Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych ryfamycyn na drodze fermentacji wywola¬ nej przez mutanty szczepu Streptomyces mediter- ranei na wodnej pozywce wzrostowej w obecnosci tlenu.W niniejszym opisie te nowe ryfamycyny ozna¬ czono jako ryfamycyne P, ryfamycyne Q, ryfa¬ mycyne R i ryfamycyne U.We wczesniejszych pracach stwierdzono, ze w czasie fermentacji na normalnej pozywce wzrosto¬ wej, wywolanej przez drobnoustroje ze szczepu Streptomyces mediterranei wytwarzana jest gru¬ pa antybiotyków, lacznie okreslona jako zespól ryfamycyn P..i(Sensi i wspólpracownicy, Antibioties Annual 1959—1960, strona 262). Autorzy nastepnej pracy stwierdzili, ze dodanie soli sodowej estru dwuetylowego kwasu barbiturowego do podloza hodowlanego, powoduje wytworzenie zasadniczo pojedynczego produktu fermentacji, to znaczy ry¬ famycyny B (Margalith P. i Pagani H., Applied Microbiology, 9, 325, H961). Zgodnie z nastepnym odkryciem stwierdzono, ze mutanat szczepu Strep¬ tomyces mediterranei wytwarza wylacznie ryfamy¬ cyne B, niezaleznie od obecnosci lub nieobecnosci soli sodowej estru dwuetylowego kwasu barbitu¬ rowego w podlozu fermentacyjnym. Dalo to ule¬ pszony sposób wytwarzania ryfamycyny B. Szczep drobnoustrojów, produkujacych ryfamycyne B, o- kreslono jako Streptomyces mediterranei ATCC 21789. (patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 3 871965).Nowa substancje antybiotyczna, sposobem we¬ dlug niniejszego wynalazku wytwarza sie za pomo¬ ca fermentacji, wywolanej przez zmutowany szczep, uzyskany ze szczepu Streptomyces medi¬ terranei ATCC 13685, prowadzonej w warunkach tlenowych, w obecnosci przyswajalnego zródla we¬ gla, azotu i niezbednych soli mineralnych.Nowe zmutowane szczepy, stosowane w sposo¬ bie wedlug wynalazku, uzyskuje sie za pomoca dzialania na szczep ATCC 13685 zwykle stosowa¬ nymi chemicznymi czynnikami mutagennymi, ta¬ kimi jak kwas azotowy lub pochodne nitrozogu- anidyny lub tez za pomoca dzialania fizycznymi czynnikami mutagennymi, takimi jak promienie Roentgena lub promienie nadfioletowe.Nowy zmutowany szczep okresla sie jako przy¬ nalezny raczej do rodzaju Nocardia, niz do ro¬ dzaju Streptomyces mediterranei, zgodnie z pro¬ pozycjami Thiemanna i jego wspólpracowników, ogloszonymi w Arch. Mikrobiol., 67, 147—155,i(1969).Izolacje zmutowanych szczepów, wytwarzajacych nowe ryfamycyny, przeprowadza sie nastepujaco: zawiesine zarodników Streptomyces mediterranei ATCC 13685 poddaje sie w ciagu 60 minut w temperaturze 28°C dzialaniu N-metylo-N'-nitro-N- -nitrozoguanidyny o stezeniu 1 mg/ml, przy war¬ tosci pH równej 9,0, uzyskanej za pomoca buforu trój(hydroksymetylo)aminometanowego. Nastepnie zarodniki przemywa sie i umieszcza na plytkach Petriego, zawierajacych agar Bennetta. 97 7883 97788 4 W ciagu 14 dni przeprowadza sie inkubacje w temperaturze 28°C, nastepnie wybiera sie kolonie i bada ich zdolnosci do hamowania wzrostu drob¬ noustrojów Bacillus subtilis. Badanie to przepro¬ wadza sie nastepujaco: Plytke agaru (srednica 4—8 mm), przenoszaca po¬ jedyncza kolonie, umieszcza sie na plytoe Petrie- go, zawierajacej agar Penaszaya o wartosci pH = = 7,2, uprzednio zaszczepiony #Vo (objetosc/obje¬ tosc) szczepem Bacillus subtilis.W podanych powyzej warukach ryfamycyna B praktycznie nie wykazuje aktywnosci i normalne kolonie drobnoustrojów, wytwarzajacych ryfamy- cyne B, nie hamuja wzrostu drobnoustrojów Ba¬ cillus subtilis w opisanym agarze. Tymczasem ja¬ kakolwiek kolonia drobnoustrojów, wytwarzaja¬ cych nowe ryfamycyny o aktywnosci przeciwbak- teryjnej, wywoluje wyraznie odciete strefy zaha¬ mowania wzrostu drobnoustroju Bacillus subtilis wokól plytek agaru. Sposobem, opisanym wyzej, wyizolowano trzy szczepy drobnoustrojów i wedlug kodu wewnetrznego oznaczono je jako D — 2, MM 18 — 6, oraz M — 36. Próbki tych trzech drobnoustrojów zlozono w ATCC, gdzie sa one o- kreslone odpowiednio jako Nocardia mediterranea ATCC 31064, Nocardia mediterranea 31065 i No¬ cardia mediterranea ATCC 31066.Ponizej przedstawiono charakterystyki nowych szczepów Nocardia mediterranea, stosowanych w sposobie wedlug wynalazku. W tablicy I zestawio¬ no wyniki makroskopowego i mikroskopowego ba¬ dania szczepów Nocardia mediterranea, okreslo¬ nych odpowiednio jako ATCC 31064, 31Ó65, 31066.W tablicy II przedstawiono charakterystyki ho¬ dowlane wymienionych powyzej szczepów Nocar¬ dia mediterranea. Przedstawiono takze charakte¬ rystyki szczepu rodzicielskiego, to znaczy szczepu Streptomyces mediterranei ATCC 13685 (ME/83).Sposób prowadzenia fermentacji zasadniczo po¬ lega na hodowli jednego z wymienionych muta¬ ntów szczepu Streptomyces mediterranei, prowa¬ dzonej na pozywce, zawierajacej przyswajane zró¬ dla azotu i wegla oraz niezbedne sole mineralne, dotad az uzyska sie znaczna wartosc aktywnosci przeciwbakteryjnej wymienionej pozywki, po czym ryfamycyny ekstrahuje sie z podloza.Bardziej szczególowo, mutanty hoduje sie w cza¬ sie mieszania w warunkach napowietrznej fer¬ mentacji glebinowej w temperaturze w zakresie od 25 do 37°C, korzystnie w temperaturze 28°C.Jako zródla wegla stosuje sie nastepujace weglo¬ wodany i pochodne wegla: glikoza, galaktoza, lak¬ toza, sacharoza, maltoza, gliceryna, mannitol i tym podobne. Uzytecznymi zródlami azotu sa na przyklad aminokwasy i ich mieszaniny, peptydy, bialka i ich hydrolizaty, jak pepton, ekstrakt droz¬ dzowy, maka sojowa, roztwór uzyskany przez na¬ moczenie ziarn kukurydzy, wyciag z ryb, ekstrakt z miesa, wyciag wodny z ziarn zboza. Fermenta¬ cje prowadzi sie w ciagu 180—220 godzin.Wartosc pH pozywki zwykle poczatkowo dopro¬ wadza sie do wartosci 6,4—6,6, a w czasie fermen¬ tacji wzrasta ona do 7,0—8,5. Najlepsze wyniki uzyskuje sie zazwyczaj, prowadzac fermentacje w ciagu 200 godzin. Po zakonczeniu fermentacji ry¬ famycyny mozna izolowac nastepujaco: pozywke fermentacyjna saczy sie przy koncowej wartosci pH równej 7,0—8,5, przesacz szybko zakwasza sie, korzystnie do wartosci pH nizszej niz okolo 5, w celu zapewnienia warunków najwiekszej stabil¬ nosci substancji antybiotycznych i substancje te nastepnie ekstrahuje sie za pomoca rozpuszczal¬ ników niemieszajacych sie z woda, takich jak chloroform, butanol, octan etylu, octan propylu, octan butylu lub octan amylu. Stosunek objetosci podloza do objetosci rozpuszczalnika zmienia sie zaleznie od rodzaju rozpuszczalnika i zwykle sto¬ suje sie stosunek o wartosci od 2:1 do 10:1.Poniewaz grzybnia zatrzymuje pewne ilosci sub¬ stancji o aktywnosci mikrobiologicznej, dlatego poddaje sie ja ekstrakcji za pomoca rozpuszczal¬ nika niemieszajacego sie z woda, po czym ekstrakt laczy sie z warstwa organiczna, zawierajaca wie¬ kszosc ryfamacyn. Ewentualnie ekstrakcje akty¬ wnych substancji z grzybni mozna przeprowadzac za pomoca rozpuszczalnika mieszajacego sie z wo¬ da, takiego jak aceton. W tym przypadku ciecz odsacza sie, z przesaczu oddestylowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem aceton, z pozostalosci ekstrahu¬ je sie ryfamycyny za pomoca rozpuszczalnika nie¬ mieszajacego sie z woda, po czym postepuje sie, jak opisano poprzednio.Wiekszosc substancji o aktywnosci przeciwbak¬ teryjnej przeprowadza sie do rozpuszczalnika, któ¬ ry nastepnie oddestylowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem do sucha, korzystnie w temperaturze nizszej niz 30°C.Surowy produkt, zawierajacy ryfamycyny, moz¬ na oczyszczac za pomoca chromatografii kolum¬ nowej na zelu krzemionkowym. Przed chromato¬ grafia surowy produkt dogodnie rozpuszcza sie w buforze fosforanowym o wartosci pH równej 40 7,0—8,0, po czym poddaje sie dzialaniu lagodnego czynnika utleniajacego. Nastepnie roztwór w bu¬ forze poddaje sie ekstrakcji za pomoca rozpu¬ szczalnika niemieszajacego sie z woda. Uzyskany ekstrakt organiczny zawiera nowa ryfamycyne, na- 45 zwana ryfamycyna R.Roztwór buforowy po ekstrakcji zakwasza sie do wartosci pH = 2,4, po czym ekstrahuje rozpu¬ szczalnikiem niemieszajacym sie z woda. Uzyska¬ ny ekstrakt zawiera trzy nowe zwiazki z grupy 50 ryfamycyn nazwane ryfamycyna P, ryfamycyna Q i ryfamycyna U.Dalsze oczyszczanie surowej ryfamycyny R prze¬ prowadza sie za pomoca chromatografii na ko- „ lumnie, wypelnionej odpowiednim materialem ad- 55 sorbujacym, takim jak zel krzemionkowy, stosu¬ jac jako eluat odpowiednia mieszanine rozpusz¬ czalników organicznych.Drugi ekstrakt organiczny, zawierajacy ryfa- 60 mycyny P, Q i U, oczyszcza sie sposobem identy¬ cznym, jak opisano dla ryfamycyny R.Ponizej przedstawiono fizykochemiczne charak¬ terystyki nowych ryfamycyn P, Q, R i U, wytwo¬ rzonych sposobem wedlug wynalazku. 65 Ryfamycyna P. Analiza elementarna:97788 6 Znaleziono: (•/o) — C = 60,6, H = 6,2, N=3,8, O = 25,2, S=4,l.Widmo w nadfiolecie i w swietle widzialnym wykazuje nastepujace pasma absorpcji: .1% l cm metanol X max/mw E x ( 406 197 350 (rozmyte) 297 344 257 423 224 550 0,1 n HC1 X max(niw) E ; (.^ 416 183 300 319 225 521 10 X ma°/« (m/u) 406 350' 297 257 224 2 F * % 178 (rozmyte) 305 405 518 Caly wykres widma przedstawiono na rysunku fig. 1. Widmo to wykonano za pomoca aparatu 15 Perkin Elmer Spectracord 4000 A.W widmie w podczerwieni najbardziej znaczace pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nujo- lu, stwierdzono dla nastepujacych czestotliwosci (cm-1): 3700—3150 (srednie, poszerzone), 3100 (sla- 20 be), 3060—2800 (bardzo silne), 1465 (silne), 1380 (po¬ szerzone) — nujal, 1722 (srednie), 1645 (srednie, po¬ szerzone), 1580 (srednie), 1510 (srednie), 1323 (sre¬ dnie), 1250 (silne, poszerzone), 1160 (srednie),. 1130 (slabe), 1070 (srednie, poszerzone), 1030 (slabe), 25 982 (srednie), 960| (srednie), 925 (slabe), 890 (srednie), 818 (slabe), 770 (slabe), 735 (slabe).Caly wykres widma w podczerwieni przedsta¬ wiono na rysunku fig. 2, Widmo to wykonano na aparacie Perkin Elmer Mod. 421.Jon masowy M+ w widmie masowym, uzyskany przy 70 eV ma wartosc stosunku — = 738. Wid- e mo to wykonano za pomoca aparatu Hitachi Perkin ElmerRMU-6L. 35 Cale widmo magnetycznego rezonansu jadrowego, wykonane przy czestotliwosci 100 MHz w CDC13, przedstawiono na rysunku fig. 3.Zwiazek nie wykazuje charakterystycznego dla ryfamycyn zachowania w polarografii, wywolane- 40 go chromoforowa grupa w chinonowej czesci cza¬ steczki.Ryfamycyna Q. Analiza elementarna: znaleziono: C = 60,7, H = 6,3, N= 3,60, 0=25,3 S=4,2. 