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ANTIBIOTIQUE, ET PROCEDES POUR SA PREPARATION.
L'invention est relative à un nouveau composé chimique ayant des propriétés antibiotiques remarquables et à des procédés pour sa,prépa- ration. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à un nouvel antibio- tique auquel on a donné le nom de sistomycosine, et à sa préparation par
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des procédés mierobiologiques.
La sistomycosine est un composé organique neutre ne contenant que les éléments carbone, hydrogène, azote et oxygène. C'est un corps so- lide chamois ou jaune clair qui apparaît, au microscope polarisant, comme étant microcristallin. Par chauffage,le composé commence à virer au brun à environ 130 C mais il ne fond pas en dessous d'environ 230 C. La sisto- mycosine est très soluble dans l'eau et le méthanol, un peu moins soluble dans l'acétone humide et des mélanges aqueux des alcools aliphatiques su- périeurs,et pratiquement insoluble dans les solvants davantage non-polai- res tels que le chloroforme, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le benzène, l'éther de pétrole,,
etc.. On l'extrait de solutions aqueuses ayant une gamme de-pH de 2 à 9 par du n-butanol et des alcools aliphatiques ana- logues plus élevés.
La sistomycosine réduit rapidement une solution aqueuse froide de permanganate de potassium et une solution de Benedict bouillante, elle donne un essai de Molisch positif sur hydrates de carbone, un essai de Beilstein négatif sur les halogènes et un essai négatif au chlorure ferri- que. L'addition d'une très petite quantité, 1-2 mgr. de l'antibiotique, à de l'acide sulfurique concentré chaud, donne à la solution une colora- tion rouge cerise foncé à chocolat. L'addition d'une petite quantité de l'antibiotique à de l'acide nitrique ou à de l'acide chlorhydrique concen- trés chauds saturés de thymol ne produit aucune modification de couleur.
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L'antibiotique de la présente invention est en outre caracté- risé par ses spectres ultraviolet et infrarouge remarquables. Le spectre d'absorption ultraviolet (Figure I) présente un maximum au voisinage de 300 millimicrons et un autre à 218 millimicrons. Le maximum au voisinage de 300 millimicrons est composé de trois pointes d'absorption distinctes à 292,5, 306 et 320,5 millimicrons, et deux minima entre ces pointes à 298 et 314 millimicrons. Le minimum principal dans le spectre d'absorption ultraviolet est situé à 253 millimicrons.
La courbe d'absorption représen- téè sur la Figure I est celle obtenue dans de l'eau mais la sistomycosine est remarquable en ce que ce spectre n'est pas modifié de fagon apprécia- ble par des variations modérées de l'acidité ou de la basicité de la so- lution;, c'est-à-dire depuis la neutralité jusqu'à une normalité d'environ 0,05 N d'acide ou de base.
La Figure 2 représente la région dite à "empreintes digitales" du spectre d'absorption infrarouge de la sistomycosine dans -un véhicule d'huile minérale neutre. Les pointes à ou au voisinage de 6,88 et 7930 mi- crons sont attribuables au véhicule d'huile minérale. Les bandes d'absorp- tion les plus intenses caractéristiques de la sistomycosine sont celles qui sont localisées à ou voisines de 6,34 et 9,44 microns. Des bandes d'in- tensité faible ou modérée sont situées à ou au voisinage de 7,70; 7,86; 8,55; 11916; Il,85 et 12,4 microns avec d'autres apparaissant comme épau- lement des bandes précédentes à ou au voisinage de 7,08; 7,16; 8,95; 9,89; 10,25 et 10,6 microns.
Une autre bande caractéristique de la sistomycosine qui se trouve en dehors de la région à empreintes digitales est située à ou au voisinage de 2,96 microns.
La sistomycosine, particulièrement en solutions, subit une dé- composition photochimique par exposition à la lumière. Elle est décomposée par des acides et alcalis, mais est plus stable en solutions neutres ou légèrement basiques, c'est-à-dire au pH 7-9 que dans des solutions à réac- tion acide. Elle est entièrement stable dans l'eau en dessous de 25 C et ses solutions aqueuses peuvent même être chauffées à 50 C pendant-une heu- re sans perte de leur activité antibiotique. Dans une solution aqueuse à 100 C, elle conserve plus de 50 % de l'activité antibiotique après une heu- re.
Contrairement aux antibiotiques connus, la sistomycosine pos- sède un haut degré d'activité contre différentes levures et moisissures, mais est, pratiquement parlant, exempte d'activité contre des bactéries gramme-négatives et gramme-positives. Par exemple, le produit de l'inven- tion ne montre aucune activité contre des bactéries telles que Escherichia coli, Salmonella schottnuelleri,Shigella sonnei, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus pvogenes var. aureus, et Streptoeoceus haemolyticus, mais il est extrêmement actif et de grande valeur dans le traitement d'infections fongi-formes causées par les Blastomyces dermatitidis Candida albicans, Histoplasma capsulatum, Microsporum canis Sporotrichum.
cschenckli, Tricho- phyton interdigitale et Trichophyton rubrum, Le tableau ci=après représen- te de façon plus frappante le spectre antibiotique remarquable de la sis- tomycosine comparé aux spectres des antibiotiques connus produits par des actinomycetes et comprenant ceux caractérisés par une activité antifonga- le.
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- <SEP> Activité <SEP> antibiotique
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<tb> Gramme-négatives
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<tb> Résistant <SEP> aux,acides
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<tb> (la <SEP> plupart)
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<tb> Actinomycetes
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<tb> Nocardia
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+ indique que la croissance est arrêtée par moins de 25 micro- grammes d'antibiotique par ml. de bouillon ou d'agar.
- indique que la croissance n'est pas arrêtée par 100 micro- grammes d'antibiotique par ml. de bouillon ou d'agar.
Il ressort du tableau ci-dessus que seul l'antibiotique acti- dione ressemble à la sistomycosine dans son inactivité contre des bacté- ries et son activité contre des eumycetes. Toutefois, l'actidione est ac- tive contre le Cryptococcus neoformans alors que la sistomycosine ne l'est pas,et la sistomycosine est active contre les eumycetes restants cités ci-dessus alors que l'actidione ne l'est pas. Il apparaît ainsi que les deux sont des substances nettement différentes.
La toxicité de la sistomycosine est à peu près négligeable.
Chez les souris, la LD50 intraveineuse est de 90 mg/Kg et le M.T.D. de 80 mg/Kg.
Conformément à la présente invention,on produit la sistomy- cosine par la culture aérobique de cultures d'un nouvel actinomycète du genre Streptomyces auquel on a donné le nom de Streptomyces viridosporus.
Ce microorganisme existe entre autres dans la terre. On peut en obtenir des cultures par mélange de cultures des eumycetes spécifiques inhibés par la sistomycosine avec de l'agar aqueux et addition de terre contenant le Streptomyces viridosporus désiré. Après incubation du mélange pendant
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un à dix jours, apparaissent des colonies de l'actinomycète désiré et d'autres antagonistes. Les cultures de Streptomyces viridosporus sont sélectionnées, transférées dans un milieu de nutrition frais,et sont isolées ultérieurement sous forme de cultures pures conformément aux procédés usuels. Une culture vivante de ce microorganisme a été déposée dans le bureau de culture de Parke, Davis & Company à Détroit, Michigan, sous le n 04889.
Microscopiquement, le mycélium primaire humide de Stre tom - ces viridosporus est vitreux et ramifié à profusion, les parties extre- mes étant recourbées ou légèrement ondulées. Le mycélium secondaire aé- rien est également ramifié à profusion. Il y a aussi des embranchements primaires, secondaires et tertiaires, qui peuvent être alternés,opposés et occasionnellement verticillés. Les parties extrêmes du mycélium aé- rien se subdivisent en chaînes de conidia. Les chaînes conidiales se pré- sentent sous forme de courtes spirales ouvertes ayant une longueur axiale d'environ 10 à 20 microns. Les conidia sont vitreux, sphéroïdes à ovoïdes et ont 1,3 à 1,9 microns de diamètre, mais en moyenne approximativement 1,5 à 1,6 microns.
Quand ils croissent sur un milieu de glucose-tryptone- agar, le jeune mycélium primaire humide de Streptomyces viridosporus ap- parait incolore;,et vire ultérieurement au jaune tan terne. Le mycélium secondaire aérien est blanc et porte des spores qui, en masse, sont vert olive foncé. Il n'apparaît que peu ou pas de pigment dans l'agar. Les colonies de surface sont circulaires, dressées, plissées ou ridées radia- lement,avec une marge pleine à ondulée. Le tableau ci-après illustre les différences caractéristiques entre ce nouvel actinomycète et d'autres ac- tinomycètes producteurs d'antibiotiques quand on les cultive sur un milieu de glucose-tryptone-agar.
