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La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de 1' antibiotique nommé tétracycline par fermentation. Elle se rapporte particulièrement à la production de cet intéressant antibiotique par culture de microorganismes dans des solutions nutritives et dans des cond- tions aérobies.
La tétracycline est un antibiotique à spectre étendu dont la structure a été indiquée pour la première fois dans une communication au Journal of the Amerio:an Chemical Society, Vol. 74, p.4976(1952), La pré- paration de cet antibiotique par réduction catalytique de la'chlortétra- cycline a également été signalée ( Journal of the American Chemical So- ciety, Vol. 74,p. 4621-23 (1953).
L'antibiotique tétracycline a donc été obtenu par un procédé chimique à partir de chlortétracycline, un produit de fermentation, mais des avantages certains s'attachent à la production directe de tétracycline par un procédé de fermentation. Ce procédé élimine évidemment le besoin appareils de traitement chimique pour l' hydrogénation de la chlortétra- cycline. En outre, il supprime le catalyseurd' hydrogénation très couteux et les dangers inhérents aux procédés d' hydrogénation.
On a trouvé que des souches de microorganismes du genre Strep- tomyces ; cultivées en milieu nutritif dans des conditions aérobies donnent l' antibiotique nommé tétracycline. Pour que les nouvelles souches de Strep- tomyces ( dont 1-' espèce n' a pas encore été déterminée) puissent servir de comparaison, on en a déposé des cultures à l' American Type Culture Collection, 2029 M Street, N.W.Washington D.C. et on les a ajoutées à la collection de microorganismes sous les numéros ATCC 1652, 11653 et 11654. Dans la collec- tion de cultures de Chas. Ptizer & Co. Inc., ces organismes sont identifiés par les numéros J-9618 ,K-6030-1 et K-6030-4 respectivement.
Les caractéristiques de culture de ces microorganismes sont indiquées dans les tableaux ci-dessous. Ls couleurs lorsqu'elles sont suivies d'un R sont celles de l'ouvrage de Ridgway, Color Standards and Nomenclature.
TABLEAU 1.
ATCC 11652. CaractéristiQues de culture.
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<tb> Agar <SEP> lation <SEP> nulle <SEP> sporulations; <SEP> mycélium <SEP> végé-
<tb> à <SEP> blanc <SEP> à <SEP> tatif <SEP> chamois, <SEP> à <SEP> cannellegris <SEP> brunâ- <SEP> chamois <SEP> à <SEP> cannelle-rosé
<tb> tre <SEP> à <SEP> gris <SEP> (Chamois <SEP> clair <SEP> (R) <SEP> à <SEP> Cannellesouris <SEP> (Blanc <SEP> chamois <SEP> (R), <SEP> à <SEP> Saumon <SEP> ocré
<tb> à <SEP> cannelle- <SEP> clair <SEP> (R);
<SEP> sur <SEP> les <SEP> colonies
<tb> brun <SEP> clair <SEP> sporulées <SEP> gouttelettes <SEP> limpi-
<tb> (R) <SEP> à <SEP> Gris <SEP> des, <SEP> incolores <SEP> et <SEP> surface <SEP> présouris <SEP> (R); <SEP> sentant <SEP> de <SEP> petites <SEP> dépressions
<tb> sur <SEP> verre <SEP> à <SEP> dues <SEP> au <SEP> séchage <SEP> des <SEP> gouttevitre <SEP> sporu- <SEP> lettes, <SEP> envers <SEP> chamois <SEP> clair
<tb> lation <SEP> humi- <SEP> ou <SEP> saumon <SEP> orangé <SEP> à <SEP> brun <SEP> gride <SEP> noire) <SEP> sâtre <SEP> ou <SEP> fauve <SEP> Chamois <SEP> clair
<tb> (R) <SEP> ou <SEP> presque <SEP> Cannelle <SEP> brun
<tb> (R)) <SEP> ; <SEP> spores <SEP> en <SEP> spirales <SEP> peu
<tb> serrées, <SEP> courteset <SEP> cylindriques, <SEP> 0,99-1,32 <SEP> x <SEP> 0,66 <SEP> .
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EMI2.1
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<tb> cannelle-chamois, <SEP> envers
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<tb> Agar <SEP> Gris <SEP> souris
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<Desc/Clms Page number 5>
TABLEAU II
EMI5.1
ATCC 11653 , arac,éristictues de culture,
EMI5.2
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb>
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<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
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<tb> Dresde <SEP> (R) <SEP> , <SEP> envers <SEP> jaune
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<tb> orange <SEP> avec <SEP> une <SEP> légère <SEP> ombre
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<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb> dévelop- <SEP> sporulapement <SEP> tion.
<tb>
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Agar <SEP> Faible <SEP> Aucun <SEP> Jaune <SEP> Surface <SEP> lisse <SEP> et <SEP> cireuse
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EMI6.2
convnlutions radiales
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<tb> Agar <SEP> modéré <SEP> Dans <SEP> diffé- <SEP> Jaune <SEP> Mycélium <SEP> végétatif <SEP> brun
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<tb> Mor- <SEP> Modéré <SEP> Aucun <SEP> Rose <SEP> Surface <SEP> brillante, <SEP> avec <SEP> con-
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<tb> ceaux <SEP> pourpre <SEP> volutions <SEP> en <SEP> labyrinthe <SEP> très
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<tb> de <SEP> pâle <SEP> petites <SEP> à <SEP> petites;
<SEP> mycélium
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<tb> de <SEP> Brun <SEP> jaune <SEP> crème <SEP> à <SEP> jaune <SEP> moutarde
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<tb> terre <SEP> Sorgho <SEP> (Blanc <SEP> Crème <SEP> à <SEP> presque
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(R)) Chamois " Colonialtt(R) à
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<tb> Jaune <SEP> Miel <SEP> (R) <SEP> ) <SEP>
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<tb> Plaques <SEP> Modéré <SEP> Mycélium <SEP> Aucun <SEP> Mycélium <SEP> végétatif <SEP> blanc <SEP> à
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<SEP> envers <SEP> blanc
<tb> rulation <SEP> sur <SEP> les <SEP> bords, <SEP> verdâtre
<tb> gris <SEP> souris <SEP> gris <SEP> au <SEP> centre <SEP> ( <SEP> presque <SEP> Gris
<tb> clair <SEP> à <SEP> Verdâtre <SEP> terne <SEP> (R); <SEP> zone <SEP> de
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<tb> à <SEP> presque <SEP> rose);
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EMI6.6
noir) petites dépressions prove-
EMI6.7
<tb> nant <SEP> de <SEP> gouttes <SEP> -de <SEP> liquide
<tb>
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb>
<tb>
<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb>
<tb>
<tb> dévelop- <SEP> sporula-
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<tb> rulation <SEP> différen- <SEP> relief;
<SEP> mycélium <SEP> végétatif
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<tb> Bouillon <SEP> gris <SEP> souris <SEP> Ocré <SEP> (R) <SEP> à <SEP> presque <SEP> Brun
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<tb> (entre <SEP> Gris <SEP> de <SEP> Prout <SEP> (R))
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<tb> Souris <SEP> clair
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<tb> d' <SEP> brun <SEP> clair <SEP> (entre <SEP> jaunâtre <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> gri-
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<tb> Emerson <SEP> puis <SEP> brun <SEP> gri- <SEP> Terre <SEP> de <SEP> sâtre(Brun <SEP> Buckthorn <SEP> (R)
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<tb> Sépia <SEP> Chaud <SEP> tique <SEP> (R) <SEP> ) <SEP> à <SEP> brun <SEP> grisâtre <SEP> (Bronze <SEP>
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<tb> (R) <SEP> à <SEP> Brun <SEP> Médaille <SEP> (R) <SEP> et <SEP> Orange <SEP> de
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<tb> Benzo <SEP> (R)) <SEP> Zinc <SEP> (R) <SEP> à <SEP> erre <SEP> d'Ombre
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<tb> crue <SEP> (R)
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<tb> Aspara- <SEP> Bon <SEP> Sporulation <SEP> Brun <SEP> ver- <SEP> Envers <SEP> presque <SEP> Brun
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<tb> gine <SEP> blanc <SEP> à <SEP> jaune <SEP> dâtre <SEP> et <SEP> Buckthorn <SEP> (R)
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<tb> Extrait <SEP> pâle <SEP> à <SEP> gris <SEP> jaunâtre
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<tb> de <SEP> à;
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<tb> Dextrose <SEP> Jaune <SEP> Paille <SEP> (R) <SEP> et <SEP> cou-
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TABLEAU III ATCC 11654, Caractéristiques de culture.
