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PERFECTIONNEMENTS A LA PRODUCTION DE SUBSTANCES ANTIBIOTIQUES.
La présente invention est relative à un procédé de préparation des substances antibiotiques et plus particulièrement d'une substance antibiotique nouvelle et efficace produite par culture dans des conditions artificielles d'un microorganisme identifié plus complètement plus loin, de l'espèce des Streptomyces, c'est-à-dire d'un des organismes classés sous le nom d'actimo- mycetes.
On peut également décrire cet organisme comme une souche de Strepto- myces du type des Streptomyces fradiae, cette dernière ayant été isolée du sol en 1915 par Waksman (un des inventeurs) et Curtis, puis désignée sous le nom d'Actinomyces Fradii, mais plus récemment enregistrée dans le manuel de Bergey sous le nom de Streptomyces fradia La souche d'organismes de cette nature ou du moins une souche qui ressemble de très près à celle dénommée ci- dessus et qu'on emploie suivant l'invention est déposée à l'Université Rut- ger, Département microbiologique, Département des cultures types, collection des cultures types, et est également citée dans le collection Américaine de cultures type sous le n officiel 35350 On peut donc ainsi l'identifier de façon pratique et précise sous le nom de Streptomyces n 3535.
'Parmi-les antibiotiques utilisés largement actuellement la strep- tomycine réussit particulièrement comme agent chimiothérapeutique pour un grand nombre de buts, en raison de son activité aussi bien contre les bactéries .négatives au Gram que contre les bactéries positives au Gram, y compris-les myco-bactéries, et on l'a utilisée avec efficacité pour le traitement et le contrôle de certaines formes de tuberculose humaine.Il existe cependant cer- taines souches bactériennes qui sont plus ou moins résistantes à la 'streptomy- cine, la manifestation la plus importante de cette résistance étant son dé- veloppement dans certains cas après administration prolongée de la drogue.
Il en résulte qu'une ou plusieurs souches résistantes peuvent se développer ou , croître parmi les organismes infectieux dans un tel cas, lequel correspond en général à une situation pour laquelle la série initiale de traitements n'a été que partiellement efficace. On comprend par conséquent qu'un antibiotique particulièrement utile serait celui possédant les propriétés essentielles sui-
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vantes : a) haute activité contre les bactéries négatives au Gram et les my- cro-bactéries, b) activité vis-à-vis des souches de bactéries résistantes à la streptomycine, particulièrement des bactéries acido-résistantes, c) basse toxicité vis-à-vis des animaux.
On a découvert, suivant la présente invention que l'on peut uti- liser l'organisme identifié précédemment (Streptomyces n 3535) pour produire une substance antibactérienne nettement nouvelle et exceptionnellement utile, qui présente une composition organique et diffère aux points de vue à la fois chimique et antibiotique des autres susbtances de sa classe générale, telles que la streptomycine, la streptothricine, la griséine, et l'actinomycine.
La nouvelle composition antibiotique nommée néomycine et identi- fiée de façon convenable dans le présent texte se distingue de façon caracté ristique en ce qu'elle possède dans une mesure assez large les propriétés dé- sirables énumérées ci-dessus, et qui indiquent son extraordinaire utilité.
On donnera plus bas une liste plus complète des propriétés antibactériennes mais on peut noter dès maintenant que cette substance a non seulement montré de l'activité contre un certain nombre de souches de bactéries résistantes à la streptomycine (y compris les myco-bactéries), mais est également moins fa- vorable au développement des cultures résistantes dans des circonstances où celles-ci, en présence d'un autre antibiotique tel que la streptomycine se- rait probable. C'est-à-dire parmi un certain nombre de type d'organismes qui comprennent des souches résistant respectivement aux autres antibiotiques, on n'a noté aucune différence notable de leur sensibilité à la néomycine.
Ce nouvel antibiotique, la néomycine, est produit en laissant se développer l'organisme dit streptomyces n 3535 dans un milieu nutritif con- venable à l'état immobile ou aérobie submergé (c'est-à-dire agité) approprié, et en isolant et purifiant ensuite la substance, par exemple par un procédé du genre décrit plus loin comprenant divers stades d'adsorption, de récupéra- tion par élution, de séparation des impuretés et de précipitation. On consta- te que la néomycine ainsi préparée est un composé basique (c'est-à-dire solu- ble dans les solutions acides), très actif en réaction alcaline.
C'est-à-dire que son activité antimicrobienne tend à être limitée en condition acide mais semble s'élever quand on atteint la neutralité, et est définitivement favori- sée dans un milieu alcalin, caractéristique avantageuse si l'on songe à la réaction généralement alcaline du sang. La substance isolée, c'est-à-dire la néomycine, est facilement soluble dans l'eau, dans les solutions acides diluées (par exemple HCl dilué), dans le méthanol aqueux et dans des mélanges acide- alcool à basse normalité acide, tels que les solutions éthanol-acide chlorhy- drique ou méthanol-acide formique utilisées jusqu'ici pour l'élution de la streptomycine à partir des adsorbants. Elle est relativement insoluble dans divers solvants organiques tel: quel-'éther, le chloroforme et l'acétone.
On a trouvé que la néomycine est thermostable, particulièrement en milieu neutre ou légèrement acide ou alcalin, et peut être ainsi chauffée à 100 G pendant plusieurs minutes sans destruction de son activité. Elle est également remarquablement stable en solution quand on la stocke pendant de longues périodes de temps, telles qu'un moins ou plus. On a maintenant ces solutions à la fois à la température ambiante et en les réfrigérant pendant au moins 3 mois sans diminution d'activité. Une telle stabilité permet une distinction précise des substances telles que la pénicilline et l'auréomyci- ne dont les solutions s'altèrent au bout d'un certain nombre de jours, l'auré- omycine étant connue pour son aptitude à s'altérer sérieusement (même en étant réfrigérée) en peu de jours.
A l'état sec, c'est-à-dire cristallisée ou fine- ment divisée d'une autre façon, on peut maintenir la néomycine inaltérée pen- dant de très longues périodes, pratiquement indéfiniment. Elle n'est pas inac- tivée dans le sang ou en présence de sérum ou d'autres matières organiques.
Bien qu'on n'ait pas encore déterminé la structure chimique préci- se de la néomycine, sa nouvelle composition semble pleinement démontrée par sa série unique de propriétés comprenant celles citées ci-dessus et dans la suite du présent mémoire et particulièrement son spectre antibiotique. On es- time que ces propriétés sont très significatives, bien que la substance n'ait
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pas encore été produite à l'état complètement pur, et n'ait pas encore été ain- si susceptible d'une analyse détaillée. Il apparaît cependant que la néomyci- ne ne donne pas la réaction au maltol comme la streptomycine, qu'elle ne donne pas non plus la réaction de Sakaguchi pour les guanidines mono-substituées, ce qui indique ainsi l'absence d'un groupement guanidine, qui est une caracté- ristique distinctive des diverses formes de streptomycine.
Comme on l'a indiqué, le spectre antibiotique de la néomycine est une caractéristique spécifique et intrinsèquement unique, au point de vue de l'identification par rapport aux autres substances antibiotiques. En effet, on reconnaît généralement qu'un tel spectre par exemple d'activité ou d'inac- tivité bactériostatique ou analogue vis-à-vis d'un certain nombre de diffé- rents organismes, constitue un moyen particulièrement efficace pour caracté- riser et identifier les matières de cette classe.
On veut dire par là que chaque substance antibiotique a un spectre nettement déterminable et défini qui la distingue de façon unique des autres matières antibiotiques, sans au- cune nécessité de comparaison numérique parmi ces substances, en ce qui con- cerne leur activité absolue vis-à-vis de l'un ou l'autre d'un grand nombre d'organismes particuliers contre lesquels on peut les employer. Ainsi, le spectre d'un antibiotique donné consiste en fait en points d'activité (ou d'inactivité) relativement forte ou faible, présentée respectivement vis-à-vis de différents organismes particuliers, et mesurée seulement l'une par rapport à l'autre.
Un tel spectre peut être schématisé ou mis en tableau, et la confi- guration ou forme de la combinaison résultante de sommets et de creux, four- nit une identification positive de la substance, par suite de sa nature aussi bien chimique qu'antibiotique.
Un spectre typique de la néomycine pour autant que le revèlent les tests, pratiqués actuellement est représenté en détail plus loin, mais on peut en noter ici certaines caractéristiques. D'une façon générale, en ce qui con- cerne les déterminations effectuées jusqu'ici, la néomycine a un spectre indi- quant une activité à l'égard des mêmes bactéries importantes (y compris les myco-bactéries), que celles à l'égard desquelles la streptomycine est effica- ce et une inactivité vis-à-vis des moisissures, également de la même façon que la streptomycine est relativement inefficace vis-à-vis de tels organis- mes.
En conséquence, on distingue par son spectre antibiotique la néomycine des autres matières (telles que la streptothricine, l'actinomycine, la griséi- ne, la pénicilline, la clavacine) par la plupart des mêmes caractéristiques générales qui distinguent la streptomycine de ces matières. Le spectre de la néomycine comprend également des "points" d'activité, relatifs à un certain nombre d'organismes insensibles à la streptomycine. Ces régions du spectre qui permettent une distinction correspondante par rapport à cette dernière matière sont représentées par les souches résistant à la streptomycine de E.coli et de M. tuberculosis, et par l'organisme dit de Bodenheimer.