45 Widmo z nadfiolecie w swietle widzialnym wy¬ kazuje nastepujace pasma absorpcji w metanolu: 50 55 W widmie w7 podczerwieni najbardziej znacza¬ ce pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nu- jolu, stwierdzono dla nastepujacych czestotliwos¬ ci (cm-1): 3700 3300 (silne, poszerzone), 3300—3080 (srednie, 60 poszerzone), 3040—2780 (bardzo silne), 1460 (silne), 1378 (silne) — nujol, 1740 (srednie), 1700 (srednie), 1650 (silne, poszerzone), 1605 (silne, poszerzone), 1555 (silne), 1510 (srednie, poszerzone), 1315 (sla¬ be), 1275 (srednie), 1240 (srednie), 1220 (srednie), 65 1160 (srednie), 1090 (srednie), 1050 (srednie, po¬ szerzone), 1020 (slabe), 970 (srednie), 945 (slabe), 910 (srednie), 808 (srednie), 765 (slabe), 720 (slabe).Cale widmo w podczerwieni przedstawiono na rysunku fig. 4.Cale widmo magnetycznego rezonansu jadrowe¬ go, wykonane przy czestotliwosci 60 MHz w CDCI3, przedstawiono na rysunku fig. 7.Ryfamycyna R. Analiza elementarna: znaleziono: C=62,0, H=6,4, N = 2,2, O=29,6.Widmo w nadfiolecie i w swietle widzialnym wykazuje nastepujace pasma absorpcji w 0,1 n roztworze chlorowodoru w metanolu: X max(nuO 219 281 340 410 X F 1 % 444 415 114 72 W widmie w podczerwieni najbardziej znaczace pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nujolu, stwierdzono dla nastepujacych czestotliwosci (cm-1): 3700—3100 (silne, poszerzone), 3040—2780 (bardzo silna), 1465 (silne), 1380 (silne) — nujol, 1745 (sil¬ ne), 1710 (srednie), 1640 (silne), 1600 (silne), 1505 (silne), 1415 (srednie), 1325 (silne), 1260 (silne, po¬ szerzone), 1220—1130 (silne, poszerzone), 1120 (sla¬ be), 1075 (silne), 1020 (slabe), 975 (silne), 950 (sla¬ be), 920 (slabe), 888 (srednie), 823 (srednie), 785 (slabe, poszerzone), 735 (slabe, poszerzone), 650 (slabe, poszerzone).Cale widmo w podczerwieni przedstawiono na rysunku fig. 5.Jon masowy M+ w widmie masowym, uzyska¬ ny przy 70 eV, ma wartosc stpsunku _ = 711. e Cale widmo magnetycznego rezonansu jadro¬ wego, wykonane przy czestotliwosci 60 MHz w CDCI3, przedstawiono na rysunku fig. 6.Zwiazek ten wykazuje charakterystyczne dla ry¬ famycyn zachowanie w polarografii, wywolane grupa chromoforowa w chinonowej czesci czastecz¬ ki.Powyzsze dane potwierdzaja wzór 1 dla ryfarriy- cyny R.Ryfamycyna U. Widmo w nadfiolecie i w swie¬ tle widzialnym wykazuje nastepujace pasma ab¬ sorpcji w metanolu: X max(ml«) 412 353 299 258 220 1 F 1% * ^ lem 163 (rozmyte) 265 389 451 W widmie w podczerwieni najbardziej znaczace pasma absorpcji substancji, zawieszonej w nujolu', stwierdzono dla nastepujacych czestotliwosci (cm-1): 3700—3100 (srednie, poszerzone), 3060 (bardzo sla¬ be), 3040—2740 (bardzo silne), 2720 (bardzo sla-97788 8 be), 1460 (silne), 1378 (srednie) — nujol, 1750—1705 (srednie, poszerzone), 1680—1620 (srednie, posze¬ rzone), 1600 (silne), 1558 (silne), 1490 rzone), 1308 (slabe), 1270 (slabe, rozmyte), 1245 (srednie, rozmyte), 1225 (srednie), 1160 (srednie), 1120 (slabe), 1090 (bardzo slabe), 1070 (slabe), 1030 (bardzo slabe), 1020 (bardzo slabe), 1000 (bardzo slabe), 975 (slabe), 960 (slabe, rozmyte), 905 (sred¬ nie), 850 (srednie), 802 (slabe), 800 (bardzo slabe), rozmyte), 777 (bardzo slabe), 760 (bardzo slabe), 720 (bardzo slabe), 685 (bardzo slabe), 670 (bardzo slabe).Aktywnosc biologiczna nowych ryfamycyn, otrzy¬ manych sposobem wedlug wynalazku, przedsta¬ wiono w tablicach V i VI.Zakres przeciwbakteryjnego dzialania in vitro ryfamycyn P, Q i R przedstawiono w tablicy V.Nowe zwiazki, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, wykazuja takze aktywnosc dzialania w próbach, przeprowadzonych na laboratoryjnych zwierzetach, zakazonych szczepami Staphylococcus aureus i Escherichia coli.W tablicy VI przedstawiono wyniki reprezenta¬ tywnych doswiadczen, przeprowadzonych na my¬ szach, w których porównywano dzialanie zwiaz¬ ków, wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku i znanej ryfamycyny naturalnej, to znaczy ryfa¬ mycyny SV.Najwieksza aktywnosc dzialania wykazuje ry- famycyna P, która charakteryzuje sie takze niska toksycznoscia, poniewaz uzyskana dla niej wartosc ED50 dla myszy jest wyzsza niz 500 mg/kg po podaniu dootrzewnowo.Sposób wedlug wynalazku jest blizej przedsta¬ wiony w przykladach.Przyklad I. Zmutowany szczep, oznaczony jako Nocardia mediterranea ATCC 31064, inkubu- je sie w ciagu 6—8 dni na agarze Bennetta w temperaturze 28°C. Hodowla, uzyskana na skosie agarowym, inokuluje sie dwie kolby Erlenmeyeaa o pojemnosci 500 ml przy zachowaniu jalowych warunków. • Kolby zawieraja po 10.0 ml pozywki wegetaty¬ wnej o nastepujacym skladzie: Ekstrakt z wolowiny 5 g Ekstrakt z drozdzy 5 g Pepton 5 g Hydrolizat kazeiny 3 g Glikoza 20 g NaCl 1,5 g woda ilosc uzupelniajaca do objetosc 1 litra Za pomoca wodorotlenku sodowego doprowadza sie wartosc pH pozywki do wartosci 7,3. Inokulo- wane kolby umieszcza sie na zmiennej wstrzasar- ce w temperaturze 28°C i wstrzasa w ciagu 72 go¬ dzin. Zawartosc tych dwu kolb uzywa sie jako inokulum i wylewa sie ja do wstepnego fermen- tora o pojemnosci 10 litrów, zawierajacego 4 li¬ try opisanej pozywki wegetatywnej. Inkubacje prowadzi sie w temperaturze 28°C, mieszajac za¬ wartosc fermentora z szybkoscia 300 obrotów na minute i przepuszczajac przez fermentor powie- trze z szybkoscia 1 objetosc powietrza na 1 obje¬ tosc pozywki w ciagu 1 minuty. Po 48 godzinach uzyskuje sie wzrost objetosci komórek do 7—10f/o calkowitej objetosci. W nastepnym etapie w szkla- nym fermentatorze o pojemnosci 10 litrów przy¬ gotowuje sie 4 litry pozywki fermentacyjnej o nastepujacym skladzie: Maka z orzechów ziemnych 25 g Makasojowa 5 g (NH4)2S04 9,5 g MgS04 • 7H20 0,85 g Glikoza 95 g Gliceryna 40 g KH2P04 1 g Glikolpropylenowy 5 g CaCOs 8,5 g Dwuetylobarbituran sodowy 1,7 g CuS04'5H20 2,8 mg FeS04 • 7H20 8,5 mg ZnS04 • 7H20 42,5 mg MnS04 • 4H20 3,4 mg CaCl2 • 6H20 1,7 mg (NH4)6M07O24 • 4H20 0,85 mg woda w ilosci uzupelniajacej do 1 litra. r **- Wartosc pH pozywki doprowadza sie do 7,8 za pomoca NaOH. Wyjalawianie prowadzi sie w tem¬ peraturze 120°C w ciagu 60 minut. Po wyjalowie- niu wartosc pH wynosi 6,4. Jako inokulum stosu¬ je sie 5f/o objetosci zawartosci fermentora wstep¬ nego.Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 28°C, stosujac mieszanie z szybkoscia 750 obrotów na minute i przepuszczanie powietrza z szybkoscia 1 objetosc powietrza na 1 objetosc pozywki w ciagu 1 minuty. Jako srodek przeciwko pienieniu stosuje sie silikon A. W czasie fermentacji brzeczka ho¬ dowlana przybiera charakterystyczna barwe czer- 40 wono-brazowa. Po 200 godzinach uzyskuje sie wzrost objetosci komórek w stosunku do calko¬ witej objetosci pozywki.Brzeczka przyjmuje wartosc pH = 7,5 i w tym momencie brzeczke poddaje sie procesowi izola- 45 cji.Przyklad II. Hodowle szczepu Nocardia me¬ diterranea ATCC 31064, przygotowana sposobem opisanym w przykladzie I, rozwija sie w kolbie podczas mieszania, sposobem identycznym, jak 50 opisany w przykladzie I. Uzyskana wstepna ho¬ dowle wylewa sie do szklanego fermentora o po¬ jemnosci 10 litrów, zawierajacego pozywke o na¬ stepujacym skladzie: Glikoza 5 g 55 Maka z orzechów ziemnych 7,5 g CaCos 1,65 g MgS04 • 7H20 0,33 g KH2P04 0,33 g FeS04 • 7H20 3,3 mg 60 ZnS04-7H20 16,5 mg MnS04-4H20 1,3 mg woda w ilosci uzupelniajacej do objetosci 1 litra.Wartosc pH calosci doprowadza sie do 7,5. Wy- 65 jalawianie przeprowadza sie w ciagu 50 minut w25 97788 9 temperaturze 120°C. Po wyjalowieniu pH przyj¬ muje wartosc 6,4. Hodowle prowadzi sie w ciagu 48 godzin, uzyskujac zwiekszenie objetosci komó¬ rek do 6—8°/t calkowitej objetosci pozywki. Uzy¬ skana hodowle w ilosci okolo 10°/o stosuje sie 5 jako inokulum dla szklanego fermentora o po¬ jemnosci 20 litrów, zawierajacego 10 litrów po¬ zywki fermentacyjnej o nastepujacym skladzie: Plyn uzyskany po namoczeniu kukurydzy 20 g Makasojowa 15 g 10 (NH4)2S04 6 g MgS04 • 7H20 0,85 g Glikoza 100 g KH2P04 lg CaC03 6 g 15 FeS04 • 7H20 8,5 mg ZnS04 • 7H20 42,5 mg MnS04 • 4H2Ó 3,4 mg CuS04 •5H20 2,8 mg CoCl2 • 6H20 1,7 mg M woda w ilosci uzupelniajacej do objetosci 1 litra.Wartosc pH calosci doprowadza sie do 7,8 za pomoca NaOH. Wyjalawianie przeprowadza sie w ciagu 50 minut w temperaturze 120°C. Po wyja¬ lowieniu wartosc pH wynosi 6,4. Fermentacje prze¬ prowadza sie w ciagu 200 godzin w temperaturze 28°C. Koncowa wartosc pH brzeczki fermentacyj¬ nej wynosi 7,5.Brzeczki fermentacyjne, uzyskiwane sposobami, opisanymi w przykladach I i II, oczyszcza sie na¬ stepujaco. Grzybnie odsacza sie i odrzuca, zas przesacz doprowadza sie do pH o wartosci 2,0 za pomoca KM (objetosc na objetosc) kwasu solnego i trzykrotnie ekstrahuje równymi objetosciami oc¬ tanu etylu. Z ekstraktu organicznego calkowicie od- destylowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem roz¬ puszczalnik w temperaturze 35°C i uzyskana po¬ zostalosc (4 g sposobem, opisanym w przykladzie I i 11 g sposobem, opisanym w przykladzie II), rozpuszcza sie w 0,05 molowym roztworze fosfo¬ ranu sodowego o pH = 7,5, po czym do roztworu dodaje sie azotyn sodowy w takiej ilosci, aby uzyskac koncowe jego stezenie 0,2V# (wagowo-ob- tf jetosciowych).Calosc miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 30 minut, po czym roztwór buforowy trzy¬ krotnie ekstrahuje sie równymi objetosciami octa¬ nu etylu. Z polaczonych warstw organicznych od- 50 destylowuje sie calkowicie rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 35°C i uzyskuje sie pierwszy ekstrakt z octanu etylu.Pozostaly po ekstrakcji roztwór buforowy dopro¬ wadza sie do pH = 2,0 za pomoca 10°/o kwasu 35 solnego i ponownie ekstrahuje trzykrotnie równy¬ mi objetosciami octanu etylu. Uzyskane ekstrakty laczy sie, oddestylowuje z nich rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 35°C i uzyskuje drugi ekstrakt z octanu etylu. 50 Suchy proszek po oddestylowaniu rozpuszczalni¬ ka z pierwszego ekstraktu w octanie etylu (1,4 g w przykladzie I i 4,2 g w przykladzie II) rozpu¬ szcza sie w chloroformie i chromatografuje na kolumnie, wypelnionej zelem krzemionkowym (70— 55 40 —230 mesh ASTM), stosujac jako eliient chloro¬ form, zawierajacy 2^/0 (objetosciowo-objetoscio- wych) alkoholu metylowego. W zebranym z kolum¬ ny eluacie wiekszosc stanowi ryfamycyna R, któ¬ ra rozpoznaje sie dzieki jej barwie pomaranczowo- -brazowej.Metoda chromatografii cienkowarstwowej, * przy uzyciu plytek, pokrytych zelem krzemionkowym (Merck 60 F254) i stosujac jako system rozwijajacy mieszanine chloroformu i alkoholu metylowego o skladzie 95:5 stwierdza sie, ze wartosc Rf dla ry¬ famycyny wynosi 0,59. Frakcje zawierajace ryfa¬ mycyne R laczy sie, calkowicie oddestylowuje z nich rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 35°C, pozostalosc ponownie roz¬ puszcza sie w octanie etylu, uzyskany roztwór przemywa sie 0,01 n roztworem kwasu solnego i na koniec woda.Z warstwy organicznej oddestylowuje sie roz¬ puszczalnik, az do uzyskania malej objetosci ste¬ zonego roztworu, z którego w temperaturze 4°C krystalizuje ryfamycyna R (uzyskuje sie 600 mg zwiazku sposobem wedlug przykladu I i 1,6 g zwiazku sposobem wedlug przykladu II). Drugi ekstrakt w octanie etylu oczyszcza - sie takze za pomoca chromatografii kolumnowej na zelu krze¬ mionkowym sposobem podobnym, jak stosowany dla ryfamycyny R. Sucha pozostalosc po oddesty¬ lowaniu octanu etylu (2,4 g w przypadku sposobu, opisanego w przykladzie I i 4,2 g w przypadku sposobu, opisanego w przykladzie II) rozpuszcza sie w chloroformie i nanosi na kolumne.Kolumne eluuje sie mieszanina chloroformu i alkoholu metylowego o skladzie 98,2. W pierwszej kolejnosci uzyskuje sie ryfamycyne U, nastepnie ryfamycyne P, zas na koncu ryfamycyne Q. Wszy¬ stkie te zwiazki charakteryzuja