BE676538A - - Google Patents

Description

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  "Production d'un nouveau polypeptide antibiotique, anthelmintique et antiprotozoaire". 



   La présente invention a trait à un nouvel antibiotique   anthelmintique   et antiprotozoaire dénommé par la suite   "Ant@anoebine"   et à un procédé pour le fabriquer,
Divers antibiotiques antiprotozoaires ont été décrits ces dernières années, tels que la Paramomycine, l'Antiproto-   zolne,   l'Hamycine, la Puromycine, l'Afzalomycine-F,   etc.,   particulièrement pour application contre Entamoeba hystolytica,   Trypanosoma     curzil   Trichomonas vaginalis et d'autres protozoaires provoquant des maladies humaines et animales.

   Contre E. histolytica qui provoque l'amibiase dans les pays tropicaux, les recherches pour un produit efficace pour détruire les amibes qui guérirait les infections hépatiques et intestinales 

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 et en même temps qui ne serait pas toxique, se   poursuivant   encore. La   Paramomycine   ne combat que les affections intestinales, et d'autres produits chimiques comme le chlorhydrate d'émétine, les arsenicaux, la gluacarubine, la camoquine et d'autres nécessitent des traitements prolongés et ont des effets secondaires défavorables. Aucun des produits chimiques et antibiotiques antiprotozoaires ci-dessus mentionnés n'ont d'effets anthelmintiques. 



   Les types de vers qui infestent l'homme et les animaux, en particulier dans les pays tropicaux, sont trop nombreux pour être mentionnés par leurs noms. Les vers des intestins et d'autres organes profondément situés sont responsables de la malnutrition et de diverses autres maladies. Les vers ronds, les vers en forme d'épingle, les vers en forme de fils diminuent la croissance des enfants par infestation grave des intestins. Les vers en forme de ruban, les vers crochus et d'autres provoquent des troubles chroniques, et particulièrement les vers crochus provoquent de l'anémie dans les populations des villages sous-alimentés. Les vers des animaux de fermes, des animaux domestiques et des volailles sont répandus par plusieurs douzaines d'espèces et de genres et la façon appropriée de les combattre est l'un des problèmes majeurs.

   Il'y a très peu d'antibiotiques comme l'Hygromycine, et l'Anthélamycine, qui sont connus comme étant des anthelmintiques. Au Japon on dit que l'Ascaridine a quelque activité anthelmintique. Les   trai-   tements actuellement appliqués aux hommes et aux animaux pour en expulser les vers sont variés. On administre des sels de pipérazine pour expulser les vers ronds et en forme d'épingles, les sels de   Belphénium   contre les vers en rubans, le   tétrachlo@-   éthylène et les composés organophosphorés contre les vers crochus, etc. Ce sont des composés toxiques et leurs effets secondaires sont assez graves. En l'absence de produits meilleurs et plus inoffensifs, ce sont ceux-ci que l'on donne.

   Aucun 

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 d'entre eux n'a une efficacité systémique, de sorte que de nos jours il n'y a ni antibiotiques ni produits chimiques pour com- battre le microstade du Toxocara, et la forme adulte des fila ires. i      
Au cours du programme de développement de nouveaux antibiotiques antiprotozoaires et anthelmintiques aux Laboratoi- res de Recherche de l'Hindustan Antibiotic Research Centre,        Pimpri,   Poona (Indes), un nouvel antibiotique l'"Antiamoebine" a été découvert en grandes quantités à partir de trois sortes de champignons. Ce sont les Emericellopsis   salmosynnemata   Marthur et Thirumalachar, Emericellopsis   poonensis   Thirumalachar et Cephalosporium   pimprina   Thirumalachar. 



   On a aussi trouvé que de petites quantités   d'antibio-   tiques sont produites par des souches de Emericellopsis   humicola   (Cain) Cain (=E. humicola (Cain) Gilman) et E. minima Stolk. 



  On sait que   l'Emericellopsis   est le stade parfait du genre imparfait Cephalosporium,Un exposé sur le champignon 3. 



