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procéde de préparation d'un nouvel agent antibacterieno
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La posent* invention au rapport* à uni sub- stance nouvelle et utile dénommée notomyeia , ainsi * *#* ,
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un procédé pour sa production; elle concerne plus par-
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ticulièrement un procédé pour la produire par t'f#.na-
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tion et des procédés pour la récupérer et la purifiât'*
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L'invention vise cet aaent antibactérien acide et ses 0410 alcalins en aolutioa diluée, nous forme de ooncentr44 bruts, .ou. forme de produite solides purifiée et de 10=0 cri$tal11n. pure. La natamyaine est efficace pour inhiber le dv91oppement de bactéries Gram-positiv...
La notomy-
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cine n'est pas torque et elle manifeste un effet théra-
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peutique sur des souris Infectées avec des bactéries Ga#- positives. La notomyoine est également utile pour guérir #chez les $trou humaine le infections provoquée$ par det
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bactéries Gram-positive', par exemple la pneumonie. La
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natomoina a également été dénommée antibiotique Du 620.
La demanderesse apporte maintenant, ocaforméoeat à la présente invention, une substance antibiotique effi-
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cace pour inhiber le développement d'une bactérie Gram-
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positive, choisie parmi le groupe, ooaetituee par une subi stance acide, la notoaycine, que est faol-lenent soluble dans l'acétone, le d10xanne et l'eau alcaline, modérément
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soluble dans l'éthanol, le butanol, l'acétate d'éthyle,
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l'acétate de butyle et la mithyl l80but11 oétoae, moins soluble dans le beneône, le méthanol et le ohloroferme et
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insoluble dans le tétrachlorure de carbone l'éther de pétrole et l'eau acidulée, qui donne des réactions de
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Fehling et de ldaliaah positives, décolore la brome et donne des réactions avec la nlnh74rine, de Tollens et avec l'anthrone négatives,
et qui sous forme purifiée fond à 222-224" z un ;lPh!7 de -134* (0 - l,0i acétone),
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présent un spectre d'absorption ultra violet dans
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'l'éthanol ayant des maxima. 275 millimicrons (2 |Ja 595) et à 555 millimierons (1 ex si 498) dans Hal If/10 ayant des maxime à 275 taillimic=no (n 1 *ffl - 287) et t '4' =il- limicrons (1 Ja 277), et dans Naon N/10 ayant un maxi- aum à 280 willioiorons (m 3' - 766), a un équivalent de neutralisation de 548 et dont l'analyse élémentaire moyenne est la suivantes 0 w 59#1 %î H . 5155 %;
N m 5tgo % et 0 (par différence) * 29,65 %; et quand on la pastille dans
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du bromure de potassium présente une absorption caraotd- viatique dans la région infra-rouge du spectre; telle qu'elle est représentée sur la Figure 1; et les mêle de ladite substance acide, en se reportant aux dessinai
La Figure 1 est une courbe du spectre d'absorption dans 1'infra-rouge de la notomyoine, acide libre, quand elle est pastillée dans du bromure de potassium.
La Figure 2 cet une courbe du spectre d'absorp-
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tion dans l'ultraviolet de la notomyoine en solution .dans de l'éthanol, dbna H01 0,1 N et dans NaOH 0,1 N.
La demanderesse fournit encore, conformément à la présente invention$ le procédé de production d'une
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substance antibiotique dénommée notomyoine, qui consiste à cultiver une couche de tr,omy" itbr,n8ft en solution aqueuna d'hydratée de carbone renfermant une sub- stance nutritive azotée, en milieu aérobie immerge,
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jusqu'à ce qu'une activité 1ptte envers les bactéries Gras-positives soit communiquée à cette solution, et à récupérer la notomyoine à partir de cette solution.
L'organisme produisant l'antibiotique de la pré-
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sente invention ,t't6 Isolé d'un échantillon de sol recueilli dans l'île de Richirit Hokkaidot Japon, et il con-
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etitue une nouvelle espèce dénommée tretoilo's ish1,n !Lot du genre des Strectomyces. Une culture de l'organisme vivant, à laquelle en a donné les désignations de laboratoire 404 y 3 et A 979;, a été déposée à la American Type cul- ture Collection, à Washington, D#0.9 Biais-Unie 41AM4- rique, et a été ajoutée à sa collection permanente de micro- ',Organismes $OU la désignation de A.Iri.0.0j, 14812.
