BE487823A

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Publication number: BE487823A
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Description


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  Procédé pour la préparation d'un antibiotique 
L'invention concerne un procédé pour la préparation d'un antibiotique nouveau et précieux et de ses dérivés. 



   Le nouvel antibiotique a reçu le nom de   "borrelidinè",   étant donné que sa grande efficacité chimiothérapeutique a été mise à profit en premier lieu contre le Borrelia novyi, qui est le spirochète de la fièvre récurrente. Des souris infectées de 

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 ce spirochète ont été complètement guéries par des injections de 0,02 mg de l'antibiotique, qui agit également par administra- tion par la bouche à dose un peu plus forte. 



   La borrelidine se distingue de tous les antibiotiques connus par l'étendue de son efficacité à l'égard des bactéries d'essai habituelles. Elle possède une efficacité très forte et spécifique à l'égard du sarcina lutea in vitro, mais est rela- tivement inefficace à l'égard d'autres organismes d'essai. 



   Le sarcina lutea a servi d'organisme d'essai de la borrelidine par un procédé analogue au procédé du "cylindre" (Méthode de Heatley, dite d'Oxford). L'unité de borrelidine est la quantité de substance qui provoque la même zone d'inhibition que 0,6 Y de pénicilline sodée pure G cristallisée. 



   Etant donné que l'efficacité de la borrelidine est 10 fois plus grande à l'égard de l'organisme d'essai choisi, l'unité de borrelidine a été définie comme étant égale à 0,06 y de borre- lidine pure, cristallisée. 



   L'efficacité chimiothérapeutique de la   borrelidine   à l'égard du microbe de la fièvre récurrente est de 50 à 150 fois plus grande que celle de la pénicilline sodée G. Encore plus sur- prenante est l'augmentation de l'efficacité synergétique que la borrelidine provoque avec d'autres agents chimiothérapeutiques, tels que la pénicilline, en particulier la pénicilline G cri- stallisée. 



   L'invention a pour objet un procédé de préparation de la borrelidine, caractérisé par le fait qu'un microorganisme - désigné ici sous le nom de streptomicès Rochei - produisant de la borrelidine est cultivé dans un milieu qui contient une source d'azote appropriée, du carbone assimilable et des tels.minéraux et qu'on recueille la borrelidine dans le filtrat de la culture. 



   Le nouveau microorganisme, le streptomycès Rochei, qui forme des chaînes caractéristiques de conidies, est classé d'après Bergey (Manual of Det. Bacter. 6ème édition) dans l'ordre actinomycetales, la famille des streptomycétacées et la catégorie streptomycès. Il peut être décrit de la manière suivante: - Mycélium 0,8 - 1,5 microns de diamètre à courtes ramifications et hyphes sporogènes de 1,5 microns de diamètre souvent enroulés en hélice (2 à 3 spires). 

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  - Liquéfaction de gélatine en 30 jours à 18 c à 1/4.    



  - Czapek-agar avec le sucre de canne : développementsatisfaisant,   forte formation de spores, mycélium aérien de couleur sable/ lavande à gris foncé. Pas de formation de pigment dans le milieu. 



    - Citrate de calcium-glycérine-agar : croissancetrès satisfai-   sante, forte formation de spores, mycélium aérien gris foncé, puis plus tard gris lavande. Pas de formation de pigment. 



  -   Amidon-agar:   croissance satisfaisante, mycélium aérien blanc- gris. Pas de formation de pigment, effet de diastase net. 



    - Glucose-agar : limitée, lisse, blanc sale. Pas de   formation de pigment. 



  - Glucose-solution nutritive   (Krainsky):   pas de croissance. 



  - Petit lait : se coagule au bout de 10 jours à 25  C et est à peu près complètement digéré au bout de 15 jours. pH initial 6,2; pH final   7,7.   



  - Pomme de terre: croissance parfaite, colonie rugueuse, forte formation de spores, mycélium aérien gris, effet de diastase satisfaisant.    