  Synnematicola Mathur et Thirumalachar a été publié par la demanderesse dans Mycologia Vol. 52 pages   694-697,   1960. L'3.   poonensis-   diffère du l'E.   synnematicola   dans le stade Cephalosporium producteur par ses conidies à la différence du type   Stilbum   de conidiophores dans E.   synnematicola.   Les tail- les des spores sont également légèrement différentes. Le Cephalosporium pimprina   Thirum,   appartient au groupe curtipes des Cephalosporium décrit par Sukapure et Thirumalachar (Mycologia- sous presse). Il ne passe pas par le stade   Périthécie:   et les colonies sont blanches et étendues.

   Les conidiophores mesurent   20-30 ,   et les conidies   8-10   x 4-6ù, sont ovées- éllipsoides ,hyalines et lisses. 



   En ce qui concerne le nouveau procédé ici traité, la présente invention comprend un procédé de fermentation pour faire: pousser l'une des trois espèces de champignons mentionnée ci- 

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 dessus, et aussi des souches sélectionnées de E. humicola et E, minima dans un milieu de culture contenant une source assimilable d'hydrates de carbone, d'azote et de sels minéraux. 



  Cependant, pour permettre une économie dans la production, un rendement maximal d'antibiotique et une facilité d'isolement de   l'"antiamoebine" ,   on préfère certains milieux de culture. 



  Ainsi, par exemple, les sources actuellement préférées d'hydrates de carbone dans le milieu de culture sont le glucose, le saccharose et l'amidon. D'autres sources peuvent comprendre les dextrines, les mélasses, etc. Les sources d'azote que l'on peut utiliser sont le liquide de trempage de mais, les farines de soya et d'arachide, divers légumes, les parties solubles de distillation, des mélanges de caséine etl'acides aminés; des peptones (aussi bien de viande que de soya) et analogues. Les sources d'azote minéral comprennent les nitrates et les sels d'ammonium. 



  Les sels minéraux nutritifs à mélanger au milieu comprennent les sels habituels capables de fournir des ions sodium, potassium, calcium, phosphates, chlorures, sulfates et analogues.   On   incorpore également au milieu de culture les oligo- éléments essentiels qui stimulent la croissance du champignon et donnent des rendements plus élevés. De tels oligo- éléments font souvent partie des produits bruts dans lesquels ils se présentent comme des impuretés. 



   Pour décrire les procédés impliqués dans la production d'antiamoebine, on décrit la manière de traiter la   souche   de Emericellopsis poonensis, et l'on peut obtenir les mêmes résultats avec les autres espèces et souches mentionnées ci-dessus,
On peut faire pousser l'E. poonensis souche SLA-I sur de l'agar- agar contenant divers produits nutritifs à des températures si- tuées entre approximativement 24  et 37 C, la température optimale étant 28 C. L'agar-agar au dextrose pomme de terre, l'agar-agar de Sabouraud, l'agar-agar peptone-glucose et l'agar-agar de 

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 Czapek conviennent tous.

   Le champignon pousse sous forme de      colonie blanche, engendrant un mycélium aérien et un grand nombre!      de masses de conidies sphériques portées sur un conidiophore, typique des   Céphalos-porium.   Après incubation pendant environ 10 à 15 jours, des points noirs apparaissent éparpillés sur la colonie. Ils constituent le stade   aseidigère   ou stade   parfait   du champignon ce qui est en conformité avec le stade Emeri- cellopsis .Pour la production de l'antibiotique, des colonies de 6 à 8 jours, portant de nombreuses masses de conidies, convien- nent bien. 



   Pour la préparation de quantités limitées des antibio-      tiques, on peut utiliser des flacons soumis à des agitations par secousses et des cultures en surface dans des bouteilles. 



  Pour une production sur une large échelle, on utilise des cuves de fermentation en acier inoxydable, avec aération et agitation, réglage de température et dispositifs pour maintenir des condi- tions de stérilité. Le procédé de production préféré consiste à faire pousser l'inoculum végétatif du champignon dans un réci- pient de semences en l'inoculant avec une culture pure, en      utilisant des conidies, des ascospores, des mycéliums ou des mélanges de ces formes. Quand la croissance de la forme végétati- ve s'est faite avec un mycélium jeune et un développement actif, on transfère de manière aseptique l'inoculum dans de grands récipients.

