique à celle de la ferri-oxamine A. 



  Par contre, en tant que substance neutre, il peut, lors d'une électrophorèse sur papier dans de l'acide acétique   0,33-normal,,   être facilement différencié de la ferrioxamine A fortenent   basiqueo   Le facteur de Terregens ne renferme que des traces de fer et est par suite 

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 différent de toutes les   ferri-oxamines   indiquées, Sur la base de ces valeurs d'analyse, le   coprogène   peut être bien différencié des ferri-oxamines A, B, D et E. 



  Dans le cas du coprogène, le rapport % 0 / % N est de 4,97, alors que pour les   ferri-oxanines   mentionnées il est de 3,5 à 4,3. Dans le cas des ferri-oxamines C et F, cette différence n'est pas si marquée (% 0 / % N = 4,74 -   4,78).   Les   ferri-oxamines   C et F sont toutefois des bases fortes qui sont isolées à l'état de chlorhydrates, tandis que le   ooprogène   constitue, suivant les valeurs fournies, une substance neutre ["Journ. Amer. Chem. Soc." 74, 1362   (19527.   



   Les ferri-oxamines, leurs dérivés et produits de scission, ainsi que les sels de ces conposés sont obtenus en isolant les nouvelles substances de croissance suivant des méthodes connues en elles-mêmes, à partir d'organismes végétaux ou de leurs extraits, en tenant compte des valeurs chimiques et physiques indiquées ci-dessus et en utilisant le test antisidéramycinique et, si on le désire, en préparant des sels, des dérivés ou des produits de scission des nouveaux composés. 



   Les substances de départ pour l'obtention des   ferri-oxamines   sont, par exemple, des plantes supérieures comme les dicotylédones, par exemple la famille des solénacées, par exemple le Solanum lycopersicum ou la   famille   

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 des   .ombellifères,   par exemple le.

   Daucus carota L., et des monocotylédones par exemple les commélinacées comme le Rheoe discolor, ainsi que des cultures d'algues, par 
 EMI28.1 
 exemple des cultures de Chlamydomonas eugaetos, ou sur- tout des cultures de micro-organismes, par exemple de représentants de la famille des streptomycètes, de bactéries, par exemple de Bacillus subtilis, ou de levures, par exemple de Saccharomyces cerevisiaeo L'effet anti- 
 EMI28.2 
 8idéramrcinique peut être constaté dans l'extrait brut ou dans le filtrat de culture sur la base du test mentionné ci-dessus. 



   Une source particulièrement préférée est constituée par des cultures de streptomycètes qui, sur la base des caractéristiques proposées par Ettlinger et ses col- 
 EMI28.3 
 laborateurs trarch, M1krobiolo" 2, 326 (195827peuvent être rangées dans les catégories suivantes : le   Strep-   tomyces   griseoflavus   (Krainsky) de Waksman et Henrici, le Streptomyces lavendulaé (Waksman et Curtis) de Waksman et Henrici, le Streptomyces galilaeus   d'Ettlinger   et ses collaborateurs, le Streptomyces pilosus   d'Ettlinger   et ses collaborateurs, le Streptomyces polychromogenes 
 EMI28.4 
 d'Hagemann, Pénasse et Teill m, le Streptomyces virido-   ohronogenes     (Krainsky)   de Waksman et Henrici, le Streptomyces aureofaciens de Duggar, le Streptomyces olivaceus (Waksman)

   de Waksman et Henrici, le Streptomyces grissus 

 <Desc/Clms Page number 29> 

 (Krainsky) de Waksman et   Henrioi,   le Streptomyces glaucescens de Cause et ses collaborateurs,
Dans le tableau ci-après sont rassemblées les caractéristiques spécifiques des souches de streptony- 
 EMI29.1 
 cètes formant des ferri-oxamines. 

 <Desc/Clms Page number 30> 

 



    TABLEAU 5    
 EMI30.1 
 
<tb> Caractéristiques <SEP> Morphologie <SEP> couleur <SEP> du <SEP> Morphologie <SEP> du <SEP> Pigment
<tb> catégorie <SEP> des <SEP> spores <SEP> mycélium <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> mélanoïdique
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> aérien
<tb> S. <SEP> griseoflavus <SEP> spores <SEP> comportant <SEP> de <SEP> gris-cendre <SEP> chaînes <SEP> de <SEP> spores <SEP> fait <SEP> défaut
<tb> (Krainsky) <SEP> de <SEP> courts <SEP> piquants <SEP> comportant <SEP> des <SEP> spiWaksman <SEP> et <SEP> Henrici <SEP> raies <SEP> régulières <SEP> ou- <SEP> 
<tb> vertes, <SEP> souventplus
<tb> de <SEP> six <SEP> a@ires
<tb> S.

   <SEP> pilosus <SEP> d'Ettlin- <SEP> spores <SEP> comportant <SEP> de <SEP> gris-cendra <SEP> chaînes <SEP> de <SEP> spores <SEP> présent
<tb> ger <SEP> et <SEP> ses <SEP> collabo- <SEP> fins <SEP> poils <SEP> cassants <SEP> comportât <SEP> des <SEP> spirarateurs <SEP> les <SEP> régulières <SEP> ouvertes, <SEP> la <SEP> plupart
<tb> du <SEP> temps <SEP> plus <SEP> de <SEP> six
<tb> spires
<tb> S. <SEP> viridochromogenes <SEP> spores <SEP> conportant <SEP> de <SEP> bleu-clair <SEP> chaînes <SEP> de <SEP> spores <SEP> présent
<tb> (Krainsky) <SEP> de <SEP> courts <SEP> piquants <SEP> comportant <SEP> des <SEP> spiWaksman <SEP> et <SEP> Henrici <SEP> raies <SEP> régulières <SEP> ouvertes, <SEP> souvent <SEP> plus
<tb> de <SEP> six <SEP> spires
<tb> S.

   <SEP> ollvaceus <SEP> (Waks- <SEP> lisses <SEP> gris-cendre <SEP> chaînes <SEP> de <SEP> spores <SEP> fait <SEP> défaut
<tb> man) <SEP> de <SEP> Waksman <SEP> et <SEP> ramifiées <SEP> en <SEP> monopoHenrici <SEP> dies, <SEP> rectilignes <SEP> ou
<tb> ondulées
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 31> 

   TABLEAU 5 (Suite)   
 EMI31.1 
 
<tb> Caractéristiques <SEP> Morphologie <SEP> couleur <SEP> du <SEP> Morphologie <SEP> du <SEP> mycélium <SEP> . <SEP> Pigment
<tb> catégorie <SEP> des <SEP> spores <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> mélanoïdique
<tb> aérien <SEP> aérien
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> de <SEP> lisses <SEP> gris-cendre <SEP> chaînes <SEP> de <SEP> spores <SEP> ramifiées <SEP> fait <SEP> défaut
<tb> Duggar <SEP> en <SEP> monopodies <SEP> et <SEP> comportant
<tb> des <SEP> spirales <SEP> régulières <SEP> ouvertes
<tb> S.

   <SEP> galilaeus <SEP> lisses <SEP> gris-cendre <SEP> chaînes <SEP> de <SEP> spores <SEP> ramifiées <SEP> présent
<tb> ger <SEP> et <SEP> ses <SEP> collabora- <SEP> en <SEP> monopodies, <SEP> long <SEP> axe
<tb> teurs <SEP> principal <SEP> rectiligne, <SEP> spirales <SEP> régulières <SEP> ouvertes,
<tb> la <SEP> plupart <SEP> du <SEP> temps <SEP> plus <SEP> de
<tb> six <SEP> spires <SEP> 
<tb> S. <SEP> lavendulae <SEP> (Waksman <SEP> lisses <SEP> carmin <SEP> pa- <SEP> chaînes <SEP> de <SEP> spores <SEP> comporet <SEP> Curtis) <SEP> de <SEP> Waksman <SEP> le-brun <SEP> tant <SEP> des <SEP> spirales <SEP> irréguet <SEP> Henrici <SEP> cannelle <SEP> ouvertes <SEP> aux <SEP> extrémités <SEP> de <SEP> longs <SEP> tronçons
<tb> rectilignes
<tb> S.

   <SEP> polychromogenes <SEP> lisses <SEP> carmin <SEP> pâ- <SEP> chaines <SEP> de <SEP> spores <SEP> rectili- <SEP> fait <SEP> défaut
<tb> d'Hageman <SEP> et <SEP> ses <SEP> col- <SEP> le-brun <SEP> gnes <SEP> ou <SEP> ondulées
<tb> laborateurs <SEP> cannelle
<tb> S. <SEP> griseus <SEP> de <SEP> Waksman <SEP> lisses <SEP> jaunâtre- <SEP> chatnes <SEP> de <SEP> spores <SEP> ondulées <SEP> fait <SEP> défaut
<tb> et <SEP> Henrici <SEP> gris <SEP> ver- <SEP> touffes <SEP> sans <SEP> spirales <SEP> radâtre <SEP> mifiées <SEP> en <SEP> sympodies
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 32> 

 
Pour l'obtention d'assez grandes quantités de ferri-oxamines, on utilise avantageusement des cultures des micro-organismes indiqués.

   Sous ce rapport, se sont avérées particulièrement intéressantes les souches de streptomycètes mentionnées ci-dessus qu'on peut facilement cultiver à grande échelleLa présente invention n'est cependant pas limitée à l'utilisation des représentante des catégories indiquées, mais elle concerne également l'utilisation de souches d'autres catégories forçant des ferri-oxamine, et notamment de variantes de tous ces organismes telles qu'on les obtient, par exemple, par sélection ou mutation,   notamment   sous l'action des rayons ultra-violet ou des rayons X, ou sous l'action de moutarde à   l'azote.   



   Pour obtenir à grande échelle les ferri-oxamines, on cultive par exemple de manière aérobie une souche présentant les propriétés des streptomycètes indiqués cidessus, par exemple dans une solution nutritive aqueuse renfermant des hydrates de carbone, des composés azotés, ainsi que des sels inorganiques, jusqu'à ce que cette solution présente un effet ferri-oxaminique notable, puis on isole ensuite les ferri-oxamines. On peut cependant cultiver également des plantes telles que des algues vertes, ou des bactéries comme le Bacillus subtilis, puis isoler ensuite de ces cultures les   ferri-oxamines   sous 

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 forme pure ou enrichie.

