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PERFECTIONNEMENTS RELATIFS A UN PROCEDE DE PREPARATION DE L'ERYTHRO-
MYCINE "B".
La présente invention se rapporte à un procédé perfectionné de préparation permettant d'obtenir en particulier l'érythronycine "B" et les sels d'addition qu'elle forme avec les acides.
Il est bien connu que l'érythromycine est une substance anti- biotique caractérisée par un spectre antibactérien étendu, que l'on peut obtenir en cultivant un @icroorganisme appelé "Streptomyces erythreus" sur des milieux de culture nutritifs artificiels. Ce microorganisme, les milieux de culture appropriés et les procédés de fermentation utiles pour .l'obtention de l'érythro:nycine ont déjà été décrits en détail dans la de- mande de brevet déposée aux Etats-Unis d'Amérique sous le n 282.246, aux noms de Robert La Bunch et James M. Mc Guire.
La présente invention concerne par conséquent un procédé de préparation de l'érythromycine "B", qui consiste à cultiver une souche productrice d'érythromycine "B", de "Streptomyces erythreus" dans un 'ni- lieu de culture contenant une source assimilable d'un hydrate de carbone, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions d'aération, à l'état immergé, jusqu'à l'obtention d'une activité antibiotique importante produi- te par cet organisme dans le milieu de culture précité; à éliminer le my- célium du milieu de culture; à extraire la totalité des produits antibio- tiques actifs de ce milieu à l'aide d'un solvant polaire non miscible à l'eau; à chasser ce solvant;
enfin, à séparer l'érythro.nycine "B" de tou- te autre érythromycine présente.
Le procédé conforme à la présente invention permet d'obtenir une composition chimique appartenant au groupe des produits contenant une
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base azotée et ses sels d'addition avec des acides, ladite base ayant les propriétés suivantes : elle présente un facteur pK' # d'environ 8,5 lorsqu'on procède à sa titration au sein d'une solution de diméthyl- formamide et d'eau en proportion de 2:1, un poids moléculaire d'environ 736 découlant des données de la titration, des maxima d'absorption bien nets dans le spectre d'absorption iinfra-roage, mesurés en solution chlo- roformique d'environ 6,0% en poids/volume, s'étendant à l'intérieur de la gamme allant de 2,4 à 12,0 s'identifiant comme suit : 2,80; 3,34; 5,80; 5,90; 6,84; 7,24; 7,50; 7,79; 8,04; 8,54; 8,98; 9,14; 9,48 ;
9,86 ; 10,,24 10,56; 10,96: (11,221 11,54 et ,1+,940 L'érythromydine (la lettre "B" désignant, au cours de la présente description.le produit obtenu grâce à la présente mise en oeuvre, -du , , procède conforme à l'invention et qui se distingue de l'érythromycine déjà connue) présente certaines analogies, quant à ses propriétés, avec l'éry- thromycine, mais elle est caractérisée par certaines différences bien net- tes de la structure chimique, qui apparaissent plus facilement lorsqu'on compare les spectres d'absorption dans l'infra-rouge de l'érythromycine et de l'érythromycine "B". Au dessin annexé, la figure 1 se rapporte à la comparaison des spectres d'absorption dans l'infra-rouge de solutions chlo- roformiques d'érythromycine (courbe en pointillé) et d'érythromycine "B" (courbe en trait plein).
On a porté en ordonnée la transmission en % et en abscisse, la longueur d'onde en microns. En outre, l'érythromycine "B" se distingue par une stabilité plus accentuée au sein de solutions fortement acides.
Le procédé conforme à l'invention permet d'obtenir l'érythromy- cine "B" d'une manière analogue à l'érythromycine et consiste à cultiver le microorganisme "Streptomyces erythreus" dans des milieux de culture contenant des sources assimilables d'hydrate de carbone, d'azote, et de sels minéraux, pour obtenir un bouillon de culture qui contient l'agent antibiotique érythromycine "B" en même temps que l'érythromycine. On filtre ce bouillon pour en éliminer le mycélium, et on sépare le mélange d'agents antibiotiques, c'est-à-dire l'érythromycine "B" et l'érythromy- cine, de ce bouillon de culture, par extraction avec un solvant non po- laire et non miscible à l'eau.
On sépare l'érythromycine "B", contenue dans le mélange, des érythromycines à l'aide de procédés qui utilisent les différences de solubilité, comme par exemple l'adsorption suivie d'une élution sélective, ou l'extraction à contre-courant par un solvant dans un appareil extracteur multi-tubulaire utilisant des solvants non misci- bles.