   Le milieu dans lequel l'inoculum se développe alors peut être un milieu semblable ou différent de celui utilisé pour la production de l'antibiotique, 
Comme il est classique dans la production d'antibioti- ques par un processus de culture submergé, on insuffle de l'air stérile dans le milieu de culture, que l'on disperse par agitation. Le volume d'air que l'on fait passer varie de 0,1 à 1 volume par minute par volume de bouillon de culture. Le pH initial du milieu de culture peut être de 4 à 7,5, bien que le pH préféré soit de 6,5 et l'on utilise une température de 24  à 28 C 

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      On laisse fermenter pendant 72 à 120 heures, et à la fin de la fermentation le pH s'élève jusqu'à l'alcalinité. 



   On surveille la production de l'antibiotique, en recueillant périodiquement une quantité connue du bouillon, en ajoutant la moitié de son volume de n-butanol, en agitant éner- giquement pour extraire, en séparant le butanol par centrifuga- tion et en évaporant le butanol sous vide. On réextrait le   rési-   du par du méthanol et l'on filtre. On évapore la solution jusqu'à siccité et l'on évalue la quantité d'antibiotique restant. 



  Ce procédé gravimétrique donne des résultats satisfaisants et indique 85 à 90% de la quantité d'antibiotique présente dans le bouillon. En général, la production maximale d'antibiotique après l'inoculation du milieu de culture se produit en environ 3 à 5 jours quand on utilise la croissance par culture submergée et en 8 à 15 jours quand on effectue la culture en surface. 



   On peut récupérer l'antibiotique produit dans la pré- sente invention par des techniques d'extraction et d'absorp- tion du milieu de culture. On préfère les .premières dans la production à l'échelle industrielle car les quantités   récupé-   rées et les rendements sont meilleurs. Pour l'extraction du composé antibiotique à partir du filtrat de bouillon de cultu- re on préfère des solvants organiques polaires non miscibles à l'eau et pour l'extraction à partir du mycélium on peut   utili-   ser des alcools aliphatiques comme le méthanol, l'éthanol, le butanol, le propanol, l'isopropanol, les méthyl- et éthyl- cellosolves, l'acétone aqueuse,   etc.   Le procédé d'extraction pré- féré est la filtration du bouillon et l'extraction du filtrat et du mycélium séparément.

   A partir du mycélium, on peut extraire l'antibiotique dans tous les. alcools inférieurs comme le méthanol. et l'éthanol, l'isopropanol, l'acétone aqueuse, le méthyl- cella- solve, la pyridine, la diméthyl formamide, l'éthyl- cellcsoive, etc. 

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   On récupère l'antibiotique dans le solvant organique et on peut l'évaporer jusqu'à siccité sous vide, pour obtenir l'antibiotique sous forme brute. Ou bien, on peut adsorber l'an- tibiotique en utilisant du charbon   actif ,  du silicate de magné- sium et d'aluminium, etc. L'élution de l'antibiotique n'est que partielle avec les solvants organiques dans lesquels l'antibioti-. que est soluble. 



   Quand on utilise seulement le procédé d'extraction, qui est celui préféré, on filtre le bouillon, et l'on extrait le filtrat avec un tiers de son volume de n-butanol. On sépare le butanol, et on concentre sous vide jusqu'à un vingtième de son   volume,   on précipite l'antibiotique en utilisant un sol- , vant miscible comme l'acétone ou un mélange de solvants misci- bles comme l'acétone et l'éther de pétrole. On reprend l'anti- biotique pour une purification plus poussée. On peut extraire le mycélium deux fois avec du n-butanol et on peut appliquer le même procédé' que celui décrit pour le filtrat.