L'organisme employé pour produire la néomycine a été isolé du sol ; comme indiqué ci-dessus, c'est un actinomycetes, qui est au moins très voisin du Streptomyces Fradiae, et est désigné sous le nom de Streptomyces n 3535. Il donne une culture jaunâtre à brunâtre sur milieux synthétiques et organiques, mais pas de pigments solubles. Il appartient par conséquent au groupe non chromogénique. Il produit facilement un mycelium aérien parti- culièrement sur un milieu synthétique, le mycelium étant pigmenté de¯blanc jusqu'à rose pâle, rose coquillage ou rose. On peut définir la couleur du mycelium comme roux-vineux clair, selon la nomenclature de Ridgway pour l'i- dentification des couleurs. Des observations indiquent également que les hyphes sporulants sont généralement droits et ne forment de spirales que sur certains milieux.
Comme on l'a indiqué précédemment, on produit la nouvelle sub- stance antibiotique par culture de l'organisme en question dans des conditions très artificielles, par exemple en inoculant un milieu convenable avec des spores de l'organisme ou par culture submergée. A la lumière du travail ex- périmental effectué sur ce procédé, il apparaît que des variations considéra- bles sont possibles dans la composition de ce milieu, de préférence en ce qui concerne la présence de constituants organiques et minéraux convenables, à la
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fois pour favoriser la croissance de l'organisme et stimuler la production de l'antibiotique.
Il apparaît ainsi que les meilleurs résultats sont ob- tenus quand la culture croit dans un milieu contenant une source convenable d'azote, un hydrate de carbone et des éléments minéraux, tels que ceux cons- titués par le chlorure de sodium et d'autres matières décrites plus loin.
Une énumération plus précise des types de constituants que l'on peut avanta- geusement incorporer au milieu de culture comprend :
I. Une peptone ou digeste de protéine, les peptones ordinaires ou les digestes de protéine, tels que les digestes de caséine, semblent satis- faisants, mais on a obtenu des résultats supérieurs avec des matières telles que la peptone du soja. On peut avantaguesment inclure un constituant de ce type par exemple dans la proportion de 10 à 20 grammes par litre de milieu.
Ce constituant semble avoir une importance toute particulière pour la produc- tion de l'antibiotique.
II. Extrait de viande ou type similaire, de matière, tel que l'ex- trait de levure en quantité, par exemple de 3 à 5 grammes par litre. Bien qu'on croît que cet ingrédient ait relativement peu d'importance et qu'on puis- se en effet s'en passer dans certains cas, il semble qu'il contribue notable- ment au résultat désiré. On peut définir ce constituant comme une matière nu- tritive du type extractive.
III. Un hydrate de carbone, de préférence représenté par du gluco- se ou un sucre similaire, tel que le maltose. On peut utiliser le glucose ou les corps analogues en quantité par exemple de 5 à 10 grammes par litre, et ces corps semblent être d'une aide primordiale pour une bonne croissance de l'organisme, bien qu'au sens direct ou strict, leur présence ne constitue pas une condition essentielle et critique pour la production de la néomycine.
IV. Certains éléments minéraux, spécialement quand on constate que ceux-ci sont absents de l'eau utilisée pour préparer le milieu ou les cultures.
Un élément qui semble particulièrement important est le zinc sous forme d'un sel de zinc tel que le sulfate de zinc, en quantité relativement faible, par exemple 10 mg par litre environ. Il apparaît également que le chlorure de so- dium est un constituant extrêmement désirable dans la proportion d'environ 5 grammes par litre.
V. De l'eau généralement sous forme d'eau du robinet ordinaire.
Bien que l'on puisse utiliser de l'eau distillée, par exemple en y ajoutant un sel de zinc, comme indiqué précédemment, l'eau du robinet, qui contient naturellement une trace de zinc combiné convient tout-à-fait et évite toute nécessité d'addition de constituants minéraux autres qu'un sel, tel que le chlo- rure de sodium.
Quand on utilise un milieu de l'espèce décrite ci-avant et conte- nant les cinq (5) ingrédients cités, on ajuste le pH de préférence à environ 7 ou 7,2 à l'aide de NaOH. Bien qu'il soit possible de commencer avec un mi- lieu acide par exemple ayant un pH de 6, l'expérience indique que la produc- tion de l'antibiotique est alors sensiblement retardée et pratiquement il peut en résulter une augmentation de l'acidité, ce qui entraîne une lyse de l'or- ganisme. En fait, il apparaît que le glucose ou les corps analogues tendent à produire ou à favoriser une augmentation de l'acidité et à retarder par con- séquent la production de néomycine. On a surmonté cet effet du glucose en employant la peptone en quantité relativement importante, c'est-à-dire voisi- ne de la limite supérieure de l'ordre des proportions indiquées précédemment.
On peut également réaliser une diminution des effets défavorables du glucose sur la production de l'antibiotique, au moins en partie, en diminuant la quantité de glucose (de préférence en augmentant la proportion de peptone, comme on vient de l'expliquer) ou en rajoutant spécialement un agent neutra- lisant, tel que le carbonate de calcium. P our ce dernier but, le carbonate de calcium a l'avantage supplémentaire d'être neutralisant de lui-même. Bien que l'on puisse utiliser d'autres substances, telles que le carbonate de so- dium, il devient alors nécessaire d'opérer quotidiennement ou à d'autres in- tervalles réguliers des additions de cet agent, dans le but de maintenir des conditions favorisant la production de l'antibiotique.
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En utilisant des milieux du type précédemment décrit ou d'un type équivalent, on peut produire la néomycine en culture soit immobile soit agitée.
Dans le cas des cultures immobiles, on obtient un rendement satisfaisant en antibiotique à condition que l'incubation ait lieu à la température ambiante, par exemple de l'ordre de 22 à 28 G pendant une période de 7 à 12 jours. Pour les cultures immobiles le milieu doit être très peu profond ; alors les spores de l'organisme tendent à couler, c'est-à-dire à devenir submergées et ainsi à être inefficaces pour la production de l'antibiotique. Il semble que cet organisme soit caractérisé par un poids ou une densité supérieure à celle des organismes tels que le Streptomyces Griseus, avec lesquels on rencontre moins de difficultés lors de l'incubation de cultures immobiles.
On peut ob- tenir des résultats préférables en épaississant quelque peu le milieu, par exemple, en y incorporant 1/4 à 1/2 % de gélose pour produire une consistance semi-solide ou semi-liquide. Avec une telle modification du milieu, l'organis- me semble avoir un support convenable, de telle sorte que la culture croît en surface sous Iorme d'une pellicule en recevant la quantité d'air nécessaire pour l'élaboration de la substance antibiotique.
On a obtenu une incubation beaucoup plus rapide avec un rendement satisfaisant en néomycine avec des cultures agitées, c'est-à-dire dans des mi- lieux de culture relativement profonds, que l'on soumet à une agitation con- venable pour obtenir une aération efficace. Ainsi, on a trouvé qu'il suffit de 3 à 5 jours à une température d'environ 25 C pour une production utile, la gamme de températures préférées étant de 22 à 28 C Il semble que pour des résultats optimum, le degré d'agitationou plus exactement le degré d'aération doit être contrôlé avec soin.
L'expérience indique qu'avec le mode d'agita- tion rigoureux employé ordinairement pour la,production de streptomycine dans des cultures de S. griseus, les cultures de Streptomyces n 3535 peuvent ne donner qu'un rendement en néomycine qui est loin d'être élevé. On obtient alors facilement une amélioration du rendement, en fait jusqu'à une valeur optimum, en réduisant la vitesse d'agitation ou bien en incorporant une peti- te quantité de gélose (1/4 à 1 %), pour réduire la diffusion de l'air. La gélose épaissit le milieu, mais de préférence pas au delà d'un état semi-li- quide. Il est naturellement extrêmement important qu'une quantité considéra- ble d'air traverse le milieu par exemple pendant l'opération d'agitation.
Bien qu'il soit impossible de définir quantitativement la quantité d'air ou d'aération nécessaire, le contrôle de la quantité désirable dans la pratique actuelle est très facile (ne nécessitant au plus que quelques essais simples), compte tenu de l'exposé précédent des facteurs nécessaires. Bien que les du- rées d'incubation établies précédemment soient celles trouvées optimum jus- qu'ici dans la mise en pratique expérimentale de l'invention, on comprend qu'on puisse ou doive utiliser d'autres durées dans des cas spéciaux. Par exemple l'expérience de la production des antibiotiques indique généralement que l'on peut réduire notablement la période d'incubation en utilisant un inoculum relativement grand.
Bien que l'on puisse adopter différents procédés pour séparer la matière antibiotique du bouillon de culture et pour la purifier ultérieurement, on peut donner une idée préliminaire de certaines opérations trouvées parti- - culièrement convenables. D'une façon générale le procédé comporte les stades- d'adsorption et d'élution, comprenant des stades de purification supplémentai- res et s'étendant, si on le désire, à la séparation chromatographique. A ti- tre d'exemple général du procédé, le milieu de culture, après la période d'incubation désirée, peut être filtré, et le filtrat traité avec une adsor- bant convenable, tel que le charbon de bois activé ou un autre charbon activé qui adsorbe la néomycine.
Après la séparation de l'adsorbat, c'est-à-dire du charbon, on peut traiter le milieu de culture avec de l'éthanol rendu acide à 2% avec HC1 pour soumettre l'antibiotique à une élution ou par un autre mé- lange acide-alcool, tel qu'un mélange méthanol-acide formique dans le même but.
Les stades ultérieurs de purification peuvent comprendre une autre adsorption et élution de l'antibiotique suivies finalement d'une précipitation par un li- quide organique, tel que l'acétone et par un lavage et un séchage final du précipité à une température modérée appropriée.
