KR790001931B1 - 리파마이신의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

리파마이신의 제조방법

제 1 도는 리파마이신 P의 자외부 및 가시부 흡수 스펙트럼을 나타낸것이고,

제 2 도는 리파마이신 P의 IR흡수 스펙트럼을 나타낸것이고,

제 3 도는 리파마이신 P의 CDC1₃중에서의 NMR 흡수 스펙트럼을 나타낸것이고,

제 4 도는 리파마이신

의 IR 흡수 스펙트럼을 나타낸것이고,

제 5 도는 리파마이신 R의 IR 흡수 스펙트럼을 나타낸것이다.

제 6 도는 리파마이신 R의 CDC1₃중에서 NMR 흡수스펙트럼을 나타낸것이며,

제 7 도는 리파마이신

의 CDC1₃중에서의 NMR 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.

본 발명은 스트렙토마이세스 메디테라네이(Streptomyces mdeiterranei)의 돌연변이 균주를 호기성조건하 수용성 영양배지중에서 발효시켜 제조하는 새로운 리파마이신 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

이들 새로운 리파마이신들은 다음부터는 리파마이신 P. 리파마이신

, 리파마이신 R 및 리파마이신 U라고 말하겠다.

보통 생장배지중에서 발효시킬때 스트렙토마이세스 메디테라네이가 리파마이신 복합체로서 불리우는 항생제균을 합성하는 것은 이미 보고된바 있다. (P. 센시, 및 공동연구자, 안티바이오틱스 애뉴얼 1959-1960, 262페이지), 영양배지에 나트륨디에틸 바비튜레이트를 가할때 단일 발효생성물이 리파마이신 B가 생성됨도 보고되었다.

(마갈리스 P 및 파가니 H. 어플라이드 마이크로바이올로지, 9, 325, 1961), 좀더 연구한결과 스트렙토마이세스 메디테라네이 변이주는 발효배지중에 나트륨 디에틸 바비튜레이트가 존재하건 존재하지 않건간에 상관없이 리파마이신 B만을 생성함을 발견하였으며 리파마이신 B의 개량제조방법도 밝혀지게 되었다. 리파마이신 B 생성균주는 스트렙토마이세스 메디테라네이 ATCC 21789와 같다. (미국특허 3, 871, 965 호 참조)

본 발명은 스트렙토마이세스 메디테라네이 ATCC 13, 685로부터 얻은 돌연변이균주를 발효시켜 새로운 항생물질을 제조하는 것이다. 새로운 균주는 균주 ATCC 13, 685를 아질산이나 니트로소구아니딘 유도체 같은 통상의 화학돌연변이제로 처리하거나 X선이나 자외선같은 물리적인 돌연변이제로 처리하여 얻는다.

새로운 균주는 제이. 이. 치만등의 제안에 의하면 스트렙토마이세스 메디테라네이속보다는 노카르아 속에 속한다.

〔Arch. Mikrobiol., 67, 147-155(1969)〕

새로운 리파마이신을 생성하는 변이주의 분리

스트렙토마이세스 메디테라네이 ATCC 13,685의 포자의 현탁액을 pH 9.0인 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충액에 1mg/mℓ되도록 녹인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 28℃에서 60분간 처리한다.

다음 변이제처리 포자를 세척하고 베네트한천이 있는 페트리디쉬상에 놓은다음 28℃에서 14일간 배양시키고 살아있는 콜로니를 떼어내어 단 한개의 콜로니가 있는 한천디스크(직경 4-8㎜)를 바실루스섭틸리스로 2%(V/V)되게 미리 심은 pH 7.2인 펜아세이 한천이 있는 페트리디쉬에 옮긴다.

이러한 조건하에서 리파마이신 B는 실제로 불활성이며 리파마이신 B를 생성하는 보통 콜로니는 기본 한천내에서 바실루스 섭틸리스의 생장을 저해시키지 않는 반면에 항생작용이 있는 새로운 리파마이신을 생성하는 어떠한 콜로니도 한천디스크주위의 생장저해대가 분명히 끊겨져 있게된다. 이러한 방법으로 3개의 균주를 분리하고 본래 국내코드 D-2, MM 18-6 및 M-36이다. 이들 미생물의 샘플은 각각 노카르디아 메디테라네이 ATCC 31, 064, 노카르디아메디테라네이 ATCC 31, 065 및 노카르디아 메디테라네이 ATCC 31, 066으로서 수직되었다.