   Le procédé préféré, cependant, est l'extraction du mycélium par le méthanol ou l'éthanol, et puis la filtration, On traite l'extractum   méthanoli.   que ou éthanolique par du charbon décolorant, et l'on évapore:. jusqu'à élimination de l'alcool. Il reste généralement   l'antibio-:         tique sous forme de bouillie blanche principalement sous forme      cristalline. On sépare les cristaux bruts par filtration et on fait recristalliser pour une purification plus poussée. 



   Pour la purification de   l'"Antiamoebine"   brute ou par- tiellement purifiée, on dissout le produit dans du méthanol ou de l'éthanol chaud à 30 à   45%,   on traite par du charbon activé . décolorant, on filtre pendant que l'ensemble est encore chaud, on refroidit à la température ambiante et laisse pendant 4 à 6 heures, puis on transfère dans une pièce froide à 5 C. pendant 16 heures. On fait précipiter de grandes quantités de cristaux sous ; forme d'aiguilles blanches en majorité, que l'on filtre et que 

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 l'on lave soigneusement avec de l'eau puis que l'on sèche. 



  L'antibiotique   "antiamoebine"   présente les caractéristiques suivantes:
Nature :Polypeptide neutre
Forme et couleur:Aiguilles blanches fasciculées blanches, légèrement amères et sans odeur. 



   Point de fusion : 219-220 C. (d)    Pouvoir rotatoire : ( [alpha]) D25 + 10 (C 1,02 % dans le   méthanol); (   et)   D25 +   10   (C 1,03 % dans le diméthyl formamide)
Maxima d'absorption : Ultra-violet absorption ultime
Maxima d'absorption :Infra-rouge 3390-3290 (liaison NH) 1650, 1530 (déformation due à CO et NH) 1078, 695 cm-1. 



   Solubilités :   Soluble   dans le méthanol, l'éthanol, le butanol, le n-pronanol, l'isopropanol, la pyridine, l'acide acétique glacial, la diméthyl formamide, l'acétone aqueuse, la méthyl éthyl cétone hydratée et le méthyl- ou l'éthyl-cellosolve. Insoluble dans l'eau, le chloroforme, l'éther, l'éther de pétrole, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, l'acétone, le toluène,le tétrachlorure de carbone, le dioxanne, le benzène, le sulfure de carbone, le toluène, le chlorure de méthyle et l'éthylène glycol. 



   Nature : Polypeptide neutre
Autres réactions : Résultats négatifs aux essais avec le chlorure ferrique de Fehling, les réactifs de Benediot, de Molisch, de Sakaguschi, avec la ninhydrine, à l'essai au biuret et à l'anthrone. Résultat positif à l'essai de la xanthoprotéine. L'hydrolyse alcaline pendant une heure donne un résultat positif à l'essai du biuret.L'hydrolise avec HCl 6N en tube scellé pendant 16 heures donne onze taches positives à la ninhydrine à la chromatographie   bidimensionnelle   sur papier. On identifie les amino acides suivants par chromatographie sur papier uni, ou bi-dimensionnelle à l'aide d'acides aminés étalons: 

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 la proline, l'acide alpha amino isobutyrique, la phényl alanine, la valine, la leucine, l'hydroxyproline, la lysine, et l'acide glutamique.      



   Analyse :C   56,11   H 7,56 N   13,56   % 
Réaction d'assigné pour les halogènes et le soufre négative. 



   Les spectres d'absorption d'ultra-violet d'infra-rouge par l'Antiamoebine dans l'huile de vaseline sont présentés dans les figures ci-jointes, où ; - la figure 1 : illustre le spectre ultra-violet (ordonnées :pourcentages de transmission) abcisses les longueurs d'onde en mù;   - les figures 2 et 3 : les spectres infra-   rouges pour deux régions différentes (ordonnées : pourcentages de transmission) abscisses longueurs d'ondes .      