EMI7.2
<tb>
Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques.
<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb> dévelop- <SEP> aporul@pement <SEP> tion
<tb>
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<tb> Glucose <SEP> bon <SEP> Aucun <SEP> Brun <SEP> grisâ- <SEP> Surface <SEP> cireuse, <SEP> modérétré <SEP> à <SEP> oli- <SEP> ment <SEP> à <SEP> fortement <SEP> méruve <SEP> brunâ- <SEP> liolde <SEP> dans <SEP> différents
<tb>
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb>
<tb>
<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb>
<tb>
<tb> dévelop- <SEP> sporula-
<tb>
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<tb> pement <SEP> tion
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<tb> tre <SEP> dans <SEP> dif- <SEP> tubes;
<SEP> mycélium <SEP> végéta-
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EMI9.1
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<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigmept <SEP> Remarques
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<tb> Sur <SEP> les <SEP> plaques <SEP> de <SEP> dilu-
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<tb> sans <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> ou
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<tb> avec <SEP> de <SEP> petites <SEP> zones <SEP> dis-
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<tb> lium <SEP> aérien <SEP> ni <SEP> sporula-
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<tb> tions <SEP> radiales <SEP> devenant
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<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb> Milieu <SEP> Impor- <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb>
<tb> tance <SEP> du <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb>
<tb> dévelop- <SEP> sporula-
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<tb> pement <SEP> tion
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méruUo5:
des aux bords,
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<tb> un <SEP> mycélium <SEP> végétatif
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<tb> et <SEP> un <SEP> envers <SEP> presque
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<tb> incolore <SEP> à <SEP> chamois <SEP> clair
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<tb> ou <SEP> chamois <SEP> rosé; <SEP> plu-
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<tb> sieurs <SEP> colonies <SEP> à <SEP> mycélium
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<tb> végétatif <SEP> orange <SEP> et <SEP> en-
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<tb> vers <SEP> brun <SEP> orange, <SEP> surface
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<tb> cireuse <SEP> et <SEP> lisse <SEP> ou <SEP> bords
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<tb> Lait <SEP> Faible <SEP> Anneau <SEP> blanc <SEP> Jaune <SEP> Le <SEP> lait <SEP> coagule;
<SEP> peptonisa-
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<tb> écrémé <SEP> à <SEP> crémeux <SEP> à <SEP> grisa- <SEP> tion <SEP> nulle <SEP> à <SEP> très <SEP> faible
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<tb> modéré <SEP> jaune <SEP> terne <SEP> tre <SEP> dans <SEP> différents <SEP> tubes;pH
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<tb> clair <SEP> jaune <SEP> terne <SEP> passe <SEP> de <SEP> 6,3, <SEP> à <SEP> 6,8.
<SEP> Faible
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<tb> bords <SEP> supé-
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<tb> presque <SEP> Jaune
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<tb> (R), <SEP> bords
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<tb> Brun <SEP> Cannelle
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<tb> (R));
<SEP> ni <SEP> mycé-
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<tb> lium <SEP> aérien,
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<tb> ni <SEP> sporula-
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<tb> menta- <SEP> glucose;
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<tb> formation <SEP> de <SEP> gaz.
<tb>
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On notera que la présente invention s' étend non seulement à 1' emploi d' organismes répondant aux descriptions données ci-dessus à
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titre d' exemple, mais également à 1' emploi de produits de mutatioir obtenus à partir des organismes décrits par différents moyens , par exem- ple les rayons X, les- rayons ultraviolets,, les gaz azotés,etc..
EMI12.2
Les souches de Streptomyces produisant la tétracycline peuvent être conservées sur des supports d' agar d' Emerson ou sur d' autres milieux appropriés, ou bien les organismes peuvent être séchés à partir de la forme congélée pour être ranimés ultérieurement.
Des cultures sur supports ou des préparations séchées par congélation peuvent être ajoutées à des milieux nutritifs stériles en petits flacons pour la préparation de petites quanti- tés de l' antibiotique ou pour préparer assez des microorganismes pour ensemencer des quantités plus importantes de milieux nutritifs. En général le milieu de fermentation doit contenir une source d' hydrate de carbone et une -source d' azote, de préférence sous forme organique. Divers sels
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métalliques cnt-également une certaine valeur, parce qu'ils stipulent la production de l' antibiotique, mais l' emploi d' eau de ville fournit souvent assez de ces métaux pour obtenir un développement approprié: Par- mi les sources d' hydrate de carbone utiles on peut compter la mélasse, le glucose, les amidons; le glycérol, etc..
Les sources d' azote organique comprennent la farine de soya, le gluten de blé, la farine d' arachide, les produits d' hydrolyse de la caséine et d' autre s protéine s etc... Cer- .taines matières brutes contiennent des substances stimulant le développe- ment qui sont intéressantes pour obtenir des rendements maximum en anti- biotique. Ce sont notamment la liqueur de fermentation du blé, les produits solubles de distillation, l' extrait de levure, etc.. Les sels tels que le chlorure de sodium, le nitrate de sodium, le phosphate de potassium et le sulfate de magnésium ont également une certaine valeur.
Bienque les orga-
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nismes n' aient pas tendance à changer appréclablement le PH du milieu pendant leur développement, 1' emploi d'un agent tampon comme le carbonate de calcium a une certaine valeur;Si le milieu a tendance à mousser pendant le développement des organismes en conditions aérobies submergées, l' addition d' huiles comme l' huile de saindoux, l' huile de soya, etc... peut etre recommandable.
