Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych ryfamycyn na drodze fermentacji wywola¬ nej przez mutanty szczepu Streptomyces mediter- ranei na wodnej pozywce wzrostowej w obecnosci tlenu.W niniejszym opisie te nowe ryfamycyny ozna¬ czono jako ryfamycyne P, ryfamycyne Q, ryfa¬ mycyne R i ryfamycyne U.We wczesniejszych pracach stwierdzono, ze w czasie fermentacji na normalnej pozywce wzrosto¬ wej, wywolanej przez drobnoustroje ze szczepu Streptomyces mediterranei wytwarzana jest gru¬ pa antybiotyków, lacznie okreslona jako zespól ryfamycyn P..i(Sensi i wspólpracownicy, Antibioties Annual 1959—1960, strona 262). Autorzy nastepnej pracy stwierdzili, ze dodanie soli sodowej estru dwuetylowego kwasu barbiturowego do podloza hodowlanego, powoduje wytworzenie zasadniczo pojedynczego produktu fermentacji, to znaczy ry¬ famycyny B (Margalith P. i Pagani H., Applied Microbiology, 9, 325, H961). Zgodnie z nastepnym odkryciem stwierdzono, ze mutanat szczepu Strep¬ tomyces mediterranei wytwarza wylacznie ryfamy¬ cyne B, niezaleznie od obecnosci lub nieobecnosci soli sodowej estru dwuetylowego kwasu barbitu¬ rowego w podlozu fermentacyjnym. Dalo to ule¬ pszony sposób wytwarzania ryfamycyny B. Szczep drobnoustrojów, produkujacych ryfamycyne B, o- kreslono jako Streptomyces mediterranei ATCC 21789. (patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 3 871965).Nowa substancje antybiotyczna, sposobem we¬ dlug niniejszego wynalazku wytwarza sie za pomo¬ ca fermentacji, wywolanej przez zmutowany szczep, uzyskany ze szczepu Streptomyces medi¬ terranei ATCC 13685, prowadzonej w warunkach tlenowych, w obecnosci przyswajalnego zródla we¬ gla, azotu i niezbednych soli mineralnych.Nowe zmutowane szczepy, stosowane w sposo¬ bie wedlug wynalazku, uzyskuje sie za pomoca dzialania na szczep ATCC 13685 zwykle stosowa¬ nymi chemicznymi czynnikami mutagennymi, ta¬ kimi jak kwas azotowy lub pochodne nitrozogu- anidyny lub tez za pomoca dzialania fizycznymi czynnikami mutagennymi, takimi jak promienie Roentgena lub promienie nadfioletowe.Nowy zmutowany szczep okresla sie jako przy¬ nalezny raczej do rodzaju Nocardia, niz do ro¬ dzaju Streptomyces mediterranei, zgodnie z pro¬ pozycjami Thiemanna i jego wspólpracowników, ogloszonymi w Arch. Mikrobiol., 67, 147—155,i(1969).Izolacje zmutowanych szczepów, wytwarzajacych nowe ryfamycyny, przeprowadza sie nastepujaco: zawiesine zarodników Streptomyces mediterranei ATCC 13685 poddaje sie w ciagu 60 minut w temperaturze 28°C dzialaniu N-metylo-N'-nitro-N- -nitrozoguanidyny o stezeniu 1 mg/ml, przy war¬ tosci pH równej 9,0, uzyskanej za pomoca buforu trój(hydroksymetylo)aminometanowego. Nastepnie zarodniki przemywa sie i umieszcza na plytkach Petriego, zawierajacych agar Bennetta. 