   Pour la culture des micro-orga-   nismes   indiqués, on envisage, comme hydrates de carbone assimilables, par exemple le   Glucose,   le saccharose, la mannites, l'amidon, ainsi que la glycérine. Comme substances nutritives azotées et le cas échéant comme substances favorisant la croissance, on citera :des acides aminés, des peptides et des protéines, ainsi que leurs produits de dégradation comme les peptones ou les tryp-   tones,   ainsi que des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales, comme le mais et le froment, des résidus de distillation provenant de la fabrication de l'alcool, des levures, des graines notamment de colza et de soja, des graines de coton, etcoo, mais également des sels d'ammonium et des nitrates.

   Comme autres sels inorganiques, la solution nutritive peut renfermer par exemple des chlorures, descarbonates, des sulfates de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux, du magnésium, du fer, du zinc et du manganèse. 



   La culture a lieu de manière aérobie,   c'est-à-   dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, de manière immergée par secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans des flacons agités ou dans des fermenteurs connuso Comme température,   --'avère   par   exemple   appropriée, dans le cas des streptomycètes, une température comprise entre 18 et 40 .

   Dans ce cas, 

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 la solution nutritive présente déjà un effet ferri-oxa-   minique   notable en général   au tout   de deux à   dix  jours., On ajoute à la culture   0,1 %   de chlorure ferrique et sépare le mycélium du filtrat de culture, la majeure partie des ferri-oxamines se trouvant dans le filtrat de culture., Il reste cependant des quantités notables de ces dernières qui sont adsorbées sur le mycélium. Il est en conséquence avantageux de bien extraire ce dernier par lavage, Conviennent par exemple à cet effet l'eau et/ou des solvants organiques aqueux tels que des alcools, par   exemple   une solution aqueusede méthanol. 



   D'une manière analogue, on peut aussi cultiver des bactéries, par exemple du Bacillus subtilis et utiliser le filtrat de culture pour l'isolement des ferri-oxamines. 



   Pour isoler les   ferri-oxamines   à partir des   ma=   tières indiquées, notamment à partir des filtrats de culture de champignons ou de bactéries, on peut procéder suivant des méthodes connues en elles-mêmes et utiliser par exemple l'un des modes opératoires indiqués ciaprès ou des combinaisons de ces modes opératoireso
1) On peut   utiliser   des agents d'adsorption, par exemple des charbons aotifs comme la norite, des terres activées comme la   frankonite,   la terre à foulon ou la floridine, ou bien des adsorbants résineux conne l'asmite. 



  L'élution des adsorbats a lieu avantageusement avec des 

 <Desc/Clms Page number 35> 

 mélanges aqueux de solvants organiques miscibles à l'eau, par exemple avec des mélanges d'eau et de méthanol, d'eau et de pyridine, d'acide acétique dilué et de   méthanol   ou aveo des Mélanges d'eau, de méthanol, d'acide acétique   glacial   et de   butanolo   Un   mélange   d'eau (4 parties en vo-   lume   et de pyridine (une partie en volume) s'est avéré particulièrement avantageux pour éluer un adsorbat sur de la frankonite ou de la   noriteo  
2) Une secondeméthode pour séparer les ferrioxamines consiste à les adsorber sur des échangeurs de cations, auquel cas conviennent notamment des résines renfermant des groupes acides, comme le Dowex 50.

   Ce dernier peut être utilisé aussi bien sous forme acide que sous forme sodique, bien qu'un mélange de ces deux formes se soit avéré Intéressant. L'élution a lieu   avan-   tageusement avec des agents acides, par exemple avec une solution méthanolique d'acide chlorhydrique ou avec des solutions-tampons acides. 



   3) On peut en outre extraire les ferri-oxamines d'une solution aqueuse à l'aide de solvants organiques Pour ces procédés d'extraction, des alcools organiques supérieurs, comme l'alcool   benzylique   ou l'alcool iso-   propylique,   se sont avérés particulièrement intéressants. 



    D'une   façon avantageuse, on ajoute dans ce cas à la phase 

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 aqueuse un sel inorganique, par exemple du sulfate d'am-   monium   ou du chlorure de sodium. A partir des extraits organiques obtenus, on peut obtenir les   ferri-oxamines   sous forme enrichie, soit en évaporant le solvant, soit en précipitant à l'aide d'un solvant organique convenable tel que par exemple l'éther, l'éther de pétrole ou l'acétate d'éthyle. 



   4) On peut aussi obtenir un enrichissement des ferri-oxamines en ajoutant à des solutions aqueuses ou alcooliques aqueuses concentrées du sel, un excès de solvants organiques miscibles à l'eau comme l'acétone, le dioxanne,   etc.,.,   les sels étant précipités sous forme   solideo  
5) Une autre méthode d'enrichissement des ferri-   oxamines   consiste à les répartir entre une solution aqueuse et une solution de phénol dans le chloroforme, en faisant varier aussi bien le pH de la solution aqueuse que la teneur en phénol de la solution chloroformiqueo Si l'on entend par coefficient de répartition des ferri-oxamines le rapport de la concentration dans la phase organique à la concentration dans la phase   aqueuse,

     il s'avère que le coefficient de répartition augmente au fur et à mesure que la teneur en phénol de la phase organique augmente et au fur et à mesure que le pH de la solution aqueuse diminuée Etant donné qu'il est ainsi possible d'établir dans ce 

 <Desc/Clms Page number 37> 

 système tout coefficient de répartition quelconque des ferri-oxamines, on peut, en combinant un petit nonbre   d'opérations   de répartition, séparer une grande   partie     d'impuretés inaotiveso  
6) Une autre méthode d'enrichissement et/ou de séparation des ferri-oxamines est constituée par une chromatographie, par exemple par une chromatographie d'adsorption sur différentes matières, par exemple, sur de la norite, de l'oxyde d'aluminium, des silicates de magnésium, du gel de silice, du sulfate de calcium,

   ainsi qu'une chromatographie de répartition avec de la cellulose, de l'amidon, du gel de silice, de la célite et analogues en tant que substances de support, ou toutefois une chroma-   tographie   sur des résines échangeuses d'ions, par exemple sur du Dowex 50, sur de   l'Amberlite   IRC-50 et analogues. 



     7)   En outre, les ferri-oxamines peuvent être enrichies par une chromatographie à contre-courant effectuéesuivant Craig entre deux phases solvantes non-miscibles. 



  Les   systèmes   solvants ci-après se sont avérés dans ce cas particulièrement   appropriés :   a) Alcool benzylique - solution aqueuse à 20 % de sulfate   d'ammonium.   b) n-butanol (100 parties en volume) - alcool benzylique (200 parties en volume) - acide chlorhydrique normal (6 parties en volume) - 

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 eau (300 parties en volume) - solution aqueuse saturée à 19  de chlorure de sodium (60 parties en volume). 



   8) Finalement une électrophorèse préparatoire sur une colonne garnie d'une matière de support est bien ap-   propriée   pour la purification, l'enrichissement et la séparation de la préparation de   ferri-oxamine.   En tant qu'électrophorèse haute-tension, celle-ci est effectuée sous 500 à   4000   volts.

   Un autre perfectionnement consiste à mettre ce procédé en oeuvre suivant le principe dit du contre-courant,Dans ce cas, les   ferri-oxamines     A,   B, C et ? se présentant à l'état de cations sont retenues localement dans la colonne de support, tandis qu'on   compense   exactement leur déplacement provoqué par le champ électrique à l'aide d'un courant d'électrolyte s'écoulant en sens opposée On obtient ainsi pour résultat que les substances possédant une autre modilité électrique abandonnent la colonne de support aux deux extrémités des électrodes. 



   Les diverses ferri-oxamines sont obtenues en tant que substances pures et unitaires, sous la forme d'une poudre amorphe ou à l'état de cristaux. Pour leur obtention, les méthodes suivantes se sont avérées par. ticulièrement appropriées : - Lyophylisation d'une solution aqueuse ou alcooli- que 

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 -   Précipitation   à partir d'une solution aqueuse, alcoolique ou phénolique, avec des solvants or- ganiques lipophiles qui sont miscibles avec le solvant renfermant la ferri-oxamine. Convien- nent particulièrement bien pour cette précipi- tation des alcoyl-cétones inférieures comme l'acétone, la méthyléthylcétone, des éthers comme l'éther diéthylique, l'éther di-isobutyli- que, et des hydrocarbures comme le pentane, l'hexane, l'éther de pétrole. 



   - Cristallisation dans des mélanges solvants ap- propriés tels que des mélanges d'alcool et d'é- ther, par exemple un mélange de méthanol et d'éther diéthylique, ou des mélanges d'eau et de solvants organiques qui sont au   noins   par- tiellement miscibles à l'eau, par exemple un mélange d'eau et d'acétone, un mélange d'eau et d'acide acétique glacial, etcooo
Les ferri-oxamines, leurs dérivés et les sels de ces composés peuvent être utilisés comme systèmes de croissance pour différents organismes et ce soit seuls, soit sous la forme de préparations particulières.

   Ils pessèdent, en outre, des propriétés anti-anémiques marquées, par exemple dans le cas de l'anémie due à un manque de sang et de l'anémie due à un manque de fer, et ils peuvent en conséquence être utilisés comme médicaments sous la forme de préparations. 

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 lies préparations renferment les   ferri-oxamines.,   leurs, sels ou dérivés conjointement avec une   Têtière   de support appropriée.

   Pour la formation de cette matière de support, on envisage les substances ne réagissant pas sur les nouveaux composés, comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de   magnésium,   le talc, des huiles végétales, des alcools   benzyliques,   des gommes, des polyalcoylène-glycols, la vaseline ou la   cholestérineo   De telles préparations peuvent se présenter sous forme solide, par exemple à l'état de poudres, ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires telles que des agents de conservation, de stabilisation, des agents mouillants ou émulsifiants. Elles peuvent aussi renfermer encore d'autres substances thérapeutiquement précieuses. 