sie barwa zólto- -pomaranczowa i identyfikuje sie je za pomoca chromatografii cienkowarstwowej. Stosujac plytki z zelem krzemionkowym (Merck 60 F2g4), system rozwijajacy w postaci mieszaniny chloroformu i alkoholu metylowego o skladzie 95:5 uzyskuje sie nastepujace wartosci Rf: ryfamycyna U ryfamycyna P ryfamycyna Q Rf = 0,63 Rf = 0,57 Rf = 0,32 Odpowiednie frakcje, zawierajace ryfamycyne U, P i Q, laczy sie, oddestylowuje z nich rozpu¬ szczalnik pod zmniejszonym cisnieniem i uzyska¬ na sucha pozostalosc krystalizuje z octanu etylu.Stosujac brzeczke, otrzymana jak w przykladzie I, uzyskuje sie 80 mg ryfamycyny U, 400 mg ryfa¬ mycyny P, 280 mg ryfamycyny Q, zas stosujac brzeczke, otrzymana w przykladzie II, uzyskuje sie 190 mg ryfamycyny U, 900 mg ryfamycyny P, oraz 750 mg ryfamycyny Q.Stosujac sposób postepowania identyczny, jak opisany w powyzszych przykladach, oraz jako szczepy produkcyjne odpowiednio Nocardia me- diterrahea ATCC 31065 lub Nocardia maditerranea ATCC 31066 uzyskuje sie ryfamycyny z wydajno- sciami tego samego rzedu, jak opisano poprzed¬ nio.97788 11 12 PL PL The subject of the invention is a method of producing new rifamycins by fermentation induced by mutants of the Streptomyces mediterranei strain on an aqueous growth medium in the presence of oxygen. These new rifamycins are hereinafter designated as rifamycin P, rifamycin Q, rifamycin R and rifamycin. In earlier studies it was found that during fermentation on normal growth medium, caused by microorganisms of the Streptomyces mediterranei strain, a group of antibiotics is produced, collectively referred to as the rifamycin P.i complex (Sensi et al., Antibioties Annual 1959—) 1960, page 262). The authors of the next work found that the addition of sodium salt of barbituric acid diethyl ester to the culture medium produces essentially a single fermentation product, that is, raphamycin B (Margalith P. and Pagani H., Applied Microbiology, 9, 325, H961). According to a further finding, it was found that the mutant of the strain Streptomyces mediterranei produces exclusively rifamycin B, irrespective of the presence or absence of the sodium salt of barbitric acid diethyl ester in the fermentation medium. Dalo is an improved method of producing rifamycin B. The strain of rifamycin B producing microorganisms is designated Streptomyces mediterranei ATCC 21789 (see US Patent No. 3,871,965). The new antibiotic substance according to the present invention is produced by means of fermentation, induced by a mutant strain, obtained from the strain Streptomyces mediterranei ATCC 13685, carried out under aerobic conditions in the presence of an assimilable source of carbon, nitrogen and the necessary salts. The new mutant strains used in the method of the invention are obtained by treating the ATCC 13685 strain with commonly used chemical mutagenic agents, such as nitric acid or nitroso-ganidine derivatives, or by treating the ATCC 13685 strain with physical mutagenic agents. such as X-rays or ultraviolet rays. The new mutant strain is said to belong to the genus Nocardia rather than to the genus Streptomyces mediterranei, as proposed by Thiemann and his associates in Arch. Microbiol., 67, 147-155, and (1969). Isolation of mutant strains producing new rifamycins is carried out as follows: the spore suspension of Streptomyces mediterranei ATCC 13685 is exposed for 60 minutes at 28 ° C to N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine at a concentration of 1 mg / ml, at a pH of 9.0 obtained with a tri (hydroxymethyl) aminomethane buffer. The spores are then washed and placed in petri dishes containing Bennett agar. 97 7883 97788 4 Incubations at 28 ° C. are carried out for 14 days, then the colonies are selected and tested for their ability to inhibit the growth of Bacillus subtilis. This test is carried out as follows: An agar plate (diameter 4-8 mm), carrying a single colony, is placed on a Petri plate containing Penaszaya agar with a pH value of = = 7.2, previously inoculated with #Vo (volume (volume) with the Bacillus subtilis strain. In the above-mentioned conditions, rifamycin B shows practically no activity and normal colonies of rifamycin B-producing microorganisms do not inhibit the growth of Bacillus subtilis microorganisms in the agar described. Meanwhile, any colony of microorganisms producing new rifamycins with antimicrobial activity elicited distinct zones of inhibition of Bacillus subtilis growth around the agar plates. Using the method described above, three strains of microorganisms were isolated and, according to the internal code, they were designated as D - 2, MM 18 - 6, and M - 36. Samples of these three microorganisms were submitted to the ATCC, where they are marked as Nocardia mediterranea ATCC 31064, respectively. , Nocardia mediterranea 31065 and Nocardia mediterranea ATCC 31066. The characteristics of the novel Nocardia mediterranea strains used in the method of the invention are presented below. Table I summarizes the results of the macroscopic and microscopic examination of the Nocardia mediterranea strains, designated ATCC 31064, 3165, 31066, respectively. Table II shows the breeding characteristics of the above-mentioned Nocardia mediterranea strains. The characteristics of the parent strain, ie, the strain Streptomyces mediterranei ATCC 13685 (ME / 83), are also shown. The method of carrying out the fermentation is basically the cultivation of one of the mentioned mutants of the