Gomme on l' a indiqué plus haut, la culture aérobie submergée des
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souches choisies de S treptowaes est surtout utile dans la production à gran- de échelle de l' antibiotique nonne tétracyaline. Pour effectuer cette pré- paration, il est nécessaire d' aérer le mélange de fermentation au mayen ' air stérile à raison d' au moins 1/2 volume d'air par volume de milieu par minute. Des quantités plus élevées sont parfois plus satisfaisantes. Ces conditions et d' autres varient dans une certaine mesure suivant la sou-
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che d' organisl#.S utilisée, le type de récipient de réaction, le type d' agitateur et ainsi de suite. Il est recommandable d' utiliser n agitateur dans le récipient de fermentation pour favoriser un bon contact entre l' air et le milieu.
EMI12.7
La culture des souches de S treptomyce s produisant la tétracycline prend de 2 à 6 jours lorsqu'elle s' effectue en flacons. Toutefois, le temps
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moyen nécessaire pour atteindre la, puissance maximum est apgréciablement plus court lorsque on utilisé une fermentation.aérobie- agitée e-t submergée.
Des quantités appréciables d' antibiotique, sont souvent formées en l' es- pace d'un jour et dans de nombreux case la production maximum; d' antibioti- que s' obtient en deux jours environ. Il est évidemment essentiel que le milieu utilisé et tous les appareils soient soigneusement stérelisés avant
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1' ensemencement-avec la souche choisie de microorganisme.. Pendant toute la durée de la fernentation ; les précautions connues doivent être- prises pour que des microorganismes contami.nants ne puissent troubler la fermentation.
Le présent procédé de- fermentation peut être effectué à une tem-
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pérature d' environ 25 à environ 30 C. La température apti=ia semble être environ 28 C. Pour amorcer une fermentation à grande échelle, il est re- commandable d' inoculer les mLlieux de fermentation stérilisés-préparés
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au moyen d' environ 1 à 10 % en volume d'une culture d'une souche de Strep- tomyces produisant la tétracycline fraîchement préparée.
L'activité antibiotique des produits obtenus à;partir des sou- ches de Streptomyces décritesci-dessus peut êtredéterminée par desmétho- des d' essai microbiologiques standard pour antibiotiques avec divers mi- croorgani sme s . Diversesmesures physiquespeuvent être également utilisées pour déterminer la teneur en antibiotique d'un échantillon donné, par exemple l'absorption de rayons ultraviolets à certaines longueurs d'onde ou l'absorption de rayons infra-rouges. La tétracycline amphotère anhydre pure cristallisée est prise comme standard de comparaison avec une puissance de 1.000 mcg/ mg; La chromatographie sur papier est particulièrement utile pour déceler et déterminer la teneur en tétracycline de matièresbrutes et de produits plus purs.
Bienque -le bouillon de fermentation brut formé par culture dans des milieux nutritifs en conditions aérobies des nouvelles souches de Streptomyces produisant de la tétracycline ait une valeur appréciable par lui-même, par exemple à titre d' addition aux aliments pour animaux ou pour stimuler la croissance des plantes, il est souvent plus intéres- sant de séparer l' antibiotique sous forme de matière sèche soit à l'état brut soit à l'état purifié. Diverses méthodes peuvent être utilisées à cette fin. Par exemple le bouillon tout entier, avant ou après filtrage du mycélium peut être séché à partir de l'état congelé pour fournir un produit brut contenant des quantités appréciables d' antibiotique.
Il est conseillé d' effectuer cette opération de sèchage à un pH qui n' est ni trop acide ni trop basique, parce que l' antibiotique peut être dégradé par ce traitement.
L'antibiotique nommé tétracycline peut être séparé du bouillon de fermentation par différents procédés. Il est recommandable, avant d' appliquer ces.procédés de séparer le mycélium, de l' ensemble du bouil- lon par filtration. La quantité maximum d' antibiotique est obtenue dans le filtrat aqueux si le mélange est réglé à un pH d' environ 2 à 3 par un acide fort-(acide chlorhydrique, acide sulfurique,acide phosphorique,etc..) -avant la filtration. Bien qu'une élévation modérée de le température puisse faciliter la coagulation d'une partie des impuretés finement divi- sées et donner ainsi un filtrat plus propre , leshautes températures doi- vent être évitées.
Il ;peut avoir une certaine destruction de l' activité antibiotique à ce pH (2 à 3) si la solution est chauffée' à plus de 40 C environ ou si la solution est maintenue à ce pH pendant un temps. considérable.
Pour séparer le mycélium du bouillon de fermentation par filtra- tion,on peut utiliser différents auxiliaires de filtration et particuliè- rement ceux qui contiennent de la terre d' infusoires. Le filtrat peut être ensuite séché ou soumis à de nouveaux procédés de séparation pour le puri- fier. Un procédé utile pour la séparation de la tétracycline des bouillons de fermentation consiste à ajouter certai@s ions métalliquespolyvalents, de préfé- rence sous la forme de sels solubles dans l'eau de ces métaux.
Bien qu' une certaine proportion desmétaux puisse être présente dans le bouillon de fermentation, particulièrement du calcium lorsqu'on utilise du carbonate de calcium comme agent tamponµ cette quantité est souventin suffisante pour précipiter des proportions importantes d'antibiotique lorsque le bouillon est rendu basique.
La précipitation, est obtenue après addition des sels métalliques nécessaires par réglage du pH à une valeur légèrement alcaline En général, un pH.de 7,5 à 9 environ convient le'mieux. L'emploi de plus d'un agent de précipitation métallique polyvalent est recommandable, parce que les produits complexes formés dans le bouillon de fermentation avec une combinaison de cesmétaux sont souvent beaucoup moins solublesque dans le cas d'un seul ion métallique polyvalent. Parmi les métaux les plus utiles pour précipiter l'antibiotique on compte le baryum, le calcium, le magnési- um, le strontium, le béryllium, le mercure, le cadmium et d' autres ions métalliquespolyvalents; particulièrement ceux du. groupe 2 du Tableau Périodique des Eléments.
Comme on l' a indiqué plus haut, une combinaison
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de deux ou de plusieurs de ces métaux est souvent plus efficace qu'un seul métal.
Le précipité complexe d' antibiotique et d'ions métalliques avec d'autres éléments du bouillon de fermentation peut être séparé de la solution restante par filtration, par centrifugation ou par d'autres procédés approprié s. Le produit peut être ensuite lavé avec un petit volume d' eau pour éliminer la li@ueur de fermentation résiduelle qui contient peu d' antibiotique et le produit brut peut être alors séché et utilisé à certaines fins si les ions polyvalents utilisés sont relativement non toxiques, comme le calcium et la magnésium par exemple. En variante, le produit brut, sous forme humide ou sèche, se laisse transformer en une fonne purifiée d'antibiotique amphotère par traitement du produit précipité par un agent précipitant sélectivement les ions métalliques utilisés.
C' est ainsi que 1' on utilise le calcium et le baryum comme métaux, le produit peut ;être traité par une solution diluée d' acide sufurique pour obtenir un précipité de sulfates de calcium et de baryum et une solution aqueuse de l' antibiotique. Par filtrage de la matière solide précipitée, on sépare la solution d' antibiotique Apres réglage du pH pour éviter la décomposi- tion de l'antibiotique, on peut utiliser la solution concentrée telle quel- le dans diverses applications ou la faire sécher. En rendant le pH légèrement alcalin, on peut séparer une forme plus pure de tétracycline amphotère de la solution aqueuse concentrée obtenue de cette manière.