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On peut également réaliser la première adsorption de la néomycine avec un adsorbant du type zéolite c'est-à-dire un échangeur de cations. Dans ce cas, (de même que quand on utilise le charbon pour adsorber la néomycine), on peut envisager un traitement préliminaire du milieu de culture après fil- tration, en l'acidifiant fortement et en introduisant du charbon activé pour adsorber les impuretés, étant entendu que la néomycine n'est pas adsorbée dans des conditions fortement acides. Lorsqu'on emploie des adsorbants du type zéolite (ou de façon analogue quand l'adsorbant du type charbon est employé après la purification préliminaire), le pH du filtrat résultant de la séparation de l'adsorbant et des impuretés doit d'abord être amené sensible- ment à la neutralité.
L'antibiotique est alors adsorbé par traitement avec l'adsorbant en question et celui-ci, c'est-à-dire un adsorbat contenant la néo- mycine, est filtré et soumis à une élution pour la séparation de l'antibioti- que. Dans le cas d'un adsorbant du type zéolite on peut réaliser une telle élution avec une solution de chlorure d'ammonium. Le liquide résultant dans lequel est dissous l'antibiotique peut ensuite être soumis à des opérations d'adsorption et d'élution successives ou terminant avec un procédé approprié pour la précipitation, la séparation physique et le séchage de la matière active désirée,c'est-à-dire la néomycine.
Cn a trouvé que la néomycine, 'par exemple produite par des pro- cédés de cette nature, possède un spectre antibiotique remarquablement éten- du, présentant une activité extrêmement utile contre les bactéries à la fois négatives et positives au Gram et présentant une activité importante contre les myco-bactéries des types à la fois sensibles et résistants à la streptomy- cine. De plus, dans les tests qui ont montré des résultats contraires avec la streptomycine il se produit un développement moindre de la résistance à la néomycine parmi les organismes éprouvés, de tels résultats tendant à indiquer le nombre limité de souches de ces organismes qui peuvent être spécifiquement résistants à la néomycine, ce qui les distingue de la streptomycine par exem- ple.
Le tableau suivant représente un spectre antibiotique de la. néomy- cine comparé à ceux de la streptomycine et de la streptothricine. Les déter- minations pour la néomycine étant faites par le procédé "à la bande de gélose" (c'est-à-dire un procédé de dilution d'une plaque de gélose) avec la matière antibiotique isolée, préparée selon le procédé de l'exemple particulier expo- sé plus bas. Les valeurs spécifiques de l'activité dans ce tableau doivent naturellement être comprises en tenant compte du fait que les déterminations peuvent être améliorées ou affectées d'une autre manière par une purification supplémentaire de l'antibiotique, et en particulier que les différentes sou- ches des différents organismes éprouvés peuvent entraîner certaines différen- ces dans la force d'activité.
On croît cependant que la nature ou configura- tion de l'ensemble du spectre n'est pas spécifiquement affectée par de telles variations; pour identifier l'antibiotique par la forme de son spectre, il est entendu de même que l'on ne doit pas attacher une signification particu- liére à une comparaison des activites absolues de la néomycine d'une part et de la streptomycine ou de la streptothricine d'autre part, c'est-à-dire à un organisme donné contre lequel la néomycine et l'un des autres ou les deux sont sensiblement actifs. La principale importance du spectre est de mettre en évidence pour chaque substance la relation d'ensemble entre les activités et inactivités diverses.
On peut noter cependant que, selon la présente ex- périence, la néomycine est une substance à haute activité ou potentiel, ce qui permet une économie sur la quantité nécessaire et facilite son adminis- tratiJn, quand on l'utilise pour le traitement de diverses affections.
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TABLEAU 1 Spectre antibiotique de la néomycine brute comparé à ceux de la streptomycine brute et de la streptothricine brute.
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(exprimé <SEP> en <SEP> unités <SEP> de <SEP> dilution <SEP> par <SEP> gramme <SEP> de <SEP> préparation <SEP> brute <SEP> nécessaire <SEP> pour
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<tb> arrêter <SEP> la <SEP> croissance <SEP> des <SEP> organismes <SEP> éprouvés).
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Organisme <SEP> Néomycine <SEP> Streptomycine <SEP> Streptothricine
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<tb> X <SEP> 1000 <SEP> X <SEP> 1000 <SEP> X <SEP> 1000'
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<tb> 1. <SEP> Bacillus <SEP> subtilis- <SEP> 150-750 <SEP> 125 <SEP> 125
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<tb> 2. <SEP> Bacillus <SEP> mycoides <SEP> 20-150 <SEP> 20 <SEP> 0,8
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<tb> 3. <SEP> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 20-60 <SEP> 30 <SEP> < <SEP> 0,8 <SEP>
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<tb> 4. <SEP> Sta[hydrocus <SEP> aureus <SEP> 100-250 <SEP> 15 <SEP> 50
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<tb> 5. <SEP> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 37,5
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<tb> 6. <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> SS <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25'
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<tb> 7. <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> RS <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> Active
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<tb> 8.
<SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 2,5 <SEP> 1 <SEP> <0,8
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<tb> 9. <SEP> Proteus <SEP> vulaaris <SEP> 25 <SEP> 10 <SEP> 12,5
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<tb> 10. <SEP> organisme <SEP> de-Bodenheimer <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> Active
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<tb> 11. <SEP> Serratia <SEP> marcescens <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 1,2
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<tb> 12. <SEP> Mvcobactérium
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<tb> tuberculosis <SEP> hominis
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<tb> 607 <SEP> (SS) <SEP> 80-250 <SEP> Active <SEP> Active
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<tb> 13. <SEP> Mycobacterium
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<tb> tuberculosis <SEP> hominis
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<tb> 607 <SEP> (RS) <SEP> 50-150 <SEP> Inactive <SEP> Active
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<tb> 14. <SEP> Mvcobacterium <SEP> avium <SEP> 50-150 <SEP> Active <SEP> Active
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EMI7.2
15.
Mycobacterium'ràna.e 150 Active Active
EMI7.3
<tb> 16. <SEP> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 300 <SEP> 100 <SEP> 12,5
<tb> 17. <SEP> Trichophyton
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metalyro-phytes <..0,3' 0,3 Active
EMI7.5
<tb> 18. <SEP> Cryptococcus <SEP> albicans <SEP> < <SEP> 0,3 <SEP> <0,3 <SEP> Active
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<tb> 19: <SEP> Penicillium <SEP> notatum <SEP> < <SEP> 0,3 <SEP> 0,3 <SEP> Active
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Dans le tableau ci-dessus et en d'autres endroits de la présente description, le symbole SS désigne une souche sensible à la streptomycine et le symbole RS désigne une souche résistante à la streptomycine.
Il est enten- du que la référence a des unités de dilution (qui sont les nombres portés dans le tableau multipliés par mille dans chaque cas) exprime le nombre de fois qu'une unité d'activité de l'antibiotique donné peut être diluée et empêche encore la croissance de l'organisme éprouvé. Une unité d'activité est la quantité de matière qu: empêche la croissance d'un organisme standard choi- si dans des conditions standard dans un cm3 de milieu. Ainsi dans le tableau, les valeurs élevées représentent une forte activité, tandis que les valeurs les plus basses représentent une inactivité relative. Pour plus de commodité et de brièveté, on peut identifier les différents organismes du tableau par les nombres qui leur sont arbitrairement assignés dans la colonne de gauche.
Comme on le voit, la néomycine est très active contre tous les organismes numérotés de 1 à 16-inclusivement dans le tableau, c'est-à-dire contre les n 1 à 6 inclusivement, 8,9, 11, 12 et 14 à 16 inclusivement, contre lesquels la streptomycine est également efficace et contre les orga- nismes 2,3, 8 et 11 pour lesquels la streptolycine présente une activité
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relativement faible ou nulle. D'autre part, tandis que la streptothricine est active contre divers champignons, par exemple les organismes 17,18 et 19 du tableau, la néomycine est relativement inactive.
On peut noter en passant que, tandis que les valeurs numériques du tableau représentent des déterminations faites sur une base garantissant une comparaison numérique, certaines activi- tés, par exemple celles de la streptomycine et de la streptothricine, ont été déterminées par des tests de différents degrés de la substance ou dans d'au- tres conditions et pour ces autres tests on a simplement donné les résultats par des caractéristiques telles que "active" ou "inactive". On estime que les caractéristiques d'activité et d'inactivité ainsi reportées sont largement suffisantes pour les comparaisons et l'aspect spectral auquel le tableau est destiné.
Une caractéristique particulière importante du spectre de la néo- mycine, qui la distingue de la streptomycine, est son activité par rapport aux organismes 7,10 et 13, c'est-à-dire le fait qu'elle présente le même ca- ractère d'activité à l'égard de ces organismes qu'à l'égard de beaucoup d'au- tres organismes du tableau par opposition avec l'inactivité relative de la néo- mycine à l'égard des organismes 17, 18 et 19. L'organisme de Bodenheimer, n 10 du tableau, a été utilisé pour l'essai des substances antibiotiques pour déterminer spécifiquement la streptothricine en présence de streptomycine, celle-ci présentant une activité relativement nulle vis-à-vis de cet organis- me.
La sensibilité des organismes 7 et 13 vis-à-vis de la néomycine est d'une utilité toute spéciale, c'est-à-dire constitue pour la néomycine la pôssibili- té de contrôler ces souches de bactéries résistantes à la streptomycine. Com- me on sait Que les organismes 12 et 13 sont parmi ceux responsables de la tu berculose chez les êtres humains, on voit clairement que la néomycine a un champ d'efficacité contre des souches résistantes que n'atteint pas la strep- tomycine.
L'antagonisme de la néomycine vis-à-vis des souches d'organisme contre lesquels la streptomycine est inefficace a été démontré dans d'autres tests en plus de ceux portés dans le tableau 1. Ainsi, par exemple, quand on raye des plaques contenant différentes concentrations de néomycine, avec des souches sensibles à la streptomycine, résistantes à la streptomycine, et dépendant de la.streptomycine, de E. Coli, les deux premières sont trouvées aussi sensibles à la néomycine tandis que la troisième né présente aucun dé- veloppement.