Les caractéristiques de la Bouche représentativet . 404 Y 3, de 8. rishirenais. sont les suivantes! PAHA0T8RIOTIQUBB. PB OUX/PUft$.
C a croissance 6 '- pigment soluble À a Mycélium aérien B a propriété biochimique 1. Agar de czapek ci modérée, de gris jaunâtre . à gris brunâtre clair, ou jaune ivoire At médiocre, poudreux, blanc S: néant
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2o u de Oeapek au cg modérée, gris jaunâtre pu gïyoérol gris brunâtre clair à jaune pâle avec brun peu prononcé A; médiocre, poudreux, blanc S: néant ou jaune pâle brun peu prononcé
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3. Asar au glycérol et bel Os modérée, de gris jaunâtre d'ammonium clair à blanc jaunâtre
A: peu abondant, poudreux, de gris jaunâtre clair à gris clair.
S: néant
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4. AEar au glucose et à Ot médiocre, mince, brillante, l'asparasine Gris jaunâtre clair
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A: néant
S: néant 5. Agar @ 1 .amidon C: bonne, de cris jaunstre clair . jaune ivoire
A: modéré, poudreux, N'étalant, de brun délavé à brun pâle avec gris
S: néant
B: l'hydrolyse est modérément forte 6. Agar nutritif C: modérée, de terre d'ombre brûlée à brune
A: médiocre, poudreux, blano.
S:brun foncé 7. Agar de Bennett C: modérée, de brun olive grisâtre à brun grisâtre
A: modéré, de blanc à brun pâle à gris brunâtre
S: brun Jaune , S: Agar à la farine C: bonne, jaune paie avec brun d'avoine et au Boyton délavé
A: modéré, de blanc à gris avec brun délavé
Si jaune pâle avec brun délavé
9. Bouchon de pomme de C: bonne, brillante, surface terre ridée
A:néant
S: la bouchon tourne au noir brunâtre 10.
Piqûre sur gélatine C: colonie noir brunâtre à la surface
A: néant S: brun foncé
B: liquéfaction négative
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11 Piqûre sur gélatine à C: colonie noir brunâtre à la la levure de tyrosine surface
A : néant
S: brun foncé
B: liquéfaction négative 12, Lait Ci formation d'un anneau brun* tre
A: néant
Si brun délavé
B: non digéré 13. Solution de nitrate Ci masse blanche en grains à la surface
B: réduction en nitrite positive.
14. Milieux de formation C: aédioore, mince, noir de mélanine grisâtre
A: rare, blano
S: de gris brunâtre à brun grisâtre
B: mélanine positive, 15. Agar au dextrose de C: bonne, brillante, nois pommes de terre brunâtre
A:
modéré, de blanc à rose pâle à brun pâle avec Crin délavé
S: cris ou crie chaud.
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muotillsàej±n 9,.o 2.0mge de oeyipono
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XIVVI-000 ++ Inuline t"t' Arabiaose ++ salloine Olucont ++ Manaitol Qalaotone ++ Sorbitol Fructose -'')' 0<llobia Scrbose Rh&cmc'Nt r+ saccharose +<- citrate de boa= 1;aai ** 8uoo,uxtr dé sodlua -t- Laatoee -*"'- lucaitol +# Raffinons +* Témoin
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++ m bonne croissance + croissance passable t * croissance douteuse
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- M pas de croissance
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paraatg'8 molq1Qu, On a observé les propriétés morpholigiquee de la souche sur de l'agar d'amidon et sur de l'aga* de Bennett.
L'examen microscopique du mycélium aérien révèle des hyphe< enchevêtrées et ramifiées, parfois en touffes, et des aporo- phorea qui produisent des spirales sin1sTArIUm, Par examen au microscope 1'n1quet on trouve que les spores ont une
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forme elliptique à ovalo et que leur surface est lisse*
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Le 3Gratomvcer 41a Y 3 a un mycélium aérien
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gris brunâtre ot il produit un pigment brun ou brun foncé sur des milieux orguniques. La liquéfaction de la Gélatine est négative tant on piqûre sur de la gélatine qu'en piqûre
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sur de la Sdlatine à la tyrosine et à la levure, et le luit
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n'est pas digéré* Il se forme du nitrite à partir du nitrate et l'amidon est hydrolyse.