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L'organisme liquéfie la gélatine sans former de pigments'et peptonise le lait de tournesol avec peu de changement du pH.
En milieu synthétique (de Gottlieb), l'organisme utilise aisément de nombreuses sources de carbone comprenant l'arabinose, le fructose, le galactose, l'inositol, le lactose, le maltose, le mannitol, le rhamnose, le xylose; il utilise moins aisément l'acétate de sodium, le citrate de sodium, le succinate de sodium et le sucrose ; il n'utilise pas le dulcitol, l'i- nuline, le raffinose et le sorbitol.
En milieu synthétique, l'organisme utilise des sources d'azote comprenant des sels ammoniques et nitrates; de l'azote organique tel que l'urée, la glycine, l'alanine,.la bêta-ala- nine, la valine, la leucine, la serine, la thréonine, la phénylalanine, la tyrosine, le tryptophane, la cystine, l'acide glutamique, l'acide as- partique, l'asparagine, la lysine, l'arginine, l'histidine et le sulfate d'adénine.
Le tableau suivant donne une comparaison des aptitudes de Streptohyces viridosporus et autres actinomyces produisant des antibioti- ques, d'utiliser différentes sources de carbone quand ils croissent dans un milieu comprenant de l'agar, des sels inorganiques et la source de car- bone essayée.
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0 = Pas de croissance ou croissance très faible + = Bonne croissance
1,2 = La différence entre les exigences nutritives est due à'une différence entre les cultures.
Comme on l'a dit plus haut, on produit la sistomycosine par la culture aérobique de Streptomyces viridosporus. Cette opération s'effectue d'ha- bitude en inoculant à un milieu nutritif approprié du Streptomyces viridosporus et incubation du mélange dans des conditions aérobiques à environ 20 à 35 C pen- dant environ un à huit jours. Dans le cas de milieux nutritifs aqueux, la.ma- tière solide présente dans le milieu de culture est séparée et on isole l'anti-
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biotique désiré du liquide de culture par les procédés décrits ci après, Quand on utilise un milieu nutritif solide, on lave convenablement le mélan- ge de culture avec un solvant de l'antibiotique tel que l'eau ou le méthanol et on sépare la sistomycosine désirée de l'extrait.
Pendant la phase d'incu- bation, on maintient de préférence la température au voisinage de 25 à 28 C.
Quand on utilise des milieux nutritifs aqueux, le pH initial doit être com- pris entre 6 et 8,2 et de préférence du côté alcalin entre.environ 7,3 et 7,7. Dans le but d'obtenir les productions maxima de sistomycine, la lumiè- re doit être exclue aussi complètement que possible pendant l'incubation du mélange de culture et la séparation de l'antibiotique. Lors de l'inocula- tion du milieu nutritif, on peut utiliser des suspensions, des sous-cultures ou des milieux de culture de Streptomyces viridosporus.
On peut effectuer la culture du microorganisme dans le milieu nutritif aqueux de plusieurs façons différentes. Par exemple, on peut cul- tiver le microorganisme dans des conditions aérobiques à la surface du mi- lieu ou bien on peut le cultiver en dessous de la surface du milieu, c'est- à-dire à l'état submergé, si on lui fournit en même temps de.l'oxygène. Le procédé préféré pour la production de sistomycine à grande échelle comprend l'utilisation de cultures submergées ou profondes de Streptomves viridospo- rus.
Suivant cette réalisation de l'invention, on inocule du Streptomyces viridosporus à un milieu nutritif aqueux stérile et on soumet celui-ci à l'incubation avec agitation et aération à une température comprise entre 20 et 35 C, de préférence au voisinage de 25 à 28 C pendant environ un à quatre jours. Dans ces conditions, l'organisme se développe sous forme de nombreuses particules plus ou moins séparées dispersées dans la masse du milieu, par contraste avec la pellicule plus ou moins continue présente à la surface du milieu dans le procédé de culture en surface. En raison-de cette distribution de l'organisme dans la masse du milieu, on peut cultiver en une fois de grands volumes du milieu nutritif inoculé, dans les grandes cuves ou tonneaux habituellement utilisés dans l'industrie de la fermenta- tion.
On a trouvé que des appareils de fermentation à cuve fixe munis de dispositifs appropriés d'agitation et d'aération ainsi que des appareils de fermentation à tambour rotatif horizontal conviennent particulièrement bien sous ce rapport. Toutefois, pour la préparation de quantités plus pe- tites de l'antibiotique ou de cultures du microorganisme, ce procédé de culture submergé peut s'effectuer dans de petits flacons qui sont secoués ou agités par des moyens mécaniques appropriés.
On peut réaliser l'agitation et l'aération du mélange de cultu- re de différentes façons. On peut produire l'agitation par un propulseur ou un dispositif mécanique semblable, en faisant tourner ou en secouant l'appa- reil de fermentation lui-même, par différents appareils de pompage, ou en faisant passer dans le milieu de l'air ou d'autres gaz contenant de l'oxy- gène. On peut effectuer l'aération en injectant de l'air ou d'autres gaz contenant de l'oxygène dans le mélange de fermentation, par des tubes ou- verts, des tubes perforés, des milieux de diffusion poreux tels que des bâ- tons de carbone, de carborundum, de verre aggloméré ou l'équivalent, ou bien on peut l'effectuer en pulvérisant, projetant ou versant le moût dans ou à travers une atmosphère contenant de l'oxygène.
Le gaz contenant de l'oxygène doit être exempt de spores, bactéries et autres contaminants a- vant d'être introduit dans le mélange de culture. On peut arriver à ce ré- sultat de fagon très avantageuse par filtration à travers un lit de char- bon de bois activé. Le degré d'aération aboutissant à une production opti- mum de sistomycosine dépend évidemment quelque peu du genre d'appareil uti- lisé, de la vitesse et du mode d'agitation, du pH, de la température et des autres conditions du milieuo Dans tous les cas, le gaz contenant de l'oxygè- ne doit être fourni à un débit suffisant pour maintenir une légère pression positive dans l'appareil de fermentation et éviter ainsi la possibilité de contamination de la culture par l'air extérieur.
Dans des-appareils de fer- mentation à cuve, de 30 litres, un débit d'air de 10-15 litres par minute donne de bons résultats quand on l'utilise avec un impulseur mécanique à six palettes du genre turbine ayant dix centimètres (quatre pouces) de dia- mètre et tournant à raison de. 100 à 200 tours par minute contre quatre
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chicanes verticales périphériques de 25 sur 400 mm. (1 pouce sur 16 pouces).
@ On peut utiliser une grande variété de milieux de culture au stade de croissance du,procédé. Ces milieux doivent contenir une source de carbone assimilable, une matière protéinique, des sels minéraux et des tra- ces de différentes matières nutritives,vitamines et autres stimulants de la croissance habituellement présentes comme impuretés dans les autres constituants du milieu. Pour obtenir la production optimum de sistomycosi- ne, le milieu de culture doit également renfermer une source de graisse.
Une source de carbone assimilable comprend ici des alcools polyhydriques et des mono-, di- et polysaccharides, tandis que le terme matière protéi- nique comprend des protéines non-modifiées et des produits de dégradation de protéines, particulièrement des produits tels qu'il s'en forme'par l'hy- drolyse de protéineso Ces produits de dégradation de protéines comprennent -des protéases, peptones, polypeptides, peptides et acides aminés.
Comme sources de carbone assimilable, on peut utiliser de l'a- rabinose, fructose, galactose, maltose, rhamnose, xylose, glycérine, manni- tol, rhamnitol, etc.. On peut également utiliser des matières complexes à base d'hydrates de carbone telles que des amidonsdextrines, eaux résidu- aires de fermentation et de distillation, corps solides de trempage de grain, liqueur de trempage de grain, résidus de fermentation séchés¯, etc..
Parmi les matières protéiniques qu'on peut utiliser dans les différents milieux, se trouvent l'extrait de boeuf, la caséine hydrolysée en milieu acide, la peptone de boeuf, la farine de soya oléagineuse,des résidus de fermentation séchés, de la farine de soya soluble dans l'eau, dégraissée et partiellement hydrolysée, des mélanges d'aminoacides de sour- ces naturelles ou synthétiques, de l'urée, des purines, etc.. L'utilisa- tion d'un dérivé de farine de soya oléagineuse ou d'un dérivé de protéine de soya comme constituant du milieu est désirable parce qu'elle fournit une petite quantité de graisse à utiliser par le microorganisme.
