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PERFECTIONNEMENTS RELATIFS A UN PROCEDE DE PREPARATION DE L'ERYTHRO-
MYCINE "B".
La présente invention se rapporte à un procédé perfectionné de préparation permettant d'obtenir en particulier l'érythronycine "B" et les sels d'addition qu'elle forme avec les acides.
Il est bien connu que l'érythromycine est une substance anti- biotique caractérisée par un spectre antibactérien étendu, que l'on peut obtenir en cultivant un @icroorganisme appelé "Streptomyces erythreus" sur des milieux de culture nutritifs artificiels. Ce microorganisme, les milieux de culture appropriés et les procédés de fermentation utiles pour .l'obtention de l'érythro:nycine ont déjà été décrits en détail dans la de- mande de brevet déposée aux Etats-Unis d'Amérique sous le n 282.246, aux noms de Robert La Bunch et James M. Mc Guire.
La présente invention concerne par conséquent un procédé de préparation de l'érythromycine "B", qui consiste à cultiver une souche productrice d'érythromycine "B", de "Streptomyces erythreus" dans un 'ni- lieu de culture contenant une source assimilable d'un hydrate de carbone, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions d'aération, à l'état immergé, jusqu'à l'obtention d'une activité antibiotique importante produi- te par cet organisme dans le milieu de culture précité; à éliminer le my- célium du milieu de culture; à extraire la totalité des produits antibio- tiques actifs de ce milieu à l'aide d'un solvant polaire non miscible à l'eau; à chasser ce solvant;
enfin, à séparer l'érythro.nycine "B" de tou- te autre érythromycine présente.
Le procédé conforme à la présente invention permet d'obtenir une composition chimique appartenant au groupe des produits contenant une
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base azotée et ses sels d'addition avec des acides, ladite base ayant les propriétés suivantes : elle présente un facteur pK' # d'environ 8,5 lorsqu'on procède à sa titration au sein d'une solution de diméthyl- formamide et d'eau en proportion de 2:1, un poids moléculaire d'environ 736 découlant des données de la titration, des maxima d'absorption bien nets dans le spectre d'absorption iinfra-roage, mesurés en solution chlo- roformique d'environ 6,0% en poids/volume, s'étendant à l'intérieur de la gamme allant de 2,4 à 12,0 s'identifiant comme suit : 2,80; 3,34; 5,80; 5,90; 6,84; 7,24; 7,50; 7,79; 8,04; 8,54; 8,98; 9,14; 9,48 ;
9,86 ; 10,,24 10,56; 10,96: (11,221 11,54 et ,1+,940 L'érythromydine (la lettre "B" désignant, au cours de la présente description.le produit obtenu grâce à la présente mise en oeuvre, -du , , procède conforme à l'invention et qui se distingue de l'érythromycine déjà connue) présente certaines analogies, quant à ses propriétés, avec l'éry- thromycine, mais elle est caractérisée par certaines différences bien net- tes de la structure chimique, qui apparaissent plus facilement lorsqu'on compare les spectres d'absorption dans l'infra-rouge de l'érythromycine et de l'érythromycine "B". Au dessin annexé, la figure 1 se rapporte à la comparaison des spectres d'absorption dans l'infra-rouge de solutions chlo- roformiques d'érythromycine (courbe en pointillé) et d'érythromycine "B" (courbe en trait plein).
On a porté en ordonnée la transmission en % et en abscisse, la longueur d'onde en microns. En outre, l'érythromycine "B" se distingue par une stabilité plus accentuée au sein de solutions fortement acides.
Le procédé conforme à l'invention permet d'obtenir l'érythromy- cine "B" d'une manière analogue à l'érythromycine et consiste à cultiver le microorganisme "Streptomyces erythreus" dans des milieux de culture contenant des sources assimilables d'hydrate de carbone, d'azote, et de sels minéraux, pour obtenir un bouillon de culture qui contient l'agent antibiotique érythromycine "B" en même temps que l'érythromycine. On filtre ce bouillon pour en éliminer le mycélium, et on sépare le mélange d'agents antibiotiques, c'est-à-dire l'érythromycine "B" et l'érythromy- cine, de ce bouillon de culture, par extraction avec un solvant non po- laire et non miscible à l'eau.
On sépare l'érythromycine "B", contenue dans le mélange, des érythromycines à l'aide de procédés qui utilisent les différences de solubilité, comme par exemple l'adsorption suivie d'une élution sélective, ou l'extraction à contre-courant par un solvant dans un appareil extracteur multi-tubulaire utilisant des solvants non misci- bles.
L'actinomycète utilisé pour la mise en oeuvre du procédé con- forme à l'invention appartient à la famille des "Streptomyces" de la caté- gorie des "Actinomycétales", conformément à la classification contenue dans l'ouvrage de Bergey "Manual of Determinative Bacteriology" (6ème édi- tion), page 938.
Les caractéristiques morphologiques de cet organisme semblent se rapprocher étroitement de celles d'un actinomycète décrit, par Waksman, comme étant "l'actinomyces 181" 'voir "Soil Science" 8, pa- ges 71 à 214, 1919)9 et identifié ultérieurement, par le même auteur, comme étant le "Streptomyces erythreus"o Il existe cependant certaines différences entre les propriétés de culture de l'organisme décrit par Waksman et celles dq nouveau produit obtenu par le procédé conforme à l'invention, ce produit étant classé provisoirement comme étant une sou- che de "Streptomyces erythreus".
Une culture de l'organisme précité a été déposée à la collection du Laboratoire "Northern Regional Research Laboratory" (Etats-Unis d'Amérique) et on a assigné à cette souche de culture le numéro "NRRL 2338".
On va décrire maintenant le procédé conforme à la présente in- vention en se reportant plus spécialement à la souche précitée, mais il est bien entendu que les procédés de fermentation conformes à cette in- vention se rapportent non seulement à l'utilisation du "Streptomyces ery-
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threus" (souche NRRL 2338), mais aussi à d'autres souches pouvant donner naissance à l'érythromycine "B", ces souches étant obtenues facilement, et étant isolées à l'aide des procédés usuels d'isolement et de modifica- tion des souches, qui consistent à choisir des organismes cultivés et à les exposer à différents moyens de modification tels que les rayons-X, la lumière ultra-violette et les agents chimiques,
comme par exemple les stimulants azotéso Comme autres exemples illustratifs de souches suscep- tibles de produire de l'érythromycine "B" on cite le "Streptomyces ery- threus" des souches NRRL 2359, 2360 et 23610
Comme on vient de le dire, on peut cultiver le "Streptomyces erythreus" de la souche NRRL 2338 dans un milieu de culture pour obtenir des agents antibiotiques efficaces. Le milieu de culture peut être choi- si dans un certain nombre de milieux, étant donné que d'après les essais d'utilisation déjà mentionnés, l'organisme précité est susceptible de mettre à profit de nombreuses sources énergétiques.
Cependant, pour une production économique, et pour que le procédé conforme à l'invention per- mette un rendement maximum en produit antibiotique, et aussi pour isoler facilement ce produit, on doit donner la préférence à des milieux de cul- ture déterminéso Ainsi, par exemple, on préfère utiliser comme sources d'hydrate de carbone dans le milieu de culture, l'amidon et le glucoseo D'autres sources possibles sont le sucrose, la dextrine, les mélasses, et des produits analogueso Comme sources d'azote préférées, on cite : les grains de mais trempés, la farine ou la fleur de farine de soja, et les résines solubles de distillerie, bien que d'autres sources soient utili- sables, comme,par exemple, la caséine, les mélanges d'aminoacides, les peptones (aussi bien de viande que de soja), et des produits analogues.
On peut également utiliser, comme sources minérales d'azote, les nitrates ou les sels d'ammonium.
