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Perfectionnements à la production d'un antibiotique.
L'invention concerne la production, l'extraction et la purification d'un nouvel antibiotique de bonne puissance, spé- cialement contre les organismes infectieux négatifs de Gram, qui convient à des usages thérapeutiques.
La plupart des antibiotiques connus jusqu'à présent sont des produits de métabolisme de moisissures, telles que le Penicillium notatum. Le nouvel antibiotique, toutefois, est le produit du méta- bolisme d'une variété de bactérie.
La variété de bactérie qui, suivant l'invention, est utilisée à la production d'un antibiotique, est le Bacillus aero- sporus Greer décrit dans le "Journal of infectious Diseases, volu-
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me 42;-, page 508, 1928", ou le Bacillus polymyxa (Prazmowski) Migula décrit dans le "Manual. of Determinative Bacteriology" de BERGEY, 5ème. édition, 1939, pages 701 à 704. Ce sont proba- blement deux dénominations du même bacille, mais si les cultures sont différentes, on peut utiliser l'une ou l'autre.
La culture de bactéries utilisée suivant l'invention peut être définie également en se rapportant à son apparence et à ses caractéristiques biologiques, qui sont les suivantes : L'organisme est un bacille, ayant des spores centraux; il est mobile et produit des acides et gaz avec le glucose, lactose, saccharose, mannite, maltose, xylose, arabinose, sali- cine, raffinose, lévulose et inuline, maispas avec le sorbitol ou l'inosite; il est négatif vis-à-vis de l'indol et du rouge de méthyle et donne une réaction de VOGES-PROSKAUER positive.
Il produit un acide et un caillot avec le latex de tournesol; le tournesol est réduit, le petit lait se sépare et le caillot est digéré. Les nitrates sont réduits, la gélatine subit une liquéfaction, le sérum coagulé est liquéfié. Il existe au moins deux variétés de colonies, l'une d'apparence blanchâtre et l'au- tre brune ou grise. Les colonies de deux des variétés ont un aspect doux et mucilagineux.
Le bacille en question est largement répandu dans la nature. côté de son existence dans l'air, il a été trouvé dans l'eau, le sol, le lait, les matières fécales et les légumes en putréfaction.
Suivant l'invention, on choisit des cultures du bacille produisant pendant le métabolisme de bonnes quantités de l'antibiotique désiré. Ceci peut être réalisé par des es- sais biologiques de cultures dérivées de colonies séparées de l'organisme, obtenues par cultures sur plateau.
Le bacille se dévelope bien dans les milieux,de cul-
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ture usuels. Les meilleurs résultats ont été obtenus dans un milieu aqueux contenant 10% en volume de bouillon de nutrition additionné de 0,002% de sulfate de manganèse, 3% de glucose et 0,6% de phosphate diammonique hydrogénée; ayant un pH d'environ 7,4. Le'bacille étant aérobie, sa culture (comme dans le cas d'autres bacilles aérobies) peut s'effectuer soit dans des cou- ches statiques peu profondes ou dans des récipients plus pro- fonds avec aérage artificiel,:
Pour préparer l'inoculum, l'incubation de la colo- nie choisie à 37 C pendant 18 à 24 heures constitue un procédé convenable.
Environ'5 millilitres de l'inoculum peuvent alors être ajoutés à 100 millilitres du milieu nutritif déjà décrit dans un flacon plat, et le tout est soumis à l'incubation à 22-28 C pendant 3 à 8 jours ou pendant 20-24 heures dans les cas où on applique l'aérage artificiel. Des échantillons sont ana- lysés périodiquement pour leur teneur en antibiotique et la cul- ture traitée est recueillie lorsque la teneur en antibiotique a atteint sensiblement un maximum.
. Du fait que l'antibiotique est absorbé par les'matières filtrantes, le fluide de métabolisme doit être, séparé de la bacté- i rie par centrifugation. 0,4% de chloroforme peuvent être ajoutés comme préservatif.
