Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych ryfamycyn na drodze fermentacji wywola¬ nej przez mutanty szczepu Streptomyces mediter- ranei na wodnej pozywce wzrostowej w obecnosci tlenu.W niniejszym opisie te nowe ryfamycyny ozna¬ czono jako ryfamycyne P, ryfamycyne Q, ryfa¬ mycyne R i ryfamycyne U.We wczesniejszych pracach stwierdzono, ze w czasie fermentacji na normalnej pozywce wzrosto¬ wej, wywolanej przez drobnoustroje ze szczepu Streptomyces mediterranei wytwarzana jest gru¬ pa antybiotyków, lacznie okreslona jako zespól ryfamycyn P..i(Sensi i wspólpracownicy, Antibioties Annual 1959—1960, strona 262). Autorzy nastepnej pracy stwierdzili, ze dodanie soli sodowej estru dwuetylowego kwasu barbiturowego do podloza hodowlanego, powoduje wytworzenie zasadniczo pojedynczego produktu fermentacji, to znaczy ry¬ famycyny B (Margalith P. i Pagani H., Applied Microbiology, 9, 325, H961). Zgodnie z nastepnym odkryciem stwierdzono, ze mutanat szczepu Strep¬ tomyces mediterranei wytwarza wylacznie ryfamy¬ cyne B, niezaleznie od obecnosci lub nieobecnosci soli sodowej estru dwuetylowego kwasu barbitu¬ rowego w podlozu fermentacyjnym. Dalo to ule¬ pszony sposób wytwarzania ryfamycyny B. Szczep drobnoustrojów, produkujacych ryfamycyne B, o- kreslono jako Streptomyces mediterranei ATCC 21789. (patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 3 871965).Nowa substancje antybiotyczna, sposobem we¬ dlug niniejszego wynalazku wytwarza sie za pomo¬ ca fermentacji, wywolanej przez zmutowany szczep, uzyskany ze szczepu Streptomyces medi¬ terranei ATCC 13685, prowadzonej w warunkach tlenowych, w obecnosci przyswajalnego zródla we¬ gla, azotu i niezbednych soli mineralnych.Nowe zmutowane szczepy, stosowane w sposo¬ bie wedlug wynalazku, uzyskuje sie za pomoca dzialania na szczep ATCC 13685 zwykle stosowa¬ nymi chemicznymi czynnikami mutagennymi, ta¬ kimi jak kwas azotowy lub pochodne nitrozogu- anidyny lub tez za pomoca dzialania fizycznymi czynnikami mutagennymi, takimi jak promienie Roentgena lub promienie nadfioletowe.Nowy zmutowany szczep okresla sie jako przy¬ nalezny raczej do rodzaju Nocardia, niz do ro¬ dzaju Streptomyces mediterranei, zgodnie z pro¬ pozycjami Thiemanna i jego wspólpracowników, ogloszonymi w Arch. Mikrobiol., 67, 147—155,i(1969).Izolacje zmutowanych szczepów, wytwarzajacych nowe ryfamycyny, przeprowadza sie nastepujaco: zawiesine zarodników Streptomyces mediterranei ATCC 13685 poddaje sie w ciagu 60 minut w temperaturze 28°C dzialaniu N-metylo-N'-nitro-N- -nitrozoguanidyny o stezeniu 1 mg/ml, przy war¬ tosci pH równej 9,0, uzyskanej za pomoca buforu trój(hydroksymetylo)aminometanowego. Nastepnie zarodniki przemywa sie i umieszcza na plytkach Petriego, zawierajacych agar Bennetta. 97 7883 97788 4 W ciagu 14 dni przeprowadza sie inkubacje w temperaturze 28°C, nastepnie wybiera sie kolonie i bada ich zdolnosci do hamowania wzrostu drob¬ noustrojów Bacillus subtilis. Badanie to przepro¬ wadza sie nastepujaco: Plytke agaru (srednica 4—8 mm), przenoszaca po¬ jedyncza kolonie, umieszcza sie na plytoe Petrie- go, zawierajacej agar Penaszaya o wartosci pH = = 7,2, uprzednio zaszczepiony #Vo (objetosc/obje¬ tosc) szczepem Bacillus subtilis.W podanych powyzej warukach ryfamycyna B praktycznie nie wykazuje aktywnosci i normalne kolonie drobnoustrojów, wytwarzajacych ryfamy- cyne B, nie hamuja wzrostu drobnoustrojów Ba¬ cillus subtilis w opisanym agarze. Tymczasem ja¬ kakolwiek kolonia drobnoustrojów, wytwarzaja¬ cych nowe ryfamycyny o aktywnosci przeciwbak- teryjnej, wywoluje wyraznie odciete strefy zaha¬ mowania wzrostu drobnoustroju Bacillus subtilis wokól plytek agaru. Sposobem, opisanym wyzej, wyizolowano trzy szczepy drobnoustrojów i wedlug kodu wewnetrznego oznaczono je jako D — 2, MM 18 — 6, oraz M — 36. Próbki tych trzech drobnoustrojów zlozono w ATCC, gdzie sa one o- kreslone odpowiednio jako Nocardia mediterranea ATCC 31064, Nocardia mediterranea 31065 i No¬ cardia mediterranea ATCC 31066.Ponizej przedstawiono charakterystyki nowych szczepów Nocardia mediterranea, stosowanych w sposobie wedlug wynalazku. W tablicy I zestawio¬ no wyniki makroskopowego i mikroskopowego ba¬ dania szczepów Nocardia mediterranea, okreslo¬ nych odpowiednio jako ATCC 31064, 31Ó65, 31066.W tablicy II przedstawiono charakterystyki ho¬ dowlane wymienionych powyzej szczepów Nocar¬ dia mediterranea. Przedstawiono takze charakte¬ rystyki szczepu rodzicielskiego, to znaczy szczepu Streptomyces mediterranei ATCC 13685 (ME/83).Sposób prowadzenia fermentacji zasadniczo po¬ lega na hodowli jednego z wymienionych muta¬ ntów szczepu Streptomyces mediterranei, prowa¬ dzonej na pozywce, zawierajacej przyswajane zró¬ dla azotu i wegla oraz niezbedne sole mineralne, dotad az uzyska sie znaczna wartosc aktywnosci przeciwbakteryjnej wymienionej pozywki, po czym ryfamycyny ekstrahuje sie z podloza.Bardziej szczególowo, mutanty hoduje sie w cza¬ sie mieszania w warunkach napowietrznej fer¬ mentacji glebinowej w temperaturze w zakresie od 25 do 37°C, korzystnie w temperaturze 28°C.Jako zródla wegla stosuje sie nastepujace weglo¬ wodany i pochodne wegla: glikoza, galaktoza, lak¬ toza, sacharoza, maltoza, gliceryna, mannitol i tym podobne. Uzytecznymi zródlami azotu sa na przyklad aminokwasy i ich mieszaniny, peptydy, bialka i ich hydrolizaty, jak pepton, ekstrakt droz¬ dzowy, maka sojowa, roztwór uzyskany przez na¬ moczenie ziarn kukurydzy, wyciag z ryb, ekstrakt z miesa, wyciag wodny z ziarn zboza. Fermenta¬ cje prowadzi sie w ciagu 