   D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront plus en détail de la description qui va suivre en regard des dessins annexés, dans lesquels : La fig. 1 illustre une répartition à contre-courant de la   ferri-oxamine   brute, en 80 stades, avec chaque fois 100 cm3 d'une phase organique et 100 cm3 d'une phase aqueuse dans le système   n-butanol/   

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 alcool   benzylique/solution   aqueuse saturée de chlorure de sodium/acide chlorhydrique normal   (100:200:

     
 EMI41.1 
 3UOs60s6) e--e-v-- extinction à 425 m}1o L'activité anti-aidéranyainique /Tll7 est exprimée en milli- mètres (test de   Bonifas   modifié). 
 EMI41.2 
 La figo 2 montre le chromatogrammo de la fraction III de la fig. 1 sur du Dowex 50-WX2 avec un tampon à l'acétate d'ammonium comme agent   d'élutiono   La   figo 3   montre le spectre infra-rouge de la   ferri-oxamine  
B dans le   nujol.   



  La fige 4 montre le chromatogramme sur papier des ferri- oxamines dans le système butanol   tertiaire/eau/   solution aqueuse saturée de chlorure de sodium/ acide chlorhydrique   décinormal   (50:25:25:1), le papier étant imprégné avec un mélange d'acétone, d'eau et d'une solution aqueuse saturée de chlo- rure de sodium (6:3:1). 



  La figo 5 illustre l'électrophorèse sur papier des ferri- examines, avec la longueur de migration en centi- mètres dans de l'acide acétique 0,33-normal au bout de 4 heures et demie sous 220 volts;   x -   fructose. 



  La fige 6 montre le chromatogramme de la fraction II de la figo 1 sur du Dowex 50-WX2 avec de   l'p.cétate   d'am- monium comme solution-tampon.-.-.- extinction à   425   m . 

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  La   figo 7   montre un chromatogramme de la fraction IV de la fige 1 sur du Dowex 50-WX2 avec un tampon à   l'acétate   d'ammonium canne agent   d'élution   .-.-. extinction à 425 m . 



  La fige  8 montre un chromatogramme des fractions 2 à 5 ob- tenu dans les deux cas en   chromatographiant   la fraction V de la fig. 1 sur du Dowex 50-WX2 avec un tampon à l'acétate d'ammonium comme agent 
 EMI42.1 
 d'élution .#.#.#. extinction à 425 mû. 



  La fig. 9 montre un chromatogramme des fractions 48 à   55,.   obtenu dans les deux cas en   chromatographiant   la fraction V de la figo 1 sur du Dowex 50-WX2 avec un tampon à l'acétate d'ammonium comme 
 EMI42.2 
 agent d9dlution s-0-ooe extlnction 425 I11J1o La fig. 10 montre l'antagonisme entre les ferri-oxamines et la ferrimycine dans le test de Bonifas   mo-   difié. Les parties hachurées montrent l'inhibi- 
 EMI42.3 
 tion de la croissance de ltorganisme-test.

   La figo 11 montre le spectre infra-rouge de la ferri-oxamine
A dans le bromure de potassiumo La figo 12 montre le spectre   infra-rouge   de la   ferri-oxa.-   mine C dans le bromure de   potassiumo   La figo 13 montre le spectre infra-rouge de la ferri-oxa- mine D1 dans le bromure de potassium. 

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  La fige 14 montre-le spectre infra-rouge de la   ferri-oxa-   mine B dans le bromure de potassium. 



  La   fig,   15 montre le spectre infra-rouge de la   ferri-oxa-   mine F dans le bromure de   potassium,,   La fig. 16 montre le spectre   infr@-rouge   de la   ferri-oxami-   ne D2 dans le bromure de potassium.,
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples   non-limitatif a   qui suivent, dans lesquels les températures sont,   on=*   dans ce qui précède, indiquées en degrés   centigrades,   

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EXEMPLE 1 
La culture du Streptomyces pilosus, souche NRRL
2857 est effectuée suivant le procédé de culture   inmergéeo  
On utilise une solution nutritive renfermant, par litre d'eau du robinet, 20 g de farine de soja et 20 g de mannite. 



   La solution nutritive est stérilisée dans les   ballons d'en-     semencement   ou dans les fermenteurs pendant 20 à 30 ninu- tes sous une pression d'une atmosphère effectiveo La so- lution nutritive stérilisée présente un pH d'une valeur de 7,2 à 7,60 L'ensemencement a lieu avec jusqu'à 20 % d'une culture végétative, partiellement   sporulante,   de l'organisme indiquée Tout en secouant bien ou en agitant, on incube à   24-30 ,   les cultures étant aérées dans les fermenteurs avec environ 2 volumes d'air par volume de et solution et par minute.

   Après 48 à   240   heures d'incubation. la solution de culture a atteint sa teneur maximale en ferri-oxamines o On interrompt la culture, ajoute   0,1   % de chlorure ferrique, sépare par filtration ou centrifugation le mycélium ainsi que d'autres composantes solides de la solution renfermant la majeure partie de'la ferrioxamine , en ajoutant le cas échéant à la solution de culture,avant filtration, environ un pour cent d'un auxiliaire de filtration tel que   l'Hyflo   Supercel par exemple, On lave les résidus de filtration avec de l'eau ou avec du méthanol aqueux et réunit les liquides'de lavage avec le 

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 filtrat de culture. Tout en agitant constanment, on ajoute au filtrat de culture obtenu 2   %   d'alumine, par exemple de frankonite.

   Après avoir mélangé à fond, on sépare par filtration, puis répète une à deux fois l'opération d'absorption avec le filtrat obtenu. On réunit les résidus de filtration et les lave à plusieurs reprises avec de l'eau et du méthanol aqueux. On élue ensuite le résidu de filtration à 2-3 reprises avec un mélange de pyridine et d'eau (1:4). Après avoir clarifié l'éluat par filtration, on l'évaporé sous vide. Les ooncentrats obtenus peuvent soit être soumis directement à la suite du traitement (voir exemple   3).   ou bien on peut à partir de   ceux-ci,   par un séchage par réfrigération, isoler sous forme brute un mélange des ferri-oxamines. 



   Si l'on utilise, à la place de la solution   nutri-   tive indiquée ci-dessus, une solution nutritive renfermant par litre d'eau du robinet les substances nutritives ciaprès, on obtient alors, après une culture analogue et traitement, des filtrats de culture présentant une teneur   aussi élevée en ferri-oxamine.

   .   
 EMI45.1 
 
<tb> 
<tb> a) <SEP> saccharose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> citrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,9 <SEP> g
<tb> acétate <SEP> d'ammonium <SEP> 3 <SEP> g
<tb> phosphate <SEP> secondaire <SEP> de
<tb> potassium <SEP> 3 <SEP> g
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 46> 

 
 EMI46.1 
 
<tb> 
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 0,8 <SEP> g
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> cuivre <SEP> 0,01 <SEP> mg
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> manganèse <SEP> 0,07 <SEP> mg
<tb> citrate <SEP> ferrique <SEP> 20 <SEP> mg
<tb> b) <SEP> glucose <SEP> brut <SEP> 10 <SEP> g
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Cornsteep <SEP> liquor <SEP> 20 <SEP> g
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb> nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb> chaux <SEP> 10 <SEP> g
<tb> c)

  déchets <SEP> d'extraction <SEP> du <SEP> colza <SEP> 20 <SEP> g
<tb> glucose <SEP> brut <SEP> 10 <SEP> g
<tb> phosphate <SEP> secondaire <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,2 <SEP> g
<tb> chaux <SEP> 10 <SEP> g
<tb> d)farine <SEP> de <SEP> lin <SEP> 40 <SEP> g
<tb> glucose <SEP> brut <SEP> 10 <SEP> g
<tb> phosphate <SEP> secondaire <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,2 <SEP> g
<tb> chaux <SEP> 10 <SEP> g
<tb> 
 
A la place de la souche indiquée de la   catégorie   du Streptomyces pilosus, on peut utiliser les souches indiquées ci-après (les souches sont conservées sous les numéros Indiqués à l'Institut de Botanique Spéciale, Ecole Polytechnique Fédérale de Zurich), après une culture analogue et traitement, on obtient des filtrats de culture présentant une teneur aussi élevée en ferri-oxamine.

   

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 EMI47.1 
 
<tb> 
<tb> Souche <SEP> Ne <SEP> : <SEP> catégorie <SEP> de <SEP> streptomycète
<tb> 9578 <SEP> S. <SEP> griseoflavus <SEP> (Krainsky) <SEP> de
<tb> Waksman <SEP> et <SEP> Henrici
<tb> 15311. <SEP> So <SEP> griseoflavus
<tb> 
 
 EMI47.2 
 11686 S. pilosus d'Et1;

  11nger' et ses 
 EMI47.3 
 
<tb> 
<tb> collaborateurs
<tb> 23258 <SEP> S. <SEP> pilosus
<tb> 23305 <SEP> S. <SEP> pilosus
<tb> 
 
 EMI47.4 
 17635 Sa v1ridochromogenes (Krainsky) de 
 EMI47.5 
 
<tb> 
<tb> Waksman <SEP> et <SEP> Henrici
<tb> 18055 <SEP> S. <SEP> virldochrontogenes
<tb> 6445 <SEP> S. <SEP> olivaceus <SEP> (Waksman) <SEP> de <SEP> Waksman
<tb> et <SEP> Henrici
<tb> 7346 <SEP> S. <SEP> olivaceus
<tb> 7437 <SEP> S. <SEP> olivaceus
<tb> 
 
 EMI47.6 
 22083 So 0 aureofaciens de Duggar 
 EMI47.7 
 
<tb> 
<tb> 22765 <SEP> S. <SEP> aureofaciens
<tb> 18822 <SEP> So <SEP> galilaeus <SEP> d'Ettlingar <SEP> et <SEP> ses
<tb> collaborateurs
<tb> 14677 <SEP> S. <SEP> lavendulae <SEP> (Waksman <SEP> et <SEP> Curtis)
<tb> de <SEP> Waksman <SEP> et <SEP> Henrici
<tb> 21510 <SEP> S. <SEP> lavendulae
<tb> 21837 <SEP> S.