Les principales exigences minérales du milieu peuvent être sa- tisfaites en ajoutant 0,1 à 0,5 % d'un ou de plusieurs sels inorganiques tels que du chlorure de sodium, du carbonate de calcium, du phosphate bi- potassique, du phosphate monopotassique, etc.. Les autres constituants du milieu nutritif, c'est-à-dire les vitamines, stimulants de croissance etc.. sont d'habitude présents en quantités suffisantes dans les sources de car- bone assimilables et/ou matières protéiniques les plus impures.
On peut séparer la sistomycosine du mélange de culture brut par un certain nombre de procédés différents. Quand on utilise un milieu de cul- ture solide dans la phase de croissance, on extrait le mycélium par un sol- vant de la sistomycosine, tel que l'eau, et on isole le produit de l'ex- trait comme on décrit ci-après. Dans le cas de cultures liquides, on sépare le mycélium, on le lave convenablement à l'eau et on utilise le filtrat et les eaux de lavage dans les phases de séparation ultérieures.
Un procédé pour séparer la sistomycosine du liquide de culture brut ou d'extraits de cultures comprend l'extraction de la solution au moyen d'un alcool non mis- cible à l'eau, tel que le n-butanol, l'élimination du solvant par distilla- tion, l'extraction du résidu par un solvant des graisses tel que le chlo- roforme, le rejet de l'extrait, l'extraction du solide insoluble dans le . chloroforme par du'chloroforme- contenant environ 10 % d'un alcool aliphati- que inférieur tel que le méthanol, l'extrait obtenu étant versé dans un é- changeur d'ions du genre silicates inorganiques (Permutite).
On lave d'a- bord l'échangeur d'ions avec du chloroforme contenant des concentrations graduellement croissantes d'un alcool aliphatique inférieur tel que le mé- thanol, puis on élutrie l'antibiotique au moyen de cet alcool. On évapore les élutriats d'alcool à siccité et on extrait le résidu à l'eau. On filtre l'extrait aqueux, on congèle le filtrat et on sépare la'glace du produit par sublimation dans le vide pour obtenir l'antibiotique désiré.
L'invention est illustrée par les'exemples suivants.
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EXEMPLE 1.
Un mélange consistant en 180 gr. de glucose industriel, 180 gr. d'une protéine partiellement hydrolysée dérivée de fèves de soya, 90 gr. de liqueur de trempage de grain, 90 gr. de chlorure de sodium, 18 gr. de carbo- nate de calcium et une quantité suffisante d'eau chaude pour porter le volu- me à 18 litres, dans un appareil de fermentation du genre à cuve'fixe en verre de 30 litres, muni d'un chapeau en acier inoxydable, d'un' agitateur du genre à hélice, de quatre chicanes intérieures de 25 sur 400 mm (1 pouce sur 6 pouces) et d'une rampe de diffusion d'air circulaire perforée.
On place l'appareil de fermentation dans un autoclave et on sté- rilise le contenu par là vapeur d'eau à 121 C pendant une heure. On refroi- dit l'appareil de fermentation et son contenu, puis on l'enlève de l'auto- clave. A ce milieu, on inocule de fagon aseptique 900 cm3 d'une sous-cultu- re en flacon secoué de sptante deux heures de Streptomves viridosporus cultivé sur le même milieu que celui décrit plus haut et ensemencée à par- tir d'un milieu de culture sporulé glucose-tryptone-agar de Streptomyces viridosporus.
Après inoculation, on soumet le milieu de culture à une incu- bation à 23-27 C pendant quatre vingt huit heures. Pendant cette incuba- tion, on introduit de l'air stérilisé par la rampe de diffusion à un débit de 15,6 à 17,8 litres par minute, et on fait tourner l'agitateur à la vi- tess-e d'environ 150 tours à la minute.
La production d'antibiotique pendant l'incubation est suivie en prélevant des échantillons de temps en'temps et en.les essayant contre le Candida albicans par le procédé dit "cylinder-plate agar-diffusion me- thod". La production d'antibiotique est indiquée par le' diamètre en milli- mètres de la zone d'inhibition. Le tableau ci-après illustre la production d'antibiotique obtenue par le procédé décrit ci-dessus.
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<tb>
Périodes <SEP> d'incubation <SEP> Inhibition <SEP> du <SEP> Candida <SEP> albicans
<tb>
<tb> en <SEP> heures <SEP> Diamètre <SEP> de <SEP> la <SEP> zone <SEP> en <SEP> mm.
<tb>
<tb>
<tb>
40 <SEP> 16,6
<tb>
<tb>
<tb> 47 <SEP> " <SEP> '19,2 <SEP> , <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 64 <SEP> 22,1
<tb>
<tb> 71 <SEP> 21,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 88 <SEP> 23,4
<tb>
A la fin de la période d'incubation, on ajoute 25 gr. par li- 'tre d'un auxiliaire de filtration à base de cilicate et on filtre le mélan- ge de culture. On lave le tourteau au moyen de deux portions de 25 cm3 d'eau par litre de mélange de culture, et on ajoute les eaux.de lavage au filtrat principal...
On extrait deux fois au moyen de 10 litres de n-butanol, 31,64 litres de filtrat ou "bière"'préparé comme décrit plus haut et don- nant 18,5 mm. à l'essai contre le Candida albicans à une dilution de 1 à 2. On rejette la solution aqueuse et on concentre les extraits dans l'obscu- rité et sous vide en dessous de 45 C à peu près jusqu'à siccité. bn extrait le résidu au moyen de quatre portions de 50' cm3 et une portion de 100 ém3 de chloroforme à 40 C et on rejette les extraits. On secoue le résidu in- soluble dans le chloroforme avec 300 cm3 d'eau et on filtre pour obtenir 3,39 gr. de solide (Solide A) et un filtrat (Filtrat A).
On congèle le fil- trat A et on en élimine la glace par sublimation dans le vide pour obtenir 3,725 gr. de sistomycosine. 500 gammas de cette substance dans 1 cm3 d'eau produisent des zones d'inhibition contre le Candida albicans de 16,8 et 11,5 mm. à des dilutions respectives de 1:1 et de 1:2. ,
On extrait le solide A (3,39 gr.) au moyen de deux portions de 100 cm3 et six portions de 150 cm3 d'eau. On filtre les extraits, on les
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soumet à des essais séparés, on combine ceux ayant des titres semblables et on les congèle. On sépare'la glace des extraits congelés par sublimation
EMI11.1
:dans le vide pour obtenir un total de 3 95 gr, de sistornycosine- brute.
Les productions et la pureté de chacune des fractions brutes sont données dans le tableau suivant.
EMI11.2
<tb> Poids <SEP> de <SEP> Concentra- <SEP> Résultats <SEP> d'essais <SEP> contre <SEP> le
<tb> Solide <SEP> produit <SEP> tion <SEP> de <SEP> pro- <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP>
<tb>
EMI11.3
'. ' . brut (mg) dui t brut en
EMI11.4
<tb> 'solution <SEP> de <SEP> Dilution <SEP> 1:1 <SEP> 1:2 <SEP> Il:4 <SEP> 1:8
<tb>
EMI11.5
stock gamma/ Diamètre mm. inm. nm. nrni.
EMI11.6
<tb> cm3 <SEP> ' <SEP> de <SEP> la <SEP> zone
<tb> d'inhibi-
<tb>
EMI11.7
tion en mm..
B. 1623 200 17,1 14,1 10,6 C 1613 ' 400 20el 17,5 14,4, 12.,o D 114 200 7:5,9 - 11,3 - +
EMI11.8
<tb> E <SEP> 100 <SEP> 330 <SEP> 16,0 <SEP> 13,5 <SEP> 11,6 <SEP> , <SEP> ++
<tb>
<tb> F <SEP> 60 <SEP> 550 <SEP> - <SEP> 13,9 <SEP> 11,9 <SEP> ++ <SEP> +
<tb>
+ Inhibition à l'intérieur du cylindre.
++ Légère inhibition immédiatement autour.du cylindre.
On extrait 995 mg. de solide B pendant 1/2 heure à l'aide de
199 cm3 de chloroforme contenant 10 % de méthanol en volume et on filtre le,mélange.*Le résidu insoluble pèse 770,5 mg. On verse l'extrait sur une colonne chromatographique contenant 21,1 gr. d'une matière d'échange à ba- 'se de silicate déonommée "Florisil", préalablement lavé e à fond au moyen 'de chloroforme contenant 10 % de méthanol en volume. On laisse percoler à travers la colonne, dans l'ordre donné, des solvants mixtes qui.consistent . en chloroforme contenant 10, 20, 30 et 50 % de méthanol en volume. On re- jette les élutriats et on verse sur la colonne 50 cm3 de méthanol. On re- jette le premier élutriat de méthanol et on verse 2050 cm3 de méthanol par petites portions sur la colonne.