La souche 404 Y 3 ressemble au
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di,rnta.nclro¯. au 8. sriaooruber, au 8. r al1voohro,:, m('}fenop, au S. nUl"!:1Ut.,b au U. r;rifJoochroItIO[Emo .1 au t3. ha-
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waiiensis et au 3. nasanish & certains pointa de vue, comme la formation de npiralou, la couleur du mycélium aérien et le pigment m61anotde, mais elle en différa par certaines propriétés de culture et physiologiques, comme indiqua ci-dessoues . didd'tgS:, D'après Waksman et Ourt1s, les aporophorea sont droits et d'après Jonsen, il se forme des spirales sint-
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strorsua. On indique que la couleur du mycélium aérien va du blanc au gris cendré sur de l'agir de Osapek et est
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grise sur de l'Q8ar au glucose et 1 ' asporagine La 11- quéfaction sur piqûres dans de la gdiatine est assez rapide.
8*¯.iip;riseoru'bert On indique que les spores ont une forme cylindre- que. La couleur du développement est orange rouge&tre sur de l'agar de Ozapek et orn8ê rougeàtre olalr à violet rougeâtre sur de l'agar à 1' amidon, On trouve également des différences dans l'utilisation des sources de carbone
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comme le saccharose, le raff.nvdd, le citrate et le 8uo01- natte S" oli.."!9ch.t'Qrnor:en.
On trouve des différences dans la couleur du développement, dans'le pigment soluble sur agar au glucose et à l'asparagine et dans la digestion de la gélatine et du lait.
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S. jaureus La couleur du développement est brun foncé sur de l'agar de Ozapek et or--.ansÓ clair sur de 3.4aaar au glucose et à l'asparagine. La liquéfaction de la gélatine est rapide puis plus tard se ralentit.
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grieQOahrçloe:lJne La couleur du mycélium aérien va du blanc au gris
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neutre clair. La liquéfaction de la gélatine eat .04''..
Le lait ont poptonind sana coagulation, On trouva égale- mont des différences dano l'utilisation de source* de carbone comme le rhamiose, l'inuline, la salîcinej le citrate et le auccinates jj}. Hawaiiens ta La couleur du développement sur aga* au glucose et A l'aspuraaine est brun clair et le myoé11ua aérien va du blano au gris. On trouve également des ditrivenota dans
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1'utilisation de sources de' carbone comme le sorbitol et
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le l3uoo:l.nate. ti's .,n2,eiiniuh.à La couleur du développement sur igar & l'amidon est crâne avec du violet rouseutte et le pigment soluble sur aga à l'amidon est- rosé faibl:*, La gélatine cet mode- retient liquéfiée te lait est coagulé et poptonjui. On ob-* serve don différences dans l'utilisation des sources de carbone, comme 1..accarOBe et le sorbitol.
Dano le but de choisir des Bouchée à forte pro- ductivité, on procède z une irradiation pur la lumière ultra- violette dur la souche primitive et on choisit des colonisa mutantes. On étudie uycolofjiquamont parmi ces couches cer tuina dpjj-lua forte producteurs, mais on n'observe pas de
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différence notables sauf que l'on obtient quelque. touches de mycélium aérien blanc.
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En ruiaon don caractéristiques indiquées ci-dessug de cette souche, on décide que la Utroptomycès 404 Y 3 eon". atitue une nouvelle eap ce et on le désigne 8treptomyees Ziahirîenais nov. sp.
L'espèce UtreptoNyeea décrits ici- %dot comprend toutes les souches do streptomyoea qui forment
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,de la notomyoine et qui ne peuvent pas être nettement
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,41* f éreneiées de la couche Ni 404 Y 3 et de son aoufaulturea, ;
y compris les mutants et.lea variante$$ Les propriétés de la netomycine sont déopiton ioi-inûrae et, une fols que ce* propriétés août connues, il est facile de différencier les souches produisant de la notomyoine des autres,
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Le .,of3-tjoi,vitncigt cultivé dans des conditions convenables* produit de la notomyointo On pré- pare un bouillon de fermentation renfermant de la notomwine en inoculant des sports ou des myoélia de l'organisme pro- duisant de la notomyoine dans un milieu approprié, puis en cultivant dans des conditions aérobies. Il est possible, pour produire de la notomyoine,
de cultiver sur un milieu solidesmais pour la production en grande quantité, un milieu liquide est préférable. On-peut faire varier la température de la culture dans un domaine étendu, entre
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20 et 550 0, dans lequel l'organisme peut et développer, mais on préfère une température de 26 à 300 0 et que If pH soit sensiblement neutre.