Les sels minéraux nutritifs à incorporer au milieu comprennent les sels habituels susceptibles d'engendrer des ions de sodium, de potas- sium, de calcium, de phosphate, de chlorure, de sulfate, et des ions ana- logues.
Comme pour la croissance et le développement d'autres micro- organismes, il est nécessaire que le milieu de culture contienne des tra- ces d'éléments essentiels favorisant la croissance de l'actinomycète uti- lisé pour la mise en oeuvre du prodédé conforme à l'inventiono Ces traces d'éléments sont généralement introduites comme impuretés accidentelles lors de l'addition des autres constituants du milieu.
Pour obtenir le maximum de croissance et de développement du "Streptomyces erythreus" (souche NRRL 2338), on doit ajuster le milieu de culture avant l'inoculation avec cet organisme à un pH compris entre 6,0 et 7,5, et situé de préférence au voisinage de 6,5. On a observé que, pendant la période de croissance de l'organisme et la production d'anti- biotiques, le milieu devient graduellement alcalin et qu'il peut attein- dre une alcalinité correspondant à un pH compris entre 7,2 et 8,5 envi- ron ou davantage, le pH final dépendant au moins en partie du pH initial du milieu, des produits tampons présents dans ce milieu, et aussi du laps de temps laissé à la croissance de l'organisme.
Comme dans la production d'autres antibiotiques en quantités massives, les conditions de culture d'aérobies en immersion constituent des conditions que l'on choisit pour obtenir des quantités importantes d'érythromycine "B"o Pour la préparation de quantités limitées de ces substances, on peut utiliser un flacon agitateur et la culture en surfa- ce dans des fioleso En outre, ainsi que cela est bien connu, lorsqu'on procède à la culture dans des récipients de grandes dimensions, il est préférable d'utiliser la forme végétative de l'organisme pour l'inocula- tion des récipients de production, afin d'éviter un retard prononcé dans la production de l'antibiotique et l'utilisation peu efficace de l'instal-
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lation qui en résulte.
En conséquence, il est désirable de produire tout d'abord un inoculum végétatif de l'organisme en inoculant une quantité relativement restreinte de milieu de culture avec des spores de cet or- ganisme et, lorsque l'on a obtenu un inoculum végétatif jeune et actif de le transférer aseptiquement dans de grands récipients. Le milieu dans lequel on produit l'inoculum végétatif peut être le même milieu ou un mi- lieu différent de celui que l'on utilise pour la production de l'antibio- tique.,
On peut obtenir une bonne croissance du "Streptomyces erythreus" (souche NRRL 2338) à des températures comprises entre environ 25 C et en- viron 37 C.
La production d'antibiotiques la plus favorable parait se fai- re dans un milieu de culture naintenu à environ 26 -30 Co
Comme on le fait d'habitude lors de la production d'antibioti- ques à l'aide de procédés de culture en immersion, on insuffle de l'air stérilisé dans le milieu de culture. Pour obtenir une croissance de l'organisme et une production d'antibiotiques efficaces, le volume d'air utilisé dans la production en récipient de l'érythromycine et de l'éry- thromycine "B" est de préférence supérieur à 0,1 volume d'air par minute et par volume de milieu de culture.
On obtient une croissance et une production encore plus efficaces lorsque le volume d'air utilisé se monte à au moins 0,4 volume d'air par minute et par volume de bouillon de cul- tureo
On peut facilement suivre la vitesse de production des agents antibiotiques et la concentration de l'activité antibiotique au sein du milieu de culture pendant la période de croissance da microorganisme, par des échantillons d'essai prélevés sur le milieu de culture dont on compare l'activité antibiotique à celles des organismes connus pour être sensibles à l'antibiotique, par exemple le "Staphylococcu aureus" et le "Mycobaxterium tuberculosis"o Pour de telles déterminations, il con- vient d'utiliser une épreuve qui consiste : à préparer des essais de di- lution en série des échantillons de culture;
à ajouter des portions des échantillons dilués à de l'agar-agar nutritif liquéfié; à solidifier cet agar-agar dans une botte de Pétri; à inoculer la plaque avec une jeune culture de "S. aureus" ou de "M. tuberculosis", et à déterminer la dilu- tion la plus grande du milieu de culture qui provoque la complète inhi- bition de croissance de l'organisme sur l'agar-agar nutritif.
On peut également suivre la production des agents antibioti- ques au moyen de procédés d'essais turbidimétriques tels que ceux utilisés couramment dans la production d'autres antibiotiques.
On peut déterminer la présence d'érythronycine "B" et d'éry- thromycine à l'aide de procédés chromatographiques. Un procédé approprié consiste : à dissoudre environ 0,2 à 0,5 mg du produit à essayer dans une faible quantité de solvant tel que l'alcool; à placer la solution concen- trée sous forme d'une touche à l'une des extrémités d'une bande de papier filtre; à sécher, enfin, à développer conformément à la technique chroma- tographique descendante utilisée habituellement sur les bandes de papier filtre.
Parmi les solvants que l'on peut utiliser pour développer la bande de papier, on cite une solution d'hydroxyde d'ammonium de concen- tration 1:99 (volume/volume); de l'eau distillée saturée en -néthyl-isobu- tyl-cétone; de l'eau distillée saturée en méthyl-isobutyl-cétone à la- quelle on a ajouté 2% (volume/volume) de pipéridine; du borate utilisé comme tampon à 0,1M pour un pH de 9,9, saturé en méthyl-isobutyl-cétone; de l'hydroxyde de sodium à 0,15M,saturé en méthyl-isobutyl-cétone; du phosphate acide de potassium à 0,1M, comme solution tampon contenant 3% en volume d'éthanol, et des solutions analogues.
On continue le dévelop-
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pâment pendant environ 4 à 5 heures, ou jusqu'à ce que le niveau du sol- vant se rapproche de l'extrémité de la bande. Après le développement, on détermine l'emplacement du produit antibiotique sur la bande de papier au moyen de la bioautographieo Dans la mise en oeuvre du procédé, on place la bande de papier développée sur la surface d'un milieu de culture nu- tritif d'agar-agar, ayant une épaisseur d'environ 3,17 mm sur une grande plaque de verre, milieu que l'on a préparé en ensemençant un agar-agar nutritif stérile et chaud avec du "Bacillus subtilis".
L'antibiotique se diffuse et passe du papier dans l'agaragaro Après 10 minutes, on re- tire la bande de papier, on renverse la plaque, et on marque directement sur le côté extérieur de la plaque de verre la position de la bande de papier filtre, le niveau du solvant et le point d'application de la solu- tion d'essaio On fait incuber le milieu d'agar-agar pendant une nuit à environ 37 C en position renversée., La production de zones claires, c'est- à-dire de zones où il ne se manifeste pas de croissance bactérienne, indi- que dans le milieu précité l'emplacement de l'agent antibiotique tel qu'il se rencontre sur le papier filtre.
En mesurant la distance parcourue res- pectivement par l'antibiotique et le solvant, on détermine la valeur "Rf", ou le rapport entre la vitesse de déplacement de l'antibiotique et celle du solvanto On a constaté que l'érythromycine "B" se déplaçait moins ra- pidement que lérythromycine au cours de cet essaio Lorsqu'il s'agit d'un mélange d'érythromycine "B" et d'érythromycine, deux zones claires appa- raissent dans la bioautographie, mais lorsqu'une zone de non-croissance se produit, la comparaison de la position de cette zone avec la position d'une zone, obtenue avec de l'érythromycine "B" pure ou avec de l'érythro- mycine, peut permettre d'établir lequel des agents antibiotiques est pré- sento Dans des conditions optima, la valeur Rf de l'érythromycine "B" est d'environ trois quarts de la valeur Rf de l'érythromycineo
Au dessin annexé,
la figure 2 représente l'image d'une bioau- tographie obtenue à partir d'un chromatogramme sur papier sur lequel on a soumis simultanément à la chromatographie l'érythromycine (a), l'érythro- mycine "B" (b) et un mélange d'érythromycine et d'érythromycine "B" (c), en quantités approximativement égaleso Le solvant utilisé pour le déve- loppement est constitué par une solution aqueuse à 1% d'hydroxyde d'am- monium concentré, saturé en méthyl-isobutyl-cétone.