97 7883 97788 4 W ciagu 14 dni przeprowadza sie inkubacje w temperaturze 28°C, nastepnie wybiera sie kolonie i bada ich zdolnosci do hamowania wzrostu drob¬ noustrojów Bacillus subtilis. Badanie to przepro¬ wadza sie nastepujaco: Plytke agaru (srednica 4—8 mm), przenoszaca po¬ jedyncza kolonie, umieszcza sie na plytoe Petrie- go, zawierajacej agar Penaszaya o wartosci pH = = 7,2, uprzednio zaszczepiony #Vo (objetosc/obje¬ tosc) szczepem Bacillus subtilis.W podanych powyzej warukach ryfamycyna B praktycznie nie wykazuje aktywnosci i normalne kolonie drobnoustrojów, wytwarzajacych ryfamy- cyne B, nie hamuja wzrostu drobnoustrojów Ba¬ cillus subtilis w opisanym agarze. Tymczasem ja¬ kakolwiek kolonia drobnoustrojów, wytwarzaja¬ cych nowe ryfamycyny o aktywnosci przeciwbak- teryjnej, wywoluje wyraznie odciete strefy zaha¬ mowania wzrostu drobnoustroju Bacillus subtilis wokól plytek agaru. Sposobem, opisanym wyzej, wyizolowano trzy szczepy drobnoustrojów i wedlug kodu wewnetrznego oznaczono je jako D — 2, MM 18 — 6, oraz M — 36. Próbki tych trzech drobnoustrojów zlozono w ATCC, gdzie sa one o- kreslone odpowiednio jako Nocardia mediterranea ATCC 31064, Nocardia mediterranea 31065 i No¬ cardia mediterranea ATCC 31066.Ponizej przedstawiono charakterystyki nowych szczepów Nocardia mediterranea, stosowanych w sposobie wedlug wynalazku. W tablicy I zestawio¬ no wyniki makroskopowego i mikroskopowego ba¬ dania szczepów Nocardia mediterranea, okreslo¬ nych odpowiednio jako ATCC 31064, 31Ó65, 31066.W tablicy II przedstawiono charakterystyki ho¬ dowlane wymienionych powyzej szczepów Nocar¬ dia mediterranea. Przedstawiono takze charakte¬ rystyki szczepu rodzicielskiego, to znaczy szczepu Streptomyces mediterranei ATCC 13685 (ME/83).Sposób prowadzenia fermentacji zasadniczo po¬ lega na hodowli jednego z wymienionych muta¬ ntów szczepu Streptomyces mediterranei, prowa¬ dzonej na pozywce, zawierajacej przyswajane zró¬ dla azotu i wegla oraz niezbedne sole mineralne, dotad az uzyska sie znaczna wartosc aktywnosci przeciwbakteryjnej wymienionej pozywki, po czym ryfamycyny ekstrahuje sie z podloza.Bardziej szczególowo, mutanty hoduje sie w cza¬ sie mieszania w warunkach napowietrznej fer¬ mentacji glebinowej w temperaturze w zakresie od 25 do 37°C, korzystnie w temperaturze 28°C.Jako zródla wegla stosuje sie nastepujace weglo¬ wodany i pochodne wegla: glikoza, galaktoza, lak¬ toza, sacharoza, maltoza, gliceryna, mannitol i tym podobne. Uzytecznymi zródlami azotu sa na przyklad aminokwasy i ich mieszaniny, peptydy, bialka i ich hydrolizaty, jak pepton, ekstrakt droz¬ dzowy, maka sojowa, roztwór uzyskany przez na¬ moczenie ziarn kukurydzy, wyciag z ryb, ekstrakt z miesa, wyciag wodny z ziarn zboza. Fermenta¬ cje prowadzi sie w ciagu 180—220 godzin.Wartosc pH pozywki zwykle poczatkowo dopro¬ wadza sie do wartosci 6,4—6,6, a w czasie fermen¬ tacji wzrasta ona do 7,0—8,5. Najlepsze wyniki uzyskuje sie zazwyczaj, prowadzac fermentacje w ciagu 200 godzin. Po zakonczeniu fermentacji