180—220 godzin.Wartosc pH pozywki zwykle poczatkowo dopro¬ wadza sie do wartosci 6,4—6,6, a w czasie fermen¬ tacji wzrasta ona do 7,0—8,5. Najlepsze wyniki uzyskuje sie zazwyczaj, prowadzac fermentacje w ciagu 200 godzin. Po zakonczeniu fermentacji ry¬ famycyny mozna izolowac nastepujaco: pozywke fermentacyjna saczy sie przy koncowej wartosci pH równej 7,0—8,5, przesacz szybko zakwasza sie, korzystnie do wartosci pH nizszej niz okolo 5, w celu zapewnienia warunków najwiekszej stabil¬ nosci substancji antybiotycznych i substancje te nastepnie ekstrahuje sie za pomoca rozpuszczal¬ ników niemieszajacych sie z woda, takich jak chloroform, butanol, octan etylu, octan propylu, octan butylu lub octan amylu. Stosunek objetosci podloza do objetosci rozpuszczalnika zmienia sie zaleznie od rodzaju rozpuszczalnika i zwykle sto¬ suje sie stosunek o wartosci od 2:1 do 10:1.Poniewaz grzybnia zatrzymuje pewne ilosci sub¬ stancji o aktywnosci mikrobiologicznej, dlatego poddaje sie ja ekstrakcji za pomoca rozpuszczal¬ nika niemieszajacego sie z woda, po czym ekstrakt laczy sie z warstwa organiczna, zawierajaca wie¬ kszosc ryfamacyn. Ewentualnie ekstrakcje akty¬ wnych substancji z grzybni mozna przeprowadzac za pomoca rozpuszczalnika mieszajacego sie z wo¬ da, takiego jak aceton. W tym przypadku ciecz odsacza sie, z przesaczu oddestylowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem aceton, z pozostalosci ekstrahu¬ je sie ryfamycyny za pomoca rozpuszczalnika nie¬ mieszajacego sie z woda, po czym postepuje sie, jak opisano poprzednio.Wiekszosc substancji o aktywnosci przeciwbak¬ teryjnej przeprowadza sie do rozpuszczalnika, któ¬ ry nastepnie oddestylowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem do sucha, korzystnie w temperaturze nizszej niz 30°C.Surowy produkt, zawierajacy ryfamycyny, moz¬ na oczyszczac za pomoca chromatografii kolum¬ nowej na zelu krzemionkowym. Przed chromato¬ grafia surowy produkt dogodnie rozpuszcza sie w buforze fosforanowym o wartosci pH równej 40 7,0—8,0, po czym poddaje sie dzialaniu lagodnego czynnika utleniajacego. Nastepnie roztwór w bu¬ forze poddaje sie ekstrakcji za pomoca rozpu¬ szczalnika niemieszajacego sie z woda. Uzyskany ekstrakt organiczny zawiera nowa ryfamycyne, na- 45 zwana ryfamycyna R.Roztwór buforowy po ekstrakcji zakwasza sie do wartosci pH = 2,4, po czym ekstrahuje rozpu¬ szczalnikiem niemieszajacym sie z woda. Uzyska¬ ny ekstrakt zawiera trzy nowe zwiazki z grupy 50 ryfamycyn nazwane ryfamycyna P, ryfamycyna Q i ryfamycyna U.Dalsze oczyszczanie surowej ryfamycyny R prze¬ prowadza sie za pomoca chromatografii na ko- „ lumnie, wypelnionej odpowiednim materialem ad- 55 sorbujacym, takim jak zel krzemionkowy, stosu¬ jac jako eluat odpowiednia mieszanine rozpusz¬ czalników organicznych.Drugi ekstrakt organiczny, zawierajacy ryfa- 60 mycyny P, Q i U, oczyszcza sie sposobem identy¬ cznym, jak opisano dla ryfamycyny R.Ponizej przedstawiono fizykochemiczne charak¬ terystyki nowych ryfamycyn P, Q, R i U, wytwo¬ rzonych sposobem wedlug wynalazku. 65 Ryfamycyna P. Analiza elementarna:97788 6 Znaleziono: (•/o) — C = 60,6, H = 6,2, N=3,8, O = 25,2, S=4,l.Widmo w nadfiolecie i w swietle widzialnym wykazuje nastepujace pasma absorpcji: .1% l cm metanol X max/mw E x ( 406 197 350 (rozmyte) 297 344 257 423 224 550 0,1 n HC1 X max(niw) E ; (.^ 416 183 300 319 225 521 10 X ma°/« (m/u) 406 350' 297 257 224 2 F * % 178 (rozmyte) 305 405 518 Caly wykres widma przedstawiono na rysunku fig. 1. Widmo to wykonano za pomoca aparatu 15 Perkin Elmer Spectracord 4000 A.W widmie w podczerwieni najbardziej znaczace pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nujo- lu, stwierdzono dla nastepujacych czestotliwosci (cm-1): 3700—3150 (srednie, poszerzone), 3100 (sla- 20 be), 3060—2800 (bardzo silne), 1465 (silne), 1380 (po¬ szerzone) — nujal, 1722 (srednie), 1645 (srednie, po¬ szerzone), 1580 (srednie), 1510 (srednie), 1323 (sre¬ dnie), 1250 (silne, poszerzone), 1160 (srednie),. 1130 (slabe), 1070 (srednie, poszerzone), 1030 (slabe), 25 982 (srednie), 960| (srednie), 925 (slabe), 890 (srednie), 818 (slabe), 770 (slabe), 735 (slabe).Caly wykres widma w podczerwieni przedsta¬ wiono na rysunku fig. 2, Widmo to wykonano na aparacie Perkin Elmer Mod. 421.Jon masowy M+ w widmie masowym, uzyskany przy 70 eV ma wartosc stosunku — = 738. Wid- e mo to wykonano za pomoca aparatu Hitachi Perkin ElmerRMU-6L. 35 Cale widmo magnetycznego rezonansu jadrowego, wykonane przy czestotliwosci 100 MHz w CDC13, przedstawiono na rysunku fig. 3.Zwiazek nie wykazuje charakterystycznego dla ryfamycyn zachowania w polarografii, wywolane- 40 go chromoforowa grupa w chinonowej czesci cza¬ steczki.Ryfamycyna Q. Analiza elementarna: znaleziono: C = 60,7, H = 6,3, N= 3,60, 0=25,3 S=4,2. 