Les surfaces repré- sentées en noir correspondent aux zones ou aucune croissance bactérienne ne se manifesteo
En général, le maximum d'activité antibiotique totale après l'inoculation du milieu de culture se produit en un laps de temps allant de deux à cinq jours environ lorsqu'on utilise une culture d'aérobies en immersion, et entre 5 à 10 jours lorsqu'on utilise la culture en surface ou dans un flacon agitateur
On obtient habituellement dans le milieu de culture des quan- tités approximativement égales d'érythromycine et d'érythromycine "B", mais cette proportion peut varier selon la durée de l'incubationo En gé- néral, une incubation plus courte, par exemple de 1 ou 2 jours,
favorise la production d'une proportion plus élevée d'érythromycine "B"o La pro- longation de l'incubation se traduit par une diminution de la proportion d'érythromycine "B", comparée à celle de l'érythromycine, et peut même aboutir à une diminution effective de la quantité totale d'érythromycine "B" présente dans le bouillon de culture.
Jusqu'à présent, on ne connaît pas la raison de cet abaissement de la proportion o de cette diminution en valeur absolueo
Dans le procédé conforme à l'invention, on peut récupérer les agents antibiotiques obtenus par culture du "So erythreus" (souche NRRL 2338) à partir du milieu de culture, en utilisant des procédés d'ex- traction ou d'adsorptiono On préfère l'extraction dans la production in- dustrielle car elle demande moins de temps et elle est moins coûteuse.
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Pour l'extraction des composés antibiotiques à partir du milieu de culture on préfère utiliser des solvants polaires organiques non miscibles à l'eau, qui comprennent : des alkyl-esters d'acides gras, par exemple l'acétate d'éthyle et l'acétate d'amyle; des hydrocarbures chlorés, par exemple le chloroforme et le dichloréthylène; des alcools peu solubles dans l'eau, par exemple le butanol et l'alcocl amylique; des cétones peu solubles dans l'eau, par exemple la méthyl-amyl-cétone, et d'autres solvants, par exem- ple l'éther éthylique et l'éther dibutylique. On peut également utiliser d'autres solvants de caractère similaire.
De préférence, on règle avant l'extraction le pH du bouillon de culture filtré à environ 9,5 ou davanta- geo
On peut réaliser la séparation de l'érythromycine "B" d'avec l'érythromycine, en utilisant les différences de solubilité et les carac- téristiques adsorptives des deux composés. Par exemple, l'érythromicine "B" est plus fortement adsorbée par la cellulose que l'érythromycine. Ain- si, lorsqu'on fait adsorber un mélange d'érythromicine et d'érythrofuicine "B" en solution dans une colonne constituée par de la cellulose, et que l'on procède à l'élution de cette colonne avec un solvant approprié, l'é- rythromicine apparaît dans les liqueurs d'élution initiales, tandis que l'érythromycine "B" reste dans la colonne et n'est récupérée que par élu- tion prolongée.
Dans une variante, on peut séparer les deux composés avec récupération de l'érythromycine "B", par des procédés d'extraction sélective dans lesquels on utilise un appareil d'extraction à contre-cou- ranto
Les exemples donnés ci-après à titre non limitatif se rappor- tent aux procédés mis en oeuvre, conformément à l'invention, pour isoler l'érythromycine "B" et aux propriétés de cette dernière.
Exemple 1.
On forme une culture sporulée de "Streptomyces erythreus" (cou- che NRRL 2338) en faisant croître cet organisme sur une plaque d'agar-agar nutritif ayant la composition suivante
Dextrine 15 grammes
Tryptone 5 "
Agar-agar 20 " Bétaine 0,5 " +Mélange de sels minéraux 2 cm3
Eau pour porter le volume à 1 litre +Le mélange de sels minéraux est constitué par les ingrédients suivants :
K2HOP4 100,0 grammes
NaCl 100,0 "
MgSO4 100,0 "
FeSO4,7H2O 2,0 " ZnS04,7H20 1,0 "
CuSO4,5H2O 0,5 "
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MnCl2,4H2O 0,5 grammes
CoCl2,6H2O 0,1 "
CaCl2 40,0 "
Eau pour porter le volume à 1 litre
On fait incuber cette plaque pendant 10 jours à 33 Co On re- cueille les spores sous forme d'une suspension aqueuse en recouvrant la plaque d'une faible quantité d'eau distillée stérile et en grattant dou- cement les spores se trouvant à la surface de la plaqueo
On utilise environ 1 cm3 de la suspension de spores ainsi ob@ tenue pour inoculer dans des conditions stériles le milieu de culture sté- rilisé suivant s
EMI7.1
<tb> Produit <SEP> de <SEP> digestion <SEP> de <SEP> la <SEP> caséine
<tb> ("N-Z <SEP>
amine <SEP> A", <SEP> provenant <SEP> de <SEP> la
<tb> Sté <SEP> "Sheffield <SEP> Farms") <SEP> 0000000000000000000000000000 <SEP> 1 <SEP> gramme
<tb>
<tb> Mélasse <SEP> de <SEP> "Blackstrap"
<tb> (expression <SEP> en <SEP> usage <SEP> aux <SEP> Etats-Unis
<tb>
EMI7.2
d'Amérique) oooooaooooo0oooooaooooo00oooooaaooooo00 2 " K2HP04 00000000000000000000000000000000000000000000 0,15 11 Eau 00000000000000000000000000000000000000000000000 100 cm3
On fait incuber le milieu de culture inoculé, à environ 28 C, pendant environ 72 heures, jusqu'à l'obtention d'un bon développement vé- gétatifo On utilise environ 5 cm3 du milieu de culture contenant le pro- duit de la croissance végétative pour inoculer une fiole Erlenmeyer de 250 cm3 contenant environ 75 cm3 d'un milieu de culture de fermentation stérilisé ayant la composition suivante
Sucrose 45,
0 grammes
Farine de soja 20,0 "
Mélasses concentrées de résidus solubles de distillerie 2,0 "
Chlorure de sodium 5,0 "
Carbonate de calcium 2,0 "
Hexahydrate de chlorure cobalteux 0,001 "
Eau pour porter le volume à 1 litre.
On place la fiole, contenant le milieu de culture inoculé, dans une chambre d'incubation maintenue à une température d'environ 28 C et on secoue, pendant environ six jours, sur une machine à secouer rotative ayant une course de 5 cm, et fonctionnant à 240 tours par mi- nute. De temps en temps, on examine des échantillons du milieu de cul- ture pour déterminer la valeur totale d'activité antibiotique qu'ils contiennent. Lorsque la valeur de cette activité atteint environ 250 à 300 mcg par cm3 de bouillon, on filtre le bouillon contenu dans la fiole pour éliminer le mycéliumo
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On règle à 9,5 le pH d'environ 1,5 litre de bouillon de cultu- re filtré, en utilisant de l'hydroxyde de sodium, et on l'extrait avec 750 cm3 d'acétate d'amyle.
L'acétate d'amyle de l'extraction, contenant sen- siblement la totalité du produit antibiotique actif présent dans le bouil- lon initial, est concentré par évaporation sous vide jusqu'à un volume d'environ 10 cm3. On ajoute à la solution concentrée d'acétate d'amyle, 0,5 gr de fibre de cellulose purifiée, et on sèche le mélange sous vide, pendant la nuit.