새로운 노카르디아 메디테라네이 균주에 대한 설명

표 1은 각각 ATCC No. 31, 064, 31, 065 및 31, 066인 노카르디아 메디테라네이 균주의 육안 및 현미경 조사 결과를 기록한 것이며 표2는 노카르디아 메디테라네이 균주의 배양특성을 기록한 것이다.

모균주 스트렙토마이세스 메디테라네이 ATCC 13, 685 (ME/83)의 특징도 기록되어 있다.

[표 1]

[표 2a]

[표 2b]

[표 2c]

셔링 및 고트리브 : 메쏘드포 캐랙티리제이션 오브 스트렙토마이세스 스페시스, Intern. J. Syst. Bact., 16, 313-338 (1966)

다음 표 3은 새로운 노카르디아 균주의 생리학적 특징을 모균주와 비교한 것을 기록한 것이다.

[표 3]

다음 표 4는 프리담 및 고트리브의 방법에 따라 조사한 탄소원 이용도를 기술한 것이다.

(J. Bact. 56, 107, 1948)

[표 4]

[발 효]

발효방법은 등화할수 있는 탄소 및 질소원과 필수적인 무기염류를 함유하는 영양배지중에서 기본량의 항생제가 배지중에 생길때까지 스트렙토마이세스 메디테라네이 균주중 하나를 배양하고 배지로부터 리파마이신을 추출하는 것이다. 더욱 특히 이들 균주를 25-37℃의 온도, 바람직하게는 28℃의 온도에서 교반하며 심부호기성 조건하에 배양시킨다.

탄소원으로서는 다음의 탄수화물 및 탄소유도체들 즉 글루코즈, 갈락토즈, 락토즈, 서당, 말토즈, 글리세롤, 만니톨등을 사용할 수 있다.

유효한 질소원은 예를들면 아미노산 및 그의 혼합물, 펩타이드, 단백질 및 그들의 가수분해물질로서 펩톤, 효모추출물, 대두밀, 옥수수즙액, 물고기가용물, 육즙, 곡식의 수용성물질등이다. 발효는 180-220시간 수행할수 있으며 일반적으로 6.4-6.6인 처음의 pH는 발효가 끝날때 7.0-8.5로 증가한다. 일반적으로 발효한지 200시간이 되었을때 가장 좋은 결과를 얻는다. 발효가 끝났을때 리파마이신은 다음과 같은 방법으로 분리할수 있다. 발효배지는 최종 pH 7.0-8.5에서 여과하고 여액을 재빨리 pH 5이하로 산성화시켜 항생물질을 최대로 안정화 시킨다.

항생물질을 클로로포름, 부타놀, 에틸, 프로필, 부틸 또는 초산 아밀같은 수불혼화성 용매로 추출한다. 배지의 량과 용매량의 비율은 선택된 용매에 따라 달라지며 일반적으로 2 : 1내지 10 : 1의 비율을 사용한다.

균사에는 아직 항생물이 남아있으므로 이것을 수불혼화성 용매로 추출한후 이미 대부분의 리파마아신을 함유하고 있는 유기물과 혼합한다. 변법으로는 아세톤같은 수화성 용매를 사용하여 균사로 부터 항생물질을 추출할수 있다. 이경우, 액체를 여과하고, 아세톤을 진공에서 증발시키고 리파마아신을 수불혼화성용매로 추출한후 전술한 바와같은 방법을 수행한다.

대부분의 항생물질이 용매로 이전하며 이것을 진공에서 바람직하게는 30℃이하의 온도에서 증류건고시킨다.

[정 제]

리파마이신 조추출물은 실리카겔컬럼상에서 크로마토그라피법으로 정제할 수 있다. 크로마토그라피하기에 앞서 조추출물을 pH70.-8.0인 인산염완충액에 녹이고 완화한 산화제로 처리하는 것이 편리하다. 다음 완충용액을 수불혼화성 용매로 추출하고 이 유기추출액은 리파마이신 R이라 불리우는 새로운 리파마이신을 함유한다. 추출된 완충용액을 pH 2-4로 산성화시킨다음다시 수불혼화성 용매로 추출한다. 이 유기추출액은 리파마이신 P,

및 U라 불리우는 리파마이신 군의 3가지 새로운 화합물 들을 함유한다.