Ce produit a gé- néralement une pureté suffisante pour qu'on puisse le cristallier par des procédés qui ont été décrits dans certaines des publications antérieures mentionnées plus haut.
Un second pocédé qu'on peut utiliser pour séparer la tétra- cycline du bouillon fermentation comprend l'extraction de l' antibiotique à un pH fortement acide ou légèrement alcalin dans certains solvants organi- ques immiscibles à 1' eau. En général, cette extraction peut être effectuée à un pH d'environ 1 à 2,5, ou à,un pH d' environ 7,5 à10. Plusieurs sol- vants organiques polaires, immiscibles à l'eau peuvent être utilisés à cette fin. Ce sont notamment des solvants alcooliques comme les butanols, les pentanols, etc.., ainsi que des alcools substitués comme 1' alcool benzylique, 1' alcool phényléthylique et certains éthers de glycols comme le phénylcellosolve; des cétones immiscibles à l'eau comme laméthyl-isobutyl- cétone,dès esters comme l'acétate d' amyle, l'acétate de propyle, le propionate d' éthyle, etc..
On a trouvé utile d' ajouter au bouillon de fermentation filtré avant l' extraction et particulièrement aux pH alcalins, un agent de séquestration des ions métalliques polyvalents . Ces agents comprennent les polyphosphates, divers hydroxy-acides comme l'acide gluco- nique; l'acide citrique,,!' acide tartrique, etc.. et des amino-acides comme l'acide éthylène-diamine-tétraacétique. On évite ainsi l'extraction des ions métalliques polyvalents sous forme de complexes avec la tétracycline et d autres éléments du bouillon de fermentation.
L'extraction peut être effectuée par des procédés statiques ou par extraction continue à contrecourant. Un procédé particulièrement utile pour l'extraction comprend 1' emploi de 1' appareil connu dans 1' indus- trie sous le,nom d' extracteur de Podbielniak. En général, un volume de - solvant d'au moins environ 1/10 du volume de la solution aqueuse de l' anti- biotique est utilisé. Des rapports de solvant appréciablement plus élevés peuvent être nécessaires si le solvant choisi n' a pas l' efficacité maxi- mum ou si l'appareil utilisé n'arrive pas rapidement à 1' équilibre de ré- partition.
Lorsque 1' extraction est achevée les phases de solvant peuvent etre combinées à l'antibiotique peut être séparé soit par l' évaporation complète du solvant ou par évaporation partielle du solvant et extraction de l'antibiotique dans un petit volume d'un acide en solution aqueuse diluée de préférence un acide Binerai. Le concentré ainsi obtenu peut être utilisé pour diverses applications. Le produit peut être précipité par règlage du pH du concentré aqueux à une valeur faiblement alcaline, par exemple envi- roi) 7,5. La tétracycline ainsi obtenue peut être employée dans certaines
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applications thérapeutiques ou peut être cristallisée.
Un autre procédé de séparation de la tétracycline du bouillon de fermentation préparé comme décrit ci-dessus comprend l' emploi de cer- taines bases organiques comme agent de précipitation. Les bases organi- ; ques à poids moléculaire élevé ayant une faible solubilité dans l' eau sont particulièrement utiles.
En particulier les substances telles qu'un sel d' ammonium quaternaire à poids moléculaire élevé, par exemple des halogénuresd' alkyl-triméthyl- ammonium en 08 à C18; des halogénuresd' alkyl-diméthyl-benzyl-ammonium en 08 à 018;des imidazolines substituées @ par une chaîne alkyli que longue , desalkyl-amines à chaîne longue, primai- res secondaires ou tertiaires, et plusieurs autres substances basiques or- ganiques.Ces agents de précipitation semblent former des complexes conte- nant non seulement l' antibiotique, mais également certains autres éléments normalement présents dans les sels préparés. Ces éléments peuvent compren- dre de petites quantités de métaux polyvalents et de substances organi- ques.
Après addition de la matière de base organique au bouillon de fer- mentation de tétracycline filtré, on règle le pH du mélange de préférence par un alcali soluble eomme l' hydroxyde de sodium, à une valeur légèrement basique , c' e st-à-dire 8 à 9,5 environ.Le produit qui précipite peut être séparé par filtration, de préférence après une courte période d' agitation. On obtient un produit un peu plus pur si le bouillon de tétra- cycline filtré et acidifié est traité par un agent de séquestration par exemple un des agents énumérés plus haut, avait d' ajouter le précipitant basique organique.
Le produit obtenu par précipitationpar une base organiqueà poids moléculaire élevé comme récrit plus haut peut être transformé en un pro- duit contenant des sels de tétracycline, ou en tétracycline amphotère.
On y arrive le plus simplement en dissolvant le précipité dans un solvant organique polaire à bas poids moléculaire comme le méthanol.L' addition d'une solution concentrée d'un acide minéral, par exemple de l'acide chlo- rhydrique concentré donne du clorhydrate de trétracycline qui peut cristal- liser ou précipiter si l' on a utilisé une solution suffisamment concentrée
Les complexes basiques organiques de tétracycline ont également une valeur appréciable, par exemple comme agents anti-bastériens industrielso
Un autre procédé pour séparer l'antibiotique consiste à mettre en contact le bouillon de'fermentation acidifié après filtration du mycéli- um avec certains colorants acide aryl-azo-sulfoniques.
On obtient ainsi la précipitation .d'un complexe du colorant dont on peut séparer l' anti- biotique par des procédés analogies à certains procédés décrits plus haut.
Par exemple, le mélange peut être dissous dans un solvant organique polaire à poids moléculaire peu élevéo Le règlage du pH à une valeur légèrement alcaline provoque la précipitation de la tétracycline amphotère si l'on utilise une solution suffisamment concentrée.
En plus des procédés de séparation décrits ci-dessus, l' anti- biotique peut etre obtenu sous-une forme partiellement purifiée en mettant en contact le bouillon de fermentation avec un adsorbant comme le charbon activé, les terres actives et d' autres matières de cette nature. L' ad- sorption peut être effectuée à un pH d'environ 3 à environ 8 et l' anti- biotique adsorbé peut être utilisé tel quel pour enrichir des aliments pour les animaux ou pour d'autres applications analogueso En variante, la té- tracycline peut être séparée de l' adsorbant par élution, par exemple par un acide en solution aqueuse diluée ou par une solution diluée d ' un a- cide fort dans un solvant polaireo Ainsi obtenue , on peut 1' utiliser sans autre transformation ou la purifier davantage, par exemple par les procédés qu ' on a énumérés plus haut.
L ' antibiotique peut être adsorbé à partir du bouillon de fermentation sur certains types de résines d' échange d' ions,particulièrement les résines fortement acides comme les résines d' échange d'ions à le acide aulfonique, par exemple le Dowex 1.