On place la cellulose séchée finement pulvérisée, qui contient à l'état absorbé la totalité du produit antibiotique actif pro- venant du bouillon, à la surface supérieure d'une colonne dadsorption chromatographique mesurant environ 3,2 cm x 38 cm et contenant environ 161 gr de fibre de cellulose purifiée séchée (on trouve cette fibre dans le commerce, aux Etats-Unis, sous la désignation "Solka floc"). On procè- de au développement de la colonne en utilisant de l'hydroxyde d'ammonium aqueux à 0,1% saturé en méthyl-isobutyl-cétone. On recueille par fractions le produit d'élution, dont on évalue l'activité antibiotique en utilisant le "S.aureus" comme organisme d'épreuve.
La présence de l'érythromycine et/ou de l'érythromycine "B" est déterminée par analyse chromatographi- que sur papier filtre en utilisant le même système de solvant que celui qui a été décrit précédemment. On constate que les premiers 120 cm3 du produit d'élution ne contiennent que de l'érythromycine, tandis que les 120 cm3 de la seconde portion contiennent un mélange d'érythromycine et d'érythromycine "B". Les fractions actives ultérieures du produit d'élu- tion contiennent uniquement de l'érythromycine "B", et l'on réunit, puis l'on extrait ces fractions avec du chloroforme. On évapore l'extrait chloroformique à siccité, sous vide et on lave le résidu, constitué par l'érythromycine "B", avec une faible quantité d'hexane, puis on le dis- sout dans 25 cm3 d'éther.
On filtre la solution éthérée, et on évapore à siccité sous vide. On dissout le résidu dans une quantité minimum d'acétone chaude et on refroidit, ce qui permet d'obtenir les cristaux d'érythromycine "B". Comme pour l'érythromycine, le sel cristallisé contient une certaine quantité de solvant de cristallisation. Lorsqu'on soumet le sel cristallisé à des conditions permettant d'éliminer le sol- vant, celui-ci se dégage et le produit antibiotique père) ses propriétés cristallines.
Exemple 2.
On prépare un milieu de culture stérilisé contenant les ingré- dients suivants
Dextrose 15 grammes
Farine de soja 15 "
Matières solides provenant de grains de mais trempés 5,0 "
Chlorure de sodium 5,0 "
Carbonate de calcium 2,0 "
Eau pour porter le volume à 1 litre.
On inocule le milieu de culture avec une suspension de spores que l'on obtient en faisant croître le "Streptomyces erythreus" (souche NRRL 2338) sur une pl4que d'agar-agar nutritif, conformément au procédé de l'exemple 1, et en enlevant les spores à l'aide d'une faible quantité d'eau distillée stérile. On fait incuber le milieu de culture inoculé, contenu dans une fiole de litres, à environ 28 C pendant environ 36 heu- res, tout en secouant la fiole sur une machine à secouer à va-et-vient
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ayant une course de 5 cm et accomplissant 114 cycles complets par minute.
On recueille par centrifugation le mycélium végétatif qui en résulte; on le lave avec de l'eau et on le met à nouveau en suspension dans envi- ron un litre d'eau distillée stérile. On utilise l'inoculum ainsi prépa- ré pour inoculer une cuve de fermentation de 40 litres contenant environ 20 litres de bouillon de fermentation stérilisé ayant la composition sui- vante s
Glycine 150 grammes
Sucrose 1370 " dl- #-alanine 17,8 "
Phosphate monosodique 100 "
Chlorure de sodium 100 "
Sulfate de magnésium 10 "
Heptahydrate de sulfate ferreux 0,4 "
Heptahydrate de sulfate de zinc 0,2 "
Tétrahydrate de chlorure de magnésium 0,032 "
Hexahydrate de chlorure cobalteux 0,
2 "
Eau pour porter le volume à 20 litreso
On stérilise ensemble le mélange de sels minéraux, la glycine et la dl-# -alanine, et on règle le pH du bouillon à epviron 7,5 après stérilisation. D'autre part, on stérilise séparément le sucrose puis on l'incorpore dans des conditions aseptiques au bouillon stériliséo
On refroidit le bouillon stérilisé et on lui ajoute dans des conditions aseptiques l'inoculum végétatif préparé comme indiqué ci-des- sus. On fait croître l'organisme dans le bouillon pendant environ quatre jours à une température d'environ 28 Co Pendant ce temps de croissance, on agite le bouillon et on y insuffle de l'air stérilisé à un débit de 0,5 volume d'air par volume de bouillon et par minute.
Des essais micro- biologiques, avec utilisation du "S.Aureus" comme organisme d'épreuve, montrent que l'activité totale de l'antibiotique du bouillon est d'envi- ron 200 mcg par cm3, dont environ 50% reviennent à l'érythromycine "B" d'après la chromatographie sur papier et la bioautographieo On filtre le bouillon pour en éliminer le mycélium, et on peut recueillir l'érythro- mycine "B" à partir de ce bouillon clairo
On règle à 9,5 le pH de 1,5 litre de bouillon de culture filtré, contenant de l'érythromycyne et de l'érythromycine "B" et préparé confor- mément au procédé ci-dessus, en utilisant de l'hydroxyde de sodium aqueux,
et on extrait ensuite avec environ 750 cm3 d'acétate d'amyle. On évapore à siccité sous vide l'acétate d'amyle d'extractiono On dissout le résidu d'évaporation dans environ 250 cm3 de chloroforme; on filtre et on évapo- re à siccité sous vide. On prépare un système de solvant en mélangeant 20 parties de méthylisobutyl-cétone, 20 parties de phosphate à 0,1 M ser- vant de tampon ayant un pH de 6,5, et une partie d'acétone. Au repos, il se forme un système à deux couches, que l'on place dans un appareil de
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Craig d'extraction à contre-courant comportant 60 tubes, entièrement en verre et ayant un volume de 200 cm3. On dissout le résidu d'évaporation de l'extrait chloroformique dans 10 cm3 de la phase supérieure, et on ajou- te ce produit dans le tube initial de l'appareil d'extraction.
On effec- tue ensuite l'extraction à contre-courant de la manière habituelle. On analyse les différentes fractions par un procédé microbiologique, en uti- lisant le "S.aureus" comme organisme d'épreuve, et par chromatographie sur papier. On constate que les fractions 27 à 40 contiennent uniquement de l'érythromycine "B"o On réunit ces fractions et on les évapore sous vide à un volume de 130 cm3. On ajoute du chlorure de sodium jusqu'à ce que la solution en contienne 10%; on règle le pH à 9,8 en utilisant de l'hydro- xyde de sodium dilué, et on extrait avec deux portions de 75 cm3 de chlo- roformeo On sèche sur du sulfate de sodium anhydre les extraits chloro- formiques réunis, et on les évapore à siccité sous vide.
On dissout le résidu d'évaporation dans une quantité minimum d'acétone à 47 C, et on laisse refroidir lentement, ce qui permet d'obtenir de l'érythromycine "B" cristallisée.
L'érythromycine "B" ainsi préparée présente un point de fusion de 190 -191 C sur le bloc de Kôflero L'analyse élémentaire d'un échantil- lon séché à 60 C sous vide pendant trois heures sur du pentoxyde de phos- phore donne les valeurs suivantes :61,54% de carbone; 9,45% d'hydrogène, 2,0% d'azote, et 28,01% l'oxygène (par différence).
Une titration électrométrique dans une solution aqueuse à 66% de diméthylformamide indique la présence d'un groupe titrable de pK'# égal à 8,5.
Le poids moléculaire déterminé d'après les résultats de la titration correspond à environ 7360
Le spectre d'absorption de la lumière ultra-violette de l'éry- thromycine "B", dissoute dans du méthanol absolu, indique un maximum à 286 m et un minimum à 259m , E286 étant égal à 59.