   <SEP> polychromogenes <SEP> d'Hageman <SEP> et
<tb> ses <SEP> collaborateurs
<tb> 23217 <SEP> S= <SEP> polychromogenes
<tb> 23310 <SEP> S. <SEP> polychromogenes
<tb> 10112 <SEP> S <SEP> grisous <SEP> de <SEP> Waksman <SEP> et <SEP> Henrioi
<tb> 13495 <SEP> So <SEP> griseus
<tb> 7419 <SEP> So <SEP> griseus
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 48> 

 
EXEMPLE 2 
La souche A   23978   du type du Streptomyces   aureo-   faciens (Institut de Botanique Spéciale, Ecole Polytechnique Fédérale de Zurich) est cultivée de manière immergée dans une solution nutritive renfermant, par litre d'eau du robinet, 20 g d'extrait de malt et 20 g de Distillers solubles., La culture et le traitement ont lieu tout comme dans l'exemple 1, et   l'on   obtient des filtrats de culture présentant une teneur aussi élevée en :terrioxamine. 



     EXEMPLE   3 
De la manière décrite dans l'exemple 1, on prépare et traite 60 litres de culture.   L'éluat   (environ 6 et litres) obtenu avec un mélange de pyridine] d'eau est concentré sous vide jusqu'à 3 litres. Dans ce concentrât, on dissout 870 g de sulfate d'ammonium. On clarifie la solution par filtration ou centrifugation, le cas échéant en ajoutant un pour cent d'Hyflo   Supercel.   En enrayant à 3 ou 4 reprises avec de l'alcool benzylique ou de l'alcool   isopropylique,   on fait passer les ferri-oxamines dons le solvant organique.

   On réunit les phases organiques et les sèche à l'aide de sulfate de sodium, On ajoute au tout un   excès   d'éther ou d'acétate d'éthyle et sépare par filtration les ferri-oxamines qui ont précipitée, 

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 L'addition d'un auxiliaire de filtration comme l'Hyflo Supercel   avcnt   la précipitation facilite l'obtention du précipité. A partir de ce précipité, on peut obtenir des ferri-oxamines par lavage avec du méthanol ou de l'eau.

   On évapore ces éluats ou les lyophilise et l'on obtient ainsi les ferri-oxamines sous forme enrichie,
EXEMPLE 4 
A un filtrat de culture obtenu suivant l'exemple 1 cu 2, on ajoute par litre 20 g de chlorure de   sodiumo   On extrait la solution limpide à trois reprises avec 1/10 volume d'un mélange de chloroforme et de phénol (une partie en volume de chloroforme, une partie en poids de phénol). On réunit les phases organiques, les filtre en ajoutant de l'Hyflo Supercel, puis ajoute un excès d'éther. En extrayant à plusieurs reprises avec peu d'eau, on fait passer les ferri-oxamines dans les fractions aqueuses.

   On réunit les phases aqueuses obtenues et les extrait à deux reprises avec de 1 'éther pour éliminer complétement le phénol, En procédant à un séchage par réfrigération, on obtient une préparation orange à rougebrun de ferri-oxamines qu'on peut décomposer par chro-   matographie   sur papier, 

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 EXEMPLE 5 
 EMI50.1 
 A... 8. A-r .A-- 
Tout en agitant, on ajoute, à'20 litres d'une solution de culture, 400 g d'Hyflo   Supercel   et 200 cm3 d'une solution aqueuse à 10 % de sulfate ferrique, puis 
 EMI50.2 
 filtre.

   Après y avoir ajouté 3,6 ka de chlorure de sodium, on extrait le filtrat,, dans un extracteur à contre-courant, avec 2 litres d'un mélange de phénol et de chloroforme (un gramme : un centimètre cube), sèche l'extrait sur du sulfate de sodium, puis le verse au cours d'une heure dans une suspension bien agitée de 200g d'Hyflo Supercel dans 2 litres d'éther et 10 litres d'éther de pétrole. 



  Après avoir   filtré' le   mélange pulvérulent constitué par l'auxiliaire de filtration et le précipité, et après l'avoir lavé avec environ 2 litres d'éther, on l'élue à cinq reprises avec chaque fois 600 cm3 de méthanol/) Une fois réunis, les éluats fournissent, par évaporation ménagée, 10 g de ferri-oxamine brute sous la forme d'une poudre rouge-brun. 



     EXEMPLE   6 
Dans le système n-butanol/alcool benzylique/eau/ solution aqueuse saturée de chlorure de sodium/acide chlorhydrique normal (100:200:300:60:6), on   répartit   en 80 stades 4 g de   terri-oxamine   brute, avec chaque fois 100 cm3 de phase organique et 100 cm3 de phase aqueuse 

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 L'estimation de la répartition a lieu par contrôle biologique et par mesure de l'extinction à 425 m  :toutes les quatre   unités,,  on prélève 2 cm3 de la phase supérieure et de la   phase inférieure   et les mélange avec 32 car de   méthanol,   ce qui fait qu'on obtient une solution homogène dont la concentration est appropriée pour les   deux contrôles   (cf. fig. 1).

   Les   fractions   de   répar..     tition   rassemblées en quatre groupes suivant cette estination renferment, comme on peut le voir par une chromatographie sur papier, à côté du produit principal constitué par la ferri-oxamine B (dans la fraction de répartition III), d'autres composés de couleur rouge ayant un   effet   antisidéramycinique, qu'on désignera par terrioxamines A, C, D1, D2, E et Po 
 EMI51.1 
 
<tb> 
<tb> Fraction <SEP> N  <SEP> Fraction <SEP> de <SEP> ferri-oxamine <SEP> principale
<tb> répartition
<tb> 6-18 <SEP> II <SEP> A
<tb> 19-32 <SEP> III <SEP> B
<tb> 33-62 <SEP> IV <SEP> 0
<tb> 63-80 <SEP> V <SEP> D1, <SEP> D2, <SEP> E <SEP> et <SEP> F
<tb> 
 
On extrait la fraction de répartition III avec 3 litresd'éther de pétrole.

   On lave avec du chloro-   forne   la phase aqueuse de teinte rouge-foncé, ajoute du 

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 chlorure de sodium jusqu'à avoir une concentration de 10%, puis extrait   jusqu'à   épuisement avec un mélange de phénol et de chloroforme (un   gramme  un centimètre   cube).   



   L'extrait obtenu avec le mélange de phénol et de chloro- forme est lavé à plusieurs reprises avec une solution centinormale   d'acide   chlorhydrique renfermant la % de : chlorure de sodium, filtré à travers une petite colonne de 20 g de célite, et l'on   précipite   les substances renfermées par addition de 25 g   d'Hyflo   Supercel, de
500 cm3 d'éther et d'un litre d'éther de pétrole, en agitant à 0 . Le mélange pulvérulent constitué par l'auxiliaire de filtration et par le précipité est bien lavé à l'éther et élue ensuite avec peu de méthanol. A partir de l'éluat   méthanolique,   on obtient, par évapo- ration ménagée, 982 mg de   ferri-oxamine   B brute sous la forme d'une poudre rouge-brun. 



   Les fractions de répartition II, IV et V sont traitées de la   mené   manière.,   EXEMPLE 7    
Dans une colonne verticale en verre pourvue d'une chemise de refroidissement et remplie de poudre de cellu- lose, colonne qui présente une hauteur de 1,5 mètre et un diamètre de 2,6 cm, on soumet à une électrophorèse en zones suivant J.

   Porath ["Biochim. et Biophys.Acta"
22, 151   (195617 un   gramme d'une préparation de terri- 

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 oxamine B obtenue suivant l'exemple 6, On se sert,  écorne   solution d'électrolyte, d'acide acétique   1/3-normal.   On dissout la substance   dans   20   car     d'eau   et apporte la so-   iutiôn   de teinte rouge-foncé sur la colonne à l'extrémité supérieure de l'anode. La zone correspondent à la . ferrioxamine, qui est   de.teinte   rouge-orange et présente une hauteur.de 10 cm environ, migre, pour une tension de 1600 volts et une intensité de courant de 30 milliampères, à une vitesse de 3,9 cm par heure, vers la cathode à l'extrémité inférieure de la colonne.

   Pour augmenter l'effet séparateur de la colonne, cette migration électrique est compensée par un courant d'électrolyte dirigé en sens opposé, ce qui fait que la substance active, bien reconnais.. sable à cause de sa teinte propre, est maintenue localement dans la colonne. Les substances accompagnatrices présentant une vitesse de migration électrique supérieure ou inférieure à celle de la substance active, sont, dans ce cas, déplacées dans la chambre cathodique ou dans la chambre anodique et éliminées de la   colonne.   Dans ces conditions, la substance active a parcouru, au bout de 5 à 6 jours, une colonne de liquide de 4 à 5 mètres de longueur, On interrompt alors   l'électrophorèse   et élue la colonne avec de l'acide acétique 1/3-normal,

   en recueillant des fractions de 15 cm3 chacune.0 On examine ces fractions in-   dividuellement.   On réunit les fractions fortement colorées 

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 en rouge qui sont actives du point de vue biologique,, On ajoute 10 % de chlorure de sodium et extrait jusqu'à épui-   sement   avec un mélange de phénol et de chloroforme (une partie en poids, une partie en volume)o Après avoir réuni les extraits, on les lave à plusieurs reprises avec une solution   continormale   d'acide chlorhydrique renfermant 10 % de chlorure de sodium, puis filtre ensuite à travers   de la   célite.

   Au filtrat   anhydre   de teinte rouge-foncé, on ajoute un auxiliaire de filtration (Hyflo   Supercel)   et, tout en agitant, a joute un volume quintuple d'un mélange d'éther et d'éther de pétrole   (1:1),   ce qui fait que la substance active est précipitée sur l'auxiliaire de filtration. On sépare ce dernier par filtration et le lave avec beaucoup d'éther. On élue ensuite la substance active avec peu de méthanol et évapore la solution rouge à 20  sous vide, jusqu'à   dessicationo   On obtient ainsi une préparation de ferri-oxamine B qui est doublement enrichie par rapport à la matière de départ.