ry¬ famycyny mozna izolowac nastepujaco: pozywke fermentacyjna saczy sie przy koncowej wartosci pH równej 7,0—8,5, przesacz szybko zakwasza sie, korzystnie do wartosci pH nizszej niz okolo 5, w celu zapewnienia warunków najwiekszej stabil¬ nosci substancji antybiotycznych i substancje te nastepnie ekstrahuje sie za pomoca rozpuszczal¬ ników niemieszajacych sie z woda, takich jak chloroform, butanol, octan etylu, octan propylu, octan butylu lub octan amylu. Stosunek objetosci podloza do objetosci rozpuszczalnika zmienia sie zaleznie od rodzaju rozpuszczalnika i zwykle sto¬ suje sie stosunek o wartosci od 2:1 do 10:1.Poniewaz grzybnia zatrzymuje pewne ilosci sub¬ stancji o aktywnosci mikrobiologicznej, dlatego poddaje sie ja ekstrakcji za pomoca rozpuszczal¬ nika niemieszajacego sie z woda, po czym ekstrakt laczy sie z warstwa organiczna, zawierajaca wie¬ kszosc ryfamacyn. Ewentualnie ekstrakcje akty¬ wnych substancji z grzybni mozna przeprowadzac za pomoca rozpuszczalnika mieszajacego sie z wo¬ da, takiego jak aceton. W tym przypadku ciecz odsacza sie, z przesaczu oddestylowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem aceton, z pozostalosci ekstrahu¬ je sie ryfamycyny za pomoca rozpuszczalnika nie¬ mieszajacego sie z woda, po czym postepuje sie, jak opisano poprzednio.Wiekszosc substancji o aktywnosci przeciwbak¬ teryjnej przeprowadza sie do rozpuszczalnika, któ¬ ry nastepnie oddestylowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem do sucha, korzystnie w temperaturze nizszej niz 30°C.Surowy produkt, zawierajacy ryfamycyny, moz¬ na oczyszczac za pomoca chromatografii kolum¬ nowej na zelu krzemionkowym. Przed chromato¬ grafia surowy produkt dogodnie rozpuszcza sie w buforze fosforanowym o wartosci pH równej 40 7,0—8,0, po czym poddaje sie dzialaniu lagodnego czynnika utleniajacego. Nastepnie roztwór w bu¬ forze poddaje sie ekstrakcji za pomoca rozpu¬ szczalnika niemieszajacego sie z woda. Uzyskany ekstrakt organiczny zawiera nowa ryfamycyne, na- 45 zwana ryfamycyna R.Roztwór buforowy po ekstrakcji zakwasza sie do wartosci pH = 2,4, po czym ekstrahuje rozpu¬ szczalnikiem niemieszajacym sie z woda. Uzyska¬ ny ekstrakt zawiera trzy nowe zwiazki z grupy 50 ryfamycyn nazwane ryfamycyna P, ryfamycyna Q i ryfamycyna U.Dalsze oczyszczanie surowej ryfamycyny R prze¬ prowadza sie za pomoca chromatografii na ko- „ lumnie, wypelnionej odpowiednim materialem ad- 55 sorbujacym, takim jak zel krzemionkowy, stosu¬ jac jako eluat odpowiednia mieszanine rozpusz¬ czalników organicznych.Drugi ekstrakt organiczny, zawierajacy ryfa- 60 mycyny P, Q i U, oczyszcza sie sposobem identy¬ cznym, jak opisano dla ryfamycyny R.Ponizej przedstawiono fizykochemiczne charak¬ terystyki nowych ryfamycyn P, Q, R i U, wytwo¬ rzonych sposobem wedlug wynalazku. 