  - Propriétés antagonistes : à l'égard des bactéries Gram   positives et Gram négatives, peu active contre les levures et mycobactéries, formation d'une substance antimicrobienne spéci- fique, la borrelidine, extrêmement active vis-à-vis de sarcina lutea, les microcoques et borrelia novyi.    



  - Aérobie : optima : 25 - 28 c - Provenance : dans l'air des ateliers. Le microorganisme   dégénère relativement vite dans une culture pure, c'est pourquoi le passage de la culture en éprouvette de verre à la fermentation en cuve doit s'effectuer en aussi peu d'étapes que possible. 



  L-'-expression "streptomycès Rochei" doit être considérée comme   désignantjtoutes   les sortes de streptomycès qui forment la borre- lidine, même Lorsque l'intensité de croissance, la formation du pigment et d'autres propriétés morphologiques varient. 



  - Développement par culture superficielle ou submergée. 



   Suivant l'invention, la culture du streptomycès Rochei s'effectue par fermentation aérobie submergée dans des cuves avec agitation et ventilation. Les sources de carbone assimilable qui conviennent sont les hydrates de carbone et les alcools polyvalents (amidon, maltose, glycérine, glucose, dextrine, 

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 lactose, sorbite, etc. ) ainsi que les sels, amides et esters d'acides organiques (acides lactique, acétique, citrique, glu- conique, arabonique) et, de préférence, les sels d'acide citrique. 



   Les sources d'azote peuvent consister en produits végétaux broyés, non modifiés, fermentés ou extraits, tels que les graines de soja, germes de blé, sous-produits de la fabrica- tion de l'amidon (par exemple la liqueur dite "corn steep"), le- vures sèches'ou autolysats de levure. Les protéines animales ou leurs hydrolysats conviennent également, telles que la caséine, le sang de boeuf, les extraits de viande, la peptone ou l'extrait de foie et produits analogues, les acides aminés, tels que par exemple l'arginine, la thréonine, la glycine, l'asparagine, la citrulline, l'ornithine, etc. 



   Parmi les sels minéraux, on peut citer le phosphate dipotassique ou le phosphate disodique. De plus, on ne doit pas ajouter de substances minérales à un milieu naturel, tandis qu' un milieu synthétique doit encore contenir du sulfate de magné- sium. 



   Un milieu qui satisfait à toutes les conditions d'un développement satisfaisant des microorganismes et d'un rendement élevé en borrelidine contient environ 0,5   %   de farine de graine de soja, 1 % d'acétate de sodium et 0,1   %   de phosphate dipotas- sique dans l'eau de source et permet d'obtenir un rendement de 1000 à 1200 unités de borrelidine par cm3 de filtrat de la culture dans des éprouvettes à secousses aussi bien que dans des cuves de 500 litres. 



   On s'oppose à la.tendance à la formation de mousse dans les cultures en cuves profondes par une addition de 0,2 à 0,6 % "d'huile de lard" (huile obtenue par pressage de la graisse de porc) au milieu de culture. La présence de l'huile dans le milieu a en même temps pour effet d'augmenter légèrement le ren- dement en borrelidine. 



   Le rendement le plus avantageux en borrelidine par fermentation en cuve est obtenu à une température comprise entre 24 et 26 C, en milieu dont le pH est compris entre 5 et 10 et avec une ventilation de 100 litres d'air par minute et pour 100 litres de la solution de culture pendant les deux premiers jours et avec 200 litres d'air par minute et pour 100 litres du milieu 

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 de culture pendant les 2 ou 3 jours suivants. 