L' adsorption s 'effectue le mieux à un pH de 3 à 8 environ
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et le produit peut être utilisé tel quel dans certaines applications ou bien là tétracycline peut être séparée par élution, par exemple au. moyen d'un alcali dilué.
Dans tous ces.procédés de séparation;on peut obtenir de la manière suivante la séparation de la tétracycline de sous-produits antibio- tiques de la fermentation: On forme d' abord une préparation aqueuse de la tétracycline brute obtenue par l' un ou l'autre des différents procédés de séparation décrits plus haut.Cette.solution est ensuite acidifiée et soumise à l'extraction par un solvant organique immiscible à 1 ' eau, particulièrement des alcools inférieurs comme le butanol, l' isobutanol, les pentanols, les hexanols etc..
l' extraction étant achevée, les extraits par le solvant organique sont réglés à un pH pratiquement neutre et la tétracycline libre peut être alors précipitée sous forme de base en agitant le mélange ou en le laissant reposer pendant plusieurs heures La tétracy- cline ainsi précipitée peut être séparée par filtration et soumse à une nouvelle purification par recristallisation.
Les exemples qui suivent sont donnés à titre d' illustration Et ne sont pas les seules formes d'exécution de l' invention.
EXEMPLE 1.-
On rince à l'eau stérile une culture de Streptomyces n ATCC 11652 sur support d' agar d' Emerson dans un flacon contenant 100 cm3 de milieu nutritif stérile de la composition suivante:'
EMI16.1
<tb> Matière <SEP> Grammes
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> 4,0
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,3
<tb> 100 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> de <SEP> ville
<tb>
On remplit une série de flacons de ce milieu, on les stérilise on les inocule et ons les incube à 28 C. en les agitant continuellement Après 6 jours on utilise un de ces flacons pour inoculer 2 litres du même milieu dans un -récipient métallique de 3 litres équipé pour la fermenta- tion aérobie submergée dans des conditions stériles.
Le mélange est agité et aéré à raison d' environ 1 volume d'air par volume de milieu par minute à une température de 28 C pendant 3 jours. On réunit les mélanges de fermentation de 10 de ces fermentations et on règle le pH 2,5 par de l'acide chlorhydrique à;la température ordinaire. Le mycélium est filtré avec addition d'un auxiliaire de filtration à bae de terre d' infusoires.
Le filtrat est réglé au pH 7,5 et extrait deux fois par 1/4 de volume de butanol. Les phases de butanol sont combinées et concentrées dans le vi- ' de à un volume de 1500 cm3.Le concentré de butanol est alors extrait par approximativement 200 cm3 d'eau réglée au pH 1,9 par de l'acide chlorhy- drique. Cette extraction est répétée avec le même volume d'eau acidifiée.
Les extraits aqueux combinés sont réglés au pH 7,5 par de l' hydroxyde de sodium dilue et le produit brut contenant de la tétracycline amphotère est séparé par filtration avec addition d'un auxiliaire de filtration à base de terre d'infusoires. La matière est soumise à une nouvelle purifi- cation pour obtenir 'de la tétracycline amphotère cristallisée. t EXEMPLE 11.-
On lave à l' eau stérile 'une culture de Streptomyces n ATCC 11653 sur un support d' agar d' Emerson dans 100 cm3 d'un milieu préparé à partir des matières suivantes: farine de soya, produit d' hydrolyse de la caséine, mélasse de betteraves, liqueur de macération du blé,et eau de ville. Le milieu inoculé est agité dans un agitateur à 28 C pendant 5 jours.
La culture obtenue de cette manière est utilisée pour inoçuler 2 litres d'un milieu stérile ayant la même composition que dans l' exemple ci-dessus.Le mélange est aéré et agité à 28 C pendant 3 jours. L' anti- biotique' brut est séparé après filtration par addition de chlorures de baryum et de magnésium et règlage du pH à 9 environ. Le produit précipité
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est filtré, lavé dans un petit volume d'eau et transformé en un concentré aqueux par traitement par de l'acide sulfurique dilué et filtration. Le -règlage du filtrat au pH 8,0 par de l' hydroxyde de sodium dilué provoque la séparation d'un produit antibiotique plus,pur qui ,après une nouvelle purification , donne la tétracycline amphotère cristallisée.
EXEMPLE 111.-
On rince à l'eau stérile une culture de Streptomyces n ATCC 11654 sur support d' agar d' Emerson dans un flacon contenant 100 cm3 de milieu nutritif stérile de la composition suivante;
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<tb> Matière <SEP> Grammes
<tb>
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<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> : <SEP> 4,0
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<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,3
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<tb>
<tb> 100 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> de <SEP> ville
<tb>
On remplit une série de flacons de ce milieu, on les stérilise on les inocule et on les incube à 28 C en les agitant continuellement.
Après 6 jours, on utilise un de ces flacons pour inoculer 2 litres du même milieu dans un récipient métallique de 3 litres équipé pour la fermentation aérobie submergée dans des conditions stérileso Le mélange est agité et aéré à raison d'environ1 volume d' air par volume de milieu par minute à une tempé- rature de 28 C pendant 3 jours. Le milieu de fermentation de 10 de ces fermentations est réuni et réglé au pH 2,5par de l'acide chlorhydrique à la température ordinaire. Le mycélium est filtré avec 1' aide d'un auxiliaire de filtration à base de terre d'infusoires. Le filtrat est réglé au pH 7,5 et extrait deux fois par 1/4 de volume de butanol.
Les phases de butanol sont combinéeset concentréessous vide à un volume de 1500 cm3? Le concentré de butanol est alors extrait par approximativement 200cm3 d' eau réglée au pH 1,9 par de l'acide chlorhydrique. Cette extraction est répétée avec le mené volume d' eau acidifiée. Les extraits aqueux combinés sont réglés au pH 7,5 par de 1' hydroxyde de sodium dilué et le produit brut contenant de la tétracycline amphotère est filtré avec addition d'un- auxiliaire à base de terred'infusoires. La matière est soumise à une nou- velle purification pour obtenir la tétracycline amphotère cristallisée.
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The present invention relates to a process for preparing the antibiotic called tetracycline by fermentation. It relates particularly to the production of this interesting antibiotic by culturing microorganisms in nutrient solutions and under aerobic conditions.
Tetracycline is a broad spectrum antibiotic, the structure of which was first reported in the Journal of the Amerio: an Chemical Society, Vol. 74, p.4976 (1952). The preparation of this antibiotic by catalytic reduction of chlortetracyclin has also been reported (Journal of the American Chemical Society, Vol. 74, p. 4621-23 (1953). ).
The antibiotic tetracycline has therefore been obtained by a chemical process from chlortetracycline, a fermentation product, but there are definite advantages attached to the direct production of tetracycline by a fermentation process. This process obviously eliminates the need for chemical processors for the hydrogenation of chlortetracyclin. In addition, it eliminates the costly hydrogenation catalyst and the dangers inherent in hydrogenation processes.
It has been found that strains of microorganisms of the genus Streptomyces; grown in a nutrient medium under aerobic conditions yield the antibiotic called tetracycline. In order that the new strains of Streptomyces (of which the species has not yet been determined) could serve as a comparison, cultures of them were deposited at the American Type Culture Collection, 2029 M Street, NWWashington DC and. they have been added to the collection of microorganisms under ATCC numbers 1652, 11653 and 11654. In the culture collection of Chas. Ptizer & Co. Inc., these organizations are identified by the numbers J-9618, K-6030-1 and K-6030-4 respectively.