L'organisme recueilli dans la coupe de la machine cen- trifuge peut être remis en suspension dans une solution saline stérile, avec addition de 1% de toluène, et incubationdu mélange à 37 C pendant 48 heures.. Le liquide surnageant contenant des pro- duits d'autolyse d la bactérie., est séparé par centrifugation et ajouté au liquide de métabolisme séparé précédemment, ou est utilisé de la même manière.
Le liquide de métabolisme préparé comme il est décrit
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plus haut, est alors traité comme suit, conformément à l'inven- tion, pour en extraire l'antibiotique.
En premier lieu, suivant le procédé préféré, le liquide est rendu acide à un pH d'environ 2,0-2,5.On utilise de préfé- rence de l'acide chlorhydrique ou sulfurique. L'acide phosphori- que peut aussi être employé comme acidifiant, mais l'acide ni- trique et d'autres acides oxydants doivent être évités.
Le liquide acidifié est alors traité par un charbon de bois activé approprié, pour absorber la plus grande partie des matières colorantes et autres impuretés présentes, mais pas l'antibiotique. Environ 0,5% de charbon de bois par rapport au poids de la solution, représente une quantité convenable. On reconnaît par un simple essai si un charbon de bois convient ou ne convient pas, c'est-à-dire s'il adsorbe les matières coloran- tes et les impuretés, mais non l'antibiotique, dans des conditions acides. Les charbons de bois activés dénommés Farnell n 14 et Farnell L.S. conviennent pour être employés de cette façon.
Le charbon de bois est alors enlevé par filtration et rejeté.
Le filtrat, contenant l'antibiotique, est alors neutra- lisé (pH 6,0 à 8,0) par addition d'alcali, tel que de la soude caustique. Il est ensuite traité à nouveau par un charbon de bois activé approprié. Cette fois (dans des conditions neutres), l'antibiotique est adsorbé.
Le charbon de bois est séparé par filtration et l'anti- biotique en est extrait par lavage au moyen d'acétone aqueux d'une concentration d'environ 40% en poids, maintenu à un pH d'environ 2,5 par de l'acide sulfurique.
On ajoute alors de l'acétone à l'extrait jusqu'à ce que la concentration en acétone soit d'environ 75%. Cette solu- tion est alors refroidie à environ 4 C pendant environ 16 heures.
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La matière solide -,contenant l'antibiotique, est séparée par' filtration. Elle est alors traitée;, par de l'eau à environ 30 C.
Le résidu insoluble est filtré et rejeté.
Le filtrat est porté au pH de 7 par addition d'alcali.
Une nouvelle quantité de matière inactive gélatineuse se dépose et est séparée par filtration. La solution restante est alors congelée et séchéµ sous vide à l'état congelé, pour produire le sulfate brut de l'antibiotique.
Plusieurs variantes du procédé d'extraction préféré décrit plus haut sont possibles.
Ainsi, le charbon de bois sur lequel l'antibiotique a été adsorbé peut être lavé au moyen d'acide chlorhydrique (pH 2,0-2,5) et/ou d'eau pure avant d'être traité par l'acétone à 40%.
Ou bien, au'lieu de traiter le liquide de métabolisme par du charbon de bois dans des conditions acides, le charbon de bois peut être ajouté dans des conditions'neutres. L'anti- biotique et une partie des impuretés sont alors adsorbés ensem- ble sur,le charbon!'de bois, qui est ensuite traité par de 1-lacé- tone à 40% à un pH de 2,5 environ,:'l'extrait étant ensuite traité comme il est dit plus haut.
Une autre variante du procédé décrit en premier lieu consiste à mettre'le charbon de bois sur lequel l'antibiotique a été adsorbé, en(suspension dans de l'éthanol neutre, puis à séparer par filtration le charbon de bois et le laver avec une nouvelle quantité d'éthanol. L'antibiotique peut ensuite être extrait du:charbon de bois par du méthanol sec contenant environ 3,65 grammes d'acide chlorhydrique gazeux dissous par 'litre.,Le charbon de bois est filtré et le filtrat est immédiatement dilué avec quatre volumes d'éther sec. Le chlorhydrate brut de l'anti- biotique désiré se précipite et est enlevé par filtration.
Il
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peut être redissous dans du méthanol, reprécipité par de l'éther', filtré, lavé avec une plus grande quantité d'éther et séché sous vide.