Streptomyces mediterranei strain, grown on a nutrient medium, containing assimilable nitrogen and carbon sources and the necessary mineral salts, until a significant value of the antimicrobial activity of said nutrient is obtained, the rifamycins are extracted from the medium. More specifically, the mutants are grown while agitated under overhead soil fermentation conditions at a temperature ranging from 25 to 37 ° C, preferably at 28 ° C. The following coal is used as the carbon source. Hydrates and carbon derivatives: glucose, galactose, lactose, sucrose, maltose, glycerin, mannitol and the like. Useful sources of nitrogen are, for example, amino acids and their mixtures, peptides, proteins and their hydrolysates, such as peptone, yeast extract, soybean flour, corn kernel solution, fish extract, meat extract, water extract of grains. cereals. The fermentation is carried out for 180-220 hours. The pH of the nutrient medium is usually initially brought to a value of 6.4-6.6, and during fermentation it rises to 7.0-8.5. Usually, the best results are obtained with fermentations carried out for 200 hours. After the fermentation of the risolamycin is completed, the following can be isolated: the fermentation broth is sipped at a final pH value of 7.0-8.5, the permeate is quickly acidified, preferably to a pH value lower than about 5, in order to ensure the highest stability conditions for the substance antibiotics and the substances are then extracted with water-immiscible solvents such as chloroform, butanol, ethyl acetate, propyl acetate, butyl acetate or amyl acetate. The ratio of the volume of substrate to the volume of solvent varies with the nature of the solvent, and the usual ratio is between 2: 1 and 10: 1. Since the mycelium retains some microbial activity, it is extracted with a water-immiscible solvent, and the extract then fuses with the organic layer containing most of the rifamacins. Optionally, the extraction of the active substances from the mycelium can be carried out with a water-miscible solvent such as acetone. In this case, the liquid is filtered off, acetone is distilled from the filtrate under reduced pressure, rifamycin is extracted from the residue with a water-immiscible solvent, and then proceeds as previously described. is transferred to a solvent which is then distilled to dryness under reduced pressure, preferably at a temperature lower than 30 ° C. The crude product, containing rifamycins, can be purified by silica gel column chromatography. Prior to chromatography, the crude product is conveniently dissolved in a phosphate buffer having a pH of 7.0-8.0 and then treated with a mild oxidizing agent. The buffer solution is then extracted with a water-immiscible solvent. The obtained organic extract contains a new rifamycin, called rifamycin R. After extraction, the buffer solution is acidified to a pH value of 2.4 and then extracted with a water-immiscible solvent. The obtained extract contains three new compounds from the group of 50 rifamycins called rifamycin P, rifamycin Q and rifamycin U. Further purification of raw rifamycin R is carried out by means of chromatography on a column filled with a suitable adsorbing material, such as silica gel, using a suitable mixture of organic solvents as the eluate. The second organic extract, containing rifamycins P, Q and U, is purified in the same way as described for rifamycin R. The following are the physicochemical characteristics of the new rifamycins P, Q, R and U, prepared according to the invention. 65 Rifamycin P. Elemental analysis: 97 788 6 Found: (/ o) - C = 60.6, H = 6.2, N = 3.8, O = 25.2, S = 4, l. Ultraviolet spectrum and In visible light it shows the following absorption bands: .1% l cm methanol X max / m in E x (406 197 350 (fuzzy) 297 344 257 423 224 550 0.1 n HCl X max (niw) E; (^ 416 183 300 319 225 521 10 X ma ° / "(m / u) 406 350 '297 257 224 2 F *% 178 (fuzzy) 305 405 518 The entire spectrum is shown in Figure 1. This spectrum was taken with a Perkin Elmer apparatus. Spectracord 4000 AW in the infrared spectrum the most significant absorption bands of the substance suspended in the nujole were found for the following frequencies (cm-1): 3700-3150 (average, extended), 3100 (weak), 3060-2800 (very strong), 1465 (strong), 1380 (extended) - nujal, 1722 (medium), 1645 (medium, extended), 1580 (average), 1510 (average), 1323 (average), 1250 ( strong, extended), 1160 (medium), 1130 (weak), 1070 (medium, extended), 1030 (weak), 25,982 (medium), 96 0 | (medium), 925 (weak), 890 (medium), 818 (weak), 770 (weak), 735 (weak). The entire infrared spectrum is shown in FIG. 2, which was made on a Perkin Elmer Mod apparatus. 421. The mass ion M + in the mass spectrum obtained at 70 eV has the ratio value - = 738. This can be done with a Hitachi Perkin ElmerRMU-6L apparatus. 35 The entire nuclear magnetic resonance spectrum, taken at a frequency of 100 MHz in CDC13, is shown in Figure 3. The compound does not exhibit the polarographic behavior characteristic of rifamycins, induced by a chromophore group on the quinone part of the molecule. Rifamycin Q. Elemental analysis. : Found: C = 60.7, H = 6.3, N = 3.60, 0 = 25.3, S = 4.2. 