L'actinomycète utilisé pour la mise en oeuvre du procédé con- forme à l'invention appartient à la famille des "Streptomyces" de la caté- gorie des "Actinomycétales", conformément à la classification contenue dans l'ouvrage de Bergey "Manual of Determinative Bacteriology" (6ème édi- tion), page 938.
Les caractéristiques morphologiques de cet organisme semblent se rapprocher étroitement de celles d'un actinomycète décrit, par Waksman, comme étant "l'actinomyces 181" 'voir "Soil Science" 8, pa- ges 71 à 214, 1919)9 et identifié ultérieurement, par le même auteur, comme étant le "Streptomyces erythreus"o Il existe cependant certaines différences entre les propriétés de culture de l'organisme décrit par Waksman et celles dq nouveau produit obtenu par le procédé conforme à l'invention, ce produit étant classé provisoirement comme étant une sou- che de "Streptomyces erythreus".
Une culture de l'organisme précité a été déposée à la collection du Laboratoire "Northern Regional Research Laboratory" (Etats-Unis d'Amérique) et on a assigné à cette souche de culture le numéro "NRRL 2338".
On va décrire maintenant le procédé conforme à la présente in- vention en se reportant plus spécialement à la souche précitée, mais il est bien entendu que les procédés de fermentation conformes à cette in- vention se rapportent non seulement à l'utilisation du "Streptomyces ery-
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threus" (souche NRRL 2338), mais aussi à d'autres souches pouvant donner naissance à l'érythromycine "B", ces souches étant obtenues facilement, et étant isolées à l'aide des procédés usuels d'isolement et de modifica- tion des souches, qui consistent à choisir des organismes cultivés et à les exposer à différents moyens de modification tels que les rayons-X, la lumière ultra-violette et les agents chimiques,
comme par exemple les stimulants azotéso Comme autres exemples illustratifs de souches suscep- tibles de produire de l'érythromycine "B" on cite le "Streptomyces ery- threus" des souches NRRL 2359, 2360 et 23610
Comme on vient de le dire, on peut cultiver le "Streptomyces erythreus" de la souche NRRL 2338 dans un milieu de culture pour obtenir des agents antibiotiques efficaces. Le milieu de culture peut être choi- si dans un certain nombre de milieux, étant donné que d'après les essais d'utilisation déjà mentionnés, l'organisme précité est susceptible de mettre à profit de nombreuses sources énergétiques.
Cependant, pour une production économique, et pour que le procédé conforme à l'invention per- mette un rendement maximum en produit antibiotique, et aussi pour isoler facilement ce produit, on doit donner la préférence à des milieux de cul- ture déterminéso Ainsi, par exemple, on préfère utiliser comme sources d'hydrate de carbone dans le milieu de culture, l'amidon et le glucoseo D'autres sources possibles sont le sucrose, la dextrine, les mélasses, et des produits analogueso Comme sources d'azote préférées, on cite : les grains de mais trempés, la farine ou la fleur de farine de soja, et les résines solubles de distillerie, bien que d'autres sources soient utili- sables, comme,par exemple, la caséine, les mélanges d'aminoacides, les peptones (aussi bien de viande que de soja), et des produits analogues.
On peut également utiliser, comme sources minérales d'azote, les nitrates ou les sels d'ammonium.
Les sels minéraux nutritifs à incorporer au milieu comprennent les sels habituels susceptibles d'engendrer des ions de sodium, de potas- sium, de calcium, de phosphate, de chlorure, de sulfate, et des ions ana- logues.
Comme pour la croissance et le développement d'autres micro- organismes, il est nécessaire que le milieu de culture contienne des tra- ces d'éléments essentiels favorisant la croissance de l'actinomycète uti- lisé pour la mise en oeuvre du prodédé conforme à l'inventiono Ces traces d'éléments sont généralement introduites comme impuretés accidentelles lors de l'addition des autres constituants du milieu.
Pour obtenir le maximum de croissance et de développement du "Streptomyces erythreus" (souche NRRL 2338), on doit ajuster le milieu de culture avant l'inoculation avec cet organisme à un pH compris entre 6,0 et 7,5, et situé de préférence au voisinage de 6,5. On a observé que, pendant la période de croissance de l'organisme et la production d'anti- biotiques, le milieu devient graduellement alcalin et qu'il peut attein- dre une alcalinité correspondant à un pH compris entre 7,2 et 8,5 envi- ron ou davantage, le pH final dépendant au moins en partie du pH initial du milieu, des produits tampons présents dans ce milieu, et aussi du laps de temps laissé à la croissance de l'organisme.