   Exemple 1 
Préparation de l'Antiamoebine     
On prépare un bouillon d'inoculum de composition suivante: 
Farine de soja ....... 2,0 % 
 EMI9.1 
 Glucose ............. Z,0 % 
Sulfate d'ammonium 0,3 % 
Chlorure de sodium... 0,25 % 
Carbonate de calcium.. 0,6 % t pH 6,5 à 7 On stérilise le milieu de 50 litres à 1,05   kg/cm2   pendant 30 minutes, et on inocule, après avoir refroidi à 28 C, avec une culture végétative de 48 heures d'Emericelopsis   synnematicola   ou      E. poonensis. On fait d'abord pousser l'inoculum à utiliser dans des ballons que l'on secoue et on contrôle sous microscope que l'on a une poussée vigoureuse.

   Pendant la période de croissance dans le milieu de 50 litres, il y a aération et agitation, les 

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 opérations devant être effectuées dans des conditions de stérilité. On utilise 0,5 volume d'air par volume de bouillon de culture par minute. 



   Après 48 heures de croissance, on transfère l'inoculum dans une cuve de fermentation comportant 1000 litres de milieu de composition suivante:
Farine de soja .........2,5 %
Glucose 3,0 %
Sulfate d'ammonium ..... 0,5 %
Chlorure de sodium   .....   0,25 %
Carbonate de calcium ... 0,5 % pH 6,5 à 6,8
On   st@rilise   le milieu par chauffage sous pression à environ 120 C pendant 30 minutes. Puis on abaisse la température   à 28 C,   et on transfère de manière aseptique l'inoculum de 50 litres du récipient d'ensemencement. Pendant la période de croissance on agite le bouillon et on insuffle de l'air stérile à raison de 0,5 à un volume d'air par volume de bouillon par minute.

   On contrôle périodiquement la croissance du mycélium et la production d'antibiotique par la méthode gravimétrique, Après 96 à 120 heures, qui est le temps habituellement nécessaire, on ajuste le pH du bouillon à 5 et on filtre. On recueille le filtrat et on extrait avec 1/3 du volume de n-butanol en utilisant un extracteur pour bien mélanger et faire passer l'antibiotique du bouillon dans le solvant. On extrait également le mycélium de la même manière d'abord avec 1,5 volume de butanol par kilogramme de mycélium, puis on fait une seconde extraction en utilisant un litre de butanol par kilogramme de mycélium. Après complète extraction par agitation, on filtre le butanol et on réunit les filtrats. On mélange ceci avec l'extraction au butanol du filtrat du bouillon.

   On fait un lavage à l'eau des extraits de butanol réunis 

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 pour éliminer les sels, etc, puis on concentre sous vide jusqu'à environ 30 litres. Le volume de solution de butanol réuni de départ est d'environ 600 litres. Il y a eu précipitation de grandes quantités de bouillie qui est l'antibiotique brut. On le filtre, le lave avec de l'acétone et on le sèche. En ce qui concerne la solution de butanol après filtration de la bouillie, on lui ajoute 3 fois sa quantité d'acétone, et on garde la solu- tion au froid pendant 24 heures à 10 C. On filtre le précipité avec jaune crémeux, on le lave/de l'acétone et on le sèche. 



   On obtient ainsi l'ANTIAMOEBINE brute, on fait plu- sieurs lavages à l'eau jusqu'à ce qu'il n'y ait plus libération de substance de couleur jaune pâle; on dissout dans du méthanol chaud à 45 %, on maintient à 50 C sur un bain d'eau. On ajoute un excès d'ANTIAMOEBINE jusqu'à ce qu'il ne s'en dissolve plus.      



   On ajoute du charbon décolorant (1% de l'extractum méthanolique), on filtre pendant que c'est encore chaud. On garde ensuite la solution à température ambiante pendant 3 à 4 heures puis on transporte dans une pièce froide et on abandonne à   5 C   pendant     
16 heures. De grandes masses de cristaux en'forme d'aiguilles pré- cipitent en touffes; on les filtre, on les lave avec de l'eau distillée et on les sèche. On peut effectuer une seconde cris- tallisation en répétant le même processus. 