Dans la fermentation aérobie Immergée de l'organisme pour produire de la notoayoine, le milieu renferme comme source de carbone une huile clyeé- ride du commerce ou bien un hydrate de carbone comme le
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ClyC6rol le Glucose, le maltoses la saccharose, le lactose$ la dextrine, l'amidon, etc, h l'état pur ou a l'état brut, et comme source d'azote une substance organique comme la farine de soja, les produite solubles de distillerie, la .
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farine d'arachides, la farine de Craines:
de coton, l'extrait de viande, la peptone, la farine de poisson, l'extrait de levure, l'eau de macération du mate etc,. et, ai on le désire, des sources minérales d'azote comme des nitrates
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et des sels d'ammonium, et des sols minéraux comme le chlo..
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rare de sodium, le chlorure de potassium et le sulfate de
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potassium, ainsi que des agent s- tampons comme du carbonate de calcium ou des phosphates et des traces de sale de métaux lourds;
ces éléments constitutifs du milieu com- prennent ceux qui sont énumérés dans le brevet canadien 513.324 du et dans les brevets britanniques
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N 730,341 du et 736.325 du et dans les brevets des Etats Unis d'Amérique J. 2.691.618 du , 2.6S.t7,8 du , 2.653.899 du , 2.586.762 du t 2.516*080 du , 2.843.892 du 2.609.329 du , et 2.709.672 du . Sa culture
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aérée immergée, on utilise un agent anti-munse tel que de la paraffine liquide, des huiles grasses ou une silicone.
On peut faire appel, pour la production de la notomyoine, à plus d'une sorte de source de carbone. On continue en gé- néral la culture jusqu'à ce qu'au moins plusieurs centaines de mcg/ml de notomyoine se soient accumulés dans le milieu* Dans certains cas, le pH du bouillon diminue au commence- ment puis peu & peu remonte.
Les exemples suivants sont destin'. , illustrer cette invention, mais sans la limiter.
EXEMPLE 1 On étudie les conditions de fermentation appro- priées pour la production de l'antibiotique dénommé noto-
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myosine et on trouve que la composition suivante de Milieu. est utile en culture secouées 1,5 % d'amidon soluble, 2 % de farine d'endosporme de graines de coton (Fharaamedia) , 0,1 % de K2HPOlf.. 0,1 z de laOl, 0,05 z5 de *%6(>v 7 8201 0,05 % de Oa012' 0,001 je de ZnS04t ? H20 et 0, % d'extraite de levure.
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La notomycine est forage en 3 à 5 jours de fermentation avec aération et agitation adéquates, et on trouve de l'activité à la fois dans le filtrat du bouillon et dans le mycélium. On dose la notomyoine contre le
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taphylococcuB aurus IDA 209 P par la méthode sur disque de papier ou sur plaque cylindrique.
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exemple Jo La fermentation aérobie immergée du S. ri8hirie&-' aie (souche 404 Y 3) en flacons secoués, dans un milieu renfermant 6 % d'amidon (Staclipae J), 3 % de levure.de brasseur débarrassée de ses pricipes amers et 1 % de Oa003' donne de 300 & 400 raog/m3, de notomyoine.
EXE!.fi)LI 3 La fermentation aérobie immergée du ,8"," iahir,i": sis (souche 404 Y 3) dans des flacons secoués, en milieu renfermant 6 % d'amidon (Staclipae J) 3 % de farine d'en-
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dosperme de graines de coton (Miarmamedia), 215 % de produite solubles de distillerie et 1 tt de OAOO donne de*150 à 200 mcg/ml de notomyoine..