Comme dans la production d'autres antibiotiques en quantités massives, les conditions de culture d'aérobies en immersion constituent des conditions que l'on choisit pour obtenir des quantités importantes d'érythromycine "B"o Pour la préparation de quantités limitées de ces substances, on peut utiliser un flacon agitateur et la culture en surfa- ce dans des fioleso En outre, ainsi que cela est bien connu, lorsqu'on procède à la culture dans des récipients de grandes dimensions, il est préférable d'utiliser la forme végétative de l'organisme pour l'inocula- tion des récipients de production, afin d'éviter un retard prononcé dans la production de l'antibiotique et l'utilisation peu efficace de l'instal-
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lation qui en résulte.
En conséquence, il est désirable de produire tout d'abord un inoculum végétatif de l'organisme en inoculant une quantité relativement restreinte de milieu de culture avec des spores de cet or- ganisme et, lorsque l'on a obtenu un inoculum végétatif jeune et actif de le transférer aseptiquement dans de grands récipients. Le milieu dans lequel on produit l'inoculum végétatif peut être le même milieu ou un mi- lieu différent de celui que l'on utilise pour la production de l'antibio- tique.,
On peut obtenir une bonne croissance du "Streptomyces erythreus" (souche NRRL 2338) à des températures comprises entre environ 25 C et en- viron 37 C.
La production d'antibiotiques la plus favorable parait se fai- re dans un milieu de culture naintenu à environ 26 -30 Co
Comme on le fait d'habitude lors de la production d'antibioti- ques à l'aide de procédés de culture en immersion, on insuffle de l'air stérilisé dans le milieu de culture. Pour obtenir une croissance de l'organisme et une production d'antibiotiques efficaces, le volume d'air utilisé dans la production en récipient de l'érythromycine et de l'éry- thromycine "B" est de préférence supérieur à 0,1 volume d'air par minute et par volume de milieu de culture.
On obtient une croissance et une production encore plus efficaces lorsque le volume d'air utilisé se monte à au moins 0,4 volume d'air par minute et par volume de bouillon de cul- tureo
On peut facilement suivre la vitesse de production des agents antibiotiques et la concentration de l'activité antibiotique au sein du milieu de culture pendant la période de croissance da microorganisme, par des échantillons d'essai prélevés sur le milieu de culture dont on compare l'activité antibiotique à celles des organismes connus pour être sensibles à l'antibiotique, par exemple le "Staphylococcu aureus" et le "Mycobaxterium tuberculosis"o Pour de telles déterminations, il con- vient d'utiliser une épreuve qui consiste : à préparer des essais de di- lution en série des échantillons de culture;
à ajouter des portions des échantillons dilués à de l'agar-agar nutritif liquéfié; à solidifier cet agar-agar dans une botte de Pétri; à inoculer la plaque avec une jeune culture de "S. aureus" ou de "M. tuberculosis", et à déterminer la dilu- tion la plus grande du milieu de culture qui provoque la complète inhi- bition de croissance de l'organisme sur l'agar-agar nutritif.
On peut également suivre la production des agents antibioti- ques au moyen de procédés d'essais turbidimétriques tels que ceux utilisés couramment dans la production d'autres antibiotiques.
On peut déterminer la présence d'érythronycine "B" et d'éry- thromycine à l'aide de procédés chromatographiques. Un procédé approprié consiste : à dissoudre environ 0,2 à 0,5 mg du produit à essayer dans une faible quantité de solvant tel que l'alcool; à placer la solution concen- trée sous forme d'une touche à l'une des extrémités d'une bande de papier filtre; à sécher, enfin, à développer conformément à la technique chroma- tographique descendante utilisée habituellement sur les bandes de papier filtre.
Parmi les solvants que l'on peut utiliser pour développer la bande de papier, on cite une solution d'hydroxyde d'ammonium de concen- tration 1:99 (volume/volume); de l'eau distillée saturée en -néthyl-isobu- tyl-cétone; de l'eau distillée saturée en méthyl-isobutyl-cétone à la- quelle on a ajouté 2% (volume/volume) de pipéridine; du borate utilisé comme tampon à 0,1M pour un pH de 9,9, saturé en méthyl-isobutyl-cétone; de l'hydroxyde de sodium à 0,15M,saturé en méthyl-isobutyl-cétone; du phosphate acide de potassium à 0,1M, comme solution tampon contenant 3% en volume d'éthanol, et des solutions analogues.