The culture characteristics of these microorganisms are shown in the tables below. The colors when followed by an R are those from Ridgway, Color Standards and Nomenclature.
TABLE 1.
ATCC 11652. Culture characteristics.
EMI1.1
<tb>
Medium <SEP> Impor <SEP> - <SEP> Mycelium <SEP> Pigment <SEP> Remarks.
<tb> tance <SEP> of the aerial <SEP> <SEP> and <SEP> soluble.
<tb> development <SEP> sporula <SEP> pement, <SEP> tion.
<tb>
<tb>
<tb>
Glucose <SEP> Moderate <SEP> Mycelium <SEP> None <SEP> Colonies <SEP> in <SEP> relief; <SEP> surface
<tb> Aspara- <SEP> aerial <SEP> rare <SEP> waxy <SEP> and <SEP> to <SEP> convolutions <SEP> in
<tb> gine <SEP> white; sporu- <SEP> labyrinth <SEP> in <SEP> the absence <SEP> of
<tb> Agar <SEP> null <SEP> lation <SEP> sporulations; <SEP> mycelium <SEP> vegeta-
<tb> to <SEP> white <SEP> to <SEP> tatif <SEP> buff, <SEP> to <SEP> cinnamongrey <SEP> brownâ- <SEP> buff <SEP> to <SEP> cinnamon-rosé
<tb> tre <SEP> to <SEP> gray <SEP> (Chamois <SEP> light <SEP> (R) <SEP> to <SEP> Cannellesouris <SEP> (White <SEP> chamois <SEP> (R) , <SEP> to <SEP> Salmon <SEP> ocher
<tb> to <SEP> cinnamon- <SEP> clear <SEP> (R);
<SEP> on <SEP> the <SEP> colonies
<tb> brown <SEP> light <SEP> spore-forming <SEP> droplets <SEP> limpi-
<tb> (R) <SEP> to <SEP> Gray <SEP> des, <SEP> colorless <SEP> and <SEP> surface <SEP> preset <SEP> (R); <SEP> feeling <SEP> from <SEP> small <SEP> depressions
<tb> on <SEP> glass <SEP> to <SEP> due <SEP> to the <SEP> drying <SEP> of the <SEP> dropvitre <SEP> sporu- <SEP> lettes, <SEP> backward <SEP> chamois <SEP> clear
<tb> lation <SEP> humi- <SEP> or <SEP> salmon <SEP> orange <SEP> to <SEP> brown <SEP> gride <SEP> black) <SEP> sâtre <SEP> or <SEP> fawn <SEP> Chamois <SEP> clear
<tb> (R) <SEP> or <SEP> almost <SEP> Cinnamon <SEP> brown
<tb> (R)) <SEP>; <SEP> spores <SEP> in <SEP> spirals <SEP> few
<tb> tight, <SEP> short and <SEP> cylindrical, <SEP> 0.99-1.32 <SEP> x <SEP> 0.66 <SEP>.
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By <SEP> dilution <SEP> colonies <SEP> on
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<tb>
<tb>
<tb> <SEP> plates of <SEP> different <SEP> types,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> the <SEP> plus <SEP> large <SEP> part <SEP> of the <SEP> co-
<tb>
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<Desc / Clms Page number 4>
EMI4.1
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<Desc / Clms Page number 5>
TABLE II
EMI5.1
ATCC 11653, arac, culture eristictues,
EMI5.2
<tb> Medium <SEP> Import- <SEP> Mycelium <SEP> Pigment <SEP> Remarks
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<tb> relief, <SEP> sporulation <SEP> gray
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<tb> and <SEP> Gray <SEP> Mouse <SEP> (R)); <SEP> ring
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<tb> exterior <SEP> with <SEP> sporulation
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<Desc / Clms Page number 6>
EMI6.1
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EMI6.6
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<Desc / Clms Page number 7>
EMI7.1
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TABLE III ATCC 11654, Culture characteristics.
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<Desc / Clms Page number 12>
It will be appreciated that the present invention extends not only to the use of organisms meeting the descriptions given above through
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As an example, but also in the use of mutator products obtained from the organisms described by various means, for example x-rays, ultraviolet rays, nitrogen gases, etc.
EMI12.2
The tetracycline producing strains of Streptomyces can be stored on Emerson agar carriers or other suitable media, or the organisms can be dried from the frozen form for subsequent revival.
Support cultures or freeze-dried preparations can be added to sterile nutrient media in small vials for the preparation of small amounts of the antibiotic or to prepare enough of the microorganisms to inoculate larger amounts of the nutrient media. In general the fermentation medium should contain a source of carbohydrate and a source of nitrogen, preferably in organic form. Various salts
EMI12.3
Metals are also of some value, because they stipulate the production of the antibiotic, but the use of tap water often provides enough of these metals for proper development: Among the sources of hydrate. useful carbon can be counted molasses, glucose, starches; glycerol, etc.
Sources of organic nitrogen include soy flour, wheat gluten, peanut flour, hydrolysis products of casein and other proteins, etc. Some raw materials contain development stimulating substances which are of interest in obtaining maximum antibiotic yields. These include wheat fermentation liquor, soluble distillation products, yeast extract, etc. Salts such as sodium chloride, sodium nitrate, potassium phosphate and magnesium sulfate are also found. some value.
Although the organizations
EMI12.4
organisms do not tend to change the pH of the medium appreciably during their development, the use of a buffering agent such as calcium carbonate has some value; If the medium tends to foam during the development of the organisms under aerobic conditions submerged, the addition of oils such as lard oil, soybean oil, etc. may be advisable.
As indicated above, the submerged aerobic culture of
EMI12.5
Selected strains of S. treptowaes are especially useful in the large-scale production of the non-tetracyaline antibiotic. To carry out this preparation, it is necessary to aerate the fermentation mixture with sterile air at a rate of at least 1/2 volume of air per volume of medium per minute. Sometimes higher amounts are more satisfactory. These and other conditions vary to some extent depending on the sub-
EMI12.6
organ # .S used, type of reaction vessel, type of stirrer and so on. It is advisable to use a stirrer in the fermentation vessel to promote good contact between the air and the medium.
EMI12.7
Cultivation of tetracycline producing strains of S. treptomyces takes 2 to 6 days when in vials. However, the time
EMI12.8
The means required to reach maximum power are appreciably shorter when using an aerobic-agitated and submerged fermentation.
Appreciable amounts of antibiotic are often formed within a day and in many cases at maximum production; of antibiotic is obtained in about two days. It is obviously essential that the medium used and all the devices are carefully sterelized before
EMI12.9
1 inoculation with the selected strain of microorganism. Throughout the duration of the fernentation; known precautions must be taken so that contaminating microorganisms cannot interfere with fermentation.
The present de-fermentation process can be carried out at a temperature.
EMI12.10
temperature about 25 to about 30 C. The apti = ia temperature appears to be about 28 C. To initiate a large scale fermentation, it is advisable to inoculate the sterilized-prepared fermentation places.