   Un phénomène intéressant et précieux au point de vue technique consiste dans le fait qu'une teneur une fois obtenue en antibiotique reste constante pendant plusieurs jours, même en cas d'incubation prolongée. Le traitement de la solution de culture peut ainsi se baser sur un plan déterminé, puisqu'il n'est pas nécessaire d'interrompre la fermentation aussitôt qu'on a obtenu une teneur optimum en borrelidine. Un autre phénomène avantageux consiste dans le fait que, lorsque le streptmycès Rochei a commencé à se développer d'une manière satisfaisante, le nouvel antibiotique ne se détruit pas en cas d'infection accidentelle du milieu de culture, comme, par exemple, c'est le cas de la pénicilline. 



   Pour recueillir la borrelidine, on élimine le mycélium par centrifugation ou par filtration, on épuise le filtrat de la culture au moyen d'un solvant organique, de préférence insoluble dans l'eau, tel que l'alcool butylique, l'alcool amylique, l'acétate d'éthyle, le cyclohexanol, l'acétate de butyle, l'acé- tate d'amyle, le dichlorure d'éthylène, le chloroforme, l'éther, etc. et on évapore l'extrait à siccité dans le vide. Le résidu consiste en borrelidine brute amorphe d'un degré de pureté de 25 à 50   %.   



   On peut aussi obtenir des produits d'un degré de pureté analogue en traitant la solution de culture par du charbon activé, par élution dans un solvant ordinaire, tel que l'acétate d'éthyle ou le butanol, et par évaporation à siccité du produit d'élution filtré. 



   On peut par extraction ou adsorption purifier encore davantage la borrelidine brute, de manière à obtenir un produit cristallisé possédant les propriétés physico-chimiques suivantes:   - Point de fusion : cristallisation dans le benzène)   145 -   146 C.   



    - Spectre d'absorption dans l'ultra-violet : environ 256 microns avec E1 cm d'environ 550 dans l'isopropanol.    



  - Spectre dans l'infra-rouge: 

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 EMI6.1 
 
<tb> 
<tb> microns <SEP> cm <SEP> - <SEP> 1
<tb> 
<tb> 
<tb> 5,83 <SEP> 1715
<tb> 3,45 <SEP> 2903
<tb> 6,85 <SEP> 1460
<tb> 7,25 <SEP> 1380
<tb> 8,51 <SEP> 1175
<tb> 10,27 <SEP> 973
<tb> 2,92 <SEP> . <SEP> 3423 <SEP> 
<tb> 9,67 <SEP> 1034
<tb> 6,08 <SEP> 1645
<tb> 8,0 <SEP> 1250
<tb> 4,59 <SEP> 2180
<tb> 
    - Polarisation rotatoire optique: Ó 27 19  (c = 2,4 dans le chloroforme). 



  - Composition: C, H, N, 0 (pas de soufre ni d'halogène). 



  - Solubilité: très soluble dans l'alcool éthylique, l'alcool butylique, l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, le chloroforme, et le dichlorure d'éthylène. Presque insoluble dans l'eau. 



  - Propriétés: la borrelidine est un acide qui forme avec les hydrates alcalins des sels alcalins aussi actifs que les acides de borrelidine libres. Le sel de sodium sec, cristallisé fond en se décomposant partiellement à une température de 240 - 244 C. 



  D'autres dérivés cristallisés caractéristiques sont : l'ester méthylique fondant à 153-154 c le diacétate de l'ester méthylique fondant à 190 C, le di-p-nitrobenzoate de l'ester méthylique fondant à 156 - 157 C, l'ester p-nitrobenzylique fondant à 161 C. 



  Exemple 1 Préparation du produit d'inoculum. 



  On inocule un flacon de 9 litres en verre pyrex contenant 6 litres de solution nutritive avec une suspension de spores de streptomycès Rochei dans l'eau stérilisée. Le flacon de culture est équipé avec un dispositif de ventilation stérilisée, inoculation aseptique, de prélèvement d'échantillons et de vidange.   