On continue le dévelop-
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pâment pendant environ 4 à 5 heures, ou jusqu'à ce que le niveau du sol- vant se rapproche de l'extrémité de la bande. Après le développement, on détermine l'emplacement du produit antibiotique sur la bande de papier au moyen de la bioautographieo Dans la mise en oeuvre du procédé, on place la bande de papier développée sur la surface d'un milieu de culture nu- tritif d'agar-agar, ayant une épaisseur d'environ 3,17 mm sur une grande plaque de verre, milieu que l'on a préparé en ensemençant un agar-agar nutritif stérile et chaud avec du "Bacillus subtilis".
L'antibiotique se diffuse et passe du papier dans l'agaragaro Après 10 minutes, on re- tire la bande de papier, on renverse la plaque, et on marque directement sur le côté extérieur de la plaque de verre la position de la bande de papier filtre, le niveau du solvant et le point d'application de la solu- tion d'essaio On fait incuber le milieu d'agar-agar pendant une nuit à environ 37 C en position renversée., La production de zones claires, c'est- à-dire de zones où il ne se manifeste pas de croissance bactérienne, indi- que dans le milieu précité l'emplacement de l'agent antibiotique tel qu'il se rencontre sur le papier filtre.
En mesurant la distance parcourue res- pectivement par l'antibiotique et le solvant, on détermine la valeur "Rf", ou le rapport entre la vitesse de déplacement de l'antibiotique et celle du solvanto On a constaté que l'érythromycine "B" se déplaçait moins ra- pidement que lérythromycine au cours de cet essaio Lorsqu'il s'agit d'un mélange d'érythromycine "B" et d'érythromycine, deux zones claires appa- raissent dans la bioautographie, mais lorsqu'une zone de non-croissance se produit, la comparaison de la position de cette zone avec la position d'une zone, obtenue avec de l'érythromycine "B" pure ou avec de l'érythro- mycine, peut permettre d'établir lequel des agents antibiotiques est pré- sento Dans des conditions optima, la valeur Rf de l'érythromycine "B" est d'environ trois quarts de la valeur Rf de l'érythromycineo
Au dessin annexé,
la figure 2 représente l'image d'une bioau- tographie obtenue à partir d'un chromatogramme sur papier sur lequel on a soumis simultanément à la chromatographie l'érythromycine (a), l'érythro- mycine "B" (b) et un mélange d'érythromycine et d'érythromycine "B" (c), en quantités approximativement égaleso Le solvant utilisé pour le déve- loppement est constitué par une solution aqueuse à 1% d'hydroxyde d'am- monium concentré, saturé en méthyl-isobutyl-cétone.
Les surfaces repré- sentées en noir correspondent aux zones ou aucune croissance bactérienne ne se manifesteo
En général, le maximum d'activité antibiotique totale après l'inoculation du milieu de culture se produit en un laps de temps allant de deux à cinq jours environ lorsqu'on utilise une culture d'aérobies en immersion, et entre 5 à 10 jours lorsqu'on utilise la culture en surface ou dans un flacon agitateur
On obtient habituellement dans le milieu de culture des quan- tités approximativement égales d'érythromycine et d'érythromycine "B", mais cette proportion peut varier selon la durée de l'incubationo En gé- néral, une incubation plus courte, par exemple de 1 ou 2 jours,
favorise la production d'une proportion plus élevée d'érythromycine "B"o La pro- longation de l'incubation se traduit par une diminution de la proportion d'érythromycine "B", comparée à celle de l'érythromycine, et peut même aboutir à une diminution effective de la quantité totale d'érythromycine "B" présente dans le bouillon de culture.
Jusqu'à présent, on ne connaît pas la raison de cet abaissement de la proportion o de cette diminution en valeur absolueo
Dans le procédé conforme à l'invention, on peut récupérer les agents antibiotiques obtenus par culture du "So erythreus" (souche NRRL 2338) à partir du milieu de culture, en utilisant des procédés d'ex- traction ou d'adsorptiono On préfère l'extraction dans la production in- dustrielle car elle demande moins de temps et elle est moins coûteuse.