리파마이신 R은 실리카겔같은 적당한 흡착제의 컬럼상에서 유기용매의 적당한 혼합물로 용출시켜 크로마트그라피법으로 더 정제한다.

리파마이신 P,

및 U를 함유하는 제 2 차 유기추출액은 리파마이신 R과 같은 방법으로 정제한다.

다음의 실시예는 본발명을 더욱더 설명한 것이다.

[실시예 1]

노카르디아 메디테라네이 ATCC 31, 064인 변이주를 베네트한천에서 6-8일간 번식시키고 28℃에서 배양시킨다.

사면한천으로부터 얻은 배양물을 넣은 두개의 500mℓ용 엘렌마이어홀라스크를 멸균조건하에서 배양시킨다. 홀라스크는 다음 조성물과 같은 생장성배지 100mℓ를 함유한다.

육즙 5g

효모추출물 5g

펩톤 5g

카제인가수분해물 3g

글루코즈 20g

NaCl 1.5g

물 1리터까지

pH는 수산화나트륨으로 7.3으로 맞춘다.

이렇게 배양한 훌라스크를 28℃에서 72시간 진탕기위에서 진탕시키고 두개의 엘렌마이어 훌라스크 내용물을 전술한 생장 배지 4리터가 들어있는 10ℓ들이 프리훠멘터에 접종시킨다. 300rpm으로 교반하며 1V/V/m 공기를 통하여 28℃에서 배양시킨다. 생장 48시간후에 충진세포는 7-10%생긴다.

다음단계에서 다음과 같은 발효배지 4ℓ가 들어있는 10ℓ용 초자발효기를 사용한다.

낙화생가루 25g

콩가루 5g

(NH₄)₂SO₄9.5g

MgSO₄7H₂O 0.85g

글루코즈 95g

글리세롤 40g

KH₂PO₄1g

푸로필렌글리콜 5g

CaCO₃8.5g

디에틸바비튜린산나트륨 1.7g

CuSO₄. 5H₂O 2.8mg

FeSO₄. 7H₂O 8.5mg

ZnSO₄. 7H₂O 42.5mg

MnSO₄. 4H₂O 3.4mg

CaCl₂. 6H₂O 1.7mg

(NH₄)₆Mo₇O₂₄4H₂O 0.85mg

물 1ℓ까지

pH는 수산화나트륨으로 7.8로 맞춘다. 120℃에서 60분간 멸균시킨후 pH는 6.4이다. 발효내용물 5%에 해당하는 프리훠멘터 내용물의 양을 접종물로서 사용한다.

28℃에서 750rpm으로 교반, 1V/V/m의 속도로 공기를 통하여 발효시킨다. 거품제지제로서 실리콘 A를 사용한다.

발효배양액을 발효도중 특징있는 적갈색으로 변한다.

생장 200시간후 충진세포가 생성된다. 배양액의 pH는 7.5이며 이때 배양액을 채취한다.

[실시예 2]

실시에 1에서 얻은 노카르디아 메디테라네아 ATCC 31, 064의 배양물을 실시예 1과 같이 교반하며 훌라스크중에서 제조한다음 다음과 같은 배지 4ℓ가 들어있는 10ℓ용 초자발효기에 넣어 예비 배양시킨다.

글루코즈 5g

낙화생가루 7.5g

CaCO₃1.65g

MgSO₄. 7H₂O 0.33g

KH₂PO₄0.33g

FeSO₄. 7H₂O 3.3mg

ZnSO₄. 7H₂O 16.5mg

MnSO₄. 4H₂O 1.3mg

물 1ℓ까지

pH를 7.5로 맞춘다. 120℃에서 50분간 멸균한후의 pH는 6.4이다. 생장 48시간후 충진세포는 총량의 6-8%이다.