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 EMI7.1 
 
<tb> Solution <SEP> nutritive <SEP> Grammes <SEP> par <SEP> litre
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 5,0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> "corn <SEP> steep" <SEP> 5,0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Phosphate <SEP> dipotassique <SEP> 2,0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Glucose <SEP> 20,0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> CaC03 <SEP> logo
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Caséine <SEP> enzymatiquement <SEP> digérée <SEP> - <SEP> 5,0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> "Lard <SEP> oil" <SEP> 1,

  0 <SEP> 3
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Eau <SEP> de <SEP> source <SEP> 1000 <SEP> cm
<tb> 
 
Après avoir réglé le pH avec de la potasse caustique à 5 N à une valeur de 7,5, on stérilise par chauffage en auto- clave pendant une heure et demie. Les spores germent et se dé- veloppent assez rapidement dans le milieu sur lequel on main-    tient régulièrement un faible courant d'air stérilisé ; aubout   de 3 jours se développe un mycélium assez compact, principale- ment sous forme de petits flocons. 



   On introduit   aseptiquement   une culture préliminaire de 3 jours dans une cuve de 700 litres qui contient 500 litres d'une solution nutritive aqueuse préalablement stérilisée et ayant la composition suivante: 
 EMI7.2 
 
<tb> Grammes <SEP> par <SEP> litre
<tb> 
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 5,0
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> anhydre <SEP> logo
<tb> Phosphate <SEP> dipotassique <SEP> 1,0
<tb> "Lard <SEP> oil" <SEP> 2,0
<tb> 
 Il faut environ 5 litres du produit d'inoculum, soit 1,2 % pour 420 litres du milieu de culture. La cuve est alimentée d'une manière continue avec 340 litres d'air stérilisé par minute et pour 450 litres du milieu. de culture et son contenu est agité au moyen d'un agitateur à turbine. Après fermentation pendant 4 jours à 26 c le streptomycès s'est fortement développé. 



  L'efficacité antibiotique du filtrat de culture est le troisième jour de 415 unités de borrelidine par cm3 et la cuve peut être traitée le quatrième jour, en centrifugeant la solution nutri- tive à travers une couche filtrante en kieselguhr. On obtient 360 litres d'un filtrat de culture limpide contenant environ    1200 unités de borrelidine par cm3 qu'on traite comme l'indiquent   les exemples 3 à 9 pour recueillir la borrelidine. 



   Le milieu de culture précité peut aussi être remplacé par d'autres, tels que par exemple: 

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A. 2   %   de farine de graine de soja partiellement dé- graissée,   2 %   de glucose et   0,1 %   de phosphate dipotassique. 



   B. 4 % de liqueur de "corn steep", 2   %   de dextrine, 0,5 % de carbonate de calcium et 0,1 % de phosphate dipotassique. 



   C. 2   %   du résidu sec de distillation de moût de céréale fermenté, 2 % de glucose et 0,1   %   de phosphate dipotas- sique. 



   D.   2 %   de farine de germe de   blé,   2 % de glucose, 0,1% de foie sec pulvérisé et   0,1 %   de phosphate dipotassique. 



   E. 2 % de farine de graine de coton, 2 % de glucose, 0,5 % de "corn steep" et 0,1 % de phosphate dipotassique. 



   F. 2% de poudre d'extrait de malt, 2 % de maltose,   0,5 %   d'un mélange d'acides aminés contenant 6,6 % de méthionine, 80 - 90 % d'isoleucine, plus de la leucine et des traces de tyroxine, plus de la phénylamine et   0,1 %   de phosphate dipotas- sique. 



   G. 0,5 % de farine de graine de soja partiellement dé- graissée, 1 % d'acétate de sodium,   0,1 %   de phosphate dipotas- sique et 0,4 % de "lard oil" empêchant la formation de la mousse. 



   H.   3 %   de germes de malt séchés et entiers, 2   %   ,d'amidon,   0,1 %   de phosphate dipotassique et 0,5   %   de farine de graine de soja. 



   I.   0,5 %   d'extrait sec de moût de céréale fermenté par clostridium acétobutylicum, 1 % d'acétate de sodium, 0,1 % de phosphate dipotassique et 0,4 % de stéarate d'éthyle. 