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Pour l'extraction des composés antibiotiques à partir du milieu de culture on préfère utiliser des solvants polaires organiques non miscibles à l'eau, qui comprennent : des alkyl-esters d'acides gras, par exemple l'acétate d'éthyle et l'acétate d'amyle; des hydrocarbures chlorés, par exemple le chloroforme et le dichloréthylène; des alcools peu solubles dans l'eau, par exemple le butanol et l'alcocl amylique; des cétones peu solubles dans l'eau, par exemple la méthyl-amyl-cétone, et d'autres solvants, par exem- ple l'éther éthylique et l'éther dibutylique. On peut également utiliser d'autres solvants de caractère similaire.
De préférence, on règle avant l'extraction le pH du bouillon de culture filtré à environ 9,5 ou davanta- geo
On peut réaliser la séparation de l'érythromycine "B" d'avec l'érythromycine, en utilisant les différences de solubilité et les carac- téristiques adsorptives des deux composés. Par exemple, l'érythromicine "B" est plus fortement adsorbée par la cellulose que l'érythromycine. Ain- si, lorsqu'on fait adsorber un mélange d'érythromicine et d'érythrofuicine "B" en solution dans une colonne constituée par de la cellulose, et que l'on procède à l'élution de cette colonne avec un solvant approprié, l'é- rythromicine apparaît dans les liqueurs d'élution initiales, tandis que l'érythromycine "B" reste dans la colonne et n'est récupérée que par élu- tion prolongée.
Dans une variante, on peut séparer les deux composés avec récupération de l'érythromycine "B", par des procédés d'extraction sélective dans lesquels on utilise un appareil d'extraction à contre-cou- ranto
Les exemples donnés ci-après à titre non limitatif se rappor- tent aux procédés mis en oeuvre, conformément à l'invention, pour isoler l'érythromycine "B" et aux propriétés de cette dernière.
Exemple 1.
On forme une culture sporulée de "Streptomyces erythreus" (cou- che NRRL 2338) en faisant croître cet organisme sur une plaque d'agar-agar nutritif ayant la composition suivante
Dextrine 15 grammes
Tryptone 5 "
Agar-agar 20 " Bétaine 0,5 " +Mélange de sels minéraux 2 cm3
Eau pour porter le volume à 1 litre +Le mélange de sels minéraux est constitué par les ingrédients suivants :
K2HOP4 100,0 grammes
NaCl 100,0 "
MgSO4 100,0 "
FeSO4,7H2O 2,0 " ZnS04,7H20 1,0 "
CuSO4,5H2O 0,5 "
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MnCl2,4H2O 0,5 grammes
CoCl2,6H2O 0,1 "
CaCl2 40,0 "
Eau pour porter le volume à 1 litre
On fait incuber cette plaque pendant 10 jours à 33 Co On re- cueille les spores sous forme d'une suspension aqueuse en recouvrant la plaque d'une faible quantité d'eau distillée stérile et en grattant dou- cement les spores se trouvant à la surface de la plaqueo
On utilise environ 1 cm3 de la suspension de spores ainsi ob@ tenue pour inoculer dans des conditions stériles le milieu de culture sté- rilisé suivant s
EMI7.1
<tb> Produit <SEP> de <SEP> digestion <SEP> de <SEP> la <SEP> caséine
<tb> ("N-Z <SEP>
amine <SEP> A", <SEP> provenant <SEP> de <SEP> la
<tb> Sté <SEP> "Sheffield <SEP> Farms") <SEP> 0000000000000000000000000000 <SEP> 1 <SEP> gramme
<tb>
<tb> Mélasse <SEP> de <SEP> "Blackstrap"
<tb> (expression <SEP> en <SEP> usage <SEP> aux <SEP> Etats-Unis
<tb>
EMI7.2
d'Amérique) oooooaooooo0oooooaooooo00oooooaaooooo00 2 " K2HP04 00000000000000000000000000000000000000000000 0,15 11 Eau 00000000000000000000000000000000000000000000000 100 cm3
On fait incuber le milieu de culture inoculé, à environ 28 C, pendant environ 72 heures, jusqu'à l'obtention d'un bon développement vé- gétatifo On utilise environ 5 cm3 du milieu de culture contenant le pro- duit de la croissance végétative pour inoculer une fiole Erlenmeyer de 250 cm3 contenant environ 75 cm3 d'un milieu de culture de fermentation stérilisé ayant la composition suivante
Sucrose 45,
0 grammes
Farine de soja 20,0 "
Mélasses concentrées de résidus solubles de distillerie 2,0 "
Chlorure de sodium 5,0 "
Carbonate de calcium 2,0 "
Hexahydrate de chlorure cobalteux 0,001 "
Eau pour porter le volume à 1 litre.