   Exemple 2 
On réalise le processus de fermentation de la même manière. On filtre le mycélium contenant la majeure partie de l'antibiotique en ajustant le pH du bouillon à 5. On lave le mycélium, on l'extrait avec du méthanol, en utilisant 1,5 litre de méthanol par kilogramme de mycélium pour la première extraction, et un litre de méthanol par kilogramme de mycélium pour la seconde extraction. On filtre le méthanol et on réunit les liquides d'extraction. On traite les extraits ainsi réunis 

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 par du charbon activé (décolorant) à raison de 0,5 % et on filtre. On évapore les extraits sous vide à une température de 45 à 50 C. Ceci est possible en raison de la présence d'eau dans l'extrait méthanolique. On abaisse le volume de 600 litres d'extrait méthanolique à 30 litres.

   On précipite l'Antiamoebine sous forme de bouillie blanche, dont la majeure partie est sous forme cristalline. On filtre les cristaux bruts, on les lave avec de l'eau et on les sèche. On dissout lce cristaux bruts dans du méthanol ou de l'éthanol à 45 %, on traite avec du charbon, on filtre et on fait recristalliser en suivant le même processus que celui donné dans l'exemple 1. 



   On traite le filtrat de bouillon par du charbon activé ("Norit SG") à raison de 2 grammes par litre de bouillon. On agite le charbon   activé,   et l'on filtre. On élue   l'antibioti-   que par du butanol, du méthanol ou de l'éthanol. On évapore l'éluat jusqu'à siccité et on purifie l'Antiamoebine par récristillisation du produit solide brut. 



   Exemple 3
On réalise le processus de fermentation de la même manière que dans les exemples 1 et 2, et l'on extrait le mycélium avec du méthyl- ou de l'éthyl-cellosolve, on concentre les extraits pour obtenir l'antibiotique brut. On continue le traitement de l'antibiotique et on le purifie pour obtenir un produit cristallisé pur. 



   Exemple 4
On réalise le processus de fermentation comme dans les exemples 1 et 2, on extrait le mycélium par de l'acétone aqueuse ou de la diméthyl formamide, on concentre les extraits pour obtenir l'antibiotique brut, que l'on purifie et fait cristalli-   ser.   

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   Exemple 5
On réalise le processus de fermentation de la même manière que dans les exemples 1 et 2, on extrait le mycélium 
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 dans de l'alcool amylique ou du aye,ohexanol chaud, et on con- centre l'extrait pour obtenir l'antibiotique brut. 



   On détermine l'activité du produit final par la méthode de l'essai biologique. L'activité antiprotozoaire, en utilisant 
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 l Tétrahyména pyriformis et Entamoeba hystolytica. 



   Essai biologique utilisant Tétrahyména   pyriformis..   



   On utilise des cultures de   Tétrahyména   pyriformis maintenues sur décoction d'extrait de sol et de farine d'ara- chide. On prend de l'antiamoebine normale et l'on obtient une solution de 1 mg par ml. On doit d'abord solubiliser   l'antibio- ;   tique dans quelques gouttes d'éthanol. On prend dans des tubes des quantités égales de culture liquide de   Tétrahyména   conte- nant 2 x 10cellules par ml, et par la méthode de dilution de ;      tubes en série; on obtient des concentrations de l'antibioti- 
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 que de 1/ig ml à 100 Atg par ml avec la série 1-10-20-30-4o;19/Ml. 



  Après mélange intime et incubation pendant une heure à 24 C. on      examine la solution de chaque tube sous microscope. On détermine la concentration à laquelle il y a 100 % de lyse des cellules. 



  Dans les séries suivantes, on fait des dilutions intermédiaires entra la concentration donnant 100 % de lyse, et la concentra- tion inférieure la plus proche, et on détermine la concentra- tion la plus proche provoquant 100 % de lyse en 60 minutes. Pour l'Antiamoebine pure, la concentration provoquant la lyse est de 46-48 ug/ml. 
 EMI13.4 
 



  On utilise des souches d'E. Histolytica (hyman) con- servées au laboratoire. On fait pousser les amibes dans un milieu de Balamuth entièrement liquide et on prend les cultures de 48 heures incubées à   370C,   On prend les amibes et on les mélange ave< du milieu de Balamuth frais contenant de l'amidon de riz. On 

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 ajuste le nombre d'amibes dans ce processus de dilution en ayant ' environ 5 amibes mobiles par 0,05   ml.   On fait la solution d'Antiamoebine en utilisant le même milieu comme   véhicule.   On la solubilise d'abord dans quelques gouttes d'éthancl.