L'essai microbiologique en utilisant le "Soaureus" comme orga- nisme d'épreuve, montre qu'un milligramme d'érythromycine "B" présente une activité antibiotique équivalent à environ 750 microgrammes d'érythro- mycine.
Le spectre d'absorption à la lumière infra-rouge d'une solu- tion à 6% d'érythromycine "B" dans le chloroforme (poids-volume) présente des maxima d'absorption nettement décelables entre 2,4 /, et 12 , répartis comme suite : 2,50; 3,34; 5,80; 6,84; 7,24; 7,50, 8,04 ; 8,54 ; 8,98; 9,14; 9,48; 9,86; 10,24; 10,56; 10,96 ; 11,22;
11,54 et Il,940 La courbe d'absorption de la lumière infra-rouge est représentée par la ligne en trait plein de la figure 1 du dessin annexéo
Lorsqu'on prépare simultanément sur des bandes de papier filtre les chromatogrammes d'échantillons d'érythromycine "B" et d'érythromycine, en utilisant de l'eau distillée ammoniacale saturée en méthyl-isobutyl- cétone comme solvant de développement, le rapport des vitesses auxquelles les deux antibiotiques se déplacent est le suivant
Rf érythromycine "B" - 0,75
Rf érythromycine
L'érythromycine "B" est beaucoup plus stable en solution acide que l'érythromycineo Lorsque des solutions aqueuses contenant respecti- venent 38 unités par cm3 d'érythromycine "B" et d'érythromycine,
que l'on a ajustées à différents niveaux de pH, sont maintenues au repos pendant une heure à environ 25 Co, l'érythromycine "B" montre une stabilité bien plus grande vis-à-vis de l'acide.
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Dans le procédé objet de l'invention, on obtient les sels d'ad- dition d'acides de l'érythromycine "B" en traitant la solution aqueuse de la base d'érythromycine "B" avec un équivalent d'un acide, et en évaporant cette solution à siccité sous vide. Dans une variante, on peut aussi traiter la solution dans un solvant organique de la base d'érythromycine "B" avec l'acide ou une solution de cet acide, et faire précipiter direc- tement de la solution le sel d'érythromycine. Lorsqu'on veut préparer des sels d'addition d'acides forts, on doit prendre soin, durant l'addi- tion de l'acide à l'antibiotique, d'éviter des concentrations locales éle- vées de l'acide, étant donné qu'une certaine partie de l'érythromycine "B" peut se décomposer,
si le pH descend en dessous de 2 pendant un laps de temps appréciable. Comme sels particulièrement caractéristiques, on cite : le chlorhydrate, le sulfate, le citrate, le mandélate, le succi- nate, l'oléate, le palmitate, le myristate, le stéarate, l'oxalate, le thiocyanate et le glucoheptonate de lérythromycine "B"o On peut préparer facilement d'autres sels similaires en utilisant les procédés décrits ci- dessus. Par exemple, on obtient le chlorhydrate de l'érythromycine "B", en traitant la solution dans l'éthanol de la base de l'antibiotique avec une quantité équivalente d'acide chlorhydrique aqueux, et en évaporant la solution à siccité sous vide pour obtenir le sel solideo On purifie ce sel en le recistallisant dans un mélange d'éthanol et d'acétone.
On note ici à titre indicatif, que l'érythromycine "B" et ses sels obtenus conformément au procédé de l'invention constituent des agents antibiotiques efficaces, possédant sensiblement le même large spectre antibactérien que l'érythromycine, compte tenu du poids moléculaire plus élevé des sels précités.
REVENDICATIONS.
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1. Procédé de production de l'érythromycine "B" caractérisé par le fait qu'on cultive une souche de "Streptomyces erythreus", donnant naissance à l'érythromycine "B". dans un milieu de culture contenant une source assimilable d'hydrate de carbone, d'azote, et de sels minéraux, dans des conditions d'aération et en immersion, jusqu'à ce que l'orga- nisme précité développe dans le milieu de culture ci-dessus une activité antibiotique substantielle; qu'on élimine le mycélium du milieu de cul- ture ; qu'on extrait l'activité antibiotique totale de ce milieu à l'aide d'un solvant polaire non miscible à l'eau; qu'on élimine le solvant ; etqu'on sépare l'érythromycine "B" de toute autre érythromycine présente.
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IMPROVEMENTS RELATING TO A PROCESS FOR PREPARING ERYTHRO-
MYCINE "B".
The present invention relates to an improved preparation process making it possible to obtain in particular erythronycin "B" and the addition salts which it forms with acids.
It is well known that erythromycin is an antibiotic substance characterized by a broad antibacterial spectrum, which can be obtained by culturing a microorganism called "Streptomyces erythreus" on artificial nutrient culture media. This microorganism, the appropriate culture media and the fermentation methods useful for obtaining erythro: nycin have already been described in detail in the patent application filed in the United States of America under No. 282,246. , in the names of Robert La Bunch and James M. Mc Guire.
The present invention therefore relates to a process for preparing erythromycin "B" which comprises culturing an erythromycin "B" producing strain of "Streptomyces erythreus" in a culture medium containing an assimilable source of 'a carbohydrate, nitrogen and mineral salts, under aeration conditions, in the submerged state, until a significant antibiotic activity produced by this organism is obtained in the culture medium above; removing mycelium from the culture medium; in extracting all of the active antibiotic products from this medium using a polar solvent immiscible with water; in removing this solvent;
finally, to separate the erythro.nycin "B" from all other erythromycin present.
The process according to the present invention makes it possible to obtain a chemical composition belonging to the group of products containing a
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nitrogenous base and its addition salts with acids, said base having the following properties: it exhibits a pK '# factor of approximately 8.5 when it is titrated in a solution of dimethylformamide and water in the proportion of 2: 1, a molecular weight of about 736 derived from the titration data, clear absorption maxima in the infrared absorption spectrum, measured in a chloroform solution of about 6.0% w / v, lying within the range of 2.4 to 12.0 identifying as follows: 2.80; 3.34; 5.80; 5.90; 6.84; 7.24; 7.50; 7.79; 8.04; 8.54; 8.98; 9.14; 9.48;
9.86; 10, 24, 10.56; 10.96: (11.221 11.54 and, 1 +, 940 Erythromydine (the letter "B" designating, during the present description. The product obtained thanks to the present implementation, -du,, proceeds in accordance with according to the invention and which differs from erythromycin already known) has certain analogies, as to its properties, with erythromycin, but it is characterized by certain very clear differences in chemical structure, which appear more easily when comparing the infrared absorption spectra of erythromycin and erythromycin "B". In the accompanying drawing, Figure 1 relates to the comparison of the infrared absorption spectra. -red of chloroform solutions of erythromycin (dotted line) and erythromycin "B" (solid line).
The transmission in% is plotted on the ordinate and the wavelength in microns on the abscissa. In addition, erythromycin "B" is distinguished by a more pronounced stability in strongly acidic solutions.
The process according to the invention makes it possible to obtain erythromycin "B" in a manner analogous to erythromycin and consists in cultivating the microorganism "Streptomyces erythreus" in culture media containing assimilable sources of hydrate. carbon, nitrogen, and mineral salts, to obtain a culture broth which contains the antibiotic agent erythromycin "B" along with erythromycin. This broth is filtered to remove the mycelium, and the mixture of antibiotic agents, ie erythromycin "B" and erythromycin, is separated from this culture broth by extraction with a non-polar solvent and immiscible with water.
Erythromycin "B" in the mixture is separated from erythromycins using methods which utilize differences in solubility, such as adsorption followed by selective elution, or countercurrent extraction. by a solvent in a multi-tubular extractor apparatus using immiscible solvents.