On place la fiole, contenant le milieu de culture inoculé, dans une chambre d'incubation maintenue à une température d'environ 28 C et on secoue, pendant environ six jours, sur une machine à secouer rotative ayant une course de 5 cm, et fonctionnant à 240 tours par mi- nute. De temps en temps, on examine des échantillons du milieu de cul- ture pour déterminer la valeur totale d'activité antibiotique qu'ils contiennent. Lorsque la valeur de cette activité atteint environ 250 à 300 mcg par cm3 de bouillon, on filtre le bouillon contenu dans la fiole pour éliminer le mycéliumo
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On règle à 9,5 le pH d'environ 1,5 litre de bouillon de cultu- re filtré, en utilisant de l'hydroxyde de sodium, et on l'extrait avec 750 cm3 d'acétate d'amyle.
L'acétate d'amyle de l'extraction, contenant sen- siblement la totalité du produit antibiotique actif présent dans le bouil- lon initial, est concentré par évaporation sous vide jusqu'à un volume d'environ 10 cm3. On ajoute à la solution concentrée d'acétate d'amyle, 0,5 gr de fibre de cellulose purifiée, et on sèche le mélange sous vide, pendant la nuit.
On place la cellulose séchée finement pulvérisée, qui contient à l'état absorbé la totalité du produit antibiotique actif pro- venant du bouillon, à la surface supérieure d'une colonne dadsorption chromatographique mesurant environ 3,2 cm x 38 cm et contenant environ 161 gr de fibre de cellulose purifiée séchée (on trouve cette fibre dans le commerce, aux Etats-Unis, sous la désignation "Solka floc"). On procè- de au développement de la colonne en utilisant de l'hydroxyde d'ammonium aqueux à 0,1% saturé en méthyl-isobutyl-cétone. On recueille par fractions le produit d'élution, dont on évalue l'activité antibiotique en utilisant le "S.aureus" comme organisme d'épreuve.
La présence de l'érythromycine et/ou de l'érythromycine "B" est déterminée par analyse chromatographi- que sur papier filtre en utilisant le même système de solvant que celui qui a été décrit précédemment. On constate que les premiers 120 cm3 du produit d'élution ne contiennent que de l'érythromycine, tandis que les 120 cm3 de la seconde portion contiennent un mélange d'érythromycine et d'érythromycine "B". Les fractions actives ultérieures du produit d'élu- tion contiennent uniquement de l'érythromycine "B", et l'on réunit, puis l'on extrait ces fractions avec du chloroforme. On évapore l'extrait chloroformique à siccité, sous vide et on lave le résidu, constitué par l'érythromycine "B", avec une faible quantité d'hexane, puis on le dis- sout dans 25 cm3 d'éther.
On filtre la solution éthérée, et on évapore à siccité sous vide. On dissout le résidu dans une quantité minimum d'acétone chaude et on refroidit, ce qui permet d'obtenir les cristaux d'érythromycine "B". Comme pour l'érythromycine, le sel cristallisé contient une certaine quantité de solvant de cristallisation. Lorsqu'on soumet le sel cristallisé à des conditions permettant d'éliminer le sol- vant, celui-ci se dégage et le produit antibiotique père) ses propriétés cristallines.
Exemple 2.
On prépare un milieu de culture stérilisé contenant les ingré- dients suivants
Dextrose 15 grammes
Farine de soja 15 "
Matières solides provenant de grains de mais trempés 5,0 "
Chlorure de sodium 5,0 "
Carbonate de calcium 2,0 "
Eau pour porter le volume à 1 litre.
On inocule le milieu de culture avec une suspension de spores que l'on obtient en faisant croître le "Streptomyces erythreus" (souche NRRL 2338) sur une pl4que d'agar-agar nutritif, conformément au procédé de l'exemple 1, et en enlevant les spores à l'aide d'une faible quantité d'eau distillée stérile. On fait incuber le milieu de culture inoculé, contenu dans une fiole de litres, à environ 28 C pendant environ 36 heu- res, tout en secouant la fiole sur une machine à secouer à va-et-vient
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ayant une course de 5 cm et accomplissant 114 cycles complets par minute.