65 Ryfamycyna P. Analiza elementarna:97788 6 Znaleziono: (•/o) — C = 60,6, H = 6,2, N=3,8, O = 25,2, S=4,l.Widmo w nadfiolecie i w swietle widzialnym wykazuje nastepujace pasma absorpcji: .1% l cm metanol X max/mw E x ( 406 197 350 (rozmyte) 297 344 257 423 224 550 0,1 n HC1 X max(niw) E ; (.^ 416 183 300 319 225 521 10 X ma°/« (m/u) 406 350' 297 257 224 2 F * % 178 (rozmyte) 305 405 518 Caly wykres widma przedstawiono na rysunku fig. 1. Widmo to wykonano za pomoca aparatu 15 Perkin Elmer Spectracord 4000 A.W widmie w podczerwieni najbardziej znaczace pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nujo- lu, stwierdzono dla nastepujacych czestotliwosci (cm-1): 3700—3150 (srednie, poszerzone), 3100 (sla- 20 be), 3060—2800 (bardzo silne), 1465 (silne), 1380 (po¬ szerzone) — nujal, 1722 (srednie), 1645 (srednie, po¬ szerzone), 1580 (srednie), 1510 (srednie), 1323 (sre¬ dnie), 1250 (silne, poszerzone), 1160 (srednie),. 1130 (slabe), 1070 (srednie, poszerzone), 1030 (slabe), 25 982 (srednie), 960| (srednie), 925 (slabe), 890 (srednie), 818 (slabe), 770 (slabe), 735 (slabe).Caly wykres widma w podczerwieni przedsta¬ wiono na rysunku fig. 2, Widmo to wykonano na aparacie Perkin Elmer Mod. 421.Jon masowy M+ w widmie masowym, uzyskany przy 70 eV ma wartosc stosunku — = 738. Wid- e mo to wykonano za pomoca aparatu Hitachi Perkin ElmerRMU-6L. 35 Cale widmo magnetycznego rezonansu jadrowego, wykonane przy czestotliwosci 100 MHz w CDC13, przedstawiono na rysunku fig. 3.Zwiazek nie wykazuje charakterystycznego dla ryfamycyn zachowania w polarografii, wywolane- 40 go chromoforowa grupa w chinonowej czesci cza¬ steczki.Ryfamycyna Q. Analiza elementarna: znaleziono: C = 60,7, H = 6,3, N= 3,60, 0=25,3 S=4,2. 45 Widmo z nadfiolecie w swietle widzialnym wy¬ kazuje nastepujace pasma absorpcji w metanolu: 50 55 W widmie w7 podczerwieni najbardziej znacza¬ ce pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nu- jolu, stwierdzono dla nastepujacych czestotliwos¬ ci (cm-1): 3700 3300 (silne, poszerzone), 3300—3080 (srednie, 60 poszerzone), 3040—2780 (bardzo silne), 1460 (silne), 1378 (silne) — nujol, 1740 (srednie), 1700 (srednie), 1650 (silne, poszerzone), 1605 (silne, poszerzone), 1555 (silne), 1510 (srednie, poszerzone), 1315 (sla¬ be), 1275 (srednie), 1240 (srednie), 1220 (srednie), 65 1160 (srednie), 1090 (srednie), 1050 (srednie, po¬ szerzone), 1020 (slabe), 970 (srednie), 945 (slabe), 910 (srednie), 808 (srednie), 765 (slabe), 720 (slabe).Cale widmo w podczerwieni przedstawiono na rysunku fig. 4.Cale widmo magnetycznego rezonansu jadrowe¬ go, wykonane przy czestotliwosci 60 MHz w CDCI3, przedstawiono na rysunku fig. 7.Ryfamycyna R. Analiza elementarna: znaleziono: C=62,0, H=6,4, N = 2,2, O=29,6.Widmo w nadfiolecie i w swietle widzialnym wykazuje nastepujace pasma absorpcji w 0,1 n roztworze chlorowodoru w metanolu: X max(nuO 219 281 340 410 X F 1 % 444 415 114 72 W widmie w podczerwieni najbardziej znaczace pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nujolu, stwierdzono dla nastepujacych czestotliwosci (cm-1): 3700—3100 (silne, poszerzone), 3040—2780 (bardzo silna), 1465 (silne), 1380 (silne) — nujol, 1745 (sil¬ ne), 1710 (srednie), 1640 (silne), 1600 (silne), 1505 (silne), 1415 (srednie), 1325 (silne), 1260 (silne, po¬ szerzone), 1220—1130 (silne, poszerzone), 1120 (sla¬ be), 1075 (silne), 1020 (slabe), 975 (silne), 950 (sla¬ be), 920 (slabe), 888 (srednie), 823 (srednie), 785 (slabe, poszerzone), 735 (slabe, poszerzone), 650 (slabe, poszerzone).Cale widmo w podczerwieni przedstawiono na rysunku fig. 5.Jon masowy M+ w widmie masowym, uzyska¬ ny przy 70 eV, ma wartosc stpsunku _ = 711. e Cale widmo magnetycznego rezonansu jadro¬ wego, wykonane przy czestotliwosci 60 MHz w CDCI3, przedstawiono na rysunku fig. 6.Zwiazek ten wykazuje charakterystyczne dla ry¬ famycyn zachowanie w polarografii, wywolane grupa chromoforowa w chinonowej czesci czastecz¬ ki.Powyzsze dane potwierdzaja wzór 1 dla ryfarriy- cyny R.Ryfamycyna U. Widmo w nadfiolecie i w swie¬ tle widzialnym wykazuje nastepujace pasma ab¬ sorpcji w metanolu: X max(ml«) 412 353 299 258 220 1 F 1% * ^ lem 163 (rozmyte) 265 389 451 W widmie w podczerwieni najbardziej znaczace pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nujolu', stwierdzono dla nastepujacych czestotliwosci (cm-1): 3700—3100 (srednie, poszerzone), 3060 (bardzo sla¬ be), 3040—2740 (bardzo silne), 2720 (bardzo sla-97788 8 be), 1460 (silne), 1378 (srednie) — nujol, 1750—1705 (srednie, poszerzone), 1680—1620 (srednie, posze¬ rzone), 1600 (silne), 1558 (silne), 1490 rzone), 1308 (slabe), 1270 (slabe, rozmyte), 1245 (srednie, rozmyte), 1225 (srednie), 1160 (srednie), 1120 (slabe), 1090 (bardzo slabe), 1070 (slabe), 1030 (bardzo slabe), 1020 (bardzo slabe), 1000 (bardzo slabe), 975 (slabe), 960 (slabe, rozmyte), 905 (sred¬ nie), 850 (srednie), 802 (slabe), 800 (bardzo slabe), rozmyte), 777 (bardzo slabe), 760 (bardzo slabe), 720 (bardzo slabe), 685 (bardzo slabe), 670 (bardzo slabe).Aktywnosc biologiczna nowych ryfamycyn, otrzy¬ manych sposobem wedlug wynalazku, przedsta¬ wiono w tablicach V i VI.Zakres przeciwbakteryjnego dzialania in vitro ryfamycyn P, Q i R przedstawiono w tablicy V.Nowe zwiazki, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, wykazuja takze aktywnosc dzialania w próbach, przeprowadzonych na laboratoryjnych zwierzetach, zakazonych szczepami Staphylococcus aureus i Escherichia coli.W tablicy VI przedstawiono wyniki reprezenta¬ tywnych doswiadczen, przeprowadzonych na my¬ szach, w których porównywano dzialanie zwiaz¬ ków, wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku i znanej ryfamycyny naturalnej, to znaczy ryfa¬ mycyny SV.Najwieksza aktywnosc dzialania wykazuje ry- famycyna P, która charakteryzuje sie takze niska toksycznoscia, poniewaz uzyskana dla niej wartosc ED50 dla myszy jest wyzsza