45 Widmo z nadfiolecie w swietle widzialnym wy¬ kazuje nastepujace pasma absorpcji w metanolu: 50 55 W widmie w7 podczerwieni najbardziej znacza¬ ce pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nu- jolu, stwierdzono dla nastepujacych czestotliwos¬ ci (cm-1): 3700 3300 (silne, poszerzone), 3300—3080 (srednie, 60 poszerzone), 3040—2780 (bardzo silne), 1460 (silne), 1378 (silne) — nujol, 1740 (srednie), 1700 (srednie), 1650 (silne, poszerzone), 1605 (silne, poszerzone), 1555 (silne), 1510 (srednie, poszerzone), 1315 (sla¬ be), 1275 (srednie), 1240 (srednie), 1220 (srednie), 65 1160 (srednie), 1090 (srednie), 1050 (srednie, po¬ szerzone), 1020 (slabe), 970 (srednie), 945 (slabe), 910 (srednie), 808 (srednie), 765 (slabe), 720 (slabe).Cale widmo w podczerwieni przedstawiono na rysunku fig. 4.Cale widmo magnetycznego rezonansu jadrowe¬ go, wykonane przy czestotliwosci 60 MHz w CDCI3, przedstawiono na rysunku fig. 7.Ryfamycyna R. Analiza elementarna: znaleziono: C=62,0, H=6,4, N = 2,2, O=29,6.Widmo w nadfiolecie i w swietle widzialnym wykazuje nastepujace pasma absorpcji w 0,1 n roztworze chlorowodoru w metanolu: X max(nuO 219 281 340 410 X F 1 % 444 415 114 72 W widmie w podczerwieni najbardziej znaczace pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nujolu, stwierdzono dla nastepujacych czestotliwosci (cm-1): 3700—3100 (silne, poszerzone), 3040—2780 (bardzo silna), 1465 (silne), 1380 (silne) — nujol, 1745 (sil¬ ne), 1710 (srednie), 1640 (silne), 1600 (silne), 1505 (silne), 1415 (srednie), 1325 (silne), 1260 (silne, po¬ szerzone), 1220—1130 (silne, poszerzone), 1120 (sla¬ be), 1075 (silne), 1020 (slabe), 975 (silne), 950 (sla¬ be), 920 (slabe), 888 (srednie), 823 (srednie), 785 (slabe, poszerzone), 735 (slabe, poszerzone), 650 (slabe, poszerzone).Cale widmo w podczerwieni przedstawiono na rysunku fig. 5.Jon masowy M+ w widmie masowym, uzyska¬ ny przy 70 eV, ma wartosc stpsunku _ = 711. e Cale widmo magnetycznego rezonansu jadro¬ wego, wykonane przy czestotliwosci 60 MHz w CDCI3, przedstawiono na rysunku fig. 6.Zwiazek ten wykazuje charakterystyczne dla ry¬ famycyn zachowanie w polarografii, wywolane grupa chromoforowa w chinonowej czesci czastecz¬ ki.Powyzsze dane potwierdzaja wzór 1 dla ryfarriy- cyny R.Ryfamycyna U. Widmo w nadfiolecie i w swie¬ tle widzialnym wykazuje nastepujace pasma ab¬ sorpcji w metanolu: X max(ml«) 412 353 299 258 220 1 F 1% * ^ lem 163 (rozmyte) 265 389 451 W widmie w podczerwieni najbardziej znaczace pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nujolu', stwierdzono dla nastepujacych czestotliwosci (cm-1): 3700—3100 (srednie, poszerzone), 3060 (bardzo sla¬ be), 3040—2740 (bardzo silne), 2720 (bardzo sla-97788 8 be), 1460 (silne), 1378 (srednie) — nujol, 1750—1705 (srednie, poszerzone), 1680—1620 (srednie, posze¬ rzone), 1600 (silne), 1558 (silne), 1490 rzone), 1308 (slabe), 1270 (slabe, rozmyte), 1245 (srednie, rozmyte), 1225 (srednie), 1160 (srednie), 1120 (slabe), 1090 (bardzo slabe), 1070 (slabe), 1030 (bardzo slabe), 1020 (bardzo slabe), 1000 (bardzo slabe), 975 (slabe), 960 (slabe, rozmyte), 905 (sred¬ nie), 850 (srednie), 802 (slabe), 800 (bardzo slabe), rozmyte), 777 (bardzo slabe), 760 (bardzo slabe), 720 (bardzo slabe), 685 (bardzo slabe), 670 (bardzo slabe).Aktywnosc biologiczna nowych ryfamycyn, otrzy¬ manych sposobem wedlug wynalazku, przedsta¬ wiono w tablicach V i VI.Zakres przeciwbakteryjnego dzialania in vitro ryfamycyn P, Q i R przedstawiono w tablicy V.Nowe zwiazki, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, wykazuja takze aktywnosc dzialania w próbach, przeprowadzonych na laboratoryjnych zwierzetach, zakazonych szczepami Staphylococcus aureus i Escherichia coli.W tablicy VI przedstawiono wyniki reprezenta¬ tywnych doswiadczen, przeprowadzonych na my¬ szach, w których porównywano dzialanie zwiaz¬ ków, wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku i znanej ryfamycyny naturalnej, to znaczy ryfa¬ mycyny SV.Najwieksza aktywnosc dzialania wykazuje ry- famycyna P, która charakteryzuje sie takze niska toksycznoscia, poniewaz uzyskana dla niej wartosc ED50 dla myszy jest wyzsza niz 500 mg/kg po podaniu dootrzewnowo.Sposób wedlug wynalazku jest blizej przedsta¬ wiony w przykladach.Przyklad I. Zmutowany szczep, oznaczony jako Nocardia mediterranea ATCC 31064, inkubu- je sie w ciagu 6—8 dni na agarze Bennetta w temperaturze 28°C. Hodowla, uzyskana na skosie agarowym, inokuluje sie dwie kolby Erlenmeyeaa o pojemnosci 500 ml przy zachowaniu jalowych warunków. • Kolby zawieraja po 10.0 ml pozywki wegetaty¬ wnej o nastepujacym skladzie: Ekstrakt z wolowiny 5 g Ekstrakt z drozdzy 5 g Pepton 5 g Hydrolizat kazeiny 3 g Glikoza 20 g NaCl 1,5 g woda ilosc uzupelniajaca do objetosc 1 litra Za pomoca wodorotlenku sodowego doprowadza sie wartosc pH pozywki do wartosci 7,3. Inokulo- wane kolby umieszcza sie na zmiennej wstrzasar- ce w temperaturze 28°C i wstrzasa w ciagu 72 go¬ dzin. Zawartosc tych dwu kolb uzywa sie jako inokulum i wylewa sie ja do wstepnego fermen- tora o pojemnosci 10 litrów, zawierajacego 4 li¬ try opisanej pozywki wegetatywnej. Inkubacje prowadzi sie w temperaturze 28°C, mieszajac za¬ wartosc fermentora z szybkoscia 300 obrotów na minute i przepuszczajac przez fermentor powie- trze z szybkoscia 1 objetosc powietrza na 1 obje¬ tosc pozywki w ciagu 1 minuty. Po 48 godzinach uzyskuje sie wzrost objetosci komórek do 7—10f/o calkowitej objetosci. W nastepnym etapie w szkla- nym fermentatorze o pojemnosci 10 litrów przy¬ gotowuje sie 4 litry pozywki fermentacyjnej o nastepujacym skladzie: Maka z orzechów ziemnych 25 g Makasojowa 5 g (NH4)2S04 9,5 g MgS04 • 7H20 0,85 g Glikoza 95 g Gliceryna 40 g KH2P04 1 g Glikolpropylenowy 5 g CaCOs 8,5 g Dwuetylobarbituran sodowy 1,7 g CuS04'5H20 2,8 mg FeS04 • 7H20 8,5 mg ZnS04 • 7H20 42,5 mg MnS04 • 4H20 3,4 mg CaCl2 • 6H20 1,7 mg (NH4)6M07O24 • 4H20 0,85 mg woda w ilosci uzupelniajacej do 1 litra. r **- Wartosc pH pozywki doprowadza sie do 7,8 za pomoca NaOH. Wyjalawianie prowadzi sie w tem¬ peraturze 120°C w ciagu 60 minut. Po wyjalowie- niu wartosc pH wynosi 6,4. Jako inokulum stosu¬ je sie 5f/o objetosci zawartosci fermentora wstep¬ nego.Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 28°C, stosujac mieszanie z szybkoscia 750 obrotów na minute i przepuszczanie powietrza z szybkoscia 1 objetosc powietrza na 1 objetosc pozywki w ciagu 1 minuty. Jako srodek przeciwko pienieniu stosuje sie silikon A. W czasie fermentacji brzeczka ho¬ dowlana przybiera charakterystyczna barwe czer- 40 wono-brazowa. Po 200 godzinach uzyskuje sie wzrost objetosci komórek w stosunku do calko¬ witej objetosci pozywki.Brzeczka przyjmuje wartosc pH = 7,5 i w tym momencie brzeczke poddaje sie procesowi izola- 45 cji.Przyklad II. Hodowle szczepu Nocardia me¬ diterranea ATCC 31064, przygotowana sposobem opisanym w przykladzie I, rozwija sie w kolbie podczas mieszania, sposobem identycznym, jak 50 opisany w przykladzie I. Uzyskana wstepna ho¬ dowle wylewa sie do szklanego fermentora o po¬ jemnosci 10 litrów, zawierajacego pozywke o na¬ stepujacym skladzie: Glikoza 5 g 55 Maka z orzechów ziemnych 7,5 g CaCos 1,65 g MgS04 • 7H20 0,33 g KH2P04 0,33 g FeS04 • 7H20 3,3 mg 60 ZnS04-7H20 16,5 mg MnS04-4H20 1,3 mg woda w ilosci uzupelniajacej do objetosci 1 litra.Wartosc pH calosci doprowadza sie do 7,5. Wy- 65 jalawianie przeprowadza sie w ciagu 50 minut w25 97788 9 temperaturze 120°C. Po wyjalowieniu pH przyj¬ muje wartosc 6,4. Hodowle prowadzi sie w ciagu 48 godzin, uzyskujac zwiekszenie objetosci komó¬ rek do 6—8°/t calkowitej objetosci pozywki. Uzy¬ skana hodowle w ilosci okolo 10°/o stosuje sie 5 jako inokulum dla szklanego fermentora o po¬ jemnosci 20 litrów, zawierajacego 10 litrów po¬ zywki fermentacyjnej o nastepujacym skladzie: Plyn uzyskany po namoczeniu kukurydzy 20 g Makasojowa 15 g 10 (NH4)2S04 6 g MgS04 • 7H20 0,85 g Glikoza 100 g KH2P04 lg CaC03 6 g 15 FeS04 • 7H20 8,5 mg ZnS04 • 7H20 42,5 mg MnS04 • 4H2Ó 3,4 mg CuS04 •5H20 2,8 mg CoCl2 • 6H20 1,7 mg M woda w ilosci uzupelniajacej do objetosci 1 litra.Wartosc pH calosci doprowadza sie do 7,8 za pomoca NaOH. Wyjalawianie przeprowadza sie w ciagu 50 minut w temperaturze 120°C. Po wyja¬ lowieniu wartosc pH wynosi 6,4. Fermentacje prze¬ prowadza sie w ciagu 200 godzin w temperaturze 28°C. Koncowa wartosc pH brzeczki fermentacyj¬ nej wynosi 7,5.Brzeczki fermentacyjne, uzyskiwane sposobami, opisanymi w przykladach I i II, oczyszcza sie na¬ stepujaco. Grzybnie odsacza sie i odrzuca, zas przesacz doprowadza sie do pH o wartosci 2,0 za pomoca KM (objetosc na objetosc) kwasu solnego i trzykrotnie ekstrahuje równymi objetosciami oc¬ tanu etylu. Z ekstraktu organicznego calkowicie od- destylowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem roz¬ puszczalnik w temperaturze 35°C i uzyskana po¬ zostalosc (4 g sposobem, opisanym w przykladzie I i 11 g sposobem, opisanym w przykladzie II), rozpuszcza sie w 0,05 molowym roztworze fosfo¬ ranu sodowego o pH = 7,5, po czym do roztworu dodaje sie azotyn sodowy w takiej ilosci, aby uzyskac koncowe jego stezenie 0,2V# (wagowo-ob- tf jetosciowych).Calosc miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 30 minut, po czym roztwór buforowy trzy¬ krotnie ekstrahuje sie równymi objetosciami octa¬ nu etylu. Z polaczonych warstw organicznych od- 50 destylowuje sie calkowicie rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 35°C i uzyskuje sie pierwszy ekstrakt z octanu etylu.Pozostaly po ekstrakcji roztwór buforowy dopro¬ wadza sie do pH = 2,0 za pomoca 10°/o kwasu 35 solnego i ponownie ekstrahuje trzykrotnie równy¬ mi objetosciami octanu etylu. Uzyskane ekstrakty laczy sie, oddestylowuje z nich rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 35°C i uzyskuje drugi ekstrakt z octanu etylu. 50 Suchy proszek po oddestylowaniu rozpuszczalni¬ ka z pierwszego ekstraktu w octanie etylu (1,4 g w przykladzie I i 4,2 g w przykladzie II) rozpu¬ szcza sie w chloroformie i chromatografuje na kolumnie, wypelnionej zelem krzemionkowym (70— 55 40 —230 mesh ASTM), stosujac jako eliient chloro¬ form, zawierajacy 2^/0 (objetosciowo-objetoscio- wych) alkoholu metylowego. W zebranym z kolum¬ ny eluacie wiekszosc stanowi ryfamycyna R, któ¬ ra rozpoznaje sie dzieki jej barwie pomaranczowo- -brazowej.Metoda chromatografii cienkowarstwowej, * przy uzyciu plytek, pokrytych zelem krzemionkowym (Merck 60 F254) i stosujac jako system rozwijajacy mieszanine chloroformu i alkoholu metylowego o skladzie 95:5 stwierdza sie, ze wartosc Rf dla ry¬ famycyny wynosi 0,59. Frakcje zawierajace ryfa¬ mycyne R laczy sie, calkowicie oddestylowuje z nich rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 35°C, pozostalosc ponownie roz¬ puszcza sie w octanie etylu, uzyskany roztwór przemywa sie 0,01 n roztworem kwasu solnego i na koniec woda.Z warstwy organicznej oddestylowuje sie roz¬ puszczalnik, az do uzyskania malej objetosci ste¬ zonego roztworu, z którego w temperaturze 4°C krystalizuje ryfamycyna R (uzyskuje sie 600 mg zwiazku sposobem wedlug przykladu I i 1,6 g zwiazku sposobem wedlug przykladu II). Drugi ekstrakt w octanie etylu oczyszcza - sie takze za pomoca chromatografii kolumnowej na zelu krze¬ mionkowym sposobem podobnym, jak stosowany dla ryfamycyny R. Sucha pozostalosc po oddesty¬ lowaniu octanu etylu (2,4 g w przypadku sposobu, opisanego w przykladzie I i 4,2 g w przypadku sposobu, opisanego w przykladzie II) rozpuszcza sie w chloroformie i nanosi na kolumne.Kolumne eluuje sie mieszanina chloroformu i alkoholu metylowego o skladzie 98,2. W pierwszej kolejnosci uzyskuje sie ryfamycyne U, nastepnie ryfamycyne P, zas na koncu ryfamycyne Q. Wszy¬ stkie te zwiazki charakteryzuja sie barwa zólto- -pomaranczowa i identyfikuje sie je za pomoca chromatografii cienkowarstwowej. Stosujac