45 The ultraviolet spectrum in visible light shows the following absorption bands in methanol: 50 55 In the infrared spectrum the most significant absorption bands of a substance suspended in a nano were found for the following frequencies (cm-1): 3700 3300 (strong, broadened), 3300-3080 (medium, 60 wide), 3040-2780 (very strong), 1460 (strong), 1378 (strong) - nujol, 1740 (medium), 1700 (medium), 1650 (strong, broadened), 1605 (strong, broadened), 1555 (strong), 1510 (medium, broadened), 1315 (weak), 1275 (medium), 1240 (average), 1220 (medium), 65 1160 (average), 1090 (average), 1050 (moderate), 1020 (weak), 970 (average), 945 (weak), 910 (average), 808 (average), 765 (weak), 720 (weak). The entire infrared spectrum is shown in Figure 4. The entire nuclear magnetic resonance spectrum, taken at a frequency of 60 MHz in CDCl3, is shown in Figure 7. Rifamycin R. Elemental analysis: found: C = 62.0, H = 6.4, N = 2.2, O = 29.6. The spectrum in ultraviolet and visible light shows the following absorption bands in a 0.1 N solution of hydrogen chloride in methanol: X max (nuO 219 281 340 410 XF 1% 444 415 114 72 In the infrared spectrum the most significant absorption bands of the substance suspended in nujol were found for the following frequencies (cm-1): 3700-3100 (strong, extended), 3040-2780 (very strong), 1465 (strong), 1380 (strong) - nujol, 1745 (strong), 1710 (medium), 1640 (strong), 1600 (strong), 1505 (strong), 1415 (medium), 1325 (strong), 1260 (strong, extended), 1220-1130 (strong, broadened), 1120 (weak), 1075 (strong), 1020 (weak), 975 (strong), 950 (weak), 920 (weak), 888 (medium), 823 (medium), 785 (weak, extended), 735 (weak, broad) , 650 (weak, widened). The entire infrared spectrum is shown in Fig. 5. The mass ion M + in the mass spectrum, obtained at 70 eV, has a value of = 711. e The entire nuclear magnetic resonance spectrum, made at a frequency of 60 MHz on the CDC I3, is shown in Fig. 6. This compound shows the behavior in polarography characteristic of rhymicines, the induced chromophore group in the quinone part of the molecule. In the visible spectrum the following absorption bands in methanol are shown: X max (ml) 412 353 299 258 220 1 F 1% * lem 163 (fuzzy) 265 389 451 In the infrared spectrum the most significant absorption bands of a substance suspended in nujol ', it was found for the following frequencies (cm-1): 3700-3100 (medium, extended), 3060 (very weak), 3040-2740 (very strong), 2720 (very weak), ( weak, fuzzy), 1245 (medium, fuzzy), 1225 (average), 1160 (average), 1120 (weak), 1090 (very weak), 1070 (weak), 1030 (very weak), 1020 (very weak), low), 1000 (very weak), 975 (weak), 960 (weak, fuzzy), 905 (medium), 850 (medium), 802 (weak), 800 (very weak), fuzzy), 777 ( very weak), 760 (very weak), 720 (very weak), 685 (very weak), 670 (very weak). The biological activity of the new rifamycins obtained according to the invention is shown in Tables V and VI. The range of the in vitro antibacterial activity of rifamycins P, Q and R is shown in Table V. The new compounds according to the invention also show activity in tests carried out on laboratory animals infected with the strains of Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Table VI shows the results of representative experiments carried out on mice comparing the effects of the compounds prepared according to the invention and the known natural rifamycin, i.e. rifamycin SV. Rifamycin P has the greatest activity, which is also characterized by low toxicity, because the ED50 value obtained for it in mice is higher than 500 mg / kg after intraperitoneal administration. The method according to the invention is further illustrated in the examples Example I. Mutant strain, designated Nocardia mediterranea ATCC 31064, incubated for 6-8 days on Bennett agar at 28 ° C. The culture, obtained on an agar slant, is inoculated with two 500 ml Erlenmeyea flasks under sterile conditions. The flasks contain 10.0 ml of vegetative medium with the following composition: Beef extract 5 g Yeast extract 5 g Peptone 5 g Casein hydrolyzate 3 g Glycose 20 g NaCl 1.5 g make-up water up to 1 liter Using sodium hydroxide to bring the pH of the nutrient solution to a value of 7.3. The inoculated flasks are placed on a variable shaker at 28 ° C. and shaken for 72 hours. The contents of these two flasks are used as inoculum and poured into a 10 liter pre-fermentor containing 4 liters of the described vegetative medium. Incubations are carried out at 28 ° C, mixing the fermentor contents at 300 rpm and passing air through the fermenter at 1 volume of air per volume of nutrient solution for 1 minute. After 48 hours, an increase in the volume of the cells to 7-10% of the total volume is obtained. In the next stage, 4 liters of fermentation medium is prepared in a glass fermentor with a capacity of 10 liters: Peanut flour 25 g Macassoy 5 g (NH4) 2SO4 9.5 g MgSO4 7H2O 0.85 g Glycose 95 g Glycerin 40 g KH2P04 1 g Propylene glycol 5 g CaCOs 8.5 g Sodium diethylbarbiturate 1.7 g CuSO4'5H20 2.8 mg FeSO4 7H20 8.5 mg ZnS04 7H20 42.5 mg MnSO4 4H20 3.4 mg CaCl2 6H20 1.7 mg (NH4) 6M07O24 4H20 0.85 mg water up to 1 liter. r ** - The pH value of the nutrient medium is adjusted to 7.8 with NaOH. The extraction is carried out at 120 ° C. for 60 minutes. After analysis, the pH value is 6.4. The inoculum used is 5% by volume of the pre-fermenter content. The fermentation is carried out at 28 ° C, using a mixing rate of 750 rpm and air circulation at 1 volume of air per 1 volume of nutrient in 1 minute. The anti-foaming agent used is silicone A. During fermentation, the culture broth acquires a characteristic reddish-brown color. After 200 hours, an increase in the volume of cells in relation to the total volume of