On recueille un total de huit fractions, 'dont on évapore les cinq premières à sec dans le vide. On extrait le ré- sidu jaune par un total de 35 cm3 d'eau, on congèle l'extrait et on en . sublime la glace pour obtenir 85,4 mgr. de sistomycosine sous forme de so- lide jaune pale. 400 gammas'de ce solide, dissous dans un cm3 d'eau don- nent une zone d'inhibition de 22 mm. de diamètre à une 'dilution de 1:1 à ¯l'essai contre le Candida albicanso , On combine les trois autres fractions et on les évapore à sec pour obtenir 131,1 mg. de sistomycosine sous forme de substance solide jau- ne clair. 400 gammas de cette substance dans 1 cm3 d'eau,,produisent une zone d'inhibition de 16 mm. à une dilution de 1:
1 dans l'essai contre le
Candida albicans. Par le procédé d'essai turbidimétrique, '7,14 gammas/cm3
EMI11.9
produisent une inhibition à 50 % de la.croissance de Garidida'albicans.
On extrait 1,435 gr. de matière solide C à l'aide'de 207 cm3 de chloroforme contenant 10 % de méthanol en volume, pendant une demi-heu- re. Le résidu insoluble (Solide G) pèse 1,084 gr. On -verse l'extrait dans une colonne d'absorption contenant 32 gr. d'une matière d'échanger d'ions à base de silicate dénommée "Decalso" préalablement lavée à fond par du chlo- roforme contenant 10 % de méthanol en volume. On fait percoler à travers la colonne les solvants mixtes suivants, par portions de 700 cm3, dans l'ordre donné chloroforme contenant 10, 20, 30, 40 et 50 % de méthanol en volume.
On rejette les percolats. On élutrie la colonne au moyen de.840 cm3 de mé- thanol divisé en six portions et on combine les élutriats. On évapore la
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solution à siccité dans le vide et on extrait le résidu par une quantité totale de 30 cm3 d'eau. On congèle l'extrait aqueux et on en sublime la glace sous pression réduite pour obtenir 107 mg. de sistomycosine sous for- me d'un solide de couleur chamois. Cette substance donne une zone d'inhibi- tion de 23,6 mm. à une concentration de 400 gammas/cm3 dans l'essai contre le Candida albicans.
On élutrie la colonne au moyen de cinq portions supplémentai- res de 700 cm3 de méthanol et on évapore les extraits combinés à siccité dans le vide. On extrait le résidu à l'eau,on congèle l'extrait et on sè- che à partir de l'état congelé pour obtenir 85 mgr. de sistomycosine sous forme de corps solide jaune clair donnant à l'essai contre le Candida al- bicans une zone d'inhibition de 20,3 mm. à une concentration de 400 gammas/ cm3. A l'essai au turbidimètre, 3,47 gammas/cm3 du produit donnent une inhibition de 50 % de la croissance de Candida albicans.
,, 0n extrait le solide G par du chloroforme contenant 10 % de méthanol,.en volume et on verse l'extrait sur une colonne chromatographi- que'contenant la substance d'échange d'ions dénommée "Decalso". On lave la colonné au moyen de portions de chloroforme contenant 10, 20, 30, 40 'et 50 %de méthanol.en volume et on rejette les eaux de lavage. On élutrie la colonne au moyen de 600 cm3 de méthanol divisés en six portions égales.
On rejette les premiers 50 em3, on combine les fractions restantes et on évapore à sec dans le vide. On extrait le résidu à l'eau, on le congèle, et on en sublime la glace sous pression réduite pour obtenir 92 mg. de sistomycosine pure. A l'essai contre le Candida albicans, 400 gammas/cm3 de cette substance solide jaune clair produisent une zone d'inhibition de
23,8 mm. à une dilution de 1:1. On peut produire 60 mgr. additionnels de . sistomycosine en lavant la colonne d'absorption avec une plus grande quan- tité de'méthanol' et en traitant l'éluat comme décrit plus haut.
La sistomycosine pure est un composé organique neutre qui ne contient qué les éléments carbone, hydrogène, azote et oxygène. Elle ne , fond pas'en dessous d'environ 230 C mais elle vire au brun à environ 130 C.
;Elle rédùit rapidement une solution froide aqueuse de permanganate de po- tassium 'et la solution de Benedict bouillante. Elle donne un essai de Mo- lisch positif aux hydrates de carbone, un essai de Beilstein négatif aux halogènes et un essai négatif au chlorure ferrique. L'addition d'une très petite quantité de l'antibiotique (1 à 2 mgr. ) à de l'acide sulfurique con- centré chaud confère à la solution une couleur rouge-cerise foncé à choco- lat. Aucune modification de couleur ne se produit quand on ajoute une peti- te quantité de l'antibiotique à de l'acide nitrique ou à de l'acide chlor- hydrique chauds saturés de thymol.
La sistomycosine, particulièrement en solutions, subit une dé- :composition photochimique par exposition à la lumière. Elle est décomposée par des.acides ou alcalis mais est plus stable dans des solutions neutres ou légèrement basiques, c'est-à-dire ayant un pH de 7-9, que dans des solu- tions à réaction acide. Elle est entièrement stable dans l'eau en dessous de 25 C et on peut même chauffer ses solutions aqueuses à 50 C pendant une heure Sans perte de son activité antibiotique. En solution aqueuse à 100 C, 'elle conserve plus de 50% de son activité antibiotique après une heure.
. Le spectre d'absorption ultraviolet (Figure I) a un maximum au voisinage de 300 millimicrons et un autre à 218 millimicrons avec un
E1% de 215. Le maximum au voisinage de 300 millimicrons se compose de
1 cm trois pointes d'absorption distinctes à 292,5, 306 et 320,5 millimicrons avec des valeurs de rpt respectivement.de 257, 340 et.295, et deux micm 1 % nima situés entre ces pointes à 298 et 314 millimicrons avec des E1% res- 1 cm pectivement de 230 et 217. Le minimum principal dans les spectres d'absorp- tion ultraviolets est situé à 253 millimicrons avec un E 1 1% de 102.
La
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courbe d'absorption représentée sur la Figure 1 est celle obtenue dans de l'eau, mais la sistomycosine est remarquable en ce que ce spectre n'est pas modifié de façon appréciable par des variations modérées de l'acidité ou de la basiéité de la solution, c'est-à-dire depuis la neutralité jusqu'à une acidité ou basicité d'environ 0,05 N.
La Figure 2 représente la région dite "à empreintes digitales" du spectre d'absorption infrarouge de la sistomycosine dans un véhicule d'huile minérale neutre. Les pointes à ou au voisinage de 6,88 et 7,30 microns sont attribuables au véhicule d'huile minérale. Les bandes d'ab- sorption les plus intenses caractéristiques de la sistomycosine sont cel- les situées à ou au voisinage de 6,34 et 9,44 microns. Des bandes d'in- tensité faible ou modérée sont situées à ou au voisinage de 7,70; 7,86;
8,55; 11,16; Il,85 et 12,4 microns avec d'autres apparaissant comme é- paulements aux bandes précédentes à ou au voisinage de-7,08, 7,16; 8,95;
9.89; 10,25 et-10,6 microns.
Une autre bande caractéristique de la sistomy- cosine située en dehors de la région à "empreintes digitales" se trouve à où au voisinage de 2,96 microns.
EXEMPLE 2.
Un milieu nutritif qui consiste en 5 gr. de glucose industriel, 2,5 gr. d'extrait de boeuf, 2,5 gr. de peptone, 2,5 gr. de chlorure de so- dium et une quantité d'eau suffisante pour porter le volume à 500 cm3 est rendue alcaline au pH 7,7 par une solution 10 N d'hydroxyde de sodium. On place le milieu dans un flacon de Fernbach bouché par un bouchon d'ouate et stérilisé sous une pression de vapeur d'eau de 1,26 Kgr/cm2 (18 livres) pen- dant vingt minutes. On inocule au milieu 1 cm3 d'une suspension de spores de Streptomyces viridosporus provenant d'un milieu de culture glucose-tryp- tone-agar vieux de dix jours. On soumet le mélange résultant à une incuba- tion à 24 C pendant huit jours.
Au bout de ce temps, le liquide de culture en dessous du mycélium de la surface a un pH de 6,8 et produit une zone d'inhibition de 22 mm. de diamètre quand on le soumet à un essai sistomy- cosine .contre Candida albicans par le procédé dit "disc-plate". On peut séparer la sistomycosine présente dans le liquide de culture par le procédé décrit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 3.