En recommençant le même test avec la streptomycine seule, la première souche d'organisme présente une sensibilité à l'effet antibiotique, le second organisme étant sensiblement non affecté et le troisième subissant la croissance pour laquelle elon la précédente découverte) la présence de streptomycine'est nécessaire. Ces tests expriment clairement les différences de nature biologique et chimique entre le néomycine et la streptomycine.
Si on met à incuber pendant des périodes de temps relativement lon- gues des cultures sur bouillon ou sur gélose' de diverses bactéries contenant suffisamment de néomycine pour arrêter la croissance, il ne se produit pas de développement supplémentaire des bactéries. Ainsi, on a encore démontré la stabilité de l'antibiotique par contraste avec d'autres substances, telles que l'auréomycine.
Pour mettre en évidence de façon supplémentaire 1¯'action de la néo- mycine sur les myco-bactéries, on fait des déterminations de la sensibilité de diverses souches de ces organismes sensibles à la streptomycine et résistants à la streptomycine, en utilisant les procédés turbidimétriques dans le milieu Dubos Tween. Le tableau suivant résume les résultats de ces tests avec un cer- tain nombre d'organismes ou de souches d'organismes de ce type, comprenant la culture pathogène humaine de M. tuberculosis H37 Rv.
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TABLEAU8 II.
Effet de la néomycine sur la croissance des différentes souches de M, tubercu- losis en milieu de Dubos,
EMI9.1
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<tb> Incubation <SEP> à <SEP> 37 C <SEP> pendant <SEP> 14 <SEP> jours.
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Organisme <SEP> essayé <SEP> .Arrêt <SEP> de <SEP> la <SEP> croissance <SEP> en <SEP> unité/cm3
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<tb> M. <SEP> tuberculosis <SEP> H37 <SEP> RvR <SEP> (RS) <SEP> 0,2
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<tb> M <SEP> tuberculosis <SEP> H37 <SEP> Rv <SEP> (SS) <SEP> 0,5-1,0
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<tb> M <SEP> tuberculosis <SEP> H37 <SEP> RVR <SEP> (RS) <SEP> 1,0
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<SEP> tuberculosis <SEP> 607R <SEP> (RS) <SEP> 0,25
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On a trouvé que la néomycine est active contre tous les types ci- tés d'organismes, et comme on le voit, sur ce tableau, dans chaque cas les souches résistantes à la streptomycine et sensibles à la streptomycine sont également sensibles à la néomycine.
Le fait que la néomycine ne semble pas favoriser le développement rapide des cultures résistantes, c'est-à-dire des souches d'organismes parti- culièrement résistantes à la néomycine est indiqué par des tests sûrs. Dans une telle série de tests, on met en suspension dans l'eau une culture de E. coli dans la gélose vieille de vingt heures et on l'étale dans une gélose nu- tritive contenant des quantités arjées de néomycine.
Après neuf jours d'in- cubation à 28 C seulement une colonie d'une levure, mais aucune de bactéries, développe 22 milliards de cellules sur une plaque contenant 25 unités par cm3 de néomycine et également seulement deux colonies de levure et aucune de bac- téries sur une plaque portant 5 unités par cm3 de néomycine, aucune colonie n'étant remarquée sur une troisième plaque portant 10 unités au cm3. Ainsi, il est évident qu'il ne s'est développé aucune culture résistante dans aucun cas. On a trouvé par la suite cependant que quelques colonies se développent en présence de 2à 4 unités de néomycine, mais beaucoup moins (c'est-à-dire 1/10 à 1/100) qu'en présence de concentrations analogues de streptomycine.
Quand on prélève des fragments de gélose de ces plaques et qu'on les inocule dans des plaques de gélose stérilisées, seulement certains des fragments provenant des plaques de gélose stérilisées ayant contenu 5 unités au cm3 de néomycine présentent une croissance. Les fragments provenant des plaques ayant contenu 10 unités au cm3 et 25 unités au cm3 de néomycine ne donnent aucune croissance. Ces tests, ainsi que d'autres, indiquent que le néomyci- ne est un puissant bactéricide aussi bien qu'un bactériostatique.
Une autre propriété extrêmement importante de la néomycine est qu'elle semble être relativement non toxique ou avoir une toxicité extrême- ment faible. Des tests sur des animaux et d'autres essais analogues in vivo (par exemple sur des embryons d'oeuf) ont non seulement confirmé la relative- ment forte activité de la néomycine contre diverses bactéries, mais encore indiqué que la toxicité de l'antibiotique, s'il en a une, envers les animaux est extrêmement limitée.
L'activité in vivo contre les bactéries a été montrée à l'égard à la fois des organismes positifs et négatifs au Gram et à l'égard à la fois des organismes sensibles à la streptomycine et des organismes résis- tants à la streptomycine, des souches sensibles à la streptomycine étant à titre d'exemple le Staphylococcus aureus, le Klebsiellapneumoniae et le Shi- gella pullorum et des souches résistantes à la streptomycine étant à titre d'exemples le Salmonella schottmulleri et la Staphylococcus aureus. Les tests révèlent une capacité efficace de la néomycine pour contrôler chacun
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de ces organismes.
En ce qui concerne la toxicité, les tests sur des animaux, par exemple des souris, indiquent qu'il ne se produit aucun effet toxique ou nuisible même quand le traitement est augmenté de 20 à 80 fois la dose effica- ce. D'après ce qui précède, on comprend que le milieu de culture utilisé pour la production de l'antibiotique peut varier considérablement selon les condi- tions, les substances nutritives disponibles et des causes analogues. A ti- tre simplement d'exemple pratique on donne ci-dessous deux exemples de milieu trouvés satisfaisants pour la culture du -ages n 3535 et par suite pour la production de néomycine.
Milieu de culture - Exemple 1 ----------------- - ---------
20 grammes de peptone de soja
5 grammes d'extrait de viande
5 à 10 grammes de glucose
5 grammes de chlorure de sodium
1 litre d'eau du robinet (comme décrit plus haut).
Milieu de culture - Exemple 2.
----------------- -
10 grammes de peptone de soja
5 grammes d'extrait de viande
10 grammes de glucose
10 grammes de carbonate de calcium (en poudre fine)
5 grammes de chlorure de sodium
1 litre d'eau du robinet (comme décrit plus haut)
Comme on l'a expliqué précédemment, le milieu de l'exemple 2, qui a une teneur relativement basse en peptone et une teneur relativement élevée en glucose, contient également une certaine quantité de carbonate de calcium pour éviter des effets possibles et indésirables de l'acidité accrue pendant l'incubation. Chacun des milieux ci-dessus permet d'obtenir des résultats très satisfaisants, par exemple un milieu agité avec un contrôle convenable de l'aération, de la manière qui a également été expliquée.
Dans chaque cas on ajuste le pH approximativement à 7 avant l'inoculation par des spores ou la culture submergée de l'organisme S n 3535.
A titre d'exemple supplémentaire et plus particulier d'une série d'opérations permettant de séparer et de purifier partiellement la néomycine, on donne le procédé suivant : Après filtration préliminaire pour éliminer les solides en suspension, le milieu de culture ou bouillon est acidifié avec de l'acide chlorhydrique concentré pour réduire son pH à une valeur comprise en- tre 2,0 et 2,5. On ajoute du charbon de bois activé, plus spécialement l'es- pèce désignée sous la marque Darco G-60, à raison de 5 grammes par litre, et on agite le mélange pendant environ 30 minutes.
Puis on agite dans*le mélan- ge une substance pour aider la filtration, par exemple une matière telle qu'une terre à diatomées, plus spécialement une substance aidant à la filtration con- nue sous le nom de Hyflo Super-Cel, en quantité de 5 grammes par litre, puis on filtre le mélange à travers un tampon de la même substance, à savoir Hyflo Super-Cel, en quantité analogue. Comme on n'a pas trouvé que la néomycine soit adsorbée en milieu à réaction fortement acide, le résultat de ce traite- ment au charbon de bois et de la filtration subséquente, est une élimination préliminaire de certaines impuretés, étant bien entendu qu'un procédé plus rapide peut dans certains cas éviter ce traitement préliminaire.
Le filtrat de ce traitement constitue ainsi un filtrat préliminai- re purifié de bouillon de culture et contient le néomycine désirée. On ajus- te alors le pH de cette solution à 7, 1 0,2 avec une solution à 40% d'hy- droxyde de sodium. On introduit alors une matière adsorbante plus précisément du type zéolite (silico luminate de sodium), une substance convenable étant le produit connu sous le nom de Decalso. La quantité de cet adsorbant peut varier, des résultats efficaces ayant été obtenus quand on l'introduit dans une proportion de 1 gramme pour 7.000 unités d'activité de néomycine dans la solution. On agite alors le mélange pendant environ 30 minutes et on sépare
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par filtration l'adsorbat, c'est-à-dire l'adsorbant contenant la néomycine.
On le lave à l'eau et on le laisse sécher à l'air jusqu'au lendemain.
On place alors l'adsorbat de Decalso séché dans une colonne ayant un diamètre intérieur de 30 mm et muni d'un bouchon en laine de verre. On fait passer à travers l'adsorbat (c'est-à-dire la substance zéolite contenant la néomycine adsorbée), une solution aqueuse à 10 % de chlorure d'ammonium. et on recueille des fractions successives pour les essayer. Ainsi la-'néomycine est effectivement séparée par élutionde l'adsorbant. On peut réaliser les es- sais des diverses fractions, soit par la méthode des bandes en utilisant le E Coli soit par le procédé de la tasse de gélose, en utilisant alors de fa- gon appropriée, 1eB subtilis. On' combine les fractions ayant les plus hau- tes puissances pour former une seule masse de solution et on ajuste le pH du mélange à 7,0.