the nutrient medium is obtained. The wort becomes pH = 7.5 and at this point the wort is subjected to the isolation process. Example II. Cultures of the Nocardia mediterranea ATCC 31064 strain, prepared as described in Example 1, are grown in a flask while stirring in the same manner as that described in Example 1. The resulting initial culture is poured into a 10 liter glass fermentor. containing medium with the following composition: Glycose 5 g 55 Peanut flour 7.5 g CaCos 1.65 g MgSO4 7H20 0.33 g KH2P04 0.33 g FeSO4 7H20 3.3 mg 60 ZnSO4-7H20 16.5 mg MnSO4-4H20 1.3 mg water in an additional amount to 1 liter. The total pH is adjusted to 7.5. Exposure is performed for 50 minutes at 120 ° C. After recovery, the pH was 6.4. Cultures are carried out for 48 hours, increasing the cell volume to 6-8% / t of the total volume of the nutrient medium. The resulting culture in an amount of about 10% is used as the inoculum for a glass fermenter with a capacity of 20 liters, containing 10 liters of fermentation medium with the following composition: ) 2SO4 6 g MgSO4 7H20 0.85 g Glycose 100 g KH2P04 lg CaC03 6 g 15 FeSO4 7H20 8.5 mg ZnSO4 7H2O 42.5 mg MnSO4 4H2Ó 3.4 mg CuSO4 5H20 2.8 mg CoCl2 6H20 1.7 mg M Make up water to a volume of 1 liter. The total pH is adjusted to 7.8 with NaOH. Treatment is carried out within 50 minutes at 120 ° C. After sterilization, the pH is 6.4. The fermentation was carried out for 200 hours at 28 ° C. The final pH of the fermentation broth is 7.5. The fermentation broths obtained by the methods described in Examples I and II are stepwise purified. The mycelia are filtered off and discarded, and the effluent is adjusted to a pH of 2.0 with the KM (v / v) hydrochloric acid and extracted three times with equal volumes of ethyl acetate. The solvent is completely distilled from the organic extract under reduced pressure at 35 ° C and the residue obtained (4 g in the manner described in Example I and 11 g in the manner described in Example II) is dissolved in 0.05 a molar solution of sodium phosphate, pH = 7.5, and then sodium nitrite is added to the solution in such an amount as to obtain its final concentration of 0.2% (w / w). The mixture is stirred at room temperature for 30 minutes, then the buffer solution is extracted three times with equal volumes of ethyl acetate. The solvent is completely distilled from the combined organic layers under reduced pressure at 35 ° C. to obtain the first ethyl acetate extract. The remaining buffer solution after extraction is brought to pH = 2.0 with 10% acid. 35 of salt and re-extracted with three times equal volumes of ethyl acetate. The obtained extracts were pooled, and the solvent was distilled off under reduced pressure at 35 ° C to obtain a second ethyl acetate extract. 50 After distilling off the solvent from the first ethyl acetate extract (1.4 g in example 1 and 4.2 g in example II), the dry powder is dissolved in chloroform and chromatographed on a column filled with silica gel (70-5540-230). mesh ASTM), using chloroform containing 2% (vol / vol) methyl alcohol as the eluent. The majority of the eluate collected from the column is rifamycin R, which is recognized by its orange-brown color. Thin layer chromatography method, * using plates coated with silica gel (Merck 60 F254) and using a mixture of chloroform and of 95: 5 methyl alcohol, the Rf value for rimycin is found to be 0.59. The rifamycin R fractions are combined, the solvent is completely distilled off under reduced pressure at 35 ° C, the residue is redissolved in ethyl acetate, the resulting solution washed with 0.01 N hydrochloric acid solution and finally with water. of the organic layer, the solvent is distilled off until a small volume of a concentrated solution is obtained, from which rifamycin R crystallizes at 4 ° C (600 mg of the compound of the method of Example I and 1.6 g of the compound of the method of Example II are obtained). The second ethyl acetate extract is also purified by silica gel column chromatography in a manner similar to that used for rifamycin R. The dry residue after distilling off ethyl acetate (2.4 g for the method described in Examples I and 4, 2 g for the method described in Example II) are dissolved in chloroform and applied to the column. The columns are eluted with a mixture of chloroform and methyl alcohol having the composition of 98.2. First, rifamycin U is obtained, then rifamycin P, and finally rifamycin Q. All these compounds are yellow-orange and are identified by thin layer chromatography. Using silica gel plates (Merck 60 F2g4) a developing system in the form of a 95: 5 mixture of chloroform and methyl alcohol, the following Rf values are obtained: rifamycin U rifamycin P rifamycin Q Rf = 0.63 Rf = 0.57 Rf = 0.32 Appropriate fractions containing rifamycin U, P and Q is combined, the solvent is distilled off under reduced pressure and the dry residue obtained is crystallized from ethyl acetate. Using the wort obtained as in Example I, 80 mg of rifamycin U, 400 mg of rifamycin P, 280 mg of rifamycin P are obtained. of rifamycin Q, while using the broth obtained in example II, 190 mg of rifamycin U, 900 mg of rifamycin P, and 750 mg of rifamycin Q are obtained. Using the same procedure as described above Examples, and as production strains of Nocardia mediterrahea ATCC 31065 or Nocardia maditerranea ATCC 31066, respectively, rifamycin is obtained in the same order of yields as previously described. 97788 11 12 EN EN