niz 500 mg/kg po podaniu dootrzewnowo.Sposób wedlug wynalazku jest blizej przedsta¬ wiony w przykladach.Przyklad I. Zmutowany szczep, oznaczony jako Nocardia mediterranea ATCC 31064, inkubu- je sie w ciagu 6—8 dni na agarze Bennetta w temperaturze 28°C. Hodowla, uzyskana na skosie agarowym, inokuluje sie dwie kolby Erlenmeyeaa o pojemnosci 500 ml przy zachowaniu jalowych warunków. • Kolby zawieraja po 10.0 ml pozywki wegetaty¬ wnej o nastepujacym skladzie: Ekstrakt z wolowiny 5 g Ekstrakt z drozdzy 5 g Pepton 5 g Hydrolizat kazeiny 3 g Glikoza 20 g NaCl 1,5 g woda ilosc uzupelniajaca do objetosc 1 litra Za pomoca wodorotlenku sodowego doprowadza sie wartosc pH pozywki do wartosci 7,3. Inokulo- wane kolby umieszcza sie na zmiennej wstrzasar- ce w temperaturze 28°C i wstrzasa w ciagu 72 go¬ dzin. Zawartosc tych dwu kolb uzywa sie jako inokulum i wylewa sie ja do wstepnego fermen- tora o pojemnosci 10 litrów, zawierajacego 4 li¬ try opisanej pozywki wegetatywnej. Inkubacje prowadzi sie w temperaturze 28°C, mieszajac za¬ wartosc fermentora z szybkoscia 300 obrotów na minute i przepuszczajac przez fermentor powie- trze z szybkoscia 1 objetosc powietrza na 1 obje¬ tosc pozywki w ciagu 1 minuty. Po 48 godzinach uzyskuje sie wzrost objetosci komórek do 7—10f/o calkowitej objetosci. W nastepnym etapie w szkla- nym fermentatorze o pojemnosci 10 litrów przy¬ gotowuje sie 4 litry pozywki fermentacyjnej o nastepujacym skladzie: Maka z orzechów ziemnych 25 g Makasojowa 5 g (NH4)2S04 9,5 g MgS04 • 7H20 0,85 g Glikoza 95 g Gliceryna 40 g KH2P04 1 g Glikolpropylenowy 5 g CaCOs 8,5 g Dwuetylobarbituran sodowy 1,7 g CuS04'5H20 2,8 mg FeS04 • 7H20 8,5 mg ZnS04 • 7H20 42,5 mg MnS04 • 4H20 3,4 mg CaCl2 • 6H20 1,7 mg (NH4)6M07O24 • 4H20 0,85 mg woda w ilosci uzupelniajacej do 1 litra. r **- Wartosc pH pozywki doprowadza sie do 7,8 za pomoca NaOH. Wyjalawianie prowadzi sie w tem¬ peraturze 120°C w ciagu 60 minut. Po wyjalowie- niu wartosc pH wynosi 6,4. Jako inokulum stosu¬ je sie 5f/o objetosci zawartosci fermentora wstep¬ nego.Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 28°C, stosujac mieszanie z szybkoscia 750 obrotów na minute i przepuszczanie powietrza z szybkoscia 1 objetosc powietrza na 1 objetosc pozywki w ciagu 1 minuty. Jako srodek przeciwko pienieniu stosuje sie silikon A. W czasie fermentacji brzeczka ho¬ dowlana przybiera charakterystyczna barwe czer- 40 wono-brazowa. Po 200 godzinach uzyskuje sie wzrost objetosci komórek w stosunku do calko¬ witej objetosci pozywki.Brzeczka przyjmuje wartosc pH = 7,5 i w tym momencie brzeczke poddaje sie procesowi izola- 45 cji.Przyklad II. Hodowle szczepu Nocardia me¬ diterranea ATCC 31064, przygotowana sposobem opisanym w przykladzie I, rozwija sie w kolbie podczas mieszania, sposobem identycznym, jak 50 opisany w przykladzie I. Uzyskana wstepna ho¬ dowle wylewa sie do szklanego fermentora o