plytki z zelem krzemionkowym (Merck 60 F2g4), system rozwijajacy w postaci mieszaniny chloroformu i alkoholu metylowego o skladzie 95:5 uzyskuje sie nastepujace wartosci Rf: ryfamycyna U ryfamycyna P ryfamycyna Q Rf = 0,63 Rf = 0,57 Rf = 0,32 Odpowiednie frakcje, zawierajace ryfamycyne U, P i Q, laczy sie, oddestylowuje z nich rozpu¬ szczalnik pod zmniejszonym cisnieniem i uzyska¬ na sucha pozostalosc krystalizuje z octanu etylu.Stosujac brzeczke, otrzymana jak w przykladzie I, uzyskuje sie 80 mg ryfamycyny U, 400 mg ryfa¬ mycyny P, 280 mg ryfamycyny Q, zas stosujac brzeczke, otrzymana w przykladzie II, uzyskuje sie 190 mg ryfamycyny U, 900 mg ryfamycyny P, oraz 750 mg ryfamycyny Q.Stosujac sposób postepowania identyczny, jak opisany w powyzszych przykladach, oraz jako szczepy produkcyjne odpowiednio Nocardia me- diterrahea ATCC 31065 lub Nocardia maditerranea ATCC 31066 uzyskuje sie ryfamycyny z wydajno- sciami tego samego rzedu, jak opisano poprzed¬ nio.97788 11 12 PL PL PL PL PL PL The subject of the invention is a method for producing new rifamycins by fermentation induced by mutants of the Streptomyces mediterranei strain on an aqueous growth medium in the presence of oxygen. In this description, these new rifamycins are designated as rifamycin P, rifamycin Q, rifamycin R and rifamycin U. In earlier works, it was found that during fermentation on a normal growth medium, induced by microorganisms of the Streptomyces mediterranei strain, a group of antibiotics is produced, collectively referred to as the P.i rifamycin complex (Sensi et al., Antibioties Annual 1959—1960, page 262). The authors of a subsequent paper found that the addition of barbituric acid diethyl ester sodium salt to the culture medium resulted in the production of essentially a single fermentation product, i.e., rifamycin B (Margalith P. and Pagani H., Applied Microbiology, 9, 325, H961). In accordance with a subsequent finding, a mutant strain of Streptomyces mediterranei produced only rifamycin B, regardless of the presence or absence of barbituric acid diethyl ester sodium salt in the fermentation medium. This provided an improved method for producing rifamycin B. The strain of microorganisms producing rifamycin B was designated Streptomyces mediterranei ATCC 21789 (see U.S. Patent No. 3,871,965). The new antibiotic substance according to the present invention is produced by fermentation of a mutant strain obtained from Streptomyces mediterranei ATCC 13685, carried out under aerobic conditions in the presence of an assimilable source of carbon, nitrogen and essential mineral salts. The new mutant strains used in the method according to the invention are obtained by treating strain ATCC 13685 with commonly used chemical mutagenic agents, such as nitric acid or nitrosoguanidine derivatives, or by treating it with physical mutagenic agents, such as X-rays or ultraviolet rays. The new mutant strain is defined as belonging to the genus Nocardia rather than to the genus Streptomyces. mediterranei, according to the proposals of Thiemann and his co-workers, published in Arch. Microbiol., 67, 147—155, (1969). Isolation of mutant strains producing new rifamycins is carried out as follows: a spore suspension of Streptomyces mediterranei ATCC 13685 is treated for 60 minutes at 28°C with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine at a concentration of 1 mg/ml, adjusted to a pH of 9.0 using tri(hydroxymethyl)aminomethane buffer. The spores are then washed and placed on Petri dishes containing Bennett's agar. 97 7883 97788 4 Incubation is carried out for 14 days at 28°C, then colonies are selected and tested for their ability to inhibit the growth of Bacillus subtilis microorganisms. This test is performed as follows: An agar plate (diameter 4-8 mm) bearing a single colony is placed on a Petri dish containing Penaszaya agar with a pH value of 7.2, previously inoculated with #Vo (volume/volume) of the Bacillus subtilis strain. Under the conditions given above, rifamycin B has practically no activity, and normal colonies of rifamycin B-producing microorganisms do not inhibit the growth of Bacillus subtilis microorganisms in the described agar. Meanwhile, any colony of microorganisms producing the new rifamycins with antibacterial activity produces clearly defined zones of inhibition of the growth of the microorganism Bacillus subtilis around the agar plates. Three strains of microorganisms were isolated by the method described above and designated by internal codes as D-2, MM 18-6, and M-36. Samples of these three microorganisms were deposited with the ATCC, where they are designated as Nocardia mediterranea ATCC 31064, Nocardia mediterranea 31065, and Nocardia mediterranea ATCC 31066, respectively. Characteristics of the new strains of Nocardia mediterranea used in the method of the invention are presented below. Table I summarizes the results of macroscopic and microscopic examination of Nocardia mediterranea strains designated ATCC 31064, 31065, and 31066, respectively. Table II presents the culturing characteristics of the Nocardia mediterranea strains mentioned above. Characteristics of the parent strain, Streptomyces mediterranei strain ATCC 13685 (ME/83), are also presented. The fermentation method essentially consists in cultivating one of the above-mentioned mutant strains of Streptomyces mediterranei in a medium containing available nitrogen and carbon sources and essential mineral salts until a significant antibacterial activity of