On ajoute une quantité supplémentaire de charbon de bois ac- tivé, par exemple du Darco G-60, à raison de 10 grammes par 100 cm3 et on agi- te le mélange pendant 30 minutes. On sépare par filtration l'adsorbat, c'est- à-dire le charbon de bois contenant la néomycine, on le lave avec de l'eau et on le sèche à l'air. On sépare l'antibiotique de cet adsorbat pai élution en agitant l'adsorbat pendant trente minutes avec du méthanol contenant 50 % d'a- cide chlorhydrique 0,05 N, en utilisant 5 cm3 du mélange acide-alcool dilué par gramme de charbon de bois. On sépare par filtration le charbon de bois soumis à l'élution et on le soumet à une seconde élution de la même manière.
On combine es éluats, le pH de la combinaison étant alors ajusté à 6,0-7,0 par de l'hydroxyde de sodium aqueux. On concentre alors cette solution con- tenant la néomycine dans le vide à un volume d'environ 3 cm3.
On recueille le petit résidu de liquide précédent contenant l'an- tibiotique en ajoutant du méthanol, le mélange résultant étant alors centri- fugé pour séparer la matière insoluble,- c'est-à-dire les autres impuretés.
On concentre encore à environ 5 cm3 dans le vide la solution, c'est-à-dire la solution d'éthanol surnageant de la centrifugation. On lave encore se second concentrat dans un tube à centrifugation avec du méthanol en quantité telle que le volume total de solution ainsi produite soit de 10 à 15 cm3. On sépa- re encore le résidu insoluble par centrifugation. On traite alors la solu- tion contenant la néomycine, c'est-à-dire le liquide surnageant à la fin de la dernière opération de centrifugation avec 8 à 10 volumes d'acétone pour précipiter la néomycine.
On laisse alors la suspension résultante reposer pendant quelques heures à 5 C puis on la centrifuge encore une fois., La ma- tière solide séparée constituant cette fois la néomycine est finalement lavée avec de l'acétone et séchée dans le vide pour fournir un produit sec assez fi- nement divisé, constituant une masse isolée et séparée bien qu'encore brute, de la nouvelle substance antibiotique, à savoir, la néomycine. Comme on l'a indiqué précédemment d'autres stades de purification peuvent suivre, conduisant à un produit à haute pureté correspondant à la qualité de certains autres an- tibiotiques actuellement disponibles sur le marché. Cependant, on a trouvé que le produit résultant du procédé décrit précédemment possède les propriétés nouvelles et désirables exposées ici, d'ordres antibiotique et autres.
L'examen du nouveau produit préparé.par le procédé décrit précé- demment tend à indiquer que c'est en fait un-complexe comprenant plusieurs composés ou formes presque identiques de néomycine, qui semblent ne se dis- tinguer que par de très petits détails. Ainsi'on a effectué des tests analy- tiques d'un type dans lequel les substances composantes sont séparées selon leurs solubilités respectives relatives dans' deux milieux (par exemple un sol- vant organique et l'eau). Par exemple par des tests consistant à observer la distribution du chlorhydrate du produit (le complexe de néomycine) après des transferts successifs de fractions des milieux en utilisant un procédé tel que celui décrit par Craie et al. dans J. Biol. Chem. Vol. 168, p. 665, 1947 (et également en partie décrit par Craig dans J.'Biol. Chem., Vol. 155, p.
519, 1944) et avec un système au tampon de borate à un pH de 7,3 ''comme il est décrit par E.A. Swart dans J. of the Amer. Chem. Society, août 1949). On a trouvé trois fractions (I, II et III) ayant différents coefficients de dis- tribution dans l'opération de séparation en question, et représentant respec- tivement 55, 20 et 11 % de l'activité antibiotique totale dans le produit ini- tial ainsi essayé.
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Toutes les propriétés du produit ou complexe complet qui viennent d'être décrites semblent également caractériser chaque fraction. Contre une souche isolée quelque peu résistante à la néomycine d'un organisme identifié comme étant le mycobactérium 607 (RN), la fraction III montre une activité su- périeure à celle des deux autres, mais les spectres antibiotiques des trois fractions et du complexe semblent qualitativement être les mêmes au point que le complexe et ses fractions semblent tous identifiables comme des formes ou des aspects particuliers de la néomycine considérée comme un nouveau composé fondamental.
Comme le complexe, les fractions ont une stabilité exceptionnel- le dans diverses conditions et diverses températures, sont de nature basique, forment des sels tels que chlorhydrates et picrates, et sont susceptibles d'une bonne adsorption sur les échangeurs cationiques.
Il est bien entendu qu'on peut utiliser d'autres procédés de pro- duction de la néomycine et pour son isolement et sa purification, par exemple en fonction des différentes circonstances indiquées précédemment, ainsi qu'en fonction de la nature de la substance et de ses caractéristiques de solubilité et de son comportement vis-à-vis des réactifs utilisés dans des procédés de ce type général. Il est par conséquent bien entendu que l'invention n'est-pas limitée aux stades et aux compositions particulières décrits ici, mais peut être réalisée de toute autre façon.
R E V E N D I C A T IONS.
1. - Procédé de préparation d'une substance antibiotique dite néo- mycine, caractérisé en ce qu'il consiste à laisser se développer une culture d'un microorganisme produisant la néomycine dans un milieu de culture artifi- ciel favorable à cette croissance et à la production de la dite substance an- tibiotique, puis à séparer du milieu de culture la néomycine obtenue.
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IMPROVEMENTS IN THE PRODUCTION OF ANTIBIOTIC SUBSTANCES.
The present invention relates to a process for the preparation of antibiotic substances and more particularly of a new and effective antibiotic substance produced by culturing under artificial conditions of a microorganism identified more fully below, of the species of Streptomyces, that is, that is, one of the organisms classified under the name actimomycetes.
This organism can also be described as a strain of Streptomyces of the type Streptomyces fradiae, the latter having been isolated from the soil in 1915 by Waksman (one of the inventors) and Curtis, then referred to as Actinomyces Fradii, but more recently recorded in the Bergey manual under the name of Streptomyces fradia The strain of organisms of this nature or at least a strain which closely resembles that named above and which is employed according to the invention is deposited at the 'Rutger University, Department of Microbiology, Department of Type Cultures, Collection of Type Cultures, and is also cited in the American Collection of Type Cultures under Official No. 35350 It can therefore be identified in a practical and precise manner under the name of Streptomyces n 3535.
Among the antibiotics in widely used today, streptomycin is particularly successful as a chemotherapeutic agent for a number of purposes, due to its activity against both Gram-negative and Gram-positive bacteria, including them. myco-bacteria, and has been used effectively for the treatment and control of certain forms of human tuberculosis. There are, however, some bacterial strains which are more or less resistant to streptomycin, the most common manifestation. an important part of this resistance being its development in certain cases after prolonged administration of the drug.
As a result, one or more resistant strains can develop or grow among infectious organisms in such a case, which generally corresponds to a situation for which the initial series of treatments were only partially effective. It is therefore understood that a particularly useful antibiotic would be one possessing the following essential properties.
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vants: a) high activity against Gram-negative bacteria and mycrobacteria, b) activity against strains of bacteria resistant to streptomycin, particularly acid-fast bacteria, c) low toxicity against streptomycin. towards animals.
It has been found in accordance with the present invention that the previously identified organism (Streptomyces No. 3535) can be used to produce a markedly new and exceptionally useful antibacterial substance, which exhibits an organic composition and differs in terms of appearance. chemical and antibiotic of other substances in its general class, such as streptomycin, streptothricin, grisein, and actinomycin.
The novel antibiotic composition called neomycin and suitably identified herein is characteristically distinguished in that it possesses to a fairly large extent the desirable properties enumerated above, and which indicate its extraordinary utility. .
A more complete list of antibacterial properties will be given below, but it can now be noted that this substance has not only shown activity against a number of strains of bacteria resistant to streptomycin (including myco-bacteria), but is also less favorable to the development of resistant cultures in circumstances where these, in the presence of another antibiotic such as streptomycin would be likely. That is, among a number of types of organisms which include strains resistant to other antibiotics, respectively, no notable difference in their sensitivity to neomycin was noted.
This new antibiotic, neomycin, is produced by allowing the organism known as streptomyces n 3535 to develop in a suitable nutrient medium in an appropriate immobile or aerobic submerged (ie agitated) state, and by isolating and then purifying the substance, for example by a method of the kind described later comprising various stages of adsorption, recovery by elution, separation of impurities and precipitation. It is found that the neomycin thus prepared is a basic compound (that is to say soluble in acid solutions), very active in an alkaline reaction.
That is, its antimicrobial activity tends to be limited under acidic conditions but seems to increase when neutral is achieved, and is definitely favored in an alkaline medium, a characteristic advantageous when considering the reaction. usually alkaline in the blood. The isolated substance, i.e. neomycin, is readily soluble in water, in dilute acidic solutions (e.g. dilute HCl), in aqueous methanol and in acid-alcohol mixtures with low acid normality, such as the ethanol-hydrochloric acid or methanol-formic acid solutions heretofore used for the elution of streptomycin from the adsorbents. It is relatively insoluble in various organic solvents such as: which ether, chloroform and acetone.
It has been found that neomycin is thermostable, particularly in neutral or slightly acidic or alkaline medium, and can thus be heated at 100 G for several minutes without destroying its activity. It is also remarkably stable in solution when stored for long periods of time, such as a minus or plus. These solutions are now available both at room temperature and by refrigeration for at least 3 months with no decrease in activity. Such stability allows precise distinction between substances such as penicillin and aureomycin, the solutions of which deteriorate after a number of days, auremycin being known for its ability to deteriorate seriously. (even when refrigerated) in a few days.