po¬ jemnosci 10 litrów, zawierajacego pozywke o na¬ stepujacym skladzie: Glikoza 5 g 55 Maka z orzechów ziemnych 7,5 g CaCos 1,65 g MgS04 • 7H20 0,33 g KH2P04 0,33 g FeS04 • 7H20 3,3 mg 60 ZnS04-7H20 16,5 mg MnS04-4H20 1,3 mg woda w ilosci uzupelniajacej do objetosci 1 litra.Wartosc pH calosci doprowadza sie do 7,5. Wy- 65 jalawianie przeprowadza sie w ciagu 50 minut w25 97788 9 temperaturze 120°C. Po wyjalowieniu pH przyj¬ muje wartosc 6,4. Hodowle prowadzi sie w ciagu 48 godzin, uzyskujac zwiekszenie objetosci komó¬ rek do 6—8°/t calkowitej objetosci pozywki. Uzy¬ skana hodowle w ilosci okolo 10°/o stosuje sie 5 jako inokulum dla szklanego fermentora o po¬ jemnosci 20 litrów, zawierajacego 10 litrów po¬ zywki fermentacyjnej o nastepujacym skladzie: Plyn uzyskany po namoczeniu kukurydzy 20 g Makasojowa 15 g 10 (NH4)2S04 6 g MgS04 • 7H20 0,85 g Glikoza 100 g KH2P04 lg CaC03 6 g 15 FeS04 • 7H20 8,5 mg ZnS04 • 7H20 42,5 mg MnS04 • 4H2Ó 3,4 mg CuS04 •5H20 2,8 mg CoCl2 • 6H20 1,7 mg M woda w ilosci uzupelniajacej do objetosci 1 litra.Wartosc pH calosci doprowadza sie do 7,8 za pomoca NaOH. Wyjalawianie przeprowadza sie w ciagu 50 minut w temperaturze 120°C. Po wyja¬ lowieniu wartosc pH wynosi 6,4. Fermentacje prze¬ prowadza sie w ciagu 200 godzin w temperaturze 28°C. Koncowa wartosc pH brzeczki fermentacyj¬ nej wynosi 7,5.Brzeczki fermentacyjne, uzyskiwane sposobami, opisanymi w przykladach I i II, oczyszcza sie na¬ stepujaco. Grzybnie odsacza sie i odrzuca, zas przesacz doprowadza sie do pH o wartosci 2,0 za pomoca KM (objetosc na objetosc) kwasu solnego i trzykrotnie ekstrahuje równymi objetosciami oc¬ tanu etylu. Z ekstraktu organicznego calkowicie od- destylowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem roz¬ puszczalnik w temperaturze 35°C i uzyskana po¬ zostalosc (4 g sposobem, opisanym w przykladzie I i 11 g sposobem, opisanym w przykladzie II), rozpuszcza sie w 0,05 molowym roztworze fosfo¬ ranu sodowego o pH = 7,5, po czym do roztworu dodaje sie azotyn sodowy w takiej ilosci, aby uzyskac koncowe jego stezenie 0,2V# (wagowo-ob- tf jetosciowych).Calosc miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 30 minut, po czym roztwór buforowy trzy¬ krotnie ekstrahuje sie równymi objetosciami octa¬ nu etylu. Z polaczonych warstw organicznych od- 50 destylowuje sie calkowicie rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 35°C i uzyskuje sie pierwszy ekstrakt z octanu etylu.Pozostaly po ekstrakcji roztwór buforowy dopro¬ wadza sie do pH = 2,0 za pomoca 10°/o kwasu 35 solnego i ponownie ekstrahuje trzykrotnie równy¬ mi objetosciami octanu etylu. Uzyskane ekstrakty laczy sie, oddestylowuje z nich rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 35°C i uzyskuje drugi ekstrakt z octanu etylu. 