The actinomycete used for carrying out the process according to the invention belongs to the family of "Streptomyces" of the category of "Actinomycetales", in accordance with the classification contained in the work by Bergey "Manual of Determinative Bacteriology "(6th edi- tion), page 938.
The morphological characteristics of this organism appear to closely approximate those of an actinomycete described by Waksman as "actinomyces 181" (see "Soil Science" 8, pages 71-214, 1919) 9 and subsequently identified. , by the same author, as being "Streptomyces erythreus" o However, there are certain differences between the culture properties of the organism described by Waksman and those of a new product obtained by the process in accordance with the invention, this product being classified tentatively as a strain of "Streptomyces erythreus".
A culture of the above organism has been deposited in the collection of the Laboratory "Northern Regional Research Laboratory" (United States of America) and this culture strain has been assigned the number "NRRL 2338".
The process according to the present invention will now be described with particular reference to the aforementioned strain, but it is understood that the fermentation processes according to this invention relate not only to the use of "Streptomyces". ery-
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threus "(strain NRRL 2338), but also to other strains capable of giving rise to erythromycin" B ", these strains being obtained easily, and being isolated using the usual methods of isolation and modification strains, which consist in choosing cultivated organisms and exposing them to different means of modification such as X-rays, ultra-violet light and chemical agents,
such as, for example, nitrogenous stimulants. As other illustrative examples of strains capable of producing erythromycin "B", the "Streptomyces ery- threus" of strains NRRL 2359, 2360 and 23610 may be mentioned.
As has just been said, the “Streptomyces erythreus” of the NRRL 2338 strain can be cultivated in a culture medium to obtain effective antibiotic agents. The culture medium can be chosen from a number of media, given that according to the use tests already mentioned, the aforementioned organism is capable of making use of numerous energy sources.
However, for economical production, and for the process according to the invention to allow a maximum yield of antibiotic product, and also to easily isolate this product, preference should be given to specific culture media. for example, it is preferred to use as sources of carbohydrate in the culture medium, starch and glucose o Other possible sources are sucrose, dextrin, molasses, and the like o As preferred sources of nitrogen , include: soaked corn kernels, soybean flour or flour, and soluble distillery resins, although other sources are useful, such as, for example, casein, mixtures of amino acids, peptones (both from meat and soybeans), and the like.
It is also possible to use, as mineral sources of nitrogen, nitrates or ammonium salts.
The mineral nutrient salts to be incorporated into the medium include the usual salts capable of generating ions of sodium, potassium, calcium, phosphate, chloride, sulfate, and the like.
As for the growth and development of other microorganisms, it is necessary that the culture medium contains traces of essential elements favoring the growth of the actinomycete used for the implementation of the product in accordance with the invention These traces of elements are generally introduced as accidental impurities during the addition of the other constituents of the medium.
To obtain the maximum growth and development of "Streptomyces erythreus" (strain NRRL 2338), the culture medium must be adjusted before inoculation with this organism to a pH between 6.0 and 7.5, and located at preferably around 6.5. It has been observed that during the growth period of the organism and the production of antibiotics, the medium gradually becomes alkaline and that it can reach an alkalinity corresponding to a pH between 7.2 and 8, About 5 or more, the final pH depending at least in part on the initial pH of the medium, the buffer products present in that medium, and also the time allowed for the growth of the organism.
As in the production of other antibiotics in massive quantities, the aerobic immersion culture conditions constitute the conditions which one chooses to obtain significant quantities of erythromycin "B" o For the preparation of limited quantities of these substances , a shaker flask and the surface culture in flasks can be used. Further, as is well known, when cultivation is carried out in large vessels, it is preferable to use the vegetative form. of the organism for inoculation of the production vessels, in order to avoid a pronounced delay in the production of the antibiotic and the inefficient use of the instal-
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resulting relationship.
Accordingly, it is desirable to first produce a vegetative inoculum of the organism by inoculating a relatively small amount of the culture medium with spores of this organism and, when a young vegetative inoculum has been obtained and active to transfer it aseptically into large containers. The medium in which the vegetative inoculum is produced may be the same medium or a different medium from that which is used for the production of the antibiotic.
Good growth of "Streptomyces erythreus" (strain NRRL 2338) can be obtained at temperatures between about 25 ° C and about 37 C.
The most favorable antibiotic production appears to be in a culture medium maintained at about 26-30 Co
As is customary in the production of antibiotics using immersion culture methods, sterilized air is blown into the culture medium. To achieve effective organism growth and antibiotic production, the volume of air used in the container production of erythromycin and erythromycin "B" is preferably greater than 0.1 volume. of air per minute and per volume of culture medium.
Even more efficient growth and production is obtained when the volume of air used is at least 0.4 volumes of air per minute per volume of culture broth.
The rate of production of the antibiotic agents and the concentration of the antibiotic activity in the culture medium during the period of growth of the microorganism can easily be followed by test samples taken from the culture medium which are compared to the culture medium. antibiotic activity to that of organisms known to be sensitive to the antibiotic, for example "Staphylococcu aureus" and "Mycobaxterium tuberculosis" o For such determinations a test should be used which consists of: preparing tests serial dilution of the culture samples;
adding portions of the samples diluted to liquefied nutrient agar; to solidify this agar-agar in a Petri boot; inoculating the plate with a young culture of "S. aureus" or "M. tuberculosis", and determining the greatest dilution of the culture medium which causes complete inhibition of the growth of the organism on nutrient agar.
The production of the antibiotic agents can also be followed by means of turbidimetric assay methods such as those commonly used in the production of other antibiotics.
The presence of erythronycin "B" and erythromycin can be determined by chromatographic methods. A suitable method is: dissolving about 0.2 to 0.5 mg of the product to be tested in a small amount of solvent such as alcohol; placing the concentrated solution as a dab at one end of a strip of filter paper; to dry, finally, to develop in accordance with the descending chroma-graphic technique usually used on filter paper strips.
Among the solvents which can be used to develop the paper web, there is mentioned a solution of ammonium hydroxide of concentration 1:99 (volume / volume); distilled water saturated with -nethyl-isobutyl-ketone; distilled water saturated with methyl isobutyl ketone to which 2% (v / v) piperidine has been added; borate used as a 0.1M buffer for a pH of 9.9, saturated with methyl isobutyl ketone; 0.15M sodium hydroxide saturated with methyl isobutyl ketone; 0.1M potassium acid phosphate, as a buffer solution containing 3% by volume of ethanol, and similar solutions.
We continue to develop
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swelter for about 4 to 5 hours, or until the solvent level approaches the end of the strip. After development, the location of the antibiotic product on the paper web is determined by means of bioautography. In carrying out the method, the developed paper web is placed on the surface of a nutrient culture medium. Agar, having a thickness of about 3.17 mm on a large glass plate, medium which was prepared by inoculating warm sterile nutrient agar with "Bacillus subtilis".
The antibiotic diffuses and passes from the paper into the agaragaro After 10 minutes, the paper strip is removed, the plate is inverted, and the position of the strip of glass is marked directly on the outside of the glass plate. filter paper, the level of the solvent and the point of application of the test solution. The agar medium is incubated overnight at about 37 ° C. in an inverted position., The production of clear areas, c That is, areas where there is no evidence of bacterial growth, indicates in the above medium the location of the antibiotic agent as it occurs on the filter paper.