.&JXE1\ÍPLE 4 La fermentation aérobie immergée de , r1ship1n1J! (souche lez Y 3) en flacons secoués, dans un milieu renfermant 1,0 % de farine de soja, 2 % de farine d'endosporma de graines de coton (Pharmamedia), 2,0 % d'amidon soluble, 0,5 % de glycérine, 0,2 % d'extraits de levure, 0,2 % de
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K2"P04' 0,1 % de MgS04' 1,0 % de OaOO, et 0,05 % de silicone anti-mousse, donne à pU ? ,0 de #¯¯¯¯¯¯.... la rtaGouycâ.ao de la rauniôre suivante!
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Durée Iili z
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<tb> 5 <SEP> (jours <SEP> 7,8 <SEP> 70
<tb>
<tb> 6 <SEP> Jours <SEP> 8,1 <SEP> 80
<tb>
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7joura 8t3 120
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mM?.mm pnltituo.nts d1fmW!.\1 ' / Marins de soja 2,0 % Glycérine 1,5% Extrait de levure 0,2%
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Phosphate dipotassique 0,1 .
Chlorure de sodium 0,1%
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cnorure do calcium 0,05 % Sulfate de magnésium 0,09 % Sulfate de zinc 0,001 % pH 7,0
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On stérilise 100 MI d'un* culture renûciaàt les composants ci-desous dans une fiole d'un volume de 500 ml, on inocule ce milieu avoc une culture d* ensemencement le sri2top to rit3hirioUla souche 404 Y 3 et on le cultive à 27 t 10 0 pendant 6 jours en la secouant, sur quoi la formation do nototayoine dans le bouillon de fermentation atteint 150 mes/MI.
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9=110LIC - -- 9.ens1ii tum}tar du uIpilioM Farine) d'endoapcrme de graine do coton (Pharaaaodia) 2 0 S Amidon soluble 1,5% Extrait de levure 0,2%
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Phosphate dîpotagoîque 0,1 % Chlorure de sodium 0,1 % Chlorure de calcium 0,05 % Sulfate de magnésium 0,05 % Sulfate de zinc 0,001 % . pH 7,0
On stérilisa, dans une fiole d'un volume de 500 ml, 100 ml d'un milieu de culture renfermant les composante ci-dessus, on l'inocule avec une culture d'on-
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semencoment de 3treptom,yceg i'Jiah1tqnu11 404 Y -30 (qui est une souche mutante de 404 Y 3 obtenue par irradiation
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avec des rayons ultra-violeta),
et le cultive & 27 t Io 0 pendant 9 jours en la secouant, sur quoi la production de notomycine dans le bouillon de fermentation atteint 400 mog/ml,
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On stdrilige 30 litres d'un Milieu de culture renfermant leo mêuea composants que dans l'Exemple 6 dans un réservoir en acier inoxydable d'un volume de 50 litres, on l'inocule avec une culture d'ensemencement de LtÙ2m.Ug2 rishiriansis et on le cultive & 28 t 10 0 pendant go heu- rose sur quoi la production de notomyoine dans le bouillon de fermentation atteint 120 cog/ml.
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On filtre 5 litres du bouillon de fermentation
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PU 8,0, on ajuste à 6to 1* pHfiltrat et on l'extrait
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avec 2 litres de méthyl isobutyl oétone. On extrait le
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gâteau c'11.n avec JK>0 al d'acétone en acitant énergi- qu.ment, et on évapore l'extrait tous vidé pour .lim1nlf le solvant. On extrait le concentré aqueux résultant à pH 6 avec koO ml de m6thyl ioobutyl cétonoï On mélange le* deux extraits cétoniques, on les lave av#* 500 ml d'eau,
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puis on fait passer l'activité dons 1000 litres d'eau
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froide dont le pH a été ajusté à 10,0 avec de l'hydroxyde
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de sodium. On ajusta à 6,0 le pH de l'extrait aqueux et
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on l'extrait 4 nouveau avec OO ml d'acétate d'éthyle qu'on oonoentre nous vide à 30 ml.
Zn ajoutant 150 ml d'éther de
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pétrole au concentré, il apparaît un précipite amorphe brun clair} on le recueille, on le lave avec de petites
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quantité. de méthanol pour enlever les impuretés colordes et on le sèche, ce qui donne 750 mg de notoayaine sous
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forme d'une poudre.