   J. 0,5 % d'autolysat de levure, 1   %   d'acétate de sodium, 0,1 % de phosphate dipotassique. 



   K. 0,5   %   de caséine,   1 %   d'acétate de sodium, 0,1 % de phosphate dipotassique et   0,4 %   de stéarate d'éthyle. 



   Tous les milieux de culture précités se préparent avec de l'eau de source. Les proportions indiqués sont des pourcen- tages en poids. 



   Exemple 2 
A titre d'exemple d'un milieu de culture synthétique, on peut employer la solution suivante: 1% 1(+) arginine, 1% de glucose, 1% de glycérine,   0,1 %   de citrate de sodium, 0,2   %   de phosphate dipotassique,   0,1 %   de 

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 sulfate de magnésium, et   0,03 %   de citrate de fer dans l'eau distillée. On règle le pH avant l'inoculation à une valeur d'environ 7. On provoque le développement du streptomycès Rochei dans le milieu de culture dans les conditions de la croissance submergée jusqu'à ce qu'on obtienne une teneur maximum en borre- lidine, qu'on détermine par l'essai de la solution de culture. 



  On traite le filtrat de culture par les procédés des exemples 3 à 9. 



   Exemple 3 
On clarifie par centrifucation 3 litres d'une solution de culture contenant 340 unités de borrelidine par cm3 et qu'on peut obtenir par les procédés des exemples 1 ou 2, et on règle la valeur du pH à 8. On épuise la solution avec un litre d'acétate de butyle. On sèche cet extrait dans l'acétate de butyl: sur du sulfate de sodium anhydre et on l'évaporé à siccité dans le vide. Le produit brut ainsi obtenu contient 0,159 gr. de borrelidine et son efficacité est environ 5000 unités par milli- gramme. On peut obtenir un rendement d'environ 75% de la borre- lidine contenue dans la solution de culture. 



   Exemple 4 
On filtre 10 litres d'une solution de culture conte- nant 560 unités de borrelidine par cm3, obtenue par les pro- cédés des exemples 1 ou 2, et on l'agite pendant 15 minutes en présence de 100 gr. de charbon activé. On sèche le charbon à l'air et on l'agite en présence d'une solution d'acétate d'éthyle pendant une demi-heure à 50 c On évapore à siccité dans le vide la solution d'acétate d'éthyle filtrée et on obtient la borre- lidine brute d'une efficacité d'environ 5000 unités par milli- gramme. 



   Exemple 5 
On agite 163 litres d'une solution d'acétate de butyle qui contient 44 gr. de borrelidine brute, obtenue par les pro- cédés des exemples 3 ou 4, pendant une demi-heure avec 5 kg. 

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 d'oxyde d'aluminium pour chromatographie. On sépare l'acétate de butyle par filtration et on le jette. Puis on sèche l'alumine à l'air pendant 48 heures et on l'agite ensuite à trois reprises pendant 15 minutes avec de l'eau de source. 36 litres d'eau sont nécessaires au total. Le pH des solutions aqueuses combinées est égal à 8,7. On sature la solution avec du chlorure de sodium et on   l'épuisé   avec 20 litres d'acétate de butyle. On sèche l'ex- trait d'acétate de butyle avec du sulfate de sodium anhydre et on évapore à siccité dans le vide à 50 c On dissout le résidu dans le chloroforme.

   Puis on ajoute lentement du tétrachlorure de carbone, jusqu'à ce que la cristallisation commence. L'effi- cacité des cristaux est d'environ 16. 000 unités de borrelidine par milligramme. 