Un mélange consistant en 180 gr. de maltose de qualité industriel- le, 180 gr. de liqueur de trempage de grain, 90 gr. de chlorure de sodium,
36 gr. de phosphate bipotassique et une quantité suffisante d'eau pour for- mer un volume de 18 litres, est placé dans un appareil de fermentation de
30 gallons du genre décrit dans l'exemple 1. On règle le pH de la solution à 7,5 par une solution 10 N d'hydroxyde de sodium, on ajoute 18 gr. de car- bonate de calcium et on stérilise l'appareil de fermentation et le milieu à 250 C pendant deux heures.
On refroidit le milieu nutritif et on-lui ino- cule de façon aseptique 10 cm3 d'une suspension de spores de Streptomyces viridosporus préparée en remuant un milieu de culture glucose-tryptone-agar de Streptomyces viridosporus, vieux de sept jours, avec 10 cm3 de solution aqueuse de savon fin à 0,01 %.
On soumet le mélange de culture à l'incubation à 28-29 C pen- dant 136 heures et pendant ce temps, on fait tourner l'agitateur.à une vi- tesse de 150 tours par minute et on fait passer de l'air, stérile dans le . mélange à la vitesse de 7,2 à 18 litres par minute. A la fin de la période d'incubation, on sépare le -mycélium du mélange et on soumet la "bière" de culture claire à un essai de détermination de sa teneur en sistomycosine 'par -le procédé turbidimétrique contre le Candida albicans. Dans l'expérien- ce 'décrite, la bière de culture produit une inhibition à 50 % de la crois- sance du Candida albicans, à une dilution de 1 à 135.
On peut séparer la sistomycosine présente dans la bière de culture sous forme pure en utilisant le procédé de séparation décrit dans l'exemple 1.
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EXEMPLE 4.
On introduit dans chaque flacon d'une série de flacons Erlen- meyer 125 cm3 d'un milieu de culture composé de 0,5 % de glucose industriel, 0,5 % de glycérine, 0,3 % de caséine hydrolysée, 0,25 % de peptone, 0,1 % de levure de brasserie, 0,25 % de matières solides d'eau de trempage de . grain, 0,25 % de farine de soya, 0,25 % de résidu de fermentation du buta- nol-acétone, 0,25% de chlorure de sodium, 0,1 % de carbonate de calcium et de l'eau pour compléter à 100 %.
On recouvre les flacons d'ouate recouverte de gaze et on stérilise sous une pression de vapeur d'eau de 1,26 Kgr/cm2 (18 livres) pendant vingt-cinq minutes, puis on inocule à chaque flacon; de façon aseptique, 1 cm3 d'une suspension de spores de Streptomyces viridos- porus préparée à partir d'un milieu de culture glucose-tryptone-agar, vieux de sept jours. Les flacons sont secoués sur une machine à secouer du type rotatif tournant à 150 tours par minute, pendant quatre jours. On maintient la température à 22-4 C pendant l'incubation. A la fin de la période d'in- "cubation, la bière de culture a un pH de 6,4 environ.
A l'essai turbidimé- 'trique entre le Candida albicans, la bière de culture contient une quantité suffisante de sistomycosine pour produire une inhibition à 50 % de la crois- sance de l'organisme d'essai, à une dilution de 1 à 1350
Si on le désire, on peut combiner et filtrer le mélange de cul- ture dans les flacons et séparer la sistomycosine par le procédé décrit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 5.
On introduit dans chaque flacon d'une série de flacons d'Erlen- meyer 125 cm3 d'un milieu de culture composé de 1 % de maltose, 1 % de li- queur de trempage de grain, 0,2 % de phosphate bipotassique, 0,5 % de chlo- rure de sodium et de l'eau pour compléter à 100 % (réglée au pH de 7,5 par une solution d'hydroxyde de sodium 10 N) et on bouche les flacons avec de l'ouate recouverte de gaze. On stérilise les flacons contenant le milieu de culture, on inocule et on soumet à l'incubation comme décrit dans l'exemple 4. A la fin de la période d'incubation, on sépare le mycélium par filtra- tion et on combine les liquides ou bières de culture.
La bière de culture a un pH de 6,35 environ et en appliquant le procédé turbidimétrique, on trouvé qu'elle contient une quantité suffisante de sistomycosine pour pro- duire une inhibition à 50 % de la croissance de Candida albicans, à une dilution de 1 à 320. On peut séparer la sistomycosine pure de la bière de culture par le procédé décrit dans l'exemple 1.
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R E iT E N D I C¯A TI 0 N S.. l.- Procédé de production de l'antibiotique sistomycosine ca- ractérisé en ce qu'on inocule à un milieu de culture du Streptomyces viri- dosporus, on soumet le milieu inoculé à l'incubation dans des conditions aérobiques à une température de 20 à 35 C pendant environ un à huit jours, et on' sépare la sistomycosine ainsi produite du mélange de culture.
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ANTIBIOTIC, AND METHODS FOR ITS PREPARATION.
The invention relates to a new chemical compound having outstanding antibiotic properties and to methods for its preparation. More particularly, the invention relates to a new antibiotic to which the name of sistomycosin has been given, and to its preparation by
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mierobiological processes.
Sistomycosin is a neutral organic compound containing only the elements carbon, hydrogen, nitrogen and oxygen. It is a solid buff or light yellow body which appears, under a polarizing microscope, to be microcrystalline. On heating the compound begins to turn brown at about 130 C but does not melt below about 230 C. Sistomycosin is very soluble in water and methanol, somewhat less soluble in acetone. moist and aqueous mixtures of the higher aliphatic alcohols, and practically insoluble in more non-polar solvents such as chloroform, diethyl ether, ethyl acetate, benzene, petroleum ether, ,
etc. It is extracted from aqueous solutions having a pH range of 2 to 9 with n-butanol and higher analogous aliphatic alcohols.
Sistomycosin rapidly reduces a cold aqueous solution of potassium permanganate and a boiling Benedict's solution, it gives a positive Molisch test on carbohydrates, a negative Beilstein test on halogens and a negative test on ferric chloride. The addition of a very small amount, 1-2 mgr. antibiotic, hot concentrated sulfuric acid, gives the solution a dark cherry red to chocolate color. Addition of a small amount of the antibiotic to hot concentrated nitric acid or hydrochloric acid saturated with thymol does not produce any color change.
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The antibiotic of the present invention is further characterized by its remarkable ultraviolet and infrared spectra. The ultraviolet absorption spectrum (Figure I) shows a maximum in the vicinity of 300 millimicrons and another at 218 millimicrons. The maximum in the vicinity of 300 millimicrons is composed of three distinct absorption peaks at 292.5, 306 and 320.5 millimicrons, and two minima between these peaks at 298 and 314 millimicrons. The main minimum in the ultraviolet absorption spectrum is located at 253 millimicrons.
The absorption curve shown in Figure I is that obtained in water, but sistomycosin is remarkable in that this spectrum is not appreciably modified by moderate variations in acidity or acidity. the basicity of the solution; that is, from neutrality to a normality of about 0.05 N acid or base.
Figure 2 shows the so-called "fingerprint" region of the infrared absorption spectrum of sistomycosin in a neutral mineral oil vehicle. The peaks at or near 6.88 and 7930 microns are attributable to the mineral oil vehicle. The most intense absorption bands characteristic of sistomycosin are those located at or around 6.34 and 9.44 microns. Bands of weak and moderate intensity are located at or near 7.70; 7.86; 8.55; 11916; 11, 85 and 12.4 microns with others appearing as shoulders of previous bands at or near 7.08; 7.16; 8.95; 9.89; 10.25 and 10.6 microns.
Another characteristic band of sistomycosin which is found outside the fingerprint region is located at or near 2.96 microns.
Sistomycosin, particularly in solutions, undergoes photochemical decomposition on exposure to light. It is decomposed by acids and alkalis, but is more stable in neutral or slightly basic solutions, ie at pH 7-9 than in solutions with an acid reaction. It is completely stable in water below 25 C and its aqueous solutions can even be heated to 50 C for an hour without loss of their antibiotic activity. In an aqueous solution at 100 ° C., it retains more than 50% of the antibiotic activity after one hour.
Unlike known antibiotics, sistomycosin has a high level of activity against various yeasts and molds, but is practically speaking devoid of activity against gram-negative and gram-positive bacteria. For example, the product of the invention shows no activity against bacteria such as Escherichia coli, Salmonella schottnuelleri, Shigella sonnei, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus pvogenes var. aureus, and Streptoeoceus haemolyticus, but it is extremely active and of great value in the treatment of fungal infections caused by Blastomyces dermatitidis Candida albicans, Histoplasma capsulatum, Microsporum canis Sporotrichum.
cschenckli, Trichophyton interdigitale and Trichophyton rubrum, The table below shows more strikingly the remarkable antibiotic spectrum of sistomycosin compared to the spectra of known antibiotics produced by actinomycetes and including those characterized by antifungal activity. the.