   Les milieux de Balamuth contenant les trophozites sont   distribues   dans des tubes, et on ajoute l'antibiotique pour obtenir la concentration finale demandée, on fait incuber à 37 C pendant 48 heures après quoi on lit en observant sous microscope les trophozites actifs* Observation après 48 heures d'incubation à   37 C.   



  Témoins(pas   d'antibiotique)   Plusde 25   trophozites   mobiles. par champ
1/100 mg/ml. Lyse complète, pas d'amibe
1/200 mg/ml. "
1/300   mg/m@@   "
1/400 mg/ml. "
1/500 mg/ml. "
1/600 à 1/900 mg/ml, "
Une ou   rarement   deux amibes à
1/900 mg/ml. 



  1/1000 mg/ml. Une ou deux amibes mobiles acti. ves dans 0,05 ml. 



  1/2000 mg/ml. Rare croissance de une à deux amibes par 0,05 ml. 



  1/2500 mg/ml. 10 amibes par 0,05 ml. 



  1/5000 mg/ml. Plus de 10 amibes par 0,05 ml. 



  1/10. 000   mg/ml.   Plus de 10 amibes par 0,05 ml,
L'activité de destruction d'amibes exercée par   l'Antiamoebine   est donc située entre 0,5 à 1,25 ug/ml. On peut déterminer l'activité des échantillons inconnus par le   même   processus. L'antibiotique n'est pas toxique par voie orale, et
10 grammes par kilogramme de poids corporel sont bien tolérés par les souris, les rats, les cobayes, les chiens, etc. La dose 

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 curative d'infections à protozoaires et à helminthes chez l'homme et les animaux est la dose orale de 5 mg seulement par kilogramme de poids corporel, la durée de traitement étant inférieure à cinq jours pour une guérison complète. Ces données montrent bien l'effet thérapeutique de cet antibiotique.

Claims (1)

1. RESUME.

   A. Procédé pour produire un antibiotique ANTIAMOEBINE, caractérisé par les points suivants, pris séparément ou en combinaisons; 1) On cultive une souche d'Emericellopsis ou de EMI15.1 Cephalosporium et en particulier E. Synnematicola, E, Eoonensis, Cephalosporium pimprina produisant de l'Antiamoebine, et des souches d'autres Emericellopsis telles que E. minima et E. humicola, notamment à leurs stades à conidies, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables d'hydrates de carbone, d'azote, et de sels minéraux jusqu'à production d'une quantité importante d'antibiotique dans le bouillon de culture, puis on récupère l'antibiotique dudit milieu de culture.

   2) La culture du microorganisme produisant l'Antiamoebine se fait dans des conditions aérobies par culture immergée.

   3) On maintient le milieu de culture à une température de l'ordre d'environ 20 à 37 C.

   4) On réalise la croissance du microorganisme pendant 2 à 8 jours.

   5) On extrait le milieu de culture à n'importe quel pH par des solvants organiques polaires non miscibles à l'eau, et des alcools aliphatiques en Cl à Ca.

   6) On extrait le bouillon de culture par des éthers mono-alkyliques d'éthylène glycol dont les groupes alkyle ont 3 à 6 atomes de carbone.

   7) On extrait le bouillon de culture à températures élevées ou basses par des cétones aliphatiques en C3 à C10. <Desc/Clms Page number 16>

   8) On extrait le mycélium par de la diméthyl formamide. B. A titre de produit industriel nouveau.une substance antibiotique de nature polypeptidique caractérisée par un point de fusion de 219-220 C et les bandes suivantes caracté- ristiques dans le spectre infra-rouge de l'ordre de 3320-3329 (liaison NH) 1650, 1530, (déformation due à C0 et NH) lofe, 695 cm-1 et notamment la substance obtenue par ce procédé défini sous (A).