Une autrevariante du procédé décrit plus haut en pre- mier lieu consiste à séparer l'antibiotique de l'extrait dans l'acétone à 40% en réglant cet extrait à un pH de 7 puis en i évaporant l'acétone sous pression réduite. La solution restante de l'antibiotique dans l'eau est remuée avec du charbon de bois activé et filtrée. Le filtrat est rejeté.L'antibiotique est extrait du charbon de bois par de l'acétone aqueux à 40% con- tenant environ 2% en poids d'acide sulfurique. L'extrait est neutralisé par du carbonate de calcium,, refroidi à environ 4 C et le sulfate de calcium précipité est séparé par filtration.
Le filtrat est congelé et séché dans le vide sous cet état, pour produire le sulfate de l'antibiotique.
Ou bien, après évaporation de l'acétone, on peut ajou- ter de l'acide picrique pour précipiter l'antibiotique sous forme de son picrate.
S'il est nécessaire ou avantageux dans certain cas d'effectuer une purification plus poussée du sulfatechlorhydrate ou picrate de l'antibiotique produit par l'un quelconque des pro- cédés d'extraction décrits plus haut, elle peut avoir lieu par transformation de l'antibiotique en son hélianthate. Ceci peut être réalisé par dissolution du sel dans du méthanol aqueux et addition d'une solution saturée de néthyl orange. L'hélianthate se sépare après repos à 4 C. pendant 12 heures.
Si la quantité de méthyl orange ajoutée est telle qu'en- viron 80% de l'activité antibiotique se retrouve dans le préci- pité, celui-ci contient l'antibiotique à l'état pur, certaines des impuretés restant dans les liqueurs mères, dans ces conditions.
Le précipité peut être lavé successivement avec de l'eau et du méthanol et être ensuite traité par de l'acide dans du méthanol
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pour transformer 1àntibiotique en son chlorhydrate soluble ou en un autre sel acide désiré pouvant être séparé sous forme solide, par exemple par précipitation par de l'acétone.
Ou bien le sulfate brut de l'antibiotique peut être transformé,en chlorhydrate par traitement du premier par du chlorure de calcium, filtration du sulfate de calcium qui se dépose en même temps que certaines impuretés.
Le'nouvel antibiotique est une base forte. Son chlor- hydrate est extrêmement soluble dans l'eau et moins facile à ma- nipuler que son sulfate, qui est moins soluble. Son hélianthate est encore moins soluble. La base est un corps solide amorphe blanchâtre. Elle est stable pour de courtes périodes dans une solution aqueuse d'un pH de 3 à 8. Elle est très instable dans des 'solutions alcalines. Elle ne peut pas être extraite de la solution aqueuse par le chloroforme. On la dissout le plus commo- dément dans de l'eau ou du méthanol.
Des expériences in vivo ont montré que -l'antibiotique ' possède une activité chémothérapeutique, et donne un degré utile de protection contre les organismes pathogéniques suivants : Haemophilus pertussis, Eaemophilus influenzae, Eberthella typhi, Escherichia coli compris les variétés haemolithiques asso- ciées à la maladie , de diarrhée blanche chez les veaux) 'et Brucella bronchiseptica. Il a été.'trouvé avoir in vitro une acti- vité antibactérielle contre tous les organismes mentionnés ci- dessus, et aussi contre toutes les variétés de Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Shigella para- dysenteriae et Shigella sonnei.
Il paraît être bactéricide et non pas seulement bacté- riostatique vis-à-vis des organismes sensibles à son activité.
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Improvements in the production of an antibiotic.
The invention relates to the production, extraction and purification of a novel antibiotic of good potency, especially against Gram-negative infectious organisms, which is suitable for therapeutic uses.
Most of the antibiotics known to date are metabolism products of molds, such as Penicillium notatum. The new antibiotic, however, is the product of the metabolism of a variety of bacteria.