10%에 해당하는 접종물은 다음과 같은 발효배지 10ℓ가 들어 있는 20ℓ용 초자 발효기에 접종시킬때 사용한다.

옥수수즙액 20g

콩가루 15g

(NH₄)₂SO₄6g

MgSO₄. 7H₂O 0.85g

글루코즈 100g

KH₂PO₄1g

CaCO₃6g

FeSO₄. 7H₂O 8.5mg

ZnSO₄. 7H₂O 42.5mg

MnSO₄. 4H₂O 3.4mg

CuSO₄. 5H₂O 2.8mg

CoCl₂. 6H₂O 1.7mg

물 1ℓ까지

pH는 수산화나트륨으로 7.8로 맞춘다. 120℃에서 50분간 멸균시킨후 pH는 6.4이다. 28℃에서 200시간 발효시킨다.

pH 7.5에서 발효배양액을 채취한다.

실시예 1 및 2에서 얻은 발효배양액을 다음과 같이 정제한다. 균사를 여과하여 제거하고 여액을 10%(V/V) 염산으로 pH 2.0으로 맞춘후 초산에틸 동량으로 3회 추출한다. 이 유기추출액을 35℃, 진공에서 농축건고시키고 잔류물질(실시예 1에서 4g, 실시예 2에서 11g 얻은 것)을 0.05M 인산염 나트륨완충액(pH 7.5)에 녹이고 아질산나트륨을 가하여 최종농도를 0.2(W/V)로 맞춘다. 실온에서 30분간 교반한후 완충용액을 초산에틸 동량으로 3회 추출한다. 혼합한 유기추출액을 35℃, 진공에서 농축건고시킨다. (제 1 초산에틸추출물) 남아있는 완충용액을 10% 염산으로 pH 2.0으로 맞추고 초산에틸 동량으로 3회 추출한 다음 혼합한 유기추출액을 35℃, 진공에서 농축건고시킨다(제 2 초산에틸추출물) 제 1 초산에틸추출물분말 (실시에 1에서 1.4g, 실시예 2에서 4.2g얻은 것)을 클로로 포름에 녹이고 실리카겔컬럼상에서(70-230메쉬 ASTM) 용출제로서 20%(V/V) 메타놀을 함유한 클로로포름을 사용하여 크로마토 그라프시킨다.

리파마이신 R은 컬럼으로부터 용출되어나오는 오렌지색-갈색을 띈 주생성물이다. 용매계로서 클로로포름 : 메타놀(95 : 5)을 사용하여 실리카겔판(메르크 60 F254) 상에서 박층크로마토 그라피시킬때 리파마이신 R는 R_f0.59이다.

리파마이신 R을 함유하는 분획층을 혼합하고 35℃, 진공에서 건조시킨후 초산에틸에 재용해시키고 0.01N 염산으로 세척한후 최종에 물로 세척한다. 유기 추출액을 소량으로 농축시키고 4℃에서 리파마이신 R이 결정화된다(실시예 1에서 600mg, 실시예 2에서 1.6g수득) 제 2 초산에틸추출물을 실리카겔상에서 리파마이신 R과 같은 방법으로 컬럼크로마토그라피시켜 정제한다. 무수잔류물질(실시예 1에서 2.4g, 실시예 2에서 4.2g수득)을 클로로포름에 녹이고 실리카겔에 적용시킨다. 컬럼을 클로로포름 및 메타놀(98 : 2)의 혼합물로 용출시킨다. 제일 먼저 나오는 화합물은 리파마이신 U이며 다음에 리파마이신 P이고 최종으로 리파마이신

가 나온다.

이들 3화합물들은 모두 용출용액중에서 황색을 띈 주황색을 나타내며 박층크로마토그라피법을 수행할때 그들의 운동성은 같다. 실리카겔판상에서(메르크 65F 254) 용매계로서 클로로포름 : 메타놀(95 : 5)을 사용할때 R_f치는 다음과 같다.

리파마이신 U R_f=0.63

리파마이신 P R_f=0.57

리파마이신

R_f=0.32

리파마이신 U, P 및

를 함유하는 적당한 분획층을 혼합하여 진공에서 건고시키고 초산에틸로 결정화 시킨다. 제 1 샘플로부터는 리파마이신 U80mg, 리파마아신 P400mg, 리파마이신

280mg을 얻으며 제 2 샘플로부터는 리파마이신 U190mg, 리파마이신 P900mg, 리파마이신

750mg을 수득한다.