By measuring the distance traveled respectively by the antibiotic and the solvent, the value "Rf", or the ratio between the speed of movement of the antibiotic and that of the solvent, is determined. It has been found that erythromycin "B" moved less quickly than erythromycin during this test. When it is a mixture of erythromycin "B" and erythromycin, two clear areas appear in the bioautography, but when an area of non-growth occurs, comparing the position of this zone with the position of a zone, obtained with pure erythromycin "B" or with erythromycin, can make it possible to establish which of the antibiotic agents is presento Under optimum conditions, the Rf value of erythromycin "B" is about three quarters of the Rf value of erythromycino
In the attached drawing,
FIG. 2 represents the image of a bioautography obtained from a chromatogram on paper on which erythromycin (a), erythromycin “B” (b) and erythromycin (a), erythromycin “B” (b) and a mixture of erythromycin and erythromycin "B" (c), in approximately equal amounts o The solvent used for the development consists of a 1% aqueous solution of concentrated ammonium hydroxide, saturated with methyl -isobutyl-ketone.
The surfaces shown in black correspond to areas where no bacterial growth is evident.
In general, the maximum total antibiotic activity after inoculation of the culture medium occurs over a period of about two to five days when using an aerobic immersion culture, and between 5 to 10 days. when using the culture on the surface or in a shaker flask
Approximately equal amounts of erythromycin and erythromycin "B" are usually obtained in the culture medium, but this proportion may vary depending on the duration of the incubation. In general, a shorter incubation period, for example. 1 or 2 days,
promotes the production of a higher proportion of erythromycin "B" o Prolongation of incubation results in a decrease in the proportion of erythromycin "B", compared to that of erythromycin, and may even result in an effective decrease in the total amount of erythromycin "B" present in the culture broth.
Until now, we do not know the reason for this lowering of the proportion o of this decrease in absolute value o
In the process according to the invention, the antibiotic agents obtained by culturing "So erythreus" (strain NRRL 2338) can be recovered from the culture medium, using extraction or adsorption processes. extraction in industrial production because it takes less time and is less expensive.
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For the extraction of the antibiotic compounds from the culture medium it is preferred to use organic polar solvents immiscible with water, which include: alkyl esters of fatty acids, for example ethyl acetate and amyl acetate; chlorinated hydrocarbons, for example chloroform and dichlorethylene; alcohols sparingly soluble in water, for example butanol and amyl alkocl; sparingly soluble ketones in water, for example methyl amyl ketone, and other solvents, for example ethyl ether and dibutyl ether. Other solvents of a similar character can also be used.
Preferably, the pH of the filtered culture broth is adjusted prior to extraction to about 9.5 or higher.
The separation of erythromycin "B" from erythromycin can be achieved by utilizing the differences in solubility and the adsorptive characteristics of the two compounds. For example, erythromycin "B" is more strongly adsorbed to cellulose than erythromycin. Thus, when a mixture of erythromicin and erythrofuicin “B” in solution in a column consisting of cellulose is adsorbed, and this column is eluted with an appropriate solvent, Erythromycin appears in the initial elution liquors, while erythromycin "B" remains in the column and is only recovered by prolonged elution.
Alternatively, the two compounds can be separated with recovery of erythromycin "B", by selective extraction methods in which a counter-current extraction apparatus is used.
The examples given below without limitation relate to the processes used, in accordance with the invention, to isolate erythromycin “B” and to the properties of the latter.
Example 1.
A spore-forming culture of "Streptomyces erythreus" (layer NRRL 2338) is formed by growing this organism on a nutrient agar plate having the following composition
Dextrin 15 grams
Tryptone 5 "
Agar-agar 20 "Betaine 0,5" + Mixture of mineral salts 2 cm3
Water to bring the volume to 1 liter + The mixture of mineral salts is made up of the following ingredients:
K2HOP4 100.0 grams
NaCl 100.0 "
MgSO4 100.0 "
FeSO4.7H2O 2.0 "ZnS04.7H2O 1.0"
CuSO4.5H2O 0.5 "
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MnCl2.4H2O 0.5 grams
CoCl2.6H2O 0.1 "
CaCl2 40.0 "
Water to bring the volume to 1 liter
This plate is incubated for 10 days at 33 Co. The spores are collected as an aqueous suspension by covering the plate with a small amount of sterile distilled water and gently scraping off the spores from the bottom. plate surface
About 1 cm3 of the spore suspension thus obtained is used to inoculate under sterile conditions the sterilized culture medium according to
EMI7.1
<tb> Product <SEP> of <SEP> digestion <SEP> of <SEP> the <SEP> casein
<tb> ("N-Z <SEP>
amine <SEP> A ", <SEP> from <SEP> from <SEP> the
<tb> Company <SEP> "Sheffield <SEP> Farms") <SEP> 0000000000000000000000000000 <SEP> 1 <SEP> gram
<tb>
<tb> Molasses <SEP> from <SEP> "Blackstrap"
<tb> (expression <SEP> in <SEP> usage <SEP> in <SEP> United States
<tb>
EMI7.2
America) oooooaooooo0oooooaooooo00oooooaaooooo00 2 "K2HP04 00000000000000000000000000000000000000000000 0.15 11 Water 000000000000000000000000000000000000000000000000000 100 cm3
The inoculated culture medium is incubated at about 28 ° C for about 72 hours until good vegetative development is obtained. About 5 cm3 of the culture medium containing the growth product is used. vegetative to inoculate a 250 cm3 Erlenmeyer flask containing approximately 75 cm3 of a sterilized fermentation culture medium having the following composition
Sucrose 45,
0 grams
Soy flour 20.0 "
Molasses concentrate from soluble distillery residues 2,0 "
5.0 "sodium chloride
Calcium carbonate 2.0 "
Cobaltous Chloride Hexahydrate 0.001 "
Water to bring the volume to 1 liter.
The flask, containing the inoculated culture medium, is placed in an incubation chamber maintained at a temperature of about 28 ° C and shaken, for about six days, on a rotary shaker having a stroke of 5 cm, and operating at 240 revolutions per minute. From time to time, samples of the culture medium are examined to determine the total value of antibiotic activity they contain. When the value of this activity reaches about 250 to 300 mcg per cm3 of broth, the broth contained in the flask is filtered to remove the mycelium.
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The pH of about 1.5 liters of filtered culture broth is adjusted to 9.5, using sodium hydroxide, and extracted with 750 cc of amyl acetate.
The amyl acetate from the extraction, containing substantially all of the active antibiotic product present in the initial broth, is concentrated by evaporation in vacuo to a volume of about 10 cm3. 0.5 g of purified cellulose fiber is added to the concentrated solution of amyl acetate, and the mixture is dried under vacuum overnight.
The finely pulverized dried cellulose, which contains all of the active antibiotic from the broth absorbed, is placed on the top surface of a chromatographic adsorption column measuring about 3.2 cm x 38 cm and containing about 161. gr of dried purified cellulose fiber (this fiber is found commercially in the United States under the name "Solka floc"). Column development was carried out using 0.1% aqueous ammonium hydroxide saturated with methyl isobutyl ketone. The elution product is collected in fractions, the antibiotic activity of which is evaluated using "S. aureus" as a test organism.
The presence of erythromycin and / or erythromycin "B" is determined by chromatographic analysis on filter paper using the same solvent system as that previously described. It is found that the first 120 cm3 of the elution product contains only erythromycin, while the 120 cm3 of the second portion contains a mixture of erythromycin and erythromycin "B". Subsequent active fractions of elution contain erythromycin "B" only, and these fractions are pooled and extracted with chloroform. The chloroform extract is evaporated to dryness in vacuo and the residue, consisting of erythromycin "B", is washed with a small amount of hexane, then it is dissolved in 25 cm 3 of ether.
The ethereal solution is filtered, and evaporated to dryness in vacuo. The residue was dissolved in a minimum amount of hot acetone and cooled, yielding erythromycin "B" crystals. As with erythromycin, the crystallized salt contains a certain amount of crystallization solvent. When the crystallized salt is subjected to conditions whereby the solvent is removed, the solvent is released and the parent antibiotic product has its crystalline properties.
Example 2.