The variety of bacteria which according to the invention is used for the production of an antibiotic is Bacillus aerosporus Greer described in the "Journal of infectious Diseases, volu-
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me 42; -, page 508, 1928 ", or Bacillus polymyxa (Prazmowski) Migula described in the" Manual. of Determinative Bacteriology ”by BERGEY, 5th edition, 1939, pages 701 to 704. These are probably two names of the same bacillus, but if the cultures are different, either one can be used.
The culture of bacteria used according to the invention can also be defined with reference to its appearance and to its biological characteristics, which are as follows: The organism is a bacillus, having central spores; it is mobile and produces acids and gases with glucose, lactose, sucrose, mannite, maltose, xylose, arabinose, salicin, raffinose, levulose and inulin, but not with sorbitol or inosite; it is negative towards indol and methyl red and gives a positive VOGES-PROSKAUER reaction.
It produces an acid and a clot with the sunflower latex; the sunflower is reduced, the whey separates and the clot is digested. Nitrates are reduced, gelatin undergoes liquefaction, coagulated serum is liquefied. There are at least two varieties of colonies, one whitish in appearance and the other brown or gray. Colonies of two of the varieties have a soft, mucilaginous appearance.
The bacillus in question is widely distributed in nature. Besides its existence in the air, it has been found in water, soil, milk, feces and rotting vegetables.
According to the invention, cultures of the bacillus are chosen which produce during metabolism good quantities of the desired antibiotic. This can be achieved by biological assays of cultures derived from separate colonies of the organism, obtained by tray cultures.
The bacillus thrives in media,
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usual ture. The best results were obtained in an aqueous medium containing 10% by volume of nutritional broth supplemented with 0.002% manganese sulfate, 3% glucose and 0.6% hydrogenated diammonium phosphate; having a pH of about 7.4. Since the bacillus is aerobic, its culture (as in the case of other aerobic bacilli) can be carried out either in shallow static layers or in deeper vessels with artificial aeration:
To prepare the inoculum, incubation of the selected colony at 37 ° C for 18-24 hours is a suitable method.
About 5 milliliters of the inoculum can then be added to 100 milliliters of the nutrient medium already described in a flat flask, and the whole is incubated at 22-28 C for 3 to 8 days or for 20-24 hours. in cases where artificial ventilation is applied. Samples are periodically analyzed for their antibiotic content and the treated culture is collected when the antibiotic content has reached a substantially maximum.
. Because the antibiotic is absorbed by the filter media, the metabolic fluid must be separated from the bacteria by centrifugation. 0.4% chloroform can be added as a preservative.
The organism collected in the cup of the centrifuge machine can be resuspended in sterile saline solution, with the addition of 1% toluene, and incubation of the mixture at 37 ° C for 48 hours. The supernatant containing proteins. autolysis products of the bacteria, is separated by centrifugation and added to the metabolism fluid separated previously, or is used in the same way.
Metabolism fluid prepared as described
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above, is then treated as follows, in accordance with the invention, to extract the antibiotic therefrom.
First, according to the preferred method, the liquid is made acidic to a pH of about 2.0-2.5. Hydrochloric or sulfuric acid is preferably used. Phosphoric acid can also be used as an acidifier, but nitric acid and other oxidizing acids should be avoided.
The acidified liquid is then treated with a suitable activated charcoal, to absorb most of the coloring matter and other impurities present, but not the antibiotic. About 0.5% charcoal based on the weight of the solution is a suitable amount. Whether or not a charcoal is suitable or unsuitable, that is, adsorbs colourants and impurities, but not the antibiotic, under acidic conditions can be recognized by simple testing. Activated charcoals named Farnell # 14 and Farnell L.S. are suitable for use in this way.
The charcoal is then removed by filtration and discarded.
The filtrate, containing the antibiotic, is then neutralized (pH 6.0 to 8.0) by adding alkali, such as caustic soda. It is then treated again with a suitable activated charcoal. This time (under neutral conditions) the antibiotic is adsorbed.
The charcoal is filtered off and the antibiotic is washed out with aqueous acetone at a concentration of about 40% by weight, maintained at a pH of about 2.5 by water. 'sulfuric acid.
Acetone is then added to the extract until the acetone concentration is about 75%. This solution is then cooled to about 4 ° C for about 16 hours.