   C'est une poudre rouge amorphe qui est soluble dans l'eau, le méthanol, le buta.nol, l'alcool benzylique, le phénol,, le   diméthylformamide   et l'acide acétique, et renferme du carbone, de l'hydrogène, de l'oxygène, de l'azote et du fer. Quant au reste, elle présente les propriétés suivantes : pK 9,54 (solution aqueuse à 66 % de   méthyl..   cellosolve) ; équivalent-poids   645 ;  dans le spectre 

 <Desc/Clms Page number 55> 

 d'absorption   ultra-violet,   on observe un maximum à 430 m  (log   Il 1 %   = 1,51) ; en ce qui concerne le spectre infrarouge, voir la figo 3
Lorsqu'on hydrolyse une telle préparation dans de l'acide chlorhydrique hexanormal (6 heures à   110*),   on obtient un mélange renfermant cinq substances positives à la ninhydrine.

   Ces substances présentent, lors d'une chromatographie   sur   papier, les   valeurs   de Rf suivantes 
 EMI55.1 
 
<tb> 
<tb> mélange-solvant <SEP> :
<tb> Substance <SEP> N  <SEP> : <SEP> phénol/eau <SEP> (8: <SEP> 2) <SEP> n-butanol/acide
<tb> acétique <SEP> glaciale
<tb> eau <SEP> (4:1:1)
<tb> 1 <SEP> 0,68 <SEP> 0,37
<tb> 2 <SEP> 0,40 <SEP> 0,34
<tb> 3 <SEP> 0,35 <SEP> 0,10
<tb> 4 <SEP> 0,30 <SEP> 0,05
<tb> 5 <SEP> 0,20 <SEP> 0,04
<tb> 
   EXEMPLE   8
Sur une colonne (66 cm x 7,14 cm2) de Dowex 50-WX2   (100/200   mailles), on chromatographie, à 15-17 , 865 mg de la ferri-oxamine B brute provenant de la fraction de répartition III (cf. exemple 6).

   L'échangeur d'ions est préalablement purifié suivant les indications fournies par 

 <Desc/Clms Page number 56> 

 Hirs et ses collaborateurs dans la publication intitulée "Jo Biol.   Ohemo"   219, 623 (1956), amené par   sédimentation   sur la colonne sous la forme ammonium et équilibré avec 
 EMI56.1 
 une solution-tampon 0,2-molair  ù'ae61àle d!üü1üm d'un pH de 4,60, Fendant 48 heures, à une vitesse de passage de 200 cm3 par heures La substance apportée sur la colonne dans 9 cm3 de la solution-tampon indiquée est développée pendant 72 heures (100 cm3 par heure) avec une solutiontampon   0,2-molaire   d'un -on de 4,6.

   On concentre ensuite en continu l'agent   d'élution   en utilisant un récipient de 
 EMI56.2 
 mélange d'une capacité d'un litre, avec une solution-taB" pon 0,2-nolalro d'acétate d'annoniun d'un pH de 4,7 (gna- dient élut ion), puis on recueille l'éluat en fractions de 40 cm3 peu avant la sortie de la première zone teintée., Lec fractions rassemblées en fonction de la mesure d'extinction à 425 m  (cf. fig. 2) sont   extraites   de la ma nière déjà décrite en   utilicant   un mélange de phénol et de chloroforme, un mélange d'éther. d'éther de pétrole et d'Hyflo Supercel, et du méthanol.

   
 EMI56.3 
 
<tb> 
<tb> fraction <SEP> quantité <SEP> en <SEP> mg <SEP> substance
<tb> 13-18 <SEP> 62 <SEP> non-identifiée
<tb> 93125 <SEP> 544 <SEP> chlorhydrate <SEP> de <SEP> la
<tb> 
 
 EMI56.4 
 ferri-oxamine ferri-oxamine 
 EMI56.5 
 
<tb> 
<tb> 185-197 <SEP> 36 <SEP> non-identifiée
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 57> 

 La ferri-oxamine B est soluble dans l'eau, le 
 EMI57.1 
 méthanols l'alcool, le phénol, le d1métiqlfomamide et l'acide acétique glacial, difficilement soluble dans le butanol, et pratiquement insoluble dans le chloroforme.   l'acétone,   l'éther et l'acétate   d'éthyle*   Micro-analyse au bout de 48 heures à 20  sous une pression de 0,001 mm de mercure t 0 48,04 %, H 7,41   %,   N 11,21   %,   01 5,25   %,   
 EMI57.2 
 P 0 %, S 0 %g 3O 'j6rJ o Titrage :

   1 pXICS = 9974, équivalontp-poide a 7040 Absorption (Hz0 ) 1 Ám.ax 430 mp, 3 1 18   39,00   Spectres en infra-rouge. et, fig. 30 La valeur de Rf dans le système I est de 0,44, et elle est de 0,29 dans le système V   (et,,   tableau 1) ; dans le système YI, le coefficient de répartition est de   0,228     (et,   tableau 1). 



   La ferri-oxamine B donné une réaction positive avec la ninhydrine. On peut facilement l'oxyder avec le réactif au chlorure ferrique et eu ferri-cyanure de potas- 
 EMI57.3 
 o1# 47.rj. Barton et ses collaborateurs, "Nature" !Z2.. 249, (1952)]. Par ailleurs, elle peut être réduite avec le dithionite de sodium en se décolorante Les solutions incolores que l'on obtient alors reprennent rapidement par repos à l'air leur coloration rouge initiale. Le fer lié 
 EMI57.4 
 drna la forri-oxamine B est soutiré du complexe en faisant agir des acides minéraux, des alcalis forts ou de la 8-- 
 EMI57.5 
 hydroxy-quinolé ino 

 <Desc/Clms Page number 58> 

 
La ferri-oxamine B exompte de fer ( desferrioxamineB) est incolore.

   On peut la reconvertir en terrioxamine avec du chlorure ferrique, La desferri-oxamine B réagît également sur d'autres ions métalliques en donnant lieu à la formation des complexes métallifères correspondants, par exemple à la formation de la desferri-oxamine cuprifère de teinte verdâtre. 



     EXEMPLE   9
Dans 3 cm3 d'une solution 1,2-normala d'acide chlorhydrique, on dissout 20 mg d'une préparation de ferrioxamine B obtenue suivant l'exemple 8, puis chauffe pendant 5 minutes au bain-marié bouillant. La solution qui est brun-rouge au début devient alors presque incolore. 



  On l'évapore à sec sous   vidéo   On dissout ensuite le résidu dans 0,2 cm3 d'eau et utilise, pour l'examen chro-   matographique   sur papier qui suit, 0,01   car   chaque fois de cette solution. Comme agent   d'élution,   on se sert d'un mélange de 7 parties en volume de butanol/normal et de 3 parties en volume d'acide chlorhydrique   hexanormal     On   a pu identifier les substances suivantes 

 <Desc/Clms Page number 59> 

 
 EMI59.1 
 
<tb> Substance <SEP> Rf <SEP> a <SEP> b <SEP> c <SEP> d
<tb> Cadavérine <SEP> 0,12 <SEP> - <SEP> violât <SEP> - <SEP> Fe <SEP> ++ <SEP> 0,17 <SEP> :Jaune <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 3 <SEP> rouge
<tb> pâle <SEP> foncé
<tb> 1-amino-5-hydroxyl- <SEP> 0,25 <SEP> - <SEP> violet <SEP> rouge <SEP> amino-pentane <SEP> : <SEP> :

   <SEP> 1 <SEP> gris <SEP> : <SEP> foncé
<tb> hydroxylamine <SEP> 0,34 <SEP> - <SEP> - <SEP> rouge <SEP> rouge
<tb> pâle <SEP> pâle <SEP> violet
<tb> substance <SEP> inconnue <SEP> 0,68 <SEP> - <SEP> bleu- <SEP> - <SEP> -
<tb> âtre
<tb> Fe+++ <SEP> 0,84 <SEP> jaune <SEP> - <SEP> - <SEP> substance <SEP> inconnue <SEP> : <SEP> 0,93 <SEP> - <SEP> - <SEP> rouge
<tb> 
   Dans ce tableau, a) désigne la couleur propre des substances qu'on peut voir sur le papier, b) désigne la réaction colorée avec la ninhydrine, c) désigne la réaction colorée avec du chlorure de triphényl-tétrazolium + une solution d'hydroxyde de sodium, d) désigne la réaction colorée avec le réactif de Czaki. (Tous les réactifs sont indiquée dans la publication publiée en 1958 à Iéna aux Editions Gustav Fischer par Messieurs I.M. Hais et K.

   Macek et intitulée "Handbuch der Papierchromatographie").   

 <Desc/Clms Page number 60> 

 



   Si l'on utilise lors de   l'hydrolyse, à   la place d'acide chlorhydrique, de l'acide iodhydrique à 57 % (4 heures à 110 ), il manque alors dans le chromatogramme sur papier 
 EMI60.1 
 l'hydroxylamine, le 1-amino..5-hydroxylamino-pentane et le Fe +++. C'est pourquoi il y a davantage de   cadavérine.   



   Une seconde portion de   ferri-oxamine   B est hydrolysée comme décrit ci-dessus avec une solution 1,2normale d'acide chlorhydrique. On extrait ensuite le mélange d'hydrolyse avec de l'éther. On sèche l'extrait avec du sulfate de sodium et l'évapore. A partir du résidu, on peut obtenir de l'acide succinique sous forme cristalline. 



   EXEMPLE 10 
 EMI60.2 
 -- 8.bA¯-" ..td......- 
A une solution aqueuse de 450 mg d'une préparation de ferri-oxamine B obtenue suivant l'exemple 8 et de 450 mg de bicarbonate de sodium, on ajoute une solution de 450 mg 
 EMI60.3 
 de 2,4-dinitro..fluorobenzène dans 26 cm3 d'éthanol. Après avoir laissé reposer pendant 4 heures à la température ambiante, on chasse l'alcool sous vide. On élimine le réactif en excès en secouant avec de l'éther. La dinitrophényl- -ferri-oxamine B de teinte brun-rouge foncé peut alors facilement être extraite avec du butanol normal (la ferrioxamine B proprement dite reste dans les mêmes conditions dans la phase aqueuse). Après avoir lavé l'extrait butanolique avec de l'eau et l'avoir ensuite séché, on l'évapore sous vide.