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On dissout 400 mg de la poudre de'notoayoine ainsi obtenue dans 100 ml d'acétate d'éthyle et on adsorbe sur une colonne de aO g d'alumine au préalable traitée aveo de l'acide sulfuriques On lave la colonne avec 200 ai d'acétate d'éthyle et on élue avec du m6thanol. On recueil'*
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le l'éluat par fractions de 10 ml, on m6lange les fractions
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actives eC on les concentre uouo vide jusqu'à o1oQ1t6. On reCtiStUllISe deux fois duns du méthanol la notomyoine
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solide de couleur jauno pâle ainsi obtenue, ce qui donne
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70 g de uotomycine cristalline blfJnùhJ, qui tond. 218-2JO* 0 ;
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en se décomposant.
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On purifia encore la notouyoine par la technique de Oraig de répartition b contre-oouruut en utilisant un
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système solvant de 5 parties (en volume) de tétrachlorure de carbone, d'une partie de chloroforme, de cinq parties de méthanol et d'une partie d'eau. Après 50 transferts, on trouve le maximum de concentration dans le tube N 26, par la courbe d'essai biolegique, par la courbe d'essai dans l'ultra-violet et par la courbe de poids; ce* courbes con- cordent avec la courbe théorique.
En lyophilisant 10 tubes autour de ce maximum on obtient la notoayoine pure.
La notomyoine a également été purifiée par re- cristallisation dans de l'acétone aqueuse, puis dans du méthanol absolu, ce qui donne une substance fondant à 220 0 en se décomposant.
On a également purifié la notomyoine par chroma- tographie sur alumine, dans laquelle on dissout 39,7 g (activité 500 mcg/mg) dans de l'acétate d'éthyle et on l'adsorbe sur 2 g de Al2O3 (pH 4,7, traitée avec H2SO4).
Après avoir lavé la colonne avec de l'acétate' d'éthyle, on l'élue successivement avec du méthanol puis avec du méthanol acide. On mélange les fractions actives, on les neutralise , on les concentre sous vide puis on les lyophilise, ce qui donne 12,4 mg, sous forme d'une poudre jaunâtre pale (acti- vité 700 mcg/mg);
On traite 480 mg de notomycine avec une petite quantité de charbon actif en solution scétonique, puis on le recristallise dans de l'éthanol chaud, ce qui donne 230 mg de notomyoine cristalline, que l'on sèche sous vide pendant 3 heures à 50 0.
Point de fusion 222-224 0 (avec déoompo- sition); pKa 6,32 dans de l'acétone à 75 %. Equivalent de titrages 526,5 Analyse. Calculé pour C26H26N2O10: C - 59,35 H - 4,98 N - 5, 32 Trouvé : C - 59,1 H - 5,35 N - 5,90
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Une détermination de poids moléculaire par
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la méthode ovysooopique dans du dioxanne donne une valeur de 500 20. te pouvoir rotatoire spécifique $&pha7 | est de -134$40 (0 - 1 ., acétone), en C.,ara1.oA avec -69,6' pour la novobiceine dans les mêmes conditions. La notomyoine donna avec l'anthrone une réaction négative (brun), tandis que la novobicelne donna avec l'antbron. une réaction positive (verte).
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On agite une solution de 100 mg de aotoayoine dans 120 ml d'éthanol absolu avec 0125 g de catalyseur d' Adam, nous une pression atmosphérique d'hydrogène, pen-' . dont 30 minutes à la température ambiante. On n'observe presque pas d'absorption d'hydrogène. Après avoir sépare le catalyseur, on ajoute au filtrat 35 ml d'eau en agitant
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énergiquement. En ajoutant à la solution r6oultantIO,' MI d'acide chlorhydrique normal, on précipite une produit so- lide blanc; on le recueille, on le sèche et on trouve qu'il pesé Sa,7 mg, et que c'est du produit primitif de départ,
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c'est à dire de la noto01n., comme le confirme la 6bvoma- tographis sur papier.
Dans les mêmes conditions, 1.000 Ils de novobiooine donnent 946 mg de dihydronovoblocinst comme
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le confirme l'analyse ohrOma'co!raph1Q.ue sur papier, con- lormément à la littérature OF.J. Wolf et autres, Antibio- tics Annual, 1956-1957# page 1035).
La notomyolne donne des réactions de Pahling et de Moliboh positives et elle cUc3010re le brome. La réaction avec la ninhydrino# la réaction de (Pollens et la réaction avec l'anthrone sont négatives.