<Desc / Clms Page number 13>
using about 1 to 10% by volume of a culture of a freshly prepared tetracycline-producing strain of Streptomyces.
The antibiotic activity of the products obtained from the strains of Streptomyces described above can be determined by standard microbiological test methods for antibiotics with various microorganisms. Various physical measurements can also be used to determine the antibiotic content of a given sample, for example absorption of ultraviolet rays at certain wavelengths or absorption of infrared rays. Crystallized pure anhydrous amphoteric tetracycline is taken as a comparison standard with a potency of 1000 mcg / mg; Paper chromatography is particularly useful for detecting and determining the tetracycline content of raw materials and purer products.
Although the crude fermentation broth formed by culturing in nutrient media under aerobic conditions the new strains of Streptomyces producing tetracycline has appreciable value on its own, for example as an addition to animal feed or to stimulate growth of plants, it is often more advantageous to separate the antibiotic as dry matter either in the crude state or in the purified state. Various methods can be used for this purpose. For example the whole broth, before or after filtering the mycelium can be dried from the frozen state to provide a crude product containing appreciable amounts of antibiotic.
It is advisable to carry out this drying operation at a pH which is neither too acidic nor too basic, because the antibiotic can be degraded by this treatment.
The antibiotic called tetracycline can be separated from the fermentation broth by different methods. It is advisable, before applying these procedures, to separate the mycelium from all of the broth by filtration. The maximum amount of antibiotic is obtained in the aqueous filtrate if the mixture is adjusted to a pH of about 2 to 3 by a strong acid - (hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc.) - before filtration. Although a moderate rise in temperature may facilitate coagulation of some of the finely divided impurities and thus give a cleaner filtrate, high temperatures should be avoided.
It may have some destruction of antibiotic activity at this pH (2-3) if the solution is heated to above about 40 ° C or if the solution is maintained at this pH for a time. considerable.
To separate the mycelium from the fermentation broth by filtration, various filtration aids can be used and especially those which contain infusoria earth. The filtrate can then be dried or subjected to new separation processes to purify it. A useful process for the separation of tetracycline from fermentation broths is to add certain versatile metal ions, preferably in the form of water soluble salts of these metals.
Although a certain proportion of the metals may be present in the fermentation broth, particularly calcium when calcium carbonate is used as a buffering agent, this amount is often sufficient to precipitate significant proportions of antibiotic when the broth is made basic.
Precipitation is obtained after addition of the necessary metal salts by adjusting the pH to a slightly alkaline value. In general, a pH of about 7.5 to 9 is most suitable. The use of more than one polyvalent metal precipitating agent is advisable, because the complex products formed in the fermentation broth with a combination of these metals are often much less soluble than in the case of a single polyvalent metal ion. Among the metals most useful for precipitating the antibiotic are barium, calcium, magnesium, strontium, beryllium, mercury, cadmium and other versatile metal ions; especially those of. group 2 of the Periodic Table of the Elements.
As indicated above, a combination
<Desc / Clms Page number 14>
of two or more of these metals is often more effective than a single metal.
The complex precipitate of antibiotic and metal ions with other elements of the fermentation broth can be separated from the remaining solution by filtration, centrifugation or other suitable methods. The product can then be washed with a small volume of water to remove the residual fermentation fluid which contains little antibiotic and the crude product can then be dried and used for some purpose if the polyvalent ions used are relatively non-toxic. , like calcium and magnesium for example. Alternatively, the crude product, in wet or dry form, can be transformed into a purified form of amphoteric antibiotic by treating the precipitated product with an agent selectively precipitating the metal ions used.
This is how calcium and barium are used as metals, the product can be treated with a dilute solution of sulfuric acid to obtain a precipitate of calcium and barium sulphates and an aqueous solution of the antibiotic. . By filtering the precipitated solid, the antibiotic solution is separated. After adjusting the pH to prevent decomposition of the antibiotic, the concentrated solution can be used as is in various applications or allowed to dry. By making the pH slightly alkaline, a purer form of amphoteric tetracycline can be separated from the concentrated aqueous solution obtained in this way.
This product generally has sufficient purity that it can be crystallized by methods which have been described in some of the earlier publications mentioned above.
A second method which can be used to separate the tetracyclin from the fermentation broth comprises extracting the antibiotic at a strongly acidic or slightly alkaline pH in certain organic solvents immiscible in water. In general, this extraction can be carried out at a pH of about 1 to 2.5, or at, a pH of about 7.5 to 10. Several polar, water-immiscible organic solvents can be used for this purpose. They are in particular alcoholic solvents such as butanols, pentanols, etc., as well as substituted alcohols such as benzyl alcohol, phenylethyl alcohol and certain glycol ethers such as phenylcellosolve; water-immiscible ketones such as ethyl-isobutyl ketone, esters such as amyl acetate, propyl acetate, ethyl propionate, etc.
It has been found useful to add to the fermentation broth filtered before extraction and particularly at alkaline pHs, a polyvalent metal ion sequestering agent. These agents include polyphosphates, various hydroxy acids such as gluconic acid; citric acid ,,! ' tartaric acid, etc. and amino acids such as ethylenediaminetetraacetic acid. This avoids the extraction of polyvalent metal ions in the form of complexes with tetracycline and other elements from the fermentation broth.
The extraction can be carried out by static methods or by continuous counterflow extraction. A particularly useful process for the extraction comprises the use of the apparatus known in the industry as the Podbielniak extractor. In general, a volume of solvent of at least about 1/10 of the volume of the aqueous solution of the antibiotic is used. Significantly higher solvent ratios may be necessary if the solvent chosen is not of maximum efficiency or if the apparatus used does not quickly reach partitioning equilibrium.
When the extraction is complete the solvent phases can be combined with the antibiotic can be separated either by complete evaporation of the solvent or by partial evaporation of the solvent and extraction of the antibiotic in a small volume of an acid in solution. dilute aqueous preferably Binerai acid. The concentrate thus obtained can be used for various applications. The product can be precipitated by adjusting the pH of the aqueous concentrate to a weakly alkaline value, for example about 7.5. The tetracycline thus obtained can be used in certain
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therapeutic applications or can be crystallized.
Another method of separating tetracycline from the fermentation broth prepared as described above involves the use of certain organic bases as a precipitating agent. The organic bases; High molecular weight products having low water solubility are particularly useful.
In particular substances such as a high molecular weight quaternary ammonium salt, for example C 8 to C 18 alkyltrimethylammonium halides; C 8-018 alkyl-dimethyl-benzyl-ammonium halides; long alkyl chain substituted imidazolines, long chain primary secondary or tertiary alkyl amines, and several other basic organic substances. precipitating agents appear to form complexes containing not only the antibiotic but also certain other elements normally present in the salts prepared. These elements can include small amounts of polyvalent metals and organic substances.
After addition of the organic base material to the filtered tetracycline fermentation broth, the pH of the mixture is adjusted preferably with a soluble alkali such as sodium hydroxide to a slightly basic value, ie. say 8 to 9.5 approximately. The product which precipitates can be filtered off, preferably after a short period of stirring. A somewhat purer product is obtained if the filtered and acidified tetracyclin broth is treated with a sequestering agent, for example one of the agents listed above, had to add the organic basic precipitant.