   On extrait le résidu avec de l'acétone et 

 <Desc/Clms Page number 61> 

 débarrasse la solution acétonique par filtration d'un résidu brun insoluble (114 mg). A partir de la solution acétonique concentrée jusqu'à 5 cm3 environ, on peut pré- cipiter la   dinitrophényl-ferri-oxamine   B sous la forme d'une poudre amorphe rouge-orange. Le rendement est de 338 mg. 



   Lors d'une électrophorèse sur papier dans l'acide acétique dilue, le dérivé dinitrophénylique migre en 2 heures sous 1000 volta de 5,5 cm, tandis que la ferri-oxamine B migre dans les   mimes   conditions de 18,5 cm. 



   EXEMPLE 11      
Pour isoler les ferri-oxamines A, C, D1, D2, E et F, on chromatographie avec un tampon à l'acétate d'ammonium comme agent d'élution, les fractions de répartition II, IV et V (cf. exemple 6) qui se forment lors de la répartition à contre-courant de la ferri-oxamine brute, en opérant sur du Dowex 50-WX2 (200/400 mailles). On purifie préalablement la résine suivant les indications fournies par Hirs et ses Collaborateurs [C.H.W. Hirs, S. Moore, W. H. Stein,   "J.   Biol. 



  Chem." 219, 623   (19567.   On apporte la résine par sédimen- tation sur la colonne sous la forme ammonium et équilibre   provisoirement   l'apport de substance pendant 70 heures environ, avec la solution-tampon utilisée pour l'élution, à une vitesse de passage de 20 cm3 par centimètre carré et par heure. Suivant leur solubilité, on apporte les 

 <Desc/Clms Page number 62> 

 substances sur la colonne sous la forme   d'une   solution à 1-10 %, et développe les chromatogrammes à   23-25    avec une vitesse de traversée de 5 à 15 cm3 par centimètre carré et par heure, avec un tampon à l'acétate d'ammonium, d'un pH de 4,5, en concentration croissante (gradient-élution). 



  L'estimation du chromatogramme a lieu par la mesure de l'extinction des fractions d'éluats (30 à 40   cm3)   425 m . 



  Les fractions   éluées   et rassemblées de façon correspondante sont extraites jusqu'à épuisement après addition de 10 % de chlorure de sodium, avec un mélange de phénol et de chloroforme (un gramme un centimètre cube). Les extraits de couleur rouge-foncé sont lavés soigneusement avec une solution centinormale d'acide chlorhydrique renfermant 10 % de chlorure de sodium, filtrés à travers une couche de célite, puis on précipite les substances renfermées dans les filtrats clairs, sur de l'Hyflo Supercel, par addition d'éther et d'éther de pétrole. En vue de le débarrasser du phénol, on lave avec de l'éther le mélange constitué par la substance et par le support, puis élue ensuite avec peu de méthanol.

   A partir des éluats méthanoliques, on obtient les ferri-oxamines par évaporation ménagée, sous la forme d'une poudre hygroscopique rouge-brun qui, en vue de l'analyse, est séchée pendant 50 heures sur du pentoxyde de phosphore, à 25  sous une pression de 0,03 mm de mercure. 

 <Desc/Clms Page number 63> 

 



   Suivant le procédé décrit ci-dessus, on chromatographie 5 g de la fraction II (cf. exemple 6) sur une colonne de Dowex   50-WX2   de 90 cm x 22 cm2(fig.6).Au début la solution-tampon est une solution 0,1-molàire d'acétate d'ammonium d'un pH de 4,5. La vitesse de traversée est dé 110 cm3 par heure. Le volume des fraction* éludes est de 35 à 40 cm3. Ajustement au gradient   d'élutioh   avec une chambre de mélange de.4 litres et une solution-tampon   1,79-molaire   d'acétate d'ammonium d'un pH de 4,70 pour la fraction N  90. 
 EMI63.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Fraction <SEP> N  <SEP> Poids <SEP> Substances
<tb> en <SEP> mg <SEP> renfermées
<tb> 283-300 <SEP> 302 <SEP> Chlorhydrate <SEP> de
<tb> ferri-oxamine <SEP> A
<tb> 301-325 <SEP> 488 <SEP> Ferri-oxamine <SEP> B <SEP> +
<tb> chlorhydrate <SEP> de <SEP> ferrioxamine <SEP> A
<tb> 326-352 <SEP> 393 <SEP> :
<tb> Substances <SEP> non <SEP> caracté-
<tb> 353-385 <SEP> 452 <SEP> :
<tb> risées <SEP> plus <SEP> en <SEP> détail
<tb> 416-445 <SEP> 415
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 64> 

 
Le chlorhydrate de la ferri-oxamine A est une poudre   rouge-brun   qui se dissout bien dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, l'acide acétique glacial et le   diméthy-   formamide. Il est insoluble dans l'éther, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le chloroforme.

   Dans le   ayatème   solvant I, la valeur de Rf est de 0,35, et elle est de 0,21 dans le   système   solvant V (cf. tableau 1). Dans la système VI, le coefficient de répartition est de 0,111 (cf. tableau 1). 
 EMI64.1 
 



  En ce qui concerne l'éleetrophorbea sur papier, cf. fig. 5. Micro-analyse : C 44,21 %, H 7,52 %, N 12,63 %, Fe 7,95
Cl 5,93 %. 



  Titrage :pKMCS   s 9,89,   équivalent-poids -' 634. 
 EMI64.2 
 Spectre ultra-violet dans l'eau s max = 430 ny (E 1 cm * 37). 



  Pris dans le bromure de potassium, le spectre en infrarouge présente entre autres les bandes suivantes : (s = forte bande, m = bande moyenne, w = faible bande) : 
 EMI64.3 
 2,92 la (a) f 3r42 (m), 6,io fl (s) f 6s32 (a) i S.8$ (m) 7,30 p (w) : 7, f12 P (w) J 8,10 f (w) J 8,49 P (w) ; J 8,98 P %lw) 9,55 r (w) = 10,15 u (w) ; 10,67p (w) (cf. fig. 11). 



   La ferri-oxamine A donne une réaction positive avec la ninhydrine. La liaison du fer dans la ferri-oxamine A est éliminée du complexe lorsqu'on traite ce dernier par un acide minéral ou des alcalis forts. La ferri-oxamine A exempte de fer est incolore. Elle peut être reconvertie en ferri-oxamine A avec le chlorure ferrique. Elle réagit 

 <Desc/Clms Page number 65> 

 également sur d'autres ions métalliques en donnant lieu à la formation des complexes métallifères correspondants, par exemple à la formation du complexe cuprifère   verdàtre.   



   EXEMPLE 12 
Suivant le procédé décrit dans   l'exemple   11 (cf. fig. 7), on chromatographie 5 g de la fraction IV (cf. exemple 6) surune colonne de Dowex 50-WX2. Au début la solution-tampon est constituée par une solution décima-   laire   d'acétate d'ammonium d'un pH de 4,5. La vitesse de traversée est de 110 cm3 par heure. Le volume des fractions éludes est de 35 à 40 cm3.

   On ajuste sur le gradient d'élution avec une solution molaire d'acétate d'ammonium d'un pH de 4,6, pour la fraction 720, et avec une solution   bimolaire   d'acétate d'ammonium d'un pH de 4,7 pour la fraction 963 : 

 <Desc/Clms Page number 66> 

 
 EMI66.1 
 
<tb> 
<tb> Fractions <SEP> N  <SEP> Poids <SEP> en <SEP> mg <SEP> Substances <SEP> renfermées
<tb> 
 
 EMI66.2 
 
<tb> 
<tb> 34-46 <SEP> 135 <SEP> Substances <SEP> non-caractérisées <SEP> plus <SEP> en <SEP> détail
<tb> 54-68 <SEP> 226
<tb> 218-284 <SEP> --- <SEP> Substance <SEP> présentant
<tb> une <SEP> fluorescence <SEP> vertjaune, <SEP> non <SEP> isolée
<tb> 780-830 <SEP> 430 <SEP> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> la
<tb> ferri-oxamine <SEP> B
<tb> 860-900 <SEP> 194 <SEP> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> la
<tb> ferri-oxamine <SEP> C
<tb> 1034-1080 <SEP> :

   <SEP> 360 <SEP> Substance <SEP> non-caractérisée <SEP> plus <SEP> en <SEP> détail
<tb> 
 
La ferri-oxamine C présente des propriétés de solubilité à peu près identiques à celles de la ferrioxamine A. Dans le système solvant I, la valeur de Rf est de 0,54, et elle est de 0,37 dans le système solvant V (cf. tableau 1). En ce qui concerne l'électrophorèse sur papier, cf.   fig. 5 ;   dans le système VI, le coefficient de répartition est de 0,489 (cf, tableau 1). 



  Micro-analyse : C 48,33 %, H 7,92 %, N 10,20 %, Cl 5,15 %,
Fe 6,82 %. 



  Titrage :pKMCS 1 8,88 équivalent-poids : 762. 
 EMI66.3 
 



  Spectre ultra-violet dans l'eau slmaX = 430 (E 1 1 % cm = 39). Le spectre infra-rouge dans le bromure de potassium présente entre autres des bandes à :  2,92     (s) 3,43   (s) 5,85   
 EMI66.4 
 (m) 1 6,10 r (s) ; 6,33 r (s) J 6,87 P is) 7,30 fi (m) ; 

 <Desc/Clms Page number 67> 

 
 EMI67.1 
 7r (m) 1 8,23}J (w) # 8,52 la (m) J 9,65 f (w) i 13,23 la (m) i cf. fig. 12. 



   La ferri-oxamine C donne une réaction colorée positive avec la ninhydrine. La liaison du fer dans la ferri-oxamine C est éliminée du complexe lorsqu'on traite ce dernier par un acide minéral ou par des alcalis forts. 



   La ferri-oxamine C exempte de fer est incolore. On peut la reconvertir en ferri-oxamine C à l'aide de chlorure ferrique.
Elle réagit également sur d'autres ions métalliques en donnant lieu à la formation des complexes métallifères correspondants, par exemple la formation du complexe cuprifère   verdàtre.   