A sterilized culture medium is prepared containing the following ingredients
Dextrose 15 grams
Soy flour 15 "
Solids from soaked corn kernels 5.0 "
5.0 "sodium chloride
Calcium carbonate 2.0 "
Water to bring the volume to 1 liter.
The culture medium is inoculated with a spore suspension obtained by growing "Streptomyces erythreus" (strain NRRL 2338) on a plate of nutrient agar, in accordance with the method of Example 1, and in removing spores using a small amount of sterile distilled water. The inoculated culture medium, contained in a liter flask, is incubated at about 28 ° C for about 36 hours, while shaking the flask on a reciprocating shaker machine.
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having a stroke of 5 cm and completing 114 complete cycles per minute.
The resulting vegetative mycelium is collected by centrifugation; it is washed with water and resuspended in about one liter of sterile distilled water. The inoculum thus prepared is used to inoculate a 40 liter fermentation tank containing about 20 liters of sterilized fermentation broth having the following composition:
Wisteria 150 grams
Sucrose 1370 "dl- # -alanine 17.8"
Monosodium Phosphate 100 "
Sodium Chloride 100 "
Magnesium sulfate 10 "
Ferrous sulphate heptahydrate 0.4 "
Zinc sulphate heptahydrate 0.2 "
Magnesium chloride tetrahydrate 0,032 "
Cobaltous chloride hexahydrate 0,
2 "
Water to bring the volume to 20 liters
The mixture of inorganic salts, glycine and dl- # -alanine are sterilized together, and the pH of the broth is adjusted to epv about 7.5 after sterilization. On the other hand, the sucrose is separately sterilized and then incorporated under aseptic conditions into the sterilized broth.
The sterilized broth is cooled and the vegetative inoculum prepared as described above is added thereto under aseptic conditions. The organism is grown in the broth for about four days at a temperature of about 28 Co. During this growth time, the broth is stirred and sterilized air is blown into it at a flow rate of 0.5 volume of air per volume of broth and per minute.
Microbiological tests, using "S.Aureus" as the test organism, show that the total activity of the antibiotic in the broth is about 200 mcg per cm3, of which about 50% amounts to l. Erythromycin "B" from paper chromatography and bioautography The broth is filtered to remove mycelium, and erythromycin "B" can be collected from this clearo broth.
The pH of 1.5 liters of filtered culture broth, containing erythromycin and erythromycin "B" and prepared according to the above procedure, is adjusted to 9.5, using sodium hydroxide. aqueous sodium,
and then extracted with about 750 cm3 of amyl acetate. The extraction amyl acetate is evaporated to dryness in vacuo. The evaporation residue is dissolved in approximately 250 cm3 of chloroform; filtered and evaporated to dryness in vacuo. A solvent system is prepared by mixing 20 parts of methyl isobutyl ketone, 20 parts of 0.1 M phosphate buffer having a pH of 6.5, and one part of acetone. At rest, a two-layer system is formed, which is placed in a
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Craig counter-current extraction comprising 60 tubes, entirely in glass and having a volume of 200 cm3. The evaporation residue of the chloroform extract is dissolved in 10 cc of the upper phase, and this product is added to the initial tube of the extractor.
The extraction is then carried out against the current in the usual manner. The different fractions are analyzed by a microbiological method, using "S. aureus" as a test organism, and by paper chromatography. It is found that fractions 27 to 40 contain only erythromycin "B" o These fractions are combined and evaporated in vacuo to a volume of 130 cm 3. Sodium chloride is added until the solution contains 10%; the pH was adjusted to 9.8 using dilute sodium hydroxide, and extracted with two 75 cm3 portions of chloroform. The combined chloroform extracts were dried over anhydrous sodium sulfate, and the combined chloroform extracts were dried over anhydrous sodium sulfate. evaporates them to dryness under vacuum.
The evaporation residue is dissolved in a minimum amount of acetone at 47 ° C., and the mixture is allowed to cool slowly, which gives crystallized erythromycin "B".
The erythromycin "B" thus prepared exhibits a melting point of 190 -191 C on the Köflero block Elemental analysis of a sample dried at 60 C under vacuum for three hours over phosphorus pentoxide gives the following values: 61.54% carbon; 9.45% hydrogen, 2.0% nitrogen, and 28.01% oxygen (by difference).
Electrometric titration in a 66% aqueous solution of dimethylformamide indicates the presence of a titratable group of pK '# equal to 8.5.
The molecular weight determined from the results of the titration corresponds to approximately 7360
The ultraviolet light absorption spectrum of erythromycin "B", dissolved in absolute methanol, indicates a maximum at 286 m and a minimum at 259 m, E286 being equal to 59.
Microbiological testing using "Soaureus" as a test organism shows that one milligram of erythromycin "B" exhibits antibiotic activity equivalent to about 750 micrograms of erythromycin.
The infrared light absorption spectrum of a 6% solution of erythromycin "B" in chloroform (weight for volume) shows clearly detectable absorption maxima between 2.4% and 12%. , distributed as follows: 2.50; 3.34; 5.80; 6.84; 7.24; 7.50, 8.04; 8.54; 8.98; 9.14; 9.48; 9.86; 10.24; 10.56; 10.96; 11.22;
11,54 and II, 940 The infra-red light absorption curve is represented by the solid line in FIG. 1 of the appended drawing.
When the chromatograms of erythromycin "B" and erythromycin samples are simultaneously prepared on strips of filter paper, using distilled ammoniacal water saturated with methyl isobutyl ketone as the developing solvent, the ratio of The speed at which the two antibiotics move is as follows
Rf erythromycin "B" - 0.75
Rf erythromycin
Erythromycin "B" is much more stable in acidic solution than erythromycin When aqueous solutions containing 38 units per cm3 of erythromycin "B" and erythromycin respectively,
which have been adjusted to different pH levels, are kept standing for one hour at about 25 Co, erythromycin "B" shows much greater stability to acid.
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In the process which is the subject of the invention, the acid addition salts of erythromycin “B” are obtained by treating the aqueous solution of the erythromycin “B” base with an equivalent of an acid, and evaporating this solution to dryness in vacuo. Alternatively, the organic solvent solution of erythromycin "B" base can also be treated with the acid or a solution thereof, and the erythromycin salt precipitated directly from the solution. When preparing addition salts of strong acids, care must be taken during the addition of the acid to the antibiotic to avoid high local concentrations of the acid, being since some part of erythromycin "B" can be broken down,
if the pH drops below 2 for an appreciable period of time. As particularly characteristic salts, there are mentioned: hydrochloride, sulfate, citrate, mandelate, succinate, oleate, palmitate, myristate, stearate, oxalate, thiocyanate and glucoheptonate of erythromycin " B "o Other similar salts can easily be prepared using the methods described above. For example, erythromycin "B" hydrochloride is obtained by treating the ethanol solution of the antibiotic base with an equivalent amount of aqueous hydrochloric acid, and evaporating the solution to dryness in vacuo to to obtain the solid salt. This salt is purified by recistallizing it in a mixture of ethanol and acetone.
It is noted here by way of indication that erythromycin "B" and its salts obtained in accordance with the process of the invention constitute effective antibiotic agents, having substantially the same broad antibacterial spectrum as erythromycin, taking into account the higher molecular weight. of the aforementioned salts.
CLAIMS.
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1. Process for the production of erythromycin “B” characterized in that a strain of “Streptomyces erythreus” is cultivated, giving rise to erythromycin “B”. in a culture medium containing an assimilable source of carbohydrate, nitrogen, and inorganic salts, under conditions of aeration and in immersion, until the aforementioned organism develops in the medium of culture above substantial antibiotic activity; that the mycelium is removed from the culture medium; that the total antibiotic activity is extracted from this medium using a polar solvent immiscible with water; that the solvent is removed; andseparating erythromycin "B" from any other erythromycin present.