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+ indicates that growth is arrested by less than 25 micrograms of antibiotic per ml. broth or agar.
- indicates that growth is not stopped by 100 micrograms of antibiotic per ml. broth or agar.
From the above table it can be seen that only the antibiotic actidione resembles sistomycosin in its inactivity against bacteria and its activity against eumycetes. However, actidione is active against Cryptococcus neoformans while sistomycosin is not, and sistomycosin is active against the remaining eumycetes mentioned above while actidione is not. It thus appears that the two are markedly different substances.
The toxicity of sistomycosin is approximately negligible.
In mice, the intravenous LD50 is 90 mg / Kg and the M.T.D. of 80 mg / Kg.
In accordance with the present invention, sistomycosin is produced by the aerobic cultivation of cultures of a novel actinomycete of the genus Streptomyces which has been given the name Streptomyces viridosporus.
This microorganism exists among others in the earth. Cultures thereof can be obtained by mixing cultures of specific eumycetes inhibited by sistomycosin with aqueous agar and adding soil containing the desired Streptomyces viridosporus. After incubating the mixture for
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one to ten days, colonies of the desired actinomycete and other antagonists appear. The cultures of Streptomyces viridosporus are selected, transferred to a fresh nutrition medium, and are subsequently isolated in the form of pure cultures according to the usual methods. A live culture of this microorganism has been deposited in the culture office of Parke, Davis & Company in Detroit, Michigan under number 04889.
Microscopically, the wet primary mycelium of Stre tom - ces viridosporus is glassy and profusely branched, the outer parts being curved or slightly wavy. The secondary aerial mycelium is also profusely branched. There are also primary, secondary and tertiary branches, which can be alternate, opposite and occasionally whorled. The extreme parts of the aerial mycelium subdivide into chains of conidia. The conidial chains are in the form of short open spirals having an axial length of about 10 to 20 microns. Conidia are glassy, spheroid to ovoid, and 1.3 to 1.9 microns in diameter, but average approximately 1.5 to 1.6 microns.
When grown on glucose-tryptone-agar medium, the young, moist primary mycelium of Streptomyces viridosporus appears colorless, and subsequently turns dull tan yellow. The secondary aerial mycelium is white and bears spores which, in bulk, are dark olive green. Little or no pigment appears in the agar. Surface colonies are circular, erect, folded or radially wrinkled, with a solid to wavy margin. The table below illustrates the characteristic differences between this new actinomycete and other antibiotic-producing acinomycetes when grown on glucose-tryptone-agar medium.
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The body liquefies gelatin without forming pigments and peptonizes sunflower milk with little change in pH.
In a synthetic medium (from Gottlieb), the organism easily uses numerous carbon sources including arabinose, fructose, galactose, inositol, lactose, maltose, mannitol, rhamnose, xylose; it less readily uses sodium acetate, sodium citrate, sodium succinate and sucrose; it does not use dulcitol, inulin, raffinose and sorbitol.
In a synthetic environment, the organism uses nitrogen sources comprising ammonium salts and nitrates; organic nitrogen such as urea, glycine, alanine, beta-alanine, valine, leucine, serine, threonine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, cystine, glutamic acid, aspartic acid, asparagine, lysine, arginine, histidine and adenine sulfate.
The following table gives a comparison of the abilities of Streptohyces viridosporus and other antibiotic-producing actinomyces to use different carbon sources when growing in a medium comprising agar, inorganic salts and the tested carbon source. .
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0 = No growth or very weak growth + = Good growth
1,2 = The difference in nutrient requirements is due to a difference between crops.
As mentioned above, sistomycosin is produced by aerobic cultivation of Streptomyces viridosporus. This is usually done by inoculating an appropriate nutrient medium with Streptomyces viridosporus and incubating the mixture under aerobic conditions at about 20 to 35 ° C for about one to eight days. In the case of aqueous nutrient media, the solid material present in the culture medium is separated and the anti-
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desired biotic of the culture liquid by the methods described below. When using a solid nutrient medium, the culture mixture is suitably washed with a solvent for the antibiotic such as water or methanol and the sistomycosin is separated. desired from the extract.
During the incubation phase, the temperature is preferably maintained in the region of 25 to 28 C.
When using aqueous nutrient media, the initial pH should be between 6 and 8.2 and preferably on the alkaline side between about 7.3 and 7.7. In order to obtain the maximum yields of sistomycin, light should be excluded as completely as possible during the incubation of the culture mixture and the separation of the antibiotic. When inoculating the nutrient medium, suspensions, subcultures or culture media of Streptomyces viridosporus can be used.
The culture of the microorganism in the aqueous nutrient medium can be carried out in several different ways. For example, the microorganism can be grown under aerobic conditions on the surface of the medium or it can be cultivated below the surface of the medium, i.e. in the submerged state, if it is at the same time supplies him with oxygen. The preferred method for the large scale production of sistomycin involves the use of submerged or deep cultures of Streptomves viridosporus.
According to this embodiment of the invention, Streptomyces viridosporus is inoculated into a sterile aqueous nutrient medium and the latter is subjected to incubation with agitation and aeration at a temperature of between 20 and 35 ° C., preferably in the region of 25 to 28 C for about one to four days. Under these conditions, the organism develops in the form of numerous more or less separated particles dispersed in the mass of the medium, in contrast to the more or less continuous film present on the surface of the medium in the surface culture process. Because of this distribution of the organism in the mass of the medium, large volumes of the inoculated nutrient medium can be cultivated at one time in the large vats or barrels usually used in the fermentation industry.
It has been found that fermentation apparatus with a fixed tank fitted with suitable agitation and aeration devices as well as fermenters with a horizontal rotating drum are particularly suitable in this connection. However, for the preparation of smaller amounts of the antibiotic or cultures of the microorganism, this submerged cultivation process can be carried out in small flasks which are shaken or agitated by suitable mechanical means.
Agitation and aeration of the culture mixture can be accomplished in a number of ways. The agitation can be produced by a propellant or similar mechanical device, by rotating or shaking the fermentation apparatus itself, by various pumping devices, or by passing air or gas through the medium. other gases containing oxygen. Aeration can be accomplished by injecting air or other oxygen-containing gases into the fermentation mixture, through open tubes, perforated tubes, porous diffusion media such as sticks. carbon, carborundum, sintered glass or the like, or it can be done by spraying, blasting or pouring the wort into or through an oxygen-containing atmosphere.
The oxygen-containing gas must be free of spores, bacteria and other contaminants before it is introduced into the culture mixture. This can be achieved very advantageously by filtration through a bed of activated charcoal. The degree of aeration resulting in optimum production of sistomycosin obviously depends somewhat on the type of apparatus used, the speed and mode of agitation, the pH, the temperature and other environmental conditions. In any case, the oxygen-containing gas should be supplied at a rate sufficient to maintain a slight positive pressure in the fermentation apparatus and thus avoid the possibility of contamination of the culture by outside air.
In 30 liter tank fermenters an air flow rate of 10-15 liters per minute gives good results when used with a six-blade mechanical impeller of the turbine type having ten centimeters ( four inches) in diameter and rotating at the rate of. 100 to 200 revolutions per minute against four
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25 x 400 mm peripheral vertical baffles. (1 inch by 16 inches).
A wide variety of culture media can be used at the growth stage of the process. These media should contain an assimilable carbon source, proteinaceous material, mineral salts and traces of various nutrients, vitamins and other growth stimulants usually present as impurities in other constituents of the medium. To obtain the optimum production of sistomycosine, the culture medium must also contain a source of fat.
An assimilable carbon source herein includes polyhydric alcohols and mono-, di- and polysaccharides, while the term proteinaceous material includes unmodified proteins and degradation products of proteins, particularly products such as these. 'shaped' by protein hydrolysis These protein degradation products include proteases, peptones, polypeptides, peptides and amino acids.
As sources of assimilable carbon, there can be used a-rabinose, fructose, galactose, maltose, rhamnose, xylose, glycerin, mannitol, rhamnitol, etc. It is also possible to use complex materials based on carbohydrates. carbon such as dextrin starches, fermentation and distillation waste water, grain steep solids, grain steep liquor, dried fermentation residues, etc.
Among the protein materials that can be used in the different media are beef extract, acid-hydrolyzed casein, beef peptone, oilseed soy flour, dried fermentation residues, soybeans soluble in water, defatted and partially hydrolyzed, mixtures of amino acids of natural or synthetic sources, urea, purines, etc. The use of a derivative of oilseed soybean meal or a soy protein derivative as a component of the medium is desirable because it provides a small amount of fat for use by the microorganism.
The main mineral requirements of the medium can be met by adding 0.1 to 0.5% of one or more inorganic salts such as sodium chloride, calcium carbonate, bicarbonate phosphate, monopotassium phosphate. , etc. The other constituents of the nutrient medium, ie vitamins, growth promoters etc., are usually present in sufficient quantities in the most assimilable carbon sources and / or protein materials. impure.