   EXEMPLE 13 , On soumet à un fractionnement préalable, sur une colonne de 150 cm x 79 cm2, 148 g de la fraction V (cf. exemple 6). On développe le chromatogramme, pour une vitesse de passage de deux à trois litres par heure, pendant
24 heures chaque fois, avec des solutions-tampons 0,1-molaire,
0,2-molaire et 0,6-molaire   dQacétate   d'ammonium d'un pH de 4,7, et pendant 100 heures avec une solution-tampon 1,8- molaire d'acétate d'ammonium d'un pH de 4,7. On recueille des fractions de 5 litres. Après avoir été rassemblées, les fractions 2 à 5 renferment surtout les ferri-oxamines D1, D2 et E (44 g), et les fractions 48 à 55 essentiellement de la ferri-oxamine F (8,4 $g). 

 <Desc/Clms Page number 68> 

 



  Rechromatographie des fractions 2 à 5 :
On chromatographie, dans les mêmes conditions que la fraction II, 5 g des fractions 2 à 5, mais sans gradient   d'élution   (cf. fig. 8). 
 EMI68.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Fractions <SEP> N  <SEP> Poids <SEP> en <SEP> mg <SEP> : <SEP> Substances <SEP> renfermées
<tb> 48-56 <SEP> 980 <SEP> Ferri-oxamines <SEP> D1 <SEP> et <SEP> D2
<tb> 66-80 <SEP> 989 <SEP> Ferri-oxamine <SEP> E
<tb> 
 
Dans 100 cm3 d'eau, on dissout le mélange (900 mg) de ferri-oxamine D1 et de ferri-oxamine D2 isolé avec un mélange de phénol et de chloroforme à partir des fractions 48 à 56, sature de chlorure de sodium et extrait à deux reprises avec le même volume de chloroforme. Après avoir séché sur du sulfate de sodium, l'extrait chloroformique abandonne par évaporation 697 mg de ferri-oxamine D1- On lave soigneusement la phase aqueuse avec du chloroforme et extrait ensuite avec un mélange de phénol et de chloroforme. En traitant l'extrait d'une manière usuelle, on obtient 95   mg   de ferri-oxamine D2.

   La   ferri-oxamine   D1 est bien soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, l'acide acétique glacial, le méthylcellosolve et le chloroforme, difficilement soluble dans l'éther, l'acétone, l'acétate d'éthyle, la pyridine et le diméthylformamide. Elle cristallise en aiguilles rouges dans un mélange de méthanol et d'éther. Après avoir été 

 <Desc/Clms Page number 69> 

 cristallisée à trois reprises, elle   fond à   194-200 . Dans le système solvant I, la valeur de Rf est de 0,73, et elle est de 0,72 dans le système solvant V (cf. tableau 1). 



  Dans le système VI, le coefficient de répartition est de 1,80 (cf. tableau 1). En ce qui concerne l'électrophorèse, cf. fige 5. 



  Micro-analyse :C 49,31 %, H 7,47 %,   N   12,37   %, Ci   0
Fe   7,66   %. 



  Titrage : On ne peut pas déceler de fractions acides ou basiques. 



    Spectre ultra-violet dans l'eau : #max = 430 my (E = 44). max 1 cm   Pris dans le bromure de potassium, le spectre infra-rouge présente entre autres des bandes à :  2,95     (s) ;3,06   
 EMI69.1 
 ils) ; 3,25 (w) i 3. r ts) 6,08 u (s) ! 6,86 u <a> ?su r (m), s Ts m) 8,20 p (wi 8,49 P (w) J 8,83 r (w) i 9. Y (w) J 9.65 P (w) 10,00 la (w) ; 10,31 (w) ; 10,67 r (w) ; I2,20 f (w) ; 1 13,30 P (m) (cf. fig. 13). 



  La ferri-oxamine   D ne   donne pas de réaction colorée avec la   ninhydrine.   La liaison du fer dans la ferri-oxamine D1 est éliminée du complexe lorsqu'on traite ce dernier par un acide minéral ou par des alcalis forts. La ferrioxamine D1 exempte de fer est incolore. Elle peut être reconvertie en ferri-oxamine D1 avec le chlorure ferrique. 



  Elle réagit également sur d'autres ions métalliques en donnant lieu à la formation des complexes métallifères 

 <Desc/Clms Page number 70> 

 correspondants, par exemple à la formation du complexe cuprifère   verdàtre.   



    Ferri-oxamine  D2 : Pris dans le bromure de potassium, le spectre infra-rouge présente entre autres des bandes à2,95   (s)   3,43     (m) ; 
 EMI70.1 
 6. Y zij 1 6#36 p ts) / 6,9O ? fa) 8,49 y (w) ; i 8.87 y (w) 9,65 p (w) 1 10,05 p (w) i 10,70 r (w) 13,22 p (w). 



  (cf. fig. 16). 



  Dans le système solvant I, la valeur de Rf est de 0,64, et elle est de 0,48 dans le système solvant V (cf. tableau 1). 
 EMI70.2 
 



  Pour ltdlectrophorèse sur papier, cf. fig. 5. 



  Ferri-oxamine E la ferri-oxamine E (898 mg) obtenue à partir des fractions 66 à 80 est soluble dans l'acide acétique glacial, difficilement soluble à insoluble dans la plupart des solvants,, notamment aussi dans l'eau et le méthanol. En recristallisant à deux reprises dans une grande quantité d'un mélange d'eau et d'acétone, on obtient une poudre micro-cristalline. 



  Dans le système I, la valeur de Rf est de 0,68, et elle est de 0,59 dans le système V. 



  Pour l'électrophorèse sur papier, cf. fig. 5. Bans le système VI, le coefficient de répartition est de 1,59 (cf. tableau 1). 



  Micro-analyse :: C 49,80 %, H   7,37   %, N 12,48 %, Cl 0 %,
Fe 8,14 %. 

 <Desc/Clms Page number 71> 

 Titrageon ne peut pas déceler de fractions acides ou basiques. 
 EMI71.1 
 Spectre ultra-violet dans l'eau Àmax :1 430 ny (E i m =: 42). 



  Pris dans le bromure de potassium, le spectre infra-rouge présente entre autres des bandes à s 2,92 p (s) ; 3,02 Y (s) ; 3,4 P Ca) 5 p 96 (s) ; 6.15 Es) ; 6,36 (s) < 6,90 (a) 7,10 p (m) i 7,15 (m) ; 1 7,39 p (m) ; J 7,82 f (w) ; J 7,98 (m) 8945 p (w) 8,54 u tw) J 8,85 f (w) ; 9,01 u (w) ; i 9.20 (w) 9,98 p (m) l 10,07p Eal) ; 10,23 r (w) ; 10,43 f (w) ; # lu,71 JJ (w) ;' 11,87 ,t (w) i 13g,20  (m) J 13,66 P (w) (cf. fig. 14).   '*-La   ferri-oxamine E ne donne pas de réaction colorée avec la   ninhydrine.   La liaison du fer dans la ferri-oxamine E est éliminée du complexe lorsqu'on traite ce dernier par un acide minéral ou par des alcalis forts. La ferri-oxamine E exempte de fer est incolore. Elle peut être reconvertie en ferri-oxamine E avec le chlorure ferrique.

   Elle réagit également sur d'autres ions métalliques en donnant lieu à la formation des complexes métallifères correspondants, par exemple à la formation du complexe cuprifère verdâtre. 



  Rechromatographie des fractions 48 à 55 :
Dans les mêmes conditions que les fractions 2 à 5 (voir ci-dessus), on rechromatographie 5 g des fractions 48 à 55. Au début, la solution-tampon est une solution 0,5-molaire d'acétate d'ammonium d'un pH de 4,7. Ajustement 

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 au gradient dilution avec une chambre de mélange de 4 litres et apport d'une solution-tampon   biaolaire   d'acétate d'ammo-   nium   d'un pH de   4,7 à   la fraction 663 (cf. fig. 9). Les fractions 821 à 880 renferment 1,12 g d'une matière constituée surtout par de la ferri-oxamine F. Pour purifier davantage cette matière, on la soumet dans le système n-butanol/ .au , une répartition à contre-courant en 20 stades suivant Craig (10/10 cm3).

   On extrait ensuite les contenus des éléments avec chaque fois 80 cm3 d'éther de pétrole, jette les phases obtenues à l'éther de pétrole et lyophilise les raffinats aqueux. On répète la répartition (30 stades) avec la matière (570 mg) obtenue à partir des éléments 1 à 4. A partir de l'élément 5, on obtient sous la forme d'une poudre   rouge-brun   64 mg de chlorhydrate de la ferri-oxamine F, composé qui s'avère unitaire lors d'une chromatographie sur papier. Le chlorhydrate de la ferri-oxamine F est bien soluble dans l'eau, le méthanol, la pyridine, l'acide acétique glacial, l'éthanol, le diméthylformamide, peu soluble dans le chloroforme, insoluble dans l'acétate d'éthyle, l'acétone et l'éther. 



  Micro-analyse : C 50,44 %, H 7,29 %, N 10,53 %, Cl 4,10 %,
Fe 5,57 %. 



  Dans le système solvant V, la valeur de Rf est de 0,80 (cf. tableau 1). Dans le système VI, le coefficient de répartition est de 3,12 (cf. tableau 1). En ce qui concerne 

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 l"lectrophorlt.8, cf. fig. 5. 



  Titrai 8 p!<tcs 9,?5, équivalent-poids " 695. Pris dans le bromure de potassium, le spectre infra-rouge présente entre autres des 'bande8 à 2,95 r (s) ; 3,45 u (m) 1 6,10 P i 1 6,37 JI isy ; 6r Y (m) 1 7,40 JI iw) 7,97 ju iw> , B.50 (w) t 8,88 (w) 9,72 (w) J 10,10 r tw) 10,70 y w) t 13,75 u (w) (cf. fig. 15). 



  Spectre ultra-violet dans l'eau : ax = 430 my (E 1 m m 34). 



  La ferri-oxamine F donne une réaction positive avec la ninhydrine. La liaison du fer dans la ferri-oxamine F est éliminée du complexe lorsqu'on traite ce dernier par un acide minéral ou par des alcalis forts. La ferri-oxamine F exempte de fer est incolore. Elle peut être reconvertie en ferri-oxamine F avec le chlorure ferrique. Elle réagit également sur d'autres ions métalliques en donnant lieu à la formation des complexes métallifères correspondants, par exemple à la formation du complexe cuprifère verdâtre. 