In the dry state, that is, crystallized or finely divided in some other way, neomycin can be maintained unaltered for very long periods of time, virtually indefinitely. It is not inactivated in the blood or in the presence of serum or other organic material.
Although the precise chemical structure of neomycin has not yet been determined, its new composition seems to be fully demonstrated by its unique series of properties including those cited above and in the remainder of this memorandum and particularly its antibiotic spectrum. . These properties are considered to be very significant, although the substance does not have
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has not yet been produced in a completely pure state, and thus has not yet been subject to detailed analysis. However, it appears that neomycine does not give the reaction to maltol like streptomycin, nor does it give the Sakaguchi reaction for mono-substituted guanidines, which thus indicates the absence of a guanidine group. , which is a distinguishing feature of the various forms of streptomycin.
As indicated, the antibiotic spectrum of neomycin is a specific and inherently unique characteristic, from the standpoint of identification from other antibiotic substances. In fact, it is generally recognized that such a spectrum, for example of bacteriostatic activity or inactivity or the like towards a certain number of different organisms, constitutes a particularly effective means of characterizing and identify the subjects of this class.
By this is meant that each antibiotic substance has a clearly determinable and defined spectrum which uniquely distinguishes it from other antibiotic materials, without any need for numerical comparison among these substances, as regards their absolute activity against. to one or the other of a large number of particular organisms against which they can be employed. Thus, the spectrum of a given antibiotic actually consists of points of relatively strong or weak activity (or inactivity), presented respectively vis-à-vis different particular organisms, and measured only one in relation to the 'other.
Such a spectrum can be schematized or tabulated, and the configuration or shape of the resulting combination of peaks and valleys provides a positive identification of the substance, owing to its chemical as well as antibiotic nature.
A typical spectrum of neomycin as far as the tests currently performed are shown in detail below, but some characteristics can be noted here. Generally speaking, in the determinations made so far, neomycin has a spectrum indicating activity against the same important bacteria (including mycobacteria) as those with In respect of which streptomycin is effective and inactivity against molds, also in the same way that streptomycin is relatively ineffective against such organisms.
Accordingly, neomycin is distinguished by its antibiotic spectrum from other materials (such as streptothricin, actinomycin, grisein, penicillin, clavacin) by most of the same general characteristics which distinguish streptomycin from these materials. The neomycin spectrum also includes activity "points" relating to a number of streptomycin-insensitive organisms. Those regions of the spectrum which allow a corresponding distinction from the latter material are represented by the streptomycin resistant strains of E. coli and M. tuberculosis, and by the so-called Bodenheimer organism.
The organism used to produce neomycin has been isolated from soil; as indicated above, it is an actinomycetes, which is at least very close to Streptomyces Fradiae, and is referred to as Streptomyces n 3535. It gives a yellowish to brownish culture on synthetic and organic media, but no pigments. soluble. It therefore belongs to the non-chromogenic group. It easily produces aerial mycelium, especially on synthetic media, the mycelium being pigmented white to pale pink, seashell pink or pink. The color of the mycelium can be defined as light reddish-red, according to the Ridgway nomenclature for color identification. Observations also indicate that the sporulating hyphae are generally straight and only spiral in some media.
As previously indicated, the new antibiotic substance is produced by culturing the organism in question under very artificial conditions, for example by inoculating a suitable medium with spores of the organism or by submerged culture. In the light of the experimental work carried out on this process, it appears that considerable variations are possible in the composition of this medium, preferably with regard to the presence of suitable organic and inorganic constituents, at the same time.
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both to promote the growth of the organism and stimulate the production of the antibiotic.
It thus appears that the best results are obtained when the culture grows in a medium containing a suitable source of nitrogen, a carbohydrate and mineral elements, such as those con- stituted by sodium chloride and others. subjects described later.
A more precise enumeration of the types of constituents which can advantageously be incorporated into the culture medium includes:
I. A peptone or protein digest, ordinary peptones or protein digestes, such as casein digestes, appear to be satisfactory, but superior results have been obtained with materials such as soybean peptone. A constituent of this type can advantageously be included, for example, in the proportion of 10 to 20 grams per liter of medium.
This constituent appears to be of particular importance for the production of the antibiotic.
II. Meat extract or the like, of material, such as yeast extract, in an amount, for example 3 to 5 grams per liter. Although this ingredient is believed to be relatively unimportant and indeed in some instances dispensable, it appears to contribute significantly to the desired result. This constituent can be defined as a nutritional material of the extractive type.
III. A carbohydrate, preferably represented by glucose or a similar sugar, such as maltose. Glucose or the like can be used in quantities of, for example, 5 to 10 grams per liter, and these bodies seem to be of paramount help for good growth of the organism, although in the direct or strict sense their presence is not an essential and critical condition for the production of neomycin.
IV. Certain mineral elements, especially when it is observed that these are absent from the water used to prepare the medium or the cultures.
One element which seems particularly important is zinc in the form of a zinc salt such as zinc sulphate, in a relatively small quantity, for example about 10 mg per liter. Sodium chloride also appears to be an extremely desirable component in the amount of about 5 grams per liter.
V. Water usually in the form of ordinary tap water.
Although distilled water can be used, for example by adding a zinc salt to it, as indicated above, tap water, which naturally contains a trace of combined zinc is quite suitable and avoids any need for addition of mineral constituents other than salt, such as sodium chloride.
When using a medium of the species described above and containing the five (5) ingredients mentioned, the pH is preferably adjusted to about 7 or 7.2 using NaOH. Although it is possible to start with an acidic medium, for example having a pH of 6, experience indicates that the production of the antibiotic is then noticeably retarded and in practice an increase in the antibiotic can result. acidity, which leads to lysis of the organism. In fact, it appears that glucose or the like tends to produce or promote an increase in acidity and therefore to retard the production of neomycin. This effect of glucose has been overcome by employing the peptone in a relatively large amount, that is to say close to the upper limit of the order of the proportions indicated above.
A decrease in the adverse effects of glucose on the production of the antibiotic can also be achieved, at least in part, by decreasing the amount of glucose (preferably by increasing the proportion of peptone, as just explained) or by especially adding a neutralizing agent, such as calcium carbonate. For the latter purpose, calcium carbonate has the additional advantage of being neutralizing on its own. Although other substances, such as sodium carbonate, can be used, it then becomes necessary to make additions of this agent daily or at other regular intervals in order to maintain conditions favoring the production of the antibiotic.
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Using media of the type previously described or an equivalent type, neomycin can be produced in either still or shaken culture.
In the case of immobile cultures, a satisfactory yield of antibiotic is obtained provided that the incubation takes place at room temperature, for example of the order of 22 to 28 G for a period of 7 to 12 days. For immobile cultures the medium must be very shallow; then the body's spores tend to sink, that is, to become submerged and thus to be ineffective in the production of the antibiotic. This organism appears to be characterized by a higher weight or density than organisms such as Streptomyces Griseus, with which less difficulty is encountered when incubating immobile cultures.
Preferable results can be obtained by thickening the medium somewhat, for example, incorporating 1/4 to 1/2% agar therein to produce a semi-solid or semi-liquid consistency. With such a modification of the medium, the organism appears to have a suitable support such that the culture grows on the surface under the form of a film receiving the quantity of air necessary for the development of the antibiotic substance.
Much faster incubation with a satisfactory yield of neomycin has been obtained with shaken cultures, that is, in relatively deep culture media, which are subjected to suitable agitation to obtain adequate agitation. efficient ventilation. Thus, it has been found that 3 to 5 days at a temperature of about 25 C are sufficient for useful production, the preferred temperature range being 22 to 28 C. It appears that for optimum results the degree of agitation or more precisely the degree of ventilation must be carefully controlled.
Experience indicates that with the rigorous mode of agitation ordinarily employed for the production of streptomycin in cultures of S. griseus, cultures of Streptomyces No. 3535 may give only a yield of neomycin which is far from sufficient. 'to be raised. An improvement in yield is then easily obtained, in fact to an optimum value, by reducing the speed of agitation or by incorporating a small quantity of agar (1/4 to 1%), to reduce the diffusion of the agar. the air. The agar thickens the medium, but preferably not beyond a semi-liquid state. It is of course extremely important that a considerable amount of air pass through the medium, for example during the stirring operation.
Although it is impossible to quantitatively define the amount of air or aeration required, the control of the desirable amount in current practice is very easy (requiring at most a few simple tests), given the discussion precedent of the necessary factors. Although the incubation times established above are those found optimum heretofore in the experimental practice of the invention, it is understood that other times may or should be used in special cases. For example, experience in the production of antibiotics generally indicates that the incubation period can be significantly reduced by using a relatively large inoculum.
Although various methods can be adopted to separate the antibiotic material from the culture broth and to purify it subsequently, a preliminary idea can be given of certain operations which have been found to be particularly suitable. Generally the process comprises the adsorption and elution steps, comprising additional purification steps and extending, if desired, to chromatographic separation. As a general example of the process, the culture medium, after the desired incubation period, can be filtered, and the filtrate treated with a suitable adsorbent, such as activated charcoal or other charcoal. activated which adsorbs neomycin.
After separation of the adsorbate, i.e. charcoal, the culture medium can be treated with ethanol made 2% acidic with HCl to subject the antibiotic to elution or other method. - acid-alcohol mixture, such as a methanol-formic acid mixture for the same purpose.
Subsequent stages of purification may include further adsorption and elution of the antibiotic ultimately followed by precipitation with an organic liquid, such as acetone and by washing and final drying of the precipitate at a suitable moderate temperature.