Sistomycosin can be separated from the crude culture mixture by a number of different methods. When using a solid culture medium in the growth phase, the mycelium is extracted with a sistomycosin solvent, such as water, and the extract product is isolated as described above. -after. In the case of liquid cultures, the mycelium is separated, washed appropriately with water and the filtrate and washings are used in the subsequent separation stages.
A process for separating sistomycosin from crude culture liquid or extracts of cultures comprises extracting the solution with a non-target alcohol in water, such as n-butanol, removing the solution. solvent by distillation, extracting the residue with a fat solvent such as chloroform, discarding the extract, extracting the solid insoluble in the. chloroform by du'chloroform- containing about 10% of a lower aliphatic alcohol such as methanol, the extract obtained being poured into an ion exchanger of the inorganic silicate type (Permutite).
The ion exchanger is washed first with chloroform containing gradually increasing concentrations of a lower aliphatic alcohol such as methanol, then the antibiotic is eluted with this alcohol. The alcohol elutriates are evaporated to dryness and the residue is extracted with water. The aqueous extract is filtered, the filtrate is frozen and the ice is separated from the product by vacuum sublimation to obtain the desired antibiotic.
The invention is illustrated by the following examples.
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EXAMPLE 1.
A mixture consisting of 180 gr. of industrial glucose, 180 gr. of a partially hydrolyzed protein derived from soybeans, 90 gr. of grain steeping liquor, 90 gr. of sodium chloride, 18 gr. of calcium carbonate and a sufficient quantity of hot water to bring the volume to 18 liters, in a fermentation apparatus of the type with a 30-liter glass fixed tank, fitted with a stainless steel cap, a propeller-type agitator, four 25 by 400 mm (1 inch by 6 inch) inner baffles and a perforated circular air distribution manifold.
The fermentation apparatus is placed in an autoclave and the contents sterilized with water vapor at 121 ° C. for one hour. The fermentation apparatus and its contents are cooled and then removed from the autoclave. To this medium is inoculated aseptically 900 cm3 of a shaken flask subculture of two hour sptanto of Streptomves viridosporus grown on the same medium as described above and seeded from a medium of Sporulated glucose-tryptone-agar culture of Streptomyces viridosporus.
After inoculation, the culture medium is incubated at 23-27 ° C for eighty-eight hours. During this incubation, sterilized air is introduced through the diffusion manifold at a rate of 15.6 to 17.8 liters per minute, and the agitator is rotated at a speed of approximately 150 revolutions per minute.
Antibiotic production during incubation is monitored by taking samples from time to time and testing them against Candida albicans by the so-called cylinder-plate agar-diffusion method. Antibiotic production is indicated by the diameter in millimeters of the zone of inhibition. The table below illustrates the production of antibiotic obtained by the process described above.
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<tb>
Incubation <SEP> periods <SEP> Inhibition <SEP> of <SEP> Candida <SEP> albicans
<tb>
<tb> in <SEP> hours <SEP> Diameter <SEP> of <SEP> the <SEP> zone <SEP> in <SEP> mm.
<tb>
<tb>
<tb>
40 <SEP> 16.6
<tb>
<tb>
<tb> 47 <SEP> "<SEP> '19, 2 <SEP>, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 64 <SEP> 22.1
<tb>
<tb> 71 <SEP> 21.9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 88 <SEP> 23.4
<tb>
At the end of the incubation period, 25 g are added. per liter of a cilicate filter aid and the culture mixture is filtered. The cake is washed with two 25 cc portions of water per liter of culture mixture, and the washings are added to the main filtrate.
31.64 liters of filtrate or "beer" prepared as described above and yielding 18.5 mm are extracted twice with 10 liters of n-butanol. in the test against Candida albicans at a dilution of 1 to 2. The aqueous solution is discarded and the extracts are concentrated in the dark and in vacuo below 45 ° C. to approximately dryness. bn extract the residue by means of four portions of 50 cm3 and one portion of 100 em3 of chloroform at 40 ° C. and the extracts are discarded. The chloroform insoluble residue is shaken with 300 cm3 of water and filtered to obtain 3.39 g. of solid (Solid A) and a filtrate (Filtrate A).
Filtrate A was frozen and the ice was removed by vacuum sublimation to obtain 3.725 g. of sistomycosin. 500 gammas of this substance in 1 cm3 of water produce 16.8 and 11.5 mm zones of inhibition against Candida albicans. at respective dilutions of 1: 1 and 1: 2. ,
Solid A (3.39 gr.) Is extracted with two 100 cm3 portions and six 150 cm3 portions of water. We filter the extracts, we
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subjected to separate tests, those with similar titers are combined and frozen. The ice is separated from the frozen extracts by sublimation
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: in vacuum to obtain a total of 395 gr, of crude sistornycosin.
The productions and the purity of each of the crude fractions are given in the following table.
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<tb> Weight <SEP> of <SEP> Concentra- <SEP> Results <SEP> of tests <SEP> against <SEP> on
<tb> Solid <SEP> produces <SEP> tion <SEP> of <SEP> pro <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP>
<tb>
EMI11.3
'. '. gross (mg) raw dui t in
EMI11.4
<tb> 'solution <SEP> of <SEP> Dilution <SEP> 1: 1 <SEP> 1: 2 <SEP> Il: 4 <SEP> 1: 8
<tb>
EMI11.5
stock gamma / Diameter mm. inm. nm. nrni.
EMI11.6
<tb> cm3 <SEP> '<SEP> from <SEP> the <SEP> zone
<tb> of inhibi-
<tb>
EMI11.7
tion in mm ..
B. 1623 200 17.1 14.1 10.6 C 1613 '400 20el 17.5 14.4, 12., o D 114 200 7: 5.9 - 11.3 - +
EMI11.8
<tb> E <SEP> 100 <SEP> 330 <SEP> 16.0 <SEP> 13.5 <SEP> 11.6 <SEP>, <SEP> ++
<tb>
<tb> F <SEP> 60 <SEP> 550 <SEP> - <SEP> 13.9 <SEP> 11.9 <SEP> ++ <SEP> +
<tb>
+ Inhibition inside the cylinder.
++ Slight inhibition immediately around the cylinder.
995 mg are extracted. of solid B for 1/2 hour using
199 cm3 of chloroform containing 10% methanol by volume and the mixture is filtered. * The insoluble residue weighs 770.5 mg. The extract is poured onto a chromatographic column containing 21.1 g. of an exchange material based on silicate called "Florisil", previously washed thoroughly with chloroform containing 10% methanol by volume. Mixed solvents which consist of are allowed to percolate through the column in the order given. in chloroform containing 10, 20, 30 and 50% methanol by volume. The elutriates are discarded and 50 cm3 of methanol are poured onto the column. The first methanol elutriate is discarded and 2050 cm3 of methanol are poured in small portions onto the column.
A total of eight fractions are collected, the first five of which are evaporated to dryness in vacuum. The yellow residue is extracted with a total of 35 cm 3 of water, the extract is frozen and taken up. sublimates the ice to obtain 85.4 mgr. of sistomycosin as a pale yellow solid. 400 gammas of this solid, dissolved in one cm3 of water, gives an inhibition zone of 22 mm. in diameter at a 1: 1 dilution in the Candida albicanso test. The other three fractions were combined and evaporated to dryness to give 131.1 mg. sistomycosin as a light yellow solid. 400 gammas of this substance in 1 cm3 of water produce an inhibition zone of 16 mm. at a dilution of 1:
1 in the test against
Candida albicans. By the turbidimetric test method, '7.14 gammas / cm3
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produce 50% inhibition of the growth of Garidida'albicans.
1.435 gr are extracted. of solid material C with 207 cm3 of chloroform containing 10% methanol by volume, for half an hour. The insoluble residue (Solid G) weighs 1.084 gr. The extract is poured into an absorption column containing 32 g. of a silicate-based ion exchange material called "Decalso" previously washed thoroughly with chloroform containing 10% methanol by volume. The following mixed solvents are percolated through the column, in portions of 700 cm 3, in the order given, chloroform containing 10, 20, 30, 40 and 50% methanol by volume.
We reject the percolates. The column is eluted with 840 cc of methanol divided into six portions and the elutriates are combined. We evaporate the
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solution to dryness in vacuo and the residue is extracted with a total amount of 30 cm3 of water. The aqueous extract was frozen and the ice was sublimed under reduced pressure to obtain 107 mg. of sistomycosin as a buff colored solid. This substance gives an inhibition zone of 23.6 mm. at a concentration of 400 gammas / cm3 in the test against Candida albicans.