   EXEMPLE 14 
Dans un litre de méthanol, on met en suspension 100 g de levain frais et agite vigoureusement pendant 30 minutée. On filtre la suspension et concentre la solu- 
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 tion m6thanolique sous vide jusqu'à 200 cm3. On ajoute à ce concentrât 200 cm3 d'eau et clarifie la solution par 
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 filtration ou eentrifugstion. La solution clarifiée est extraite à trois reprises avec un mélange de chloroforme 

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 et de phénol (une partie en volume de chloroforme, une   partie   en poids de phénol).   Apres   avoir réuni les phases organiques. on y ajoute peu d'un auxiliaire de filtration   (Hyflo     Supercel),   puis, tout en agitant constamment, on ajoute à cette suspension un excès d'éther.

   La ferrioxamine brute qui a précipité est séparée conjointement avec l'auxiliaire de filtration, lavée à l'éther et séchée. 



  Les ferri-oxamines sont extraites de l'auxiliaire de filtration par élution avec du méthanol. On évapore la solution méthanolique de façon ménagée sous vide, les ferri-oxamines étant obtenues sous la forme d'une résine active de teinte brun-rouge qui peut être purifiée par chromatographie sur papier. 



   On obtient les préparations d'une teneur aussi élevée en   ferri-oxamines   en traitant comme décrit ci-dessus, non pas du levain, mais un extrait de levure du commerce, du moût de bière exprimé ou des cultures fraîches de levure. 



   EXEMPLE 15 
Dans une solution nutritive de la composition indiquée ci-après, on cultive à 24  l'algue verte qu'est 
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 le araydoJlOD08a. euqametos 1 
 EMI74.2 
 
<tb> 
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb> K2HPO4 <SEP> 1,25 <SEP> g <SEP> 
<tb> urée <SEP> 1,05 <SEP> g <SEP> 
<tb> eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb> 
 
 EMI74.3 
 solution d'ëlëments-traeas 10 cm3 

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 Pour 1000 cm3, la solution dtéléments-traces renferme CaCl2 80,35 9 N2Mo04 0,719 H3803 11,42 9 CuS04 5 H20 1,7 q l'sS04 , 9 7H20 4,98 9 Co(N03)2 6 B20 0,49 g ZnS 4 ' '1H20 8,82 g ttKomplexon III- 3 9 IInCl,2 , 4ïLZ0 1,44 g 
La solution nutritive est stérilisée dans les récipients de culture pendant 20 à 30   minutes   sous une pression d'une atmosphère effective.

   L'ensemencement a lieu avec jusqu'à 20 % d'une culture immergée. Les cultures sont constamment aérées dans des récipients à agitation de 4 litres avec 1/4 volume d'air par volume de solution et par minute.   Apres   avoir cultivé pendant 4 à 12 jours en irradiant constamment, on traite les cultures qui sont d'un vert intense. Sans filtrer les cultures, on y ajoute 2 % d'alumine, par exemple de frankonite, puis mélange vigoureusement. On filtre la suspension en ajoutant un auxiliaire de filtration et ajoute à nouveau à la solution 2 % d'alumine, agite et filtre.

   Après avoir réuni les résidus de filtration, on les lave avec de l'eau et du méthanol, puis élue ensuite avec un mélange de pyridine et d'eau   (lt4).   Le mélange azéotropique est concentré sous vide et les ferri-oxamines sont isolées des concentrats par un séchage par réfrigération. Les préparations brunrouge peuvent être davantage enrichies de la manière 

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 indiquée ci-dessus. 



   EXEMPLE 16 
Dans un presse-fruits, on extrait le jus de jeunes planta de tomates d'une hauteur de 50 cm environ. En extrayant à trois reprises avec de l'acétate d'éthyle, on débarrasse un litre de jus de la chlorophylle qu'il renferme. 



  On ajoute à la phase aqueuse brune 290 g de sulfate d'ammonium, filtre la solution obtenue et l'extrait ensuite à trois reprises avec de l'alcool benzylique. Après avoir réuni les phases organiques, on les sèche en y ajoutant du sulfate de sodium, puis ajoute un excès d'acétate d'éthyle. On lave avec de l'éther le précipité formé et le reprend ensuite dans peu d'eau. En procédant à un séchage par réfrigération, on obtient finalement une préparation active de ferri-oxamine qui peut être traitée comme indiqué dans les exemples précédents. 



   On obtient des préparations d'une activité identique en utilisant, à la place de plants de tomates, des feuilles de Rheoe discolor. 



   EXEMPLE 17
La culture du Bacillus subtilis est effectuée suivant le procédé de culture immergée. On utilise une solution nutritive renfsrmant, par litre d'eau du robinet, 10 g de glucose brut, 5 g de peptone, 3 g d'extrait de 

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 Viande, 5 g de chlorure de sodium et 10 g de chaux. On incube les cultures à 33-37 , en faisant passer de l'air et en secouant ou en agitant   constamment.   Après 48 à 96 heures d'incubation, on ajoute aux cultures, sans les filtrer, 2 %   d'alumine,     (frankonite),   agite de façon in-   tensive   et clarifie enauite par filtration ou centrifugation.

   On lave le sédiment avec du méthanol et élue ensuite avec un mélange de pyridine et d'eau (1:4).   L'éluat   renferme la majeure partie des ferri-oxamines qui sont isolées comme décrit ci-dessus. 



   EXEMPLE 18 
Ampoules sèches (lyophilisées) 
 EMI77.1 
 
<tb> 
<tb> ferri-oxamine <SEP> B <SEP> 100,0 <SEP> mg
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> stérile <SEP> 1,0 <SEP> cm3
<tb> 
 
On dissout la   ferri-oxamine   dans de l'eau distillée   stérile,   filtra la solution dans des conditions stériles et la place dans des conditions aseptiques dans des ampoules 
 EMI77.2 
 stérila renfersaant au total 5,0 mg de substance active par cm3. On congèle ensuite la solutinn et sèche le tout à l'état congelé sous un vide poussé. Le remplissage des appareils et la fermeture des ampoule. ont lieu dans'des conditions aseptiques et à l'abri de l'humidité. 



   La préparation lyophilisée est soluble dans l'eau et elle présente un pH d'une valeur de 4,3 environ.

Claims (1)

1. Revendications -------------- I.- Un procédé de préparation des ferri-oxamines, de leurs dérivés et produits de scission, ainsi que des sels de ces composée, ledit procédé étant caractérisé par le fait qu'on isole les nouvelles substances actives à partir d'organismes végétaux au de leurs extraits, en tenant compte des propriétés chimiques et physiques des ferri-oxamines et en utilisant le test antisidéramycinique et, si on le désire, qu'on prépare des sels, des dérivés ou des produits de scission de ces composés.

   Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants : 1) A partir d'extraits de monocotylédones ou de dicotylédones ou de cultures d'algues, de levures, de bacilles ou de streptomycètes, on isole les ferri-oxamines A, B, C, D1, D2, E, F, ou un mélange de composants élémen- taires, par adsorption, extraction, précipitation, cris- tallisation, lyophilisation, répartition entre des sol- vants, chromatographie et/ou électrophorèse, en contrôlant à l'aida du test antisidéramycinique la présence des ferri- oxamines dans la matière de départ et aux différentes opérations de traitement. <Desc/Clms Page number 79>

   2) On utilise comma matière de départ : a) des cultures de streptomycètes. b) des cultures de Streptomyces griseoflavus EMI79.1 (Krainslcy) de Wat8llal1 et Henrici. c) des cultures de Streptomyces griseoflavus (Krainsky) de Waksman et Henrici A 9578. d) des cultures de Streptomyces lavendulae (Waksman et Curtis) de Waksman et Henrici. e) des cultures de Streptomyces pilosus NRRL 2857. EMI79.2

   3) On isole les ferri-oxamines : s f) par adsorption à l'aide de charbon actif, de terres activées ou d'adsorbants résineux. g) par adsorption à l'aide de frankonite. EMI79.3 4) On 'util!... COl8D8 liquide d'élution, un solvant organique miscible à l'eau ou un mélange aqueux dudit solvant.

   5) On adsorbe les ferri-oxaminea à l'aide d'un échangeur d'ions faiblement acide renfermant des groupes carboxyliques, et les isole de ce dernier à l'aide d'un agent d'élution acide.

   6) On utilise comme échangeur d'ions le Dowex 50-WX2 7) On élue avec une solution-tampon 0,2- à 2,0- molaire d'acétate d'ammonium d'un pH de 4,5 à 4,6.

   8) On extrait les ferri-oxamines avec des solutions de phénol dans le chloroforme. <Desc/Clms Page number 80>

   9) On fait vari3:' la teneur en phénol de la solution chloroformique.

   10) On fait varier la valeur du pH de la solution résineuse.

   11) On répartit les ferri-oxamines entre deux phases solvantes non-miscibles.

   12) La phase organique renferme de l'alcool benzylique.

   13) On effectue la répartition entre la phase supérieure et la phase inférieure (1:1) dans le système n-butanol (100) - alcool benzylique (200) - acide chlorhydrique normal (6) - eau (300) - solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (60).

   14) On enrichit les ferri-oxamines à 1 aide d'une électrophorèse effectuée sous haute-tension.

   15) On effectue l'électrophorèse haute-tension suivant le principe du contre-courant.

   16) On combine mutuellement de la manière convenable les méthodes d'isolement et de traitement indiquées sous 3), f) et g), et 4) à 15).

   II.- A titre de produits industriels nouveaux 17) Les ferri-oxamines A, B, C, D1, D2, E et F, leurs produits de scission. leurs sels et leurs dérivés, ainsi que les mélanges de ces composés. <Desc/Clms Page number 81>

   18) Les chlorhydrates des ferri-oxamines A, B, C et F.

   19) Les sulfates des ferri-oxamines A, B, C et F.

   20) Les phosphates des ferri-oxamines A, B. C et F.

   21) Les pantothénates des ferri-oxamines A, B, C et F.

   22) Les préparations pharmaceutiques renfermant les ferri-oxamines A, B, C, D1, D2, E F, leurs composante, leur* produite de scission, leurs sels, leurs dérivés, ou des mélanges de ces composé