   Exemple 6 
On dissout 121 gr. de borrelidine brute d'une effica- cité de 2400 unités de borrelidine par milligramme, obtenue par les procédés des exemples 3 ou 4, dans 197 cm3 de benzène. On fait couler cette solution dans une colonne qui contient 500 gr. d'argile bentonique activée saturée de benzène. En alimentant la colonne avec 5 litres de benzène pur, on élimine environ 55 gr. d'un résidu sans efficacité de borrelidine. Puis on fait couler environ 1,2 litre d'une solution à 10 % d'acétone dans le benzène dans la colonne. On obtient avec le produit d'élution, après évaporation sous pression réduite, un résidu qui, après cristal- lisation dans le benzène, fournit 11,4 gr. de borrelidine cri- stallisée, d'une efficacité d'environ 16. 600 unités par milli- gramme. 



   Exemple 7 
On règle à une valeur de 7 le pH de 2200 litres d'une solution de culture contenant au total environ un milliard d'unités de borrelidine et obtenue par les procédés des exemples 1 ou 2 et on extrait cette solution avec 400 litres d'acétate de butyle. 



   Les 541 gr. du résidu d'évaporation contiennent pra- tiquement la totalité de la borrelidine, contenue dans la 

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 solution aqueuse initiale. Son efficacité est de 1800 unités de borrelidine par milligramme. 



   On dissout le résidu dans 5 litres de méthanol et on l'agite pendant une demi-heure avec 1000 gr. d'alumine-bentonite activée. On élimine l'alumine par filtration; la solution ainsi obtenue contient pratiquement la totalité de la borrelidine con- tenue dans la solution aqueuse initiale. On évapore la solution dans le méthanol dans le vide à l'état de sirop épais, dont l'efficacité est d'environ 4000 unités de borrelidine par milli- gramme. On le dissout dans environ 6 litres de benzène et on l'agite pendant une demi-heure avec 3000 gr. d'alumine-bentonite activée. Après séparation de l'alumine par filtration, la solu- tion dans le benzène ne contient sensiblement plus de borrelidine. 



   On agite avec de l'acétone et du méthanol l'argile lavée avec environ 15 litres de benzène. Après filtration, on concentre à siccité dans le vide les solutions combinées. Les résidus ainsi obtenus, une fois cristallisés dans le benzène, fournissent la borrelidine cristallisée. 



   Exemple 8 
On épuise avec 500 litres d'acétate de butyle 2500 litres du filtrat de culture de streptomycès obtenu par le procédé des exemples 1 ou 2 et dont l'efficacité est de 610 unités de borrelidine par cm3 On évapore l'extrait organique dans le vide à siccité. On dissout 584 gr. de résidu dans 4,5 litres de méthanol et on l'agite pendant une demi-heure avec 1000 gr. d'alumine-bentonite activée. Après filtration, on évapore le méthanol dans le vide à siccité. On reprend le résidu, qui pèse 288 gr., dans 3 litres d'éther et cette solution est    lavée d'abord avec 235 cm3 puis avec 440 cm3 d'une solution-   tampon de phosphates dont le pH est égal à 7. Les deux solutions- tampons ne contiennent pratiquement pas de borrelidine et on les jette.

   Puis on épuise la solution dans l'éther avec 300 cm3 d'une solution de soude caustique à 1,0 N. On règle à une valeur de 6 le pH de cet extrait de soude caustique par addition d'acide sulfurique à 6 N, et   onrépuise   à trois reprises avec 100 cm3 de benzène. On sèche les extraits benzéniques réunis avec du sul- fate de sodium anhydre et on les concentre à un faible volume. 

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  L'antibiotique, ayant reposé pendant deux heures à la température ambiante,   commence   à cristalliser dans la solution. 



   Exemple 9 'On concentre par évaporation à l'état de sirop 5,5 litres d'une solution dans l'acétate de butyle de 1110 gr. de borrelidine brute contenant environ 800 millions d'unités de borrelidine et préparée par les procédés des exemples 3 ou 4. 



  On dissout ce sirop dans 6 litres de méthanol, on l'agite pendant une demi-heure avec 4 kg. d'alumine-bentonite activée, on le filtre et'on lave l'argile avec du méthanol. Les solutions dans le méthanol combinées contiennent la totalité du produit activé contenu dans le concentré d'acétate de butyle, mais un tiers seulement du résidu solide pesant dans ce cas 370 gr. 