생성균주로서 각각 노카르디아 메디테라네이 ATCC 31065 또는 노카르디아 메디테라네이 ATCC 31066을 사용하여 전술한 방법과 같이 행할때 전술한 바와같은 수율을 얻는다.

새로운 리파마이신의 물리-화학성질

리파마이신 P

1) 원소분석 (%) :

실측치 : C=60.6; H=6.2; N=3.8; O=25.2; S=4.1

2) 자의부 및 가시부 흡수밴드

화합물은 메타놀 또는 0.1N 염산중에서 다음과 같은 흡수밴드를 나타낸다.

메타놀 0.1N 염산

λmax(mμ)

λmax(mμ)

406 197 416 183

350 (쇼울더) 300 319

297 344 225 521

257 423

224 550

스펙트럼의 완전한 양상은 제 1 도와 같다.

스펙트럼은 퍼킨 엘머 스펙트라코드 4, 000 A 기계로 기록한 것이다.

3) IR 스펙트럼

뉴졸중에서 가장 중요한 흡수피크는 다음과 같은 주파수에서 나타난다. (cm^-1)

3, 700-3, 150(m, br); 3, 100(w); 3, 060-2, 800(Vs); 1, 465(s); 1,380(b) : Nujol; 1, 722(m); 1, 645(m,br); 1, 580(m); 1, 510(m); 1, 325(m); 1, 250(s,br); 1, 160(m); 1, 130(w); 1,070(m, br) 1, 030(w); 982(m); 960(m); 925(w); 890(m); 818(w); 770(w); 735(w).

I.R. 스펙트럼의 완전한 양상은 제 2 도와 같다.

스펙트럼은 퍼킨엘머 모드 421기계로 기록한 것이다.

4) 질량 스펙트럼

70eV에서 얻은 질량 스펙트럼은 다음의 m/e 값 738에서 몰이온 피크 M⁺을 나타낸다.

스펙트럼은 히타치퍼킨 엘머 RMU-6L 기계로 기록한 것이다.

5) 핵자기 공명 스펙트럼

100MHz에서 측정한 CDC1₃중에서의 N.M.R.스펙트럼의 완전한 양상은 제 3 도와 같다.

이 화합물은 퀴논 구조와 함께 크로모포르기를 가지고 있는 리파마이신의 특징적인 폴라로그라프 운동을 나타내지 않는다.

리파마이신

1) 원소분석

실축치 C=60.7; H=6.3; N=3.60; O=25.3; S=4.2

2) 자외부 및 가시부흡수밴드

화합물은 메타놀중에서 다음과 같은 수치를 나타낸다.

λmax(mμ)

406 178

350 (쇼울더)

297 305

257 405

224 518

3) IR스펙트럼

뉴졸중에서 가장 중요한 흡수피크는 다음과 같은 주파수(cm^-1)에서 생긴다.

3, 700-3, 300(s, br); 3, 300-3, 080(m, br); 3, 040-2,780(vs); 1,460(s); 1,378(s); Nujol; 1, 740(m); 1, 700(m); 1, 650(s, br); 1, 605(s, br); 1, 555(s); 1,510(m, br); 1, 315(w); 1, 275(m); 1, 240(m); 1, 220(m); 1, 160(m); 1, 090(m); 1, 050(m, br); 1, 020(w); 970(m); 945(w); 910(m); 808(m); 765(w); 720(w).

IR 흡수스펙트럼의 완전한 양상은 제 4 도와 같다.

4) 핵자기 공명 스펙트럼

60MHz에서 측정시 CDC1₃중에서의 NMR스펙트럼의 완전한 양상은 제 7 도와 같다.

리파마이신 R

1) 원소분석

실측치 C=62.0; H=6.4; N=2.2; O=29.6

2) 자외부 및 가시부흡수밴드

화합물은 0.1N 메타놀성 염산중에서 다음과 같은 수치를 나타낸다.