The column is eluted with five additional 700 cc portions of methanol and the combined extracts evaporated to dryness in vacuo. The residue is extracted with water, the extract is frozen and dried from the frozen state to obtain 85 mgr. sistomycosin as a light yellow solid giving the Candida albicans test an inhibition zone of 20.3 mm. at a concentration of 400 gammas / cm3. In the turbidimeter test, 3.47 gammas / cm3 of the product give a 50% inhibition of the growth of Candida albicans.
The solid G is extracted with chloroform containing 10% methanol, by volume, and the extract is poured onto a chromatographic column containing the ion exchange substance called "Decalso". The column is washed with portions of chloroform containing 10, 20, 30, 40 'and 50% methanol by volume and the washings are discarded. The column is eluted with 600 cc of methanol divided into six equal portions.
Discard the first 50 em3, combine the remaining fractions and evaporate to dryness in vacuum. The residue was extracted with water, frozen, and the ice was sublimed under reduced pressure to obtain 92 mg. pure sistomycosin. When tested against Candida albicans, 400 gammas / cm3 of this light yellow solid produced a zone of inhibition of
23.8 mm. at a dilution of 1: 1. We can produce 60 mgr. additional. sistomycosin by washing the absorption column with more 'methanol' and treating the eluate as described above.
Pure sistomycosin is a neutral organic compound that contains only the elements carbon, hydrogen, nitrogen and oxygen. It does not melt below about 230 C but turns brown at about 130 C.
It rapidly reduced a cold aqueous solution of potassium permanganate and the boiling Benedict's solution. It gives a positive Molisch test for carbohydrates, a negative Beilstein test for halogens and a negative test for ferric chloride. Addition of a very small amount of the antibiotic (1 to 2 mg) to hot concentrated sulfuric acid gives the solution a dark cherry red to chocolate color. No color change occurs when a small amount of the antibiotic is added to hot nitric or hydrochloric acid saturated with thymol.
Sistomycosin, particularly in solutions, undergoes photochemical decomposition on exposure to light. It is decomposed by acids or alkalis but is more stable in neutral or slightly basic solutions, ie having a pH of 7-9, than in solutions with an acid reaction. It is completely stable in water below 25 C and its aqueous solutions can even be heated at 50 C for one hour without losing its antibiotic activity. In aqueous solution at 100 ° C., it retains more than 50% of its antibiotic activity after one hour.
. The ultraviolet absorption spectrum (Figure I) has a maximum in the vicinity of 300 millimicrons and another at 218 millimicrons with a
E1% of 215. The maximum in the neighborhood of 300 millimicrons consists of
1 cm three distinct absorption peaks at 292.5, 306 and 320.5 millimicrons with rpt values of 257, 340 and 295, respectively, and two microns 1% nima located between these peaks at 298 and 314 millimicrons with E1% of 230 and 217 respectively. The main minimum in the UV absorption spectra is 253 millimicrons with an E 11% of 102.
The
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The absorption curve shown in Figure 1 is that obtained in water, but sistomycosin is remarkable in that this spectrum is not appreciably modified by moderate variations in the acidity or base of the substance. solution, i.e. from neutrality to an acidity or basicity of about 0.05 N.
Figure 2 shows the so-called "fingerprint" region of the infrared absorption spectrum of sistomycosin in a neutral mineral oil vehicle. Spikes at or near 6.88 and 7.30 microns are attributable to the mineral oil vehicle. The most intense absorption bands characteristic of sistomycosin are those located at or near 6.34 and 9.44 microns. Bands of weak and moderate intensity are located at or near 7.70; 7.86;
8.55; 11.16; 11, 85 and 12.4 microns with others appearing as shoulders to the previous bands at or near -7.08, 7.16; 8.95;
9.89; 10.25 and -10.6 microns.
Another characteristic band of sistomycosin outside of the "fingerprint" region is found at or near 2.96 microns.
EXAMPLE 2.
A nutrient medium which consists of 5 gr. of industrial glucose, 2.5 gr. of beef extract, 2.5 gr. of peptone, 2.5 gr. of sodium chloride and a quantity of water sufficient to bring the volume to 500 cm 3 is made alkaline to pH 7.7 with a 10 N solution of sodium hydroxide. The medium is placed in a Fernbach flask stoppered with a cotton ball and sterilized under a water vapor pressure of 1.26 Kgr / cm2 (18 lbs) for twenty minutes. The medium is inoculated with 1 cm 3 of a suspension of Streptomyces viridosporus spores originating from a ten-day old glucose-tryp-tone-agar culture medium. The resulting mixture is incubated at 24 ° C. for eight days.
At the end of this time, the culture fluid below the surface mycelium has a pH of 6.8 and produces a zone of inhibition of 22 mm. in diameter when subjected to a sistomycosin test against Candida albicans by the so-called "disc-plate" method. The sistomycosin present in the culture liquid can be separated by the method described in Example 1.
EXAMPLE 3.
A mixture consisting of 180 gr. of industrial grade maltose, 180 gr. of grain steeping liquor, 90 gr. sodium chloride,
36 gr. of bipotassium phosphate and a sufficient quantity of water to form a volume of 18 liters, is placed in a fermentation apparatus of
30 gallons of the type described in Example 1. The pH of the solution is adjusted to 7.5 with a 10 N solution of sodium hydroxide, and 18 gr. of calcium carbonate and sterilize the fermentation apparatus and medium at 250 ° C. for two hours.
The nutrient medium is cooled and aseptically inoculated with 10 cm3 of a Streptomyces viridosporus spore suspension prepared by stirring a seven day old Streptomyces viridosporus glucose-tryptone-agar culture medium with 10 cm3. 0.01% fine soap aqueous solution.
The culture mixture is incubated at 28-29 ° C for 136 hours and during this time the stirrer is rotated at a speed of 150 rpm and air is passed through. , sterile in the. mixing at the speed of 7.2 to 18 liters per minute. At the end of the incubation period, the mycelium is separated from the mixture and the clear culture "beer" is subjected to an assay for its sistomycosin content by the turbidimetric method against Candida albicans. In the experiment described, cultured beer produced 50% inhibition of the growth of Candida albicans at a dilution of 1 to 135.
Sistomycosin present in cultured beer in pure form can be separated using the separation process described in Example 1.
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EXAMPLE 4.
Is introduced into each flask of a series of Erlenmeyer flasks 125 cm3 of a culture medium composed of 0.5% industrial glucose, 0.5% glycerin, 0.3% hydrolyzed casein, 0.25 % peptone, 0.1% brewer's yeast, 0.25% steeping water solids. grain, 0.25% soy flour, 0.25% fermentation residue of butanol-acetone, 0.25% sodium chloride, 0.1% calcium carbonate and water to supplement 100 %.
The vials are covered with cotton wool covered with gauze and sterilized under a pressure of water vapor of 1.26 Kgr / cm2 (18 lbs) for twenty-five minutes, then each vial is inoculated; aseptically, 1 cm3 of a spore suspension of Streptomyces viridosporus prepared from a glucose-tryptone-agar culture medium, seven days old. The vials are shaken on a rotary type shaking machine rotating at 150 revolutions per minute for four days. The temperature is maintained at 22-4 C during the incubation. At the end of the incubation period, the cultured beer has a pH of about 6.4.
In the turbidimetric test between Candida albicans, the cultured beer contains a sufficient amount of sistomycosin to produce a 50% inhibition of the growth of the test organism at a dilution of 1 to 1350
If desired, the culture mixture can be combined and filtered into the vials and the sistomycosin separated by the method described in Example 1.
EXAMPLE 5.
Is introduced into each flask of a series of Erlenmeyer flasks 125 cm3 of a culture medium composed of 1% maltose, 1% grain soaking liquor, 0.2% bipotassium phosphate, 0.5% sodium chloride and water to make up to 100% (adjusted to pH 7.5 with 10N sodium hydroxide solution) and the flasks are sealed with covered cotton wool. gauze. The flasks containing the culture medium are sterilized, inoculated and incubated as described in Example 4. At the end of the incubation period, the mycelium is filtered off and the fluids are combined. or cultured beers.
Cultured beer has a pH of about 6.35 and by applying the turbidimetric method it has been found to contain a sufficient amount of sistomycosin to produce a 50% inhibition of the growth of Candida albicans at a dilution of. 1 to 320. Pure sistomycosin can be separated from cultured beer by the method described in Example 1.
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RE iT ENDIC¯A TI 0 N S .. l.- Process for the production of the antibiotic sistomycosin characterized in that one inoculates a culture medium of Streptomyces viridosporus, one subjects the inoculated medium to the. incubation under aerobic conditions at a temperature of 20 to 35 C for about one to eight days, and the sistomycosin thus produced is separated from the culture mixture.