50 Suchy proszek po oddestylowaniu rozpuszczalni¬ ka z pierwszego ekstraktu w octanie etylu (1,4 g w przykladzie I i 4,2 g w przykladzie II) rozpu¬ szcza sie w chloroformie i chromatografuje na kolumnie, wypelnionej zelem krzemionkowym (70— 55 40 —230 mesh ASTM), stosujac jako eliient chloro¬ form, zawierajacy 2^/0 (objetosciowo-objetoscio- wych) alkoholu metylowego. W zebranym z kolum¬ ny eluacie wiekszosc stanowi ryfamycyna R, któ¬ ra rozpoznaje sie dzieki jej barwie pomaranczowo- -brazowej.Metoda chromatografii cienkowarstwowej, * przy uzyciu plytek, pokrytych zelem krzemionkowym (Merck 60 F254) i stosujac jako system rozwijajacy mieszanine chloroformu i alkoholu metylowego o skladzie 95:5 stwierdza sie, ze wartosc Rf dla ry¬ famycyny wynosi 0,59. Frakcje zawierajace ryfa¬ mycyne R laczy sie, calkowicie oddestylowuje z nich rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 35°C, pozostalosc ponownie roz¬ puszcza sie w octanie etylu, uzyskany roztwór przemywa sie 0,01 n roztworem kwasu solnego i na koniec woda.Z warstwy organicznej oddestylowuje sie roz¬ puszczalnik, az do uzyskania malej objetosci ste¬ zonego roztworu, z którego w temperaturze 4°C krystalizuje ryfamycyna R (uzyskuje sie 600 mg zwiazku sposobem wedlug przykladu I i 1,6 g zwiazku sposobem wedlug przykladu II). Drugi ekstrakt w octanie etylu oczyszcza - sie takze za pomoca chromatografii kolumnowej na zelu krze¬ mionkowym sposobem podobnym, jak stosowany dla ryfamycyny R. Sucha pozostalosc po oddesty¬ lowaniu octanu etylu (2,4 g w przypadku sposobu, opisanego w przykladzie I i 4,2 g w przypadku sposobu, opisanego w przykladzie II) rozpuszcza sie w chloroformie i nanosi na kolumne.Kolumne eluuje sie mieszanina chloroformu i alkoholu metylowego o skladzie 98,2. W pierwszej kolejnosci uzyskuje sie ryfamycyne U, nastepnie ryfamycyne P, zas na koncu ryfamycyne Q. Wszy¬ stkie te zwiazki charakteryzuja sie barwa zólto- -pomaranczowa i identyfikuje sie je za pomoca chromatografii cienkowarstwowej. Stosujac plytki z zelem krzemionkowym (Merck 60 F2g4), system rozwijajacy w postaci mieszaniny chloroformu i alkoholu metylowego o skladzie 95:5 uzyskuje sie nastepujace wartosci Rf: ryfamycyna U ryfamycyna P ryfamycyna Q Rf = 0,63 Rf = 0,57 Rf = 0,32 Odpowiednie frakcje, zawierajace ryfamycyne U, P i Q, laczy sie, oddestylowuje z nich rozpu¬ szczalnik pod zmniejszonym cisnieniem i uzyska¬ na sucha pozostalosc krystalizuje z octanu etylu.Stosujac brzeczke, otrzymana jak w przykladzie I, uzyskuje sie 80 mg ryfamycyny U, 400 mg ryfa¬ mycyny P, 280 mg ryfamycyny Q, zas stosujac brzeczke, otrzymana w przykladzie II, uzyskuje sie 190 mg ryfamycyny U, 900 mg ryfamycyny P, oraz 750 mg ryfamycyny Q.Stosujac sposób postepowania identyczny, jak opisany w powyzszych przykladach, oraz jako szczepy produkcyjne odpowiednio Nocardia me- diterrahea ATCC 31065 lub Nocardia maditerranea ATCC 31066 uzyskuje sie ryfamycyny z wydajno- sciami tego samego rzedu, jak opisano poprzed¬ nio.97788 11 12 PL PL PL PL PL