The product obtained by precipitation with a high molecular weight organic base as recited above can be converted into a product containing tetracycline salts, or into amphoteric tetracycline.
This is most easily accomplished by dissolving the precipitate in a low molecular weight polar organic solvent such as methanol. Addition of a concentrated solution of a mineral acid, for example concentrated hydrochloric acid, gives hydrochloride. tretracycline which can crystallize or precipitate if a sufficiently concentrated solution has been used
Organic basic tetracycline complexes are also of appreciable value, for example as industrial anti-basteric agents.
Another method of separating the antibiotic is to contact the acidified fermentation broth after filtration of the mycelium with certain aryl-azo-sulfonic acid dyes.
There is thus obtained the precipitation of a complex of the dye from which the antibiotic can be separated by methods analogous to certain methods described above.
For example, the mixture can be dissolved in a low molecular weight polar organic solvent. Adjusting the pH to a slightly alkaline value causes precipitation of the amphoteric tetracycline if a sufficiently concentrated solution is used.
In addition to the separation methods described above, the antibiotic can be obtained in a partially purified form by contacting the fermentation broth with an adsorbent such as activated charcoal, active earths and other fermentation materials. this nature. The adsorption can be carried out at a pH of from about 3 to about 8 and the adsorbed antibiotic can be used as such to fortify animal feeds or for other similar applications. tracycline can be separated from the adsorbent by elution, for example by an acid in dilute aqueous solution or by a dilute solution of a strong acid in a polar solvent. Thus obtained, it can be used without further processing or purified. more so, for example by the methods listed above.
The antibiotic can be adsorbed from the fermentation broth onto certain types of ion exchange resins, particularly strongly acidic resins such as aulfonic acid ion exchange resins, for example Dowex 1.
Adsorption best occurs at a pH of around 3-8.
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and the product can be used as is in certain applications or the tetracycline can be separated by elution, for example au. by means of a dilute alkali.
In all of these separation processes, the separation of tetracycline from antibiotic by-products of fermentation can be achieved as follows: First, an aqueous preparation of the crude tetracycline obtained by one or more is formed. Another of the different separation processes described above. This solution is then acidified and subjected to extraction with an organic solvent immiscible in water, particularly lower alcohols such as butanol, isobutanol, pentanols, hexanols etc ..
when the extraction is complete, the organic solvent extracts are adjusted to almost neutral pH and the free tetracycline can then be precipitated as the base by stirring the mixture or by allowing it to stand for several hours. The tetracycline thus precipitated can be precipitated. be separated by filtration and subjected to further purification by recrystallization.
The examples which follow are given by way of illustration and are not the only embodiments of the invention.
EXAMPLE 1.-
A culture of Streptomyces n ATCC 11652 on Emerson's agar support is rinsed with sterile water in a flask containing 100 cm3 of sterile nutrient medium of the following composition:
EMI16.1
<tb> Material <SEP> Grams
<tb>
<tb> Soy <SEP> <SEP> flour <SEP> 4.0
<tb> Nitrate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 0.3
<tb> 100 <SEP> cm3 <SEP> of water <SEP> from <SEP> city
<tb>
A series of vials are filled with this medium, sterilized, inoculated and incubated at 28 ° C. with continuous shaking. After 6 days one of these vials is used to inoculate 2 liters of the same medium in a metal container of 3 liters equipped for submerged aerobic fermentation under sterile conditions.
The mixture is stirred and aerated at a rate of approximately 1 volume of air per volume of medium per minute at a temperature of 28 ° C. for 3 days. The fermentation mixtures of 10 of these fermentations are combined and the pH 2.5 is adjusted with hydrochloric acid at room temperature. The mycelium is filtered with the addition of a filter aid to infusoria earth.
The filtrate is adjusted to pH 7.5 and extracted twice with 1/4 volume of butanol. The butanol phases are combined and concentrated in the vacuum to a volume of 1500 cc. The butanol concentrate is then extracted with approximately 200 cc of water adjusted to pH 1.9 with hydrochloric acid. This extraction is repeated with the same volume of acidified water.
The combined aqueous extracts are adjusted to pH 7.5 with dilute sodium hydroxide and the crude product containing amphoteric tetracycline is separated by filtration with the addition of diatomaceous earth filter aid. The material is subjected to further purification to obtain crystallized amphoteric tetracycline. t EXAMPLE 11.-
A culture of Streptomyces n ATCC 11653 on a support of Emerson's agar in 100 cm3 of a medium prepared from the following materials is washed with sterile water: soy flour, hydrolysis product of casein, beet molasses, wheat maceration liquor, and tap water. The inoculated medium is stirred in a stirrer at 28 ° C. for 5 days.
The culture obtained in this way is used to inoculate 2 liters of a sterile medium having the same composition as in the example above. The mixture is aerated and stirred at 28 ° C. for 3 days. The crude 'antibiotic' is separated after filtration by adding barium and magnesium chlorides and adjusting the pH to about 9. The precipitated product
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is filtered, washed in a small volume of water and made into an aqueous concentrate by treatment with dilute sulfuric acid and filtration. Adjusting the filtrate to pH 8.0 with dilute sodium hydroxide results in the separation of a more pure antibiotic product which, upon further purification, gives the amphoteric crystallized tetracycline.
EXAMPLE 111.-
A culture of Streptomyces n ATCC 11654 on Emerson's agar support is rinsed with sterile water in a flask containing 100 cm 3 of sterile nutrient medium of the following composition;
EMI17.1
<tb> Material <SEP> Grams
<tb>
<tb>
<tb> Soy <SEP> <SEP> flour <SEP>: <SEP> 4.0
<tb>
<tb>
<tb> Nitrate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 0.3
<tb>
<tb>
<tb> 100 <SEP> cm3 <SEP> of water <SEP> from <SEP> city
<tb>
A series of vials are filled with this medium, sterilized, inoculated and incubated at 28 ° C with continuous shaking.
After 6 days, one of these vials is used to inoculate 2 liters of the same medium into a 3-liter metal container equipped for submerged aerobic fermentation under sterile conditions o The mixture is stirred and aerated at a rate of approximately 1 volume of air per volume of medium per minute at 28 ° C for 3 days. The fermentation medium from 10 of these fermentations is combined and adjusted to pH 2.5 with hydrochloric acid at room temperature. The mycelium is filtered with the help of a diatomaceous earth filter aid. The filtrate is adjusted to pH 7.5 and extracted twice with 1/4 volume of butanol.
The butanol phases are combined and concentrated under vacuum to a volume of 1500 cm3? The butanol concentrate is then extracted with approximately 200 cm3 of water adjusted to pH 1.9 with hydrochloric acid. This extraction is repeated with the same volume of acidified water. The combined aqueous extracts are adjusted to pH 7.5 with dilute sodium hydroxide and the crude product containing amphoteric tetracycline is filtered with the addition of an infusorium auxiliary. The material is subjected to further purification to obtain crystallized amphoteric tetracycline.