the medium is achieved, after which the rifamycins are extracted from the medium. More specifically, the mutants are cultivated under agitated conditions in an aerial submerged fermentation at a temperature ranging from 25 to 37°C, preferably at 28°C. The following carbohydrates and carbon derivatives are used as carbon sources: glucose, galactose, lactose, sucrose, maltose, glycerol, mannitol, and the like. Useful nitrogen sources include amino acids and their mixtures, peptides, proteins and their hydrolysates, such as peptone, yeast extract, soy flour, corn soaking solution, fish extract, meat extract, and aqueous extract of cereal grains. Fermentation is carried out for 180-220 hours. The pH of the medium is usually initially adjusted to 6.4-6.6, and during fermentation it increases to 7.0-8.5. The best results are usually achieved with a fermentation time of 200 hours. After fermentation, the rifamycins can be isolated as follows: the fermentation medium is filtered at a final pH of 7.0-8.5, the filtrate is rapidly acidified, preferably to a pH of less than about 5, to ensure maximum stability of the antibiotic substances, and the substances are then extracted with water-immiscible solvents such as chloroform, butanol, ethyl acetate, propyl acetate, butyl acetate, or amyl acetate. The volume ratio of medium to solvent varies with the type of solvent and is typically between 2:1 and 10:1. Because the mycelium retains certain amounts of microbiologically active substances, it is extracted with a water-immiscible solvent, after which the extract is combined with the organic layer containing most of the rifamcins. Alternatively, the active substances can be extracted from the mycelium with a water-miscible solvent, such as acetone. In this case, the liquid is filtered, acetone is distilled from the filtrate under reduced pressure, and the rifamycins are extracted from the residue using a water-immiscible solvent, and the procedure is then repeated as described previously. Most of the antibacterial substances are transferred to the solvent, which is then distilled to dryness under reduced pressure, preferably at a temperature below 30°C. The crude product containing the rifamycins can be purified by column chromatography on silica gel. Before chromatography, the crude product is conveniently dissolved in a phosphate buffer with a pH of 7.0-8.0 and then treated with a mild oxidizing agent. The buffer solution is then extracted with a water-immiscible solvent. The resulting organic extract contains a new rifamycin, called rifamycin R. After extraction, the buffer solution is acidified to pH 2.4 and then extracted with a water-immiscible solvent. The extract obtained contains three new compounds from the rifamycin group, named rifamycin P, rifamycin Q and rifamycin U. Further purification of the crude rifamycin R is carried out by chromatography on a column packed with a suitable adsorbent material, such as silica gel, using as eluant a suitable mixture of organic solvents. The second organic extract, containing rifamycins P, Q and U, is purified by a method identical to that described for rifamycin R. The physicochemical characteristics of the new rifamycins P, Q, R and U, prepared by the method according to the invention, are presented below. Rifamycin P. Elemental analysis: 97788 6 Found: ( /o) — C = 60.6, H = 6.2, N = 3.8, O = 25.2, S = 4.1. The spectrum in ultraviolet and visible light shows the following absorption bands: .1% l cm methanol X max/mw E x ( 406 197 350 (blurred) 297 344 257 423 224 550 0.1 n HC1 X max(niw) E ; (. ^ 416 183 300 319 225 521 10 X ma°/« (m/u) 406 350' 297 257 224 2 F * % 178 (blurred) 305 405 518 The entire spectrum graph is shown in Fig. 1. This spectrum was obtained using a 15 Perkin Elmer Spectracord 4000 A apparatus. In the infrared spectrum, the most significant absorption bands of the substance suspended in Nujol were found at the following frequencies (cm-1): 3700-3150 (medium, broadened), 3100 (weak), 3060-2800 (very strong), 1465 (strong), 1380 (broadened) — Nujal, 1722 (medium), 1645 (medium, broadened), 1580 (medium), 1510 (medium), 1323 (medium), 1250 (strong, broadened), 1160 (medium), 1130 (weak), 1070 (medium, broadened), 1030 (weak), 982 (medium), 960 (medium), 925 (weak), 890 (medium), 818 (weak), 770 (weak), 735 (weak). The complete infrared spectrum is shown in Figure 2. This spectrum was obtained on a Perkin Elmer Mod. 421 instrument. The mass ion M+ in the mass spectrum, obtained at 70 eV, has a ratio of — = 738. This spectrum was obtained on a Hitachi Perkin Elmer RMU-6L instrument. The complete nuclear magnetic resonance spectrum, obtained at a frequency of 100 MHz in CDC13, is shown in Figure 3. The compound does not exhibit polarographic behavior characteristic of rifamycins, 40 caused by a chromophoric group in the quinone part of the molecule. Rifamycin Q. Elemental analysis: found: C = 60.7, H = 6.3, N = 3.60, O = 25.3 S = 4.2. 