La chromatographie sur bande de papier de la
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notonyoine donne les résultats suivants!
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Système solvant Vnlaur de M lîutanol humide 0,15 Solution aqueuse 9S de ohlorurw
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<tb> d'ammonium <SEP> 0,03
<tb>
<tb> Phénol <SEP> à <SEP> 75 <SEP> % <SEP> 0,95
<tb>
<tb> Acétone <SEP> à <SEP> 50 <SEP> % <SEP> . <SEP> 0,75
<tb>
<tb> Butanol-méthanol-eau <SEP> (4:1:2) <SEP> +
<tb>
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2 % de méthyl-orange ## 0,45 Butanol-méthanol-eau (4$192) 0,40 Benz6ne.-méthanol (4il) oto5
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<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> . <SEP> 0,05
<tb>
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Butanol-eau (4:
1) + 0,25 % d'aoide p-toluèneaultonique 0,30 ButaNol-eau-acide aoétique (21111) ot5o Butanol-eau (4tl) + 2 % de pipdridine 0,25
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La notomyoine se dissout ta1lam.nt dani 1'&0'- tonot le dloxanno et l'eau alcaline, elle ont aodérement soluble dans 1$6thanolt le butanol, l'acétate d'éthyle l'acétate de butyle et la méthyl i8obu1 cétonal elle cet moins 80Juble dans le bonsènet le môthamol,et le chloroforme et elle est insoluble dana le tétrachlorure de carbone, l'éther de pétrole et l'eau acidulée.
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Comme le montre la Figure 2, la notoayoine pré- sente un spectre d'absorption dans l'ultra-violet compre- 'nant les maxima suivantes
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Maxima dans l'éthanol zon5 mil11m1cronl -(3 | Jft m 595) 335 ml111m1orons (1 i JR * 498) Maxiaa dans HOI 1;
/10 275 millimiorone (1 t:a. 287) 345 milllmiorona (1 :.. 277) Maximum dans NAOU H/10 280 mil11miorona (0 c " 766)
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Comme le montre la Figure 1, la notomyoine, pu*-
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utilisa dans du bromure d. p.taS/sima, présente des l1U1X1111.1. d'absorption caractéristiques dans 1'infra-rouge aux longu- eurs d'ondes suivantes, exprimées en microns :
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'2,99; 3,36 ('paul.mont). 3145; 5,88 (épauleunt); 3,92; 6110; 6,24i 6$451 6,; 6#?1 7,2; .-7,63; 7s85l 8,9} 9t2$ 9,6; 10#05; 10,3! 10,6; llb>i 12#251 12,65; 1>#I; 13,39.
Ainsi la notomyoine et la novobiooint se diffe" rendent facilement,par exemple par le point de fusion, par l'analyse élémentaire, par le pouvoir rotatoire spécifique,
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par 1.ur.piQtre8 d'absorption dans l'ultra-violet et dans 1'infra-rouge, par la réaction avec l'anthrone et par leur comportement en chromatceraphît sur bunde de papier.
La notomyoine est un composa organique acide qui est facilement soluble dans des solutions alcalines, comme des solutions aqueuses d'hydroxydes de métaux alcalins et
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alcaline-terreux. C'est ainsi qu'une solution de nataayoisre dans une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou de cal-
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oium forme respectivement Je seul de sodium ou de calcium, que l'on peut si on le désire isoler, par exemple par lyophilisation.
On forme d'une manière analogue des sels avec des bases organiques;l'addition de la streptomycine ou
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de la dihydrostreptomycine bases à la netoo1n. forme respectivement les sels de streptomycine et de dihydro- streptomycine de la notomycine; il est commode pour cette réaction, d'utiliser un solvant organique comme l'acétate d'éthyle, D'autres sols d'aminés que l'on peut utiliser comprennent ceux dont on se sert en thérapeutique tous forme de sels de la pénicilline, par exemple de procaîns,
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de N-bansyl-bâta-phdndthylamine, d'hydrabamins, d"ph6na- mine. de N,N'-<Hbons:yl6thylènediaroine, de d6hydroab16tamine
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et de dicyclohexylamine.
On se sort de l'acidification d'une solution aqueuse du dérivé sodique de la notomycine pour précipiter la notomycine purifiée, sous forme d'acide libre.