On recueille par centrifugation le mycélium végétatif qui en résulte; on le lave avec de l'eau et on le met à nouveau en suspension dans envi- ron un litre d'eau distillée stérile. On utilise l'inoculum ainsi prépa- ré pour inoculer une cuve de fermentation de 40 litres contenant environ 20 litres de bouillon de fermentation stérilisé ayant la composition sui- vante s
Glycine 150 grammes
Sucrose 1370 " dl- #-alanine 17,8 "
Phosphate monosodique 100 "
Chlorure de sodium 100 "
Sulfate de magnésium 10 "
Heptahydrate de sulfate ferreux 0,4 "
Heptahydrate de sulfate de zinc 0,2 "
Tétrahydrate de chlorure de magnésium 0,032 "
Hexahydrate de chlorure cobalteux 0,
2 "
Eau pour porter le volume à 20 litreso
On stérilise ensemble le mélange de sels minéraux, la glycine et la dl-# -alanine, et on règle le pH du bouillon à epviron 7,5 après stérilisation. D'autre part, on stérilise séparément le sucrose puis on l'incorpore dans des conditions aseptiques au bouillon stériliséo
On refroidit le bouillon stérilisé et on lui ajoute dans des conditions aseptiques l'inoculum végétatif préparé comme indiqué ci-des- sus. On fait croître l'organisme dans le bouillon pendant environ quatre jours à une température d'environ 28 Co Pendant ce temps de croissance, on agite le bouillon et on y insuffle de l'air stérilisé à un débit de 0,5 volume d'air par volume de bouillon et par minute.
Des essais micro- biologiques, avec utilisation du "S.Aureus" comme organisme d'épreuve, montrent que l'activité totale de l'antibiotique du bouillon est d'envi- ron 200 mcg par cm3, dont environ 50% reviennent à l'érythromycine "B" d'après la chromatographie sur papier et la bioautographieo On filtre le bouillon pour en éliminer le mycélium, et on peut recueillir l'érythro- mycine "B" à partir de ce bouillon clairo
On règle à 9,5 le pH de 1,5 litre de bouillon de culture filtré, contenant de l'érythromycyne et de l'érythromycine "B" et préparé confor- mément au procédé ci-dessus, en utilisant de l'hydroxyde de sodium aqueux,
et on extrait ensuite avec environ 750 cm3 d'acétate d'amyle. On évapore à siccité sous vide l'acétate d'amyle d'extractiono On dissout le résidu d'évaporation dans environ 250 cm3 de chloroforme; on filtre et on évapo- re à siccité sous vide. On prépare un système de solvant en mélangeant 20 parties de méthylisobutyl-cétone, 20 parties de phosphate à 0,1 M ser- vant de tampon ayant un pH de 6,5, et une partie d'acétone. Au repos, il se forme un système à deux couches, que l'on place dans un appareil de
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Craig d'extraction à contre-courant comportant 60 tubes, entièrement en verre et ayant un volume de 200 cm3. On dissout le résidu d'évaporation de l'extrait chloroformique dans 10 cm3 de la phase supérieure, et on ajou- te ce produit dans le tube initial de l'appareil d'extraction.
On effec- tue ensuite l'extraction à contre-courant de la manière habituelle. On analyse les différentes fractions par un procédé microbiologique, en uti- lisant le "S.aureus" comme organisme d'épreuve, et par chromatographie sur papier. On constate que les fractions 27 à 40 contiennent uniquement de l'érythromycine "B"o On réunit ces fractions et on les évapore sous vide à un volume de 130 cm3. On ajoute du chlorure de sodium jusqu'à ce que la solution en contienne 10%; on règle le pH à 9,8 en utilisant de l'hydro- xyde de sodium dilué, et on extrait avec deux portions de 75 cm3 de chlo- roformeo On sèche sur du sulfate de sodium anhydre les extraits chloro- formiques réunis, et on les évapore à siccité sous vide.
On dissout le résidu d'évaporation dans une quantité minimum d'acétone à 47 C, et on laisse refroidir lentement, ce qui permet d'obtenir de l'érythromycine "B" cristallisée.
L'érythromycine "B" ainsi préparée présente un point de fusion de 190 -191 C sur le bloc de Kôflero L'analyse élémentaire d'un échantil- lon séché à 60 C sous vide pendant trois heures sur du pentoxyde de phos- phore donne les valeurs suivantes :61,54% de carbone; 9,45% d'hydrogène, 2,0% d'azote, et 28,01% l'oxygène (par différence).
Une titration électrométrique dans une solution aqueuse à 66% de diméthylformamide indique la présence d'un groupe titrable de pK'# égal à 8,5.