45 The ultraviolet-visible spectrum shows the following absorption bands in methanol: 50 55 In the infrared spectrum, the most significant absorption bands of the substance suspended in Nujol were found at the following frequencies (cm-1): 3700 3300 (strong, broadened), 3300-3080 (medium, broadened), 3040-2780 (very strong), 1460 (strong), 1378 (strong) — nujol, 1740 (medium), 1700 (medium), 1650 (strong, broadened), 1605 (strong, broadened), 1555 (strong), 1510 (medium, broadened), 1315 (weak), 1275 (medium), 1240 (medium), 1220 (medium), 65 1160 (medium), 1090 (medium), 1050 (medium, broadened), 1020 (weak), 970 (medium), 945 (weak), 910 (medium), 808 (medium), 765 (weak), 720 (weak). The complete infrared spectrum is shown in Figure 4. The complete magnetic resonance spectrum The nuclear spectrometry, performed at a frequency of 60 MHz in CDCl3, is shown in Figure 7. Rifamycin R. Elemental analysis: found: C = 62.0, H = 6.4, N = 2.2, O = 29.6. The ultraviolet and visible spectrum shows the following absorption bands in a 0.1 N solution of hydrogen chloride in methanol: X max (nuO 219 281 340 410 X F 1 % 444 415 114 72 In the infrared spectrum, the most significant absorption bands of the substance suspended in Nujol were found at the following frequencies (cm-1): 3700—3100 (strong, broadened), 3040—2780 (very strong), 1465 (strong), 1380 (strong) — nujol, 1745 (strong), 1710 (medium), 1640 (strong), 1600 (strong), 1505 (strong), 1415 (medium), 1325 (strong), 1260 (strong, broadened), 1220—1130 (strong, broadened), 1120 (weak), 1075 (strong), 1020 (weak), 975 (strong), 950 (weak), 920 (weak), 888 (medium), 823 (medium), 785 (weak, broadened), 735 (weak, broadened), 650 (weak, broadened). The entire infrared spectrum is shown in Fig. 5. Ion The mass spectrometer M+ in the mass spectrum, obtained at 70 eV, has a value of the ratio _ = 711. The complete nuclear magnetic resonance spectrum, obtained at a frequency of 60 MHz in CDCl3, is shown in Figure 6. This compound shows polarographic behavior typical of rifamycins, caused by the chromophore group in the quinone part of the molecule. The above data confirm formula 1 for rifamycin R. Rifamycin U. The ultraviolet and visible spectrum shows the following absorption bands in methanol: X max (ml«) 412 353 299 258 220 1 F 1% * ^ lem 163 (blurred) 265 389 451 In the spectrum In the infrared, the most significant absorption bands of the substance suspended in Nujol were found at the following frequencies (cm-1): 3700-3100 (medium, broadened), 3060 (very weak), 3040-2740 (very strong), 2720 (very weak), 1460 (strong), 1378 (medium) — Nujol, 1750-1705 (medium, broadened), 1680-1620 (medium, broadened), 1600 (strong), 1558 (strong), 1490 (weak), 1308 (weak), 1270 (weak, diffuse), 1245 (medium, diffuse), 1225 (medium), 1160 (medium), 1120 (weak), 1090 (very weak), 1070 (weak), 1030 (very weak), 1020 (very weak), 1000 (very weak), 975 (weak), 960 (weak, diffuse), 905 (medium), 850 (medium), 802 (weak), 800 (very weak, diffuse), 777 (very weak), 760 (very weak), 720 (very weak), 685 (very weak), 670 (very weak). The biological activity of the new rifamycins obtained by the method according to the invention is presented in Tables V and VI. The range of in vitro antibacterial activity of rifamycins P, Q and R is presented in Table V. The new compounds produced by the method according to the invention also demonstrate activity in tests carried out on laboratory animals infected with strains of Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Table VI presents the results of representative experiments carried out on mice, in which the activity of the compounds produced by the method according to the invention and the known natural rifamycin, i.e. rifamycin SV, was compared. The highest activity is demonstrated by rifamycin P, which is also characterized by low toxicity, since the ED50 value obtained for it in mice is higher than 500 mg/kg after intraperitoneal administration. The method according to the invention is presented in more detail in the examples. Example I. Mutant strain designated as Nocardia mediterranea ATCC 31064, is incubated for 6-8 days on Bennett's agar at 28°C. The culture obtained on the agar slant is inoculated into two 500 ml Erlenmeyer flasks under sterile conditions. The flasks each contain 10.0 ml of a vegetative medium with the following composition: Beef extract 5 g Yeast extract 5 g Peptone 5 g Casein hydrolysate 3 g Glucose 20 g NaCl 1.5 g Water to make up 1 liter The pH of the medium is adjusted to 7.3 with sodium hydroxide. The inoculated flasks are placed on a variable shaker at 28°C and shaken for 72 minutes. The contents of these two flasks are used as inoculum and poured into a 10-liter pre-fermenter containing 4 liters of the described vegetative medium. Incubation is carried out at 28°C, with the fermenter contents stirred at 300 rpm and air passed through the fermenter at a rate of 1 volume of air per 1 volume of medium per minute. After 48 hours, the cell volume has increased to 7-10% of the total volume. Next, 4 liters of fermentation medium are prepared in a 10-liter glass fermenter with the following composition: peanut flour 25 g, soy flour 5 g (NH4)2SO4 9.5 g MgSO4 7H2O 0.85 g Glucose 95 g Glycerin 40 g KH2P04 1 g Propylene glycol 5 g CaCO3 8.5 g Sodium diethylbarbiturate 1.7 g CuSO4'5H2O 2.8 mg FeSO4 7H20 8.5 mg ZnSO4 7H20 42.5 mg MnSO4 4H20 3.4 mg CaCl2 6H20 1.7 mg (NH4)6M07O24 4H2O 0.85 mg water to make up to 1 liter. r **- The pH of the medium is adjusted to 7.8 with NaOH. Sterilization is carried out at 120°C for 60 minutes. After sterilization, the pH is 6.4. 