λmax(mμ)

219 444

281 415

340 114

410 72

3) IR 스펙트럼

뉴졸중에서의 가장 중요한 흡수피크는 다음과 같은 주파수(cm^-1)에서 생긴다.

3, 700-3, 100(s, br); 3, 040-2, 780(vs); 1, 465(s); 1, 380(s); Nujol; 1, 745(s); 1, 710(m); 1, 640(s); 1,600(s); 1, 505(s); 1, 415(m); 1, 325(s); 1, 260(s, br); 1, 220; 1, 130(s, br); 1,120(w); 1, 075(s); 1, 020(w); 975(s); 950(w); 920(w); 888(m); 823(m); 785(w, br); 735(w, br); 650(w, br).

IR 흡수스펙트럼의 완전한 양상은 제 5 도와 같다.

4) 질량 스펙트럼

70eV에서 얻은 질량 스펙트럼은 다음과 같은 m/e 수치 : 711에서 몰이온 피크 M⁺를 나타낸다.

5) 핵자기공명 스펙트럼

60MHz에서 축정시 CDC1₃중에서의 NMR 스펙트럼의 완전한 양상은 제 6 도와 같다.

화합물은 퀴논 구조와 함께 크로모포르기를 가지고 있는 리파마이신의 특징적인 폴라로 그라피운동을 나타낸다.

전술한 데이타로 리파마이신 R에 대한 다음과 같은 구조를 알수있다.

리파마이신 U

1) 자외부 및 가시부 흡수밴드

화합물은 메타놀중에서 다음과 같은 수치를 나타낸다.

λmax(mμ)

412 163

353 (쇼울더)

299 265

258 389

220 451

2) IR 흡수 스펙트럼

뉴졸중에서 가장 중요한 흡수피크는 다음의 주파수에서 (cm^-1) 생긴다.

3, 700-3, 100(m, br); 3, 060(vw); 3, 040-2, 740(vs); 2, 720(vw); 1, 460(s), 1, 378(m); Nujol; 1, 750-1, 705(m, br); 1, 680-1,620(m, br); 1,600(5); 1, 558(s); 1, 490(w, 쇼울더); 1, 308(w); 1, 270(w, shoulder); 1, 245(m, shoulder); 1, 225m); 1, 160(m); 1, 120(w); 1, 090(vw); 1, 070(w); 1, 030(vw); 1, 020(vw); 1,000(vw); 975(w); 960(w, Shoulder); 905(m); 850(m); 802(w); 800(vw, shoulder); 777(vw); 760(vw); 720(vw); 685(vw); 670(vw).

화합물들의 미생학적 성질

리파마이신 P,

및 R의 시험관내 항생작용 스펙트럼은 다음표와 같다.

새로운 화합물들은 스타필로코쿠스 아우레우스, 에스케리챠콜라이를 실험동물에 주사할때에도 활성이 있다.

다음표는 쥐의 대표적인 실험결과를 기지의 천연 리파마이신 즉 리파마이신 SV와 비교하여 기록한 것이다.

화합물 감염균 ED₅₀mg/kg

피하투여 경구투여

리파마이신 P 스타필로코쿠스 아우레우스 0.3 0.8

리파마이신 P 에스케리챠 콜라이 40 -

리파마이신

스타필로코쿠스 아우레우스 8 -

리파마이신 SV 스타필로코쿠스 아우레우스 17 74

쥐에 있어서 LD₅₀이 500mg/kg (복강내투여) 보다 더 높기 때문에 가장 활성있는 천연 리파마이신보다 리파마이신 P는 저독성이다.

Claims (1)

1. 노카르디아 메디테라네이(ATCC 31064) 노카르디아 메디테라네이 (ATCC 31065) 및 노카르디아 메디테라네이 ATCC 31066으로부터 선택된 노카르디아 메디테라네이 변이주를 발효배지가 기본량의 항생작용을 나타날때까지, 동화할수 있는 탄소원, 질소원 및 필수 무기염류존재하 호기성조건하에서 발효시키고, 발효배지로부터 새로운 리파마이신을 회수하고 각각의 단일 생성물로 분리하여 리파마이신 P, 리파마이신

   

   , 리파마이신 R 및 리파마이신 U를 제조하는 방법.

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