Le poids moléculaire déterminé d'après les résultats de la titration correspond à environ 7360
Le spectre d'absorption de la lumière ultra-violette de l'éry- thromycine "B", dissoute dans du méthanol absolu, indique un maximum à 286 m et un minimum à 259m , E286 étant égal à 59.
L'essai microbiologique en utilisant le "Soaureus" comme orga- nisme d'épreuve, montre qu'un milligramme d'érythromycine "B" présente une activité antibiotique équivalent à environ 750 microgrammes d'érythro- mycine.
Le spectre d'absorption à la lumière infra-rouge d'une solu- tion à 6% d'érythromycine "B" dans le chloroforme (poids-volume) présente des maxima d'absorption nettement décelables entre 2,4 /, et 12 , répartis comme suite : 2,50; 3,34; 5,80; 6,84; 7,24; 7,50, 8,04 ; 8,54 ; 8,98; 9,14; 9,48; 9,86; 10,24; 10,56; 10,96 ; 11,22;
11,54 et Il,940 La courbe d'absorption de la lumière infra-rouge est représentée par la ligne en trait plein de la figure 1 du dessin annexéo
Lorsqu'on prépare simultanément sur des bandes de papier filtre les chromatogrammes d'échantillons d'érythromycine "B" et d'érythromycine, en utilisant de l'eau distillée ammoniacale saturée en méthyl-isobutyl- cétone comme solvant de développement, le rapport des vitesses auxquelles les deux antibiotiques se déplacent est le suivant
Rf érythromycine "B" - 0,75
Rf érythromycine
L'érythromycine "B" est beaucoup plus stable en solution acide que l'érythromycineo Lorsque des solutions aqueuses contenant respecti- venent 38 unités par cm3 d'érythromycine "B" et d'érythromycine,
que l'on a ajustées à différents niveaux de pH, sont maintenues au repos pendant une heure à environ 25 Co, l'érythromycine "B" montre une stabilité bien plus grande vis-à-vis de l'acide.
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Dans le procédé objet de l'invention, on obtient les sels d'ad- dition d'acides de l'érythromycine "B" en traitant la solution aqueuse de la base d'érythromycine "B" avec un équivalent d'un acide, et en évaporant cette solution à siccité sous vide. Dans une variante, on peut aussi traiter la solution dans un solvant organique de la base d'érythromycine "B" avec l'acide ou une solution de cet acide, et faire précipiter direc- tement de la solution le sel d'érythromycine. Lorsqu'on veut préparer des sels d'addition d'acides forts, on doit prendre soin, durant l'addi- tion de l'acide à l'antibiotique, d'éviter des concentrations locales éle- vées de l'acide, étant donné qu'une certaine partie de l'érythromycine "B" peut se décomposer,
si le pH descend en dessous de 2 pendant un laps de temps appréciable. Comme sels particulièrement caractéristiques, on cite : le chlorhydrate, le sulfate, le citrate, le mandélate, le succi- nate, l'oléate, le palmitate, le myristate, le stéarate, l'oxalate, le thiocyanate et le glucoheptonate de lérythromycine "B"o On peut préparer facilement d'autres sels similaires en utilisant les procédés décrits ci- dessus. Par exemple, on obtient le chlorhydrate de l'érythromycine "B", en traitant la solution dans l'éthanol de la base de l'antibiotique avec une quantité équivalente d'acide chlorhydrique aqueux, et en évaporant la solution à siccité sous vide pour obtenir le sel solideo On purifie ce sel en le recistallisant dans un mélange d'éthanol et d'acétone.
On note ici à titre indicatif, que l'érythromycine "B" et ses sels obtenus conformément au procédé de l'invention constituent des agents antibiotiques efficaces, possédant sensiblement le même large spectre antibactérien que l'érythromycine, compte tenu du poids moléculaire plus élevé des sels précités.
REVENDICATIONS.
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1. Procédé de production de l'érythromycine "B" caractérisé par le fait qu'on cultive une souche de "Streptomyces erythreus", donnant naissance à l'érythromycine "B". dans un milieu de culture contenant une source assimilable d'hydrate de carbone, d'azote, et de sels minéraux, dans des conditions d'aération et en immersion, jusqu'à ce que l'orga- nisme précité développe dans le milieu de culture ci-dessus une activité antibiotique substantielle; qu'on élimine le mycélium du milieu de cul- ture ; qu'on extrait l'activité antibiotique totale de ce milieu à l'aide d'un solvant polaire non miscible à l'eau; qu'on élimine le solvant ; etqu'on sépare l'érythromycine "B" de toute autre érythromycine présente.