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The first adsorption of neomycin can also be carried out with an adsorbent of the zeolite type, that is to say a cation exchanger. In this case, (as when charcoal is used to adsorb neomycin), a preliminary treatment of the culture medium after filtration, by strongly acidifying it and introducing activated charcoal to adsorb impurities, can be considered. it being understood that neomycin is not adsorbed under strongly acidic conditions. When employing zeolite-type adsorbents (or the like when the carbon-type adsorbent is employed after the preliminary purification), the pH of the filtrate resulting from the separation of the adsorbent and the impurities must first be brought to noticeably to neutrality.
The antibiotic is then adsorbed by treatment with the adsorbent in question and this, i.e. an adsorbate containing neomycin, is filtered and eluted for the separation of the antibiotic. . In the case of an adsorbent of the zeolite type, such an elution can be carried out with an ammonium chloride solution. The resulting liquid in which the antibiotic is dissolved can then be subjected to successive adsorption and elution operations or ending with a suitable process for the precipitation, physical separation and drying of the desired active material, that is that is, neomycin.
It has been found that neomycin, for example produced by processes of this nature, has a remarkably broad antibiotic spectrum, showing extremely useful activity against both Gram-negative and Gram-positive bacteria and showing significant activity. against mycobacteria of both susceptible and streptomycin resistant types. Furthermore, in tests which showed contrary results with streptomycin there was less development of resistance to neomycin among the organisms tested, such results tending to indicate the limited number of strains of these organisms which may be specifically resistant to neomycin, which distinguishes them from streptomycin, for example.
The following table represents an antibiotic spectrum of the. neomycin compared to streptomycin and streptothricin. The determinations for neomycin being made by the "agar strip" method (i.e. a method of diluting an agar plate) with the isolated antibiotic material, prepared according to the method of 1 particular example set out below. The specific values of activity in this table should of course be understood taking into account that the determinations may be improved or otherwise affected by further purification of the antibiotic, and in particular that the different strains different organisms tested may cause certain differences in strength of activity.
It is believed, however, that the nature or configuration of the entire spectrum is not specifically affected by such variations; in order to identify the antibiotic by the shape of its spectrum, it is also understood that one should not attach a particular significance to a comparison of the absolute activities of neomycin on the one hand and streptomycin or streptothricin on the other hand, that is, to a particular organism against which neomycin and one or both of the others are significantly active. The main importance of the spectrum is to highlight for each substance the overall relationship between the various activities and inactivities.
It may be noted, however, that, according to the present experience, neomycin is a substance with high activity or potential, which allows an economy on the quantity necessary and facilitates its administration, when it is used for the treatment of various types. affections.
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TABLE 1 Antibiotic spectrum of crude neomycin compared to those of crude streptomycin and crude streptothricin.
EMI7.1
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(expressed <SEP> in <SEP> units <SEP> of <SEP> dilution <SEP> by <SEP> gram <SEP> of <SEP> preparation <SEP> crude <SEP> necessary <SEP> for
<tb>
<tb>
<tb> stop <SEP> the <SEP> growth <SEP> of the <SEP> proven <SEP> organisms).
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Body <SEP> Neomycin <SEP> Streptomycin <SEP> Streptothricin
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<tb>
<tb> X <SEP> 1000 <SEP> X <SEP> 1000 <SEP> X <SEP> 1000 '
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1. <SEP> Bacillus <SEP> subtilis- <SEP> 150-750 <SEP> 125 <SEP> 125
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2. <SEP> Bacillus <SEP> mycoides <SEP> 20-150 <SEP> 20 <SEP> 0.8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3. <SEP> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 20-60 <SEP> 30 <SEP> <<SEP> 0.8 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4. <SEP> Sta [hydrocus <SEP> aureus <SEP> 100-250 <SEP> 15 <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5. <SEP> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 37.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6. <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> SS <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25 '
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7. <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> RS <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> Active
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8.
<SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 2.5 <SEP> 1 <SEP> <0.8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9. <SEP> Proteus <SEP> vulaaris <SEP> 25 <SEP> 10 <SEP> 12.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10. <SEP> organism <SEP> de-Bodenheimer <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> Active
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 11. <SEP> Serratia <SEP> marcescens <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 1,2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12. <SEP> Mvcobacterium
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> tuberculosis <SEP> hominis
<tb>
<tb>
<tb> 607 <SEP> (SS) <SEP> 80-250 <SEP> Active <SEP> Active
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13. <SEP> Mycobacterium
<tb>
<tb>
<tb> tuberculosis <SEP> hominis
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 607 <SEP> (RS) <SEP> 50-150 <SEP> Inactive <SEP> Active
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14. <SEP> Mvcobacterium <SEP> avium <SEP> 50-150 <SEP> Active <SEP> Active
<tb>
EMI7.2
15.
Mycobacterium'ràna.e 150 Active Active
EMI7.3
<tb> 16. <SEP> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 300 <SEP> 100 <SEP> 12.5
<tb> 17. <SEP> Trichophyton
<tb>
EMI7.4
metalyro-phytes <.. 0.3 '0.3 Active
EMI7.5
<tb> 18. <SEP> Cryptococcus <SEP> albicans <SEP> <<SEP> 0.3 <SEP> <0.3 <SEP> Active
<tb>
<tb> 19: <SEP> Penicillium <SEP> notatum <SEP> <<SEP> 0.3 <SEP> 0.3 <SEP> Active
<tb>
In the table above and elsewhere in the present description, the symbol SS denotes a strain sensitive to streptomycin and the symbol RS denotes a strain resistant to streptomycin.
It is understood that the reference to units of dilution (which are the numbers given in the table multiplied by one thousand in each case) expresses the number of times a unit of activity of the given antibiotic can be diluted and further inhibits the growth of the proven organism. A unit of activity is the amount of material which prevents the growth of a standard organism chosen under standard conditions in one cm3 of medium. So in the table, high values represent high activity, while lower values represent relative inactivity. For convenience and brevity, the different organisms in the table can be identified by the numbers arbitrarily assigned to them in the left column.
As can be seen, neomycin is very active against all the organisms numbered from 1 to 16-inclusive in the table, that is to say against nos. 1 to 6 inclusive, 8,9, 11, 12 and 14 to 16 inclusive, against which streptomycin is also effective and against organisms 2, 3, 8 and 11 for which streptolycin has activity
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relatively low or zero. On the other hand, while streptothricin is active against various fungi, for example organisms 17,18 and 19 in the table, neomycin is relatively inactive.
It may be noted in passing that, while the numerical values in the table represent determinations made on a basis ensuring numerical comparison, certain activities, for example those of streptomycin and streptothricin, were determined by tests of different degrees of the substance or under other conditions and for these other tests the results were simply given by characteristics such as "active" or "inactive". It is considered that the activity and inactivity characteristics thus reported are largely sufficient for the comparisons and the spectral aspect for which the table is intended.
A particular important characteristic of the neomycin spectrum, which distinguishes it from streptomycin, is its activity against organisms 7,10 and 13, that is, the fact that it has the same character. activity towards these organisms than towards many other organisms in the table as opposed to the relative inactivity of neomycin towards organisms 17, 18 and 19. Bodenheimer's organism, No. 10 in the table, was used for the test for antibiotic substances to specifically determine streptothricin in the presence of streptomycin, which exhibits relatively no activity against this organism.
The sensitivity of organisms 7 and 13 to neomycin is of special utility, that is to say, it provides neomycin with the potential to control these strains of bacteria resistant to streptomycin. As we know that organisms 12 and 13 are among those responsible for tuberculosis in humans, we clearly see that neomycin has a field of efficacy against resistant strains that streptomycin does not reach.
The antagonism of neomycin towards organism strains against which streptomycin is ineffective has been demonstrated in other tests in addition to those given in Table 1. Thus, for example, when scratching plaques containing different concentrations of neomycin, with strains sensitive to streptomycin, resistant to streptomycin, and dependent on .streptomycin, of E. Coli, the first two are found to be equally sensitive to neomycin while the third born shows no de- development.
By repeating the same test with streptomycin alone, the first strain of organism shows sensitivity to the antibiotic effect, the second organism being substantially unaffected and the third undergoing the growth for which according to the previous finding) the presence of streptomycin ' is necessary. These tests clearly express the biological and chemical differences between neomycin and streptomycin.
If broth or agar cultures of various bacteria containing sufficient neomycin to arrest growth are incubated for relatively long periods of time, no further development of the bacteria occurs. Thus, the stability of the antibiotic was further demonstrated in contrast to other substances, such as aureomycin.
To further demonstrate the action of neomycin on mycobacteria, susceptibility determinations of various strains of these streptomycin-sensitive and streptomycin-resistant organisms are made using turbidimetric methods. in the middle Dubos Tween. The following table summarizes the results of these tests with a number of organisms or strains of such organisms, including the human pathogenic culture of M. tuberculosis H37 Rv.
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TABLE 8 II.
Effect of neomycin on the growth of different strains of M. tuberculosis in Dubos medium,
EMI9.1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Incubation <SEP> at <SEP> 37 C <SEP> for <SEP> 14 <SEP> days.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Organism <SEP> tested <SEP>. Stop <SEP> of <SEP> the <SEP> growth <SEP> in <SEP> unit / cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> M <SEP> avium <SEP> (SS) <SEP> 4.0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> M <SEP> avium <SEP> R <SEP> (RS) <SEP> 4.0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> M <SEP> tuberculosis <SEP> H37 <SEP> Rv <SEP> (SS) <SEP> 0.2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> M. <SEP> tuberculosis <SEP> H37 <SEP> RvR <SEP> (RS) <SEP> 0.2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> M <SEP> tuberculosis <SEP> H37 <SEP> Rv <SEP> (SS) <SEP> 0.5-1.0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> M <SEP> tuberculosis <SEP> H37 <SEP> RVR <SEP> (RS) <SEP> 1.0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> M. <SEP> tuberculosis <SEP> 607 <SEP> (SS) <SEP> 0.1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mr.