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The solid matter, containing the antibiotic, is separated by filtration. It is then treated ;, with water at about 30 C.
The insoluble residue is filtered and discarded.
The filtrate is brought to pH 7 by adding alkali.
A further quantity of gelatinous inactive material settles and is separated by filtration. The remaining solution is then frozen and dried under vacuum in the frozen state, to produce the crude sulfate of the antibiotic.
Several variations of the preferred extraction process described above are possible.
Thus, the charcoal on which the antibiotic has been adsorbed can be washed with hydrochloric acid (pH 2.0-2.5) and / or pure water before being treated with acetone at 40%.
Or, instead of treating the metabolism liquid with charcoal under acidic conditions, the charcoal can be added under neutral conditions. The antibiotic and part of the impurities are then adsorbed together on the charcoal, which is then treated with 40% 1-acetone at a pH of about 2.5: ' the extract then being processed as described above.
Another variant of the process first described is to put the charcoal on which the antibiotic has been adsorbed, in suspension in neutral ethanol, then to filter off the charcoal and wash it with a new amount of ethanol The antibiotic can then be extracted from the charcoal by dry methanol containing about 3.65 grams of dissolved hydrochloric acid gas per liter., The charcoal is filtered and the filtrate is immediately diluted with four volumes of dry ether The crude hydrochloride of the desired antibiotic precipitates and is removed by filtration.
he
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can be redissolved in methanol, reprecipitated with ether, filtered, washed with a larger quantity of ether and dried in vacuo.
Another variant of the process described above first consists in separating the antibiotic from the extract in 40% acetone by adjusting this extract to a pH of 7 and then by evaporating the acetone under reduced pressure. The remaining solution of the antibiotic in water is stirred with activated charcoal and filtered. The filtrate is discarded. The antibiotic is extracted from the charcoal with 40% aqueous acetone containing about 2% by weight of sulfuric acid. The extract is neutralized with calcium carbonate, cooled to about 4 ° C. and the precipitated calcium sulphate is separated by filtration.
The filtrate is frozen and dried in vacuum in this state, to produce the antibiotic sulfate.
Or, after the acetone has evaporated, picric acid can be added to precipitate the antibiotic as its picrate.
If it is necessary or advantageous in certain cases to carry out further purification of the sulfatechlorhydrate or picrate from the antibiotic produced by any of the extraction methods described above, it can take place by processing the antibiotic. antibiotic in its helianthate. This can be done by dissolving the salt in aqueous methanol and adding a saturated solution of methyl orange. The helianthate separates after standing at 4 ° C. for 12 hours.
If the amount of methyl orange added is such that about 80% of the antibiotic activity is found in the precipitate, the precipitate contains the antibiotic in its pure state, some of the impurities remaining in the mother liquors. , in these conditions.
The precipitate can be washed successively with water and methanol and then be treated with acid in methanol.
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to convert the antibiotic to its soluble hydrochloride or to another desired acid salt which can be separated in solid form, for example by precipitation with acetone.
Or else the crude sulphate of the antibiotic can be transformed into the hydrochloride by treatment of the first with calcium chloride, filtration of the calcium sulphate which is deposited at the same time as certain impurities.
The new antibiotic is a strong base. Its hydrochloride is extremely soluble in water and less easy to handle than its sulfate, which is less soluble. Its helianthate is even less soluble. The base is a whitish amorphous solid body. It is stable for short periods in an aqueous solution with a pH of 3 to 8. It is very unstable in alkaline solutions. It cannot be extracted from the aqueous solution by chloroform. It is most conveniently dissolved in water or methanol.
In vivo experiments have shown that the 'antibiotic' possesses chemotherapeutic activity, and gives a useful degree of protection against the following pathogenic organisms: Haemophilus pertussis, Eaemophilus influenzae, Eberthella typhi, Escherichia coli including the Haemolithic varieties associated with the disease, white diarrhea in calves) and Brucella bronchiseptica. It has been found to have in vitro antibacterial activity against all of the above-mentioned organisms, and also against all varieties of Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Shigella paradysenteriae and Shigella sonnei.
It appears to be bactericidal and not only bacteriostatic with respect to organisms sensitive to its activity.