   On concentre la solution dans le méthanol, dans le vide, à siccité ; on dissout le résidu dans l'éther et on épuise par portions cette solution étherée avec une solution-tampon de phos- phates dont le pH est égal à 7,3, jusqu'à ce que le pH de cette solution-tampon ait diminué à 6,0. On épuise l'éther par portions avec la soude caustique à 1/2 N jusqu'à ce que le pH du dernier extrait soit égal à 8,5. On règle le pH des extraits alcalins combinés (500 cm3 avec l'acide chlorhydrique à une valeur de 6, et on les extrait avec du benzène.

   On sèche la solution de benzène et on la concentre à un faible volume, et on peut re-, cueillir par filtration la borrelidine cristallisée après avoir laissé reposer la solution pendant 12 heures à 25 c 
Revendications 
1) Procédé de préparation d'un antibiotique, carac- térisé par le fait qu'on provoque le développement du streptomycès Rochei dans un milieu de culture aqueux, qui contient des sources d'azote, de carbone assimilable et des sels minéraux, puis qu'on épuise le milieu de culture par un solvant et qu'on purifie la borrelidine brute ainsi obtenue.

Claims

2) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la source d'azote du milieu de culture est un produit <Desc/Clms Page number 13> végétal, par exemple la farine de soja, la liqueurde "corn steep" ou un autolysat de levure.

3) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la source d'azote du milieu de culture est un produit animal, en particulier une protéine animale ou un hydrolysat de protéine.

4) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la source de carbone du milieu de culture est le sel d'une acide organique.

5) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le sel minéral du milieu de culture est un composé phosphoré.

6) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la fermentation s'effectue dans des conditions aérobie-- et par submersion.

7) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le produit servant à l'extraction est un composé ne se mélangeant pas avec l'eau.

8) Procédé suivant les revendications 1 et 7, caractéri- sé par le fait que le produit servant à l'extraction est l'acétate de n-butyle.

9) Procédé suivant les revendications 1 et 7, caractéri- sé par le fait qu'on traite la solution de borrelidine brute dans un solvant insoluble dans l'eau par un adsorbant tel que le noir animal, ou l'hydrate d'aluminium, qu'on sépare la borrelidine de l'adsorbant au moyen d'un solvant aqueux, qu'on épuise la solution aqueuse avec un solvant organique, par exemple le benzène, et qu'on fait cristalliser la borrelidine.

10) Procédé suivant les revendications 1 et 7, caractéri- sé par le fait qu'on traite la solution de borrelidine brute dans un solvant non polaire tel que le benzène par l'alumine-bentonite activée, qu'on sépare l'alumine au moyen d'un solvant polaire tel que, par exemple, l'acétone, et qu'on fait cristalliser la borre- lidine dans un produit d'élution.

11) Procédé suivant les revendications 1 et 7, caractéri- sé par le fait qu'on traite pour éliminer les matières étrangères <Desc/Clms Page number 14> une solution de borrelidine brute dans un solvant polaire, tel que le méthanol, par une alumine bentonite activée, qu'on évapore le filtrat à siccité, qu'on reprend le résidu dans le benzène et qu'on fait cristalliser la borrelidine.

12) Procédé suivant les revendications 1 et 7, caracté- risé par le fait qu'on traite pour en extraire les impuretés une solution de borrelidine brute dans un solvant non miscible avec l'eau, tel que l'éther, par une solution-tampon de phosphates (pH 7), puis en réglant le pH à une valeur de 8,5 à 9 (avec NaOH à 2 N), qu'on épuise la borrelidine par l'eau, qu'on reprend la borrelidine dans l'extrait aqueux après avoir réglé le pH à une valeur de 3 à 6 par le benzène et qu'on la fait cristalliser.