<SEP> tuberculosis <SEP> 607R <SEP> (RS) <SEP> 0.25
<tb>
Neomycin has been found to be active against all of the above types of organisms, and as can be seen from this table, in each case the streptomycin resistant and streptomycin sensitive strains are also sensitive to neomycin.
The fact that neomycin does not appear to promote the rapid development of resistant cultures, ie strains of organisms particularly resistant to neomycin, is indicated by reliable tests. In such a series of tests, a culture of E. coli is suspended in water in the 20 hour agar agar and plated in nutrient agar containing high amounts of neomycin.
After nine days of incubation at 28 C only a colony of yeast, but no bacteria, develops 22 billion cells on a plate containing 25 units per cm3 of neomycin and also only two colonies of yeast and none of bac - series on a plate carrying 5 units per cm3 of neomycin, no colony being noticed on a third plate carrying 10 units per cm3. Thus, it is evident that no resistant culture has developed in any case. It was subsequently found, however, that a few colonies grow in the presence of 2 to 4 units of neomycin, but much less (i.e. 1/10 to 1/100) than in the presence of similar concentrations of streptomycin.
When agar fragments were taken from these plates and inoculated into sterilized agar plates, only some of the fragments from sterilized agar plates that had contained 5 units per cm3 of neomycin showed growth. The fragments from the plates which contained 10 units per cm3 and 25 units per cm3 of neomycin did not give any growth. These tests and others indicate that neomycin is a potent bactericide as well as a bacteriostatic.
Another extremely important property of neomycin is that it appears to be relatively non-toxic or to have extremely low toxicity. Animal tests and other similar in vivo assays (eg on egg embryos) have not only confirmed the relatively strong activity of neomycin against various bacteria, but also indicated that the toxicity of the antibiotic , if there is one, towards animals is extremely limited.
In vivo activity against bacteria has been shown against both Gram positive and negative organisms and against both streptomycin sensitive and streptomycin resistant organisms, strains sensitive to streptomycin being, for example, Staphylococcus aureus, Klebsiellapneumoniae and Shigella pullorum and strains resistant to streptomycin being, by way of example, Salmonella schottmulleri and Staphylococcus aureus. Tests reveal effective ability of neomycin to control everyone
<Desc / Clms Page number 10>
of these organisms.
With regard to toxicity, tests in animals, for example mice, indicate that no toxic or harmful effects occur even when the treatment is increased by 20 to 80 times the effective dose. From the above, it is understood that the culture medium used for the production of the antibiotic can vary considerably depending on conditions, available nutrients and the like. By way of practical example, two examples of medium found satisfactory for the cultivation of Age No. 3535 and hence for the production of neomycin are given below.
Culture medium - Example 1 ----------------- - ---------
20 grams of soy peptone
5 grams of meat extract
5 to 10 grams of glucose
5 grams of sodium chloride
1 liter of tap water (as described above).
Culture medium - Example 2.
----------------- -
10 grams of soy peptone
5 grams of meat extract
10 grams of glucose
10 grams of calcium carbonate (fine powder)
5 grams of sodium chloride
1 liter of tap water (as described above)
As explained above, the medium of Example 2, which has a relatively low peptone content and a relatively high glucose content, also contains a certain amount of calcium carbonate to avoid possible and undesirable effects of the l. increased acidity during incubation. Each of the above media allows very satisfactory results to be obtained, for example a stirred medium with suitable aeration control, as has also been explained.
In each case the pH is adjusted to approximately 7 before inoculation with spores or submerged culture of the organism S n 3535.
As an additional and more specific example of a series of operations making it possible to separate and partially purify neomycin, the following process is given: After preliminary filtration to remove the solids in suspension, the culture medium or broth is acidified with concentrated hydrochloric acid to reduce its pH to a value between 2.0 and 2.5. Activated charcoal, more especially the species referred to as Darco G-60, is added at the rate of 5 grams per liter, and the mixture is stirred for about 30 minutes.
A substance to aid filtration, for example a material such as diatomaceous earth, more especially a substance aiding filtration known as Hyflo Super-Cel, is then stirred into the mixture. of 5 grams per liter, then the mixture is filtered through a pad of the same substance, namely Hyflo Super-Cel, in a similar amount. Since neomycin has not been found to be adsorbed in a strongly acidic reaction medium, the result of this charcoal treatment and subsequent filtration is a preliminary removal of certain impurities, it being understood, of course, that a faster process can in some cases avoid this preliminary treatment.
The filtrate from this treatment thus constitutes a preliminary filtrate purified from culture broth and contains the desired neomycin. The pH of this solution is then adjusted to 7.1.2 with a 40% solution of sodium hydroxide. An adsorbent material is then introduced more precisely of the zeolite type (sodium silico luminate), a suitable substance being the product known under the name of Decalso. The amount of this adsorbent can vary, effective results having been obtained when it is introduced in a proportion of 1 gram per 7,000 units of neomycin activity in the solution. The mixture is then stirred for about 30 minutes and separated
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by filtration the adsorbate, that is to say the adsorbent containing neomycin.
It is washed with water and allowed to air dry overnight.
The dried Decalso adsorbate is then placed in a column having an internal diameter of 30 mm and fitted with a glass wool stopper. A 10% aqueous solution of ammonium chloride is passed through the adsorbate (i.e. the zeolite substance containing the adsorbed neomycin). and we collect successive fractions to try them. Thus -neomycin is effectively separated by elution from the adsorbent. The various fractions can be tested either by the strip method using E Coli or by the agar cup method, then suitably using eB subtilis. The higher potency fractions are combined to form a single mass of solution and the pH of the mixture is adjusted to 7.0.
An additional amount of activated charcoal, for example Darco G-60, is added at the rate of 10 grams per 100 cc and the mixture is stirred for 30 minutes. The adsorbate, i.e., the charcoal containing neomycin is filtered off, washed with water and air dried. The antibiotic is separated from this adsorbate by elution by stirring the adsorbate for thirty minutes with methanol containing 50% of 0.05 N hydrochloric acid, using 5 cm3 of the dilute acid-alcohol mixture per gram of charcoal. wood. The eluted charcoal is filtered off and subjected to a second elution in the same manner.
The eluates are combined, the pH of the combination then being adjusted to 6.0-7.0 with aqueous sodium hydroxide. This neomycin-containing solution is then concentrated in vacuo to a volume of about 3 cm3.
The previous small liquid residue containing the antibiotic is collected by adding methanol, the resulting mixture then being centrifuged to separate the insoluble matter, ie other impurities.
The solution, that is to say the ethanol solution supernatant from the centrifugation, is further concentrated to about 5 cm3 in vacuo. The second concentrate is further washed in a centrifuge tube with methanol in an amount such that the total volume of solution thus produced is 10 to 15 cm3. The insoluble residue is further separated by centrifugation. The neomycin-containing solution, i.e. the supernatant liquid at the end of the last centrifugation run, is then treated with 8-10 volumes of acetone to precipitate neomycin.
The resulting suspension is then allowed to stand for a few hours at 5 ° C. and then centrifuged again. The separated solid, this time constituting neomycin, is finally washed with acetone and dried in vacuo to provide a product. dry rather finely divided, constituting an isolated and separate, although still gross, mass of the new antibiotic substance, namely, neomycin. As previously indicated other purification stages can follow, resulting in a high purity product corresponding to the quality of certain other antibiotics currently available on the market. However, it has been found that the product resulting from the process described above possesses the novel and desirable properties set forth herein, of antibiotic and other orders.
Examination of the new product prepared by the process described above tends to indicate that it is in fact a complex comprising several compounds or almost identical forms of neomycin, which seem to be distinguished only in very small details. . Thus, analytical tests of a type in which the component substances are separated according to their respective relative solubilities in two media (eg organic solvent and water) have been carried out. For example by tests consisting in observing the distribution of the hydrochloride of the product (the neomycin complex) after successive transfers of fractions of the media using a method such as that described by Craie et al. in J. Biol. Chem. Flight. 168, p. 665, 1947 (and also in part described by Craig in J.'Biol. Chem., Vol. 155, p.
519, 1944) and with a borate buffer system at pH 7.3 '' as described by E.A. Swart in J. of the Amer. Chem. Society, August 1949). Three fractions (I, II and III) were found having different distribution coefficients in the separation operation in question, and representing respectively 55, 20 and 11% of the total antibiotic activity in the initial product. tial so tried.
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All the properties of the product or complete complex which have just been described also seem to characterize each fraction. Against an isolated strain somewhat resistant to neomycin from an organism identified as mycobacterium 607 (RN), fraction III shows greater activity than the other two, but the antibiotic spectra of the three fractions and the complex appear qualitatively being the same to such an extent that the complex and its fractions all appear to be identifiable as particular forms or aspects of neomycin considered to be a new foundational compound.
Like the complex, the fractions have exceptional stability under various conditions and temperatures, are basic in nature, form salts such as hydrochlorides and picrates, and are susceptible to good adsorption on cation exchangers.
Of course, other processes for the production of neomycin and for its isolation and purification can be used, for example depending on the different circumstances indicated above, as well as depending on the nature of the substance and. of its solubility characteristics and of its behavior vis-à-vis the reagents used in processes of this general type. It is consequently of course understood that the invention is not limited to the stages and to the particular compositions described here, but can be carried out in any other way.
R E V E N D I C A T IONS.
1. - Process for preparing an antibiotic substance called neomycin, characterized in that it consists in allowing a culture of a microorganism producing neomycin to develop in an artificial culture medium favorable to this growth and to the production of said antibiotic substance, then in separating the neomycin obtained from the culture medium.