5% of the volume of the pre-fermenter contents is used as the inoculum. Fermentation is carried out at 28°C, with stirring at 750 rpm and air circulation at a rate of 1 volume of air per 1 volume of medium per minute. Silicone A is used as an antifoaming agent. During fermentation, the culture broth takes on a characteristic reddish-brown color. After 200 hours, an increase in the cell volume is achieved in relation to the total volume of the medium. The pH of the broth reaches 7.5 and at this point the broth is subjected to the isolation process. Example II. A culture of the Nocardia mediterranea ATCC 31064 strain, prepared as described in Example 1, is grown in a flask with stirring in a manner identical to that described in Example 1. The obtained pre-culture is poured into a 10-liter glass fermenter containing a medium with the following composition: Glucose 5 g Peanut flour 7.5 g CaCos 1.65 g MgSO4 7H2O 0.33 g KH2PO4 0.33 g FeSO4 7H2O 3.3 mg ZnSO4 7H2O 16.5 mg MnSO4 4H2O 1.3 mg water to bring the volume to 1 liter. The pH of the whole is adjusted to 1000 mL. to 7.5. Sterilization is carried out for 50 minutes at 120°C. After sterilization, the pH is 6.4. Cultivation is continued for 48 hours, achieving an increase in cell volume to 6-8% of the total volume of the medium. The obtained culture in the amount of about 10% is used as inoculum for a 20 liter glass fermenter containing 10 liters of fermentation medium with the following composition: Liquid obtained after soaking corn 20 g Makasoya 15 g (NH4)2SO4 6 g MgSO4 7H2O 0.85 g Glucose 100 g KH2PO4 1 g CaCO3 6 g FeSO4 7H2O 8.5 mg ZnSO4 7H2O 42.5 mg MnSO4 4H2O 3.4 mg CuSO4 5H2O 2.8 mg CoCl2 6H2O 1.7 mg M water to make up the volume of 1 The pH of the mixture was adjusted to 7.8 with NaOH. Sterilization was carried out for 50 minutes at 120°C. After sterilization, the pH was 6.4. Fermentation was carried out for 200 hours at 28°C. The final pH of the fermentation broth was 7.5. The fermentation broths obtained by the methods described in Examples 1 and 2 were purified as follows. The mycelia were filtered off and discarded, and the filtrate was adjusted to a pH of 2.0 with KM (volume per volume) of hydrochloric acid and extracted three times with equal volumes of ethyl acetate. The solvent was completely distilled from the organic extract under reduced pressure at 35°C, and the residue obtained (4 g as described in Example 1 and 11 g as described in Example 2) was dissolved in a 0.05 molar sodium phosphate solution, pH 7.5, and sufficient sodium nitrite was added to give a final concentration of 0.2% (w/v). The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, after which the buffer solution was extracted three times with equal volumes of ethyl acetate. The combined organic layers were completely evaporated under reduced pressure at 35°C to obtain a first ethyl acetate extract. The buffer solution remaining after extraction was adjusted to pH 2.0 with 10% hydrochloric acid and re-extracted three times with equal volumes of ethyl acetate. The extracts were combined and evaporated under reduced pressure at 35°C to obtain a second ethyl acetate extract. The dry powder, after distilling off the solvent from the first ethyl acetate extract (1.4 g in Example 1 and 4.2 g in Example 2), was dissolved in chloroform and chromatographed on a silica gel column (70-55 40-230 mesh ASTM), using chloroform containing 2% (v/v) of methyl alcohol as the eluent. The eluate collected from the column is predominantly rifamycin R, which is recognized by its orange-brown color. Thin-layer chromatography using silica gel plates (Merck 60 F254) and a 95:5 mixture of chloroform and methyl alcohol as a developing system shows that the Rf value for rifamycin is 0.59. The fractions containing rifamycin R are combined, the solvent is completely distilled off under reduced pressure at 35°C, the residue is redissolved in ethyl acetate, the resulting solution is washed with 0.01 N hydrochloric acid solution and finally with water. The solvent is distilled off from the organic layer until a small volume of concentrated solution is obtained, from which rifamycin R crystallizes at 4°C (600 mg of the compound are obtained according to the method of Example I and 1.6 g of the compound according to the method of Example II). The second ethyl acetate extract is also purified by column chromatography on silica gel in a manner similar to that used for rifamycin R. The dry residue after distilling off the ethyl acetate (2.4 g in the case of the method described in Example 1 and 4.2 g in the case of the method described in Example 2) is dissolved in chloroform and applied to the column. The column is eluted with a mixture of chloroform and methyl alcohol of composition 98.2. First, rifamycin U is obtained, then rifamycin P, and finally rifamycin Q. All these compounds are yellow-orange in color and are identified by thin-layer chromatography. Using silica gel plates (Merck 60 F2g4), the development system is a mixture chloroform and methyl alcohol with a composition of 95:5, the following Rf values are obtained: rifamycin U, rifamycin P, rifamycin Q Rf = 0.63 Rf = 0.57 Rf = 0.32 Appropriate fractions containing rifamycin U, P and Q are combined, and the solvent is distilled from them under reduced pressure and obtain dryness the residue crystallizes from ethyl acetate. Using the wort obtained in Example I, 80 mg of rifamycin U, 400 mg of rifamycin P, 280 mg of rifamycin Q are obtained, and using the wort obtained in Example II, 190 mg of rifamycin U, 900 mg rifamycin P, and 750 mg of rifamycin Q. Using a procedure identical to that described in the above examples, and as the production strains, respectively, Nocardia mediterrahea ATCC 31065 or Nocardia maditerranea ATCC 31066, rifamycins are obtained with yields of the same order as described previously. nio.97788 11 12 PL PL PL PL PL PL