Un procédé préféré pour isoler la notomycine d'un bouillon de fermentation consiste à extraire la to- talité du bouillon à pH 6,0 avec la moitié de son volume de méthyl ieobutyl cétone, à re-extraire à pH 10,0 dans de l'eau (un quart du volume de la phace de méthyl isobutyl cétone), et à re-extraire à pH 6,0 dans de l'acétate d'éthy.
/le ou dans de la méthyl isobui-yl cétone (un tiers du volume de la dernière phase aqueuse), La solution consen- trée finale de notomyoine dune le solvant organique est en- suite concentrée par distillation sous vide au dixième ou au vingtième de son volume primitif. On précipite enduite la notomycine et si elle ne précipite pas spontanément, en ajoutant des alkanes inférieurs mélangés, par exemple par addition de 10 volumes de Ukellysolve B.
On récupère également avec facilité la notomyoine à partir des bouillons filtrés par adsorption sur du charbon activé (Daroo KB), puis en 3'éluant de ce dernier, mais cette manière d'opérer n'est pas supérieure à l'extraction du bouillon total par un solvant, du fait que dans de nom- breux bouillons la plus grande partie de la notomyoine se trouve dans le mycélium.
Etudes Microbiolomioues eux- la Notomycine activité antibactérienns in vitro
On a déterminé la concentration inhibitrice mini- des male (CIM) de la notomycino envere microorganismes vairés par la méthode de dilution on sórie dune de l'agar, en utili- sant de l'agar au arme do cheval pour les streptocoques et
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les pneuNoooquea h'olft1qu,
ut de jeagar au SJUOOO*T à l'extrait de levure et 1 lu peptone pour les feaoillts 140tiquois de l'agar nutritif pour d'autres baot'r1." de Ilagar de Sabouraud à 2 de Glucose pour les ohamp1SAoni et du bouillon de K1rhn.r pour les bacilles de la tuber- culoses Les résultats sont réunie ci-dessous sous forât de tableau$ On même tempe quo ceux obtenus pour la uovo. biooine, qui a été utilisée à'titre de oopara18o.
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-et 1% lAiiufriori ien tJr ani som oUt ( tac .,1' jDrfianlBm da l 8fll tpNMim##MVMM G1"am-nl.hsatl.t .
Racherichia ooli NIHJ eup.& 0 ldilin M1495 aup.à 50 90 Kl'ébâlplia tlttuütal7.t,l Type A 5 13 *?#? a"? tt'1 I!I¯t xl t3 Ï,1 ±1. tix7 . t 6,2' riexnorî lup.à ;0 6,a, 1 .' 5CifJOlfM A stip à 50 5(j"i'fl\ op. l-1î) tbup.é 0 12,' àgr2lialli senti en aup à 50 <t)p.& p0 #######ji'2UU 4bly Pceudor.10no.o 116.L'u!':inODI aup.à 50 <upt& 50 Vi'6rlo " v IlwtchTIi1'kovi1 1 U 0,025 0,1 Orwn-polJl tU' leDx-2D9p 0,003 0,049 f3. aurleus iDA 209P ;3:u1, UT-il) 0,003 0,049 â' clult3ua FDA 209P (UB-H) it56 6t23 St aureus 52-34 <T0, 14, CM, P0-R)0,003 0,1 t'7 'hUr'l'\U3 Siaith utrain 0,006 0,049 ST aureua 193 (pot Ta-11) 0,003 0,049 ST nurcu3 193 ÇPO 1 'C, t Ùt OM-R) 0,003 0,1 ST aurou3 193 PO, TO, Ï34-R) 0,003 0,049 ST 3ur6uo Terajima . 0,003 0,012 .
Ir.' 91bu;l" 0,006 0,049 rrcrococcua elavus 0,006 0,049 .'C I11 logea lot 1001 010,5 0,1 i1e SLl )'.4' 219 0,1 ?. spherrEs 122 0,78 0,1 0 mycoides vu()" ot?8 0,39 r cereùs ÀTQG 10702 3 . 5 0,76 TT 'unthr'1ci t 115 0, i6 0,1 r?ctol)>jcï"nu8 cosel .ti'00 769 ###########IUP$À 50 0,1 L. aGic3orihiina B-406-1 eup.à 50 0,1 ro'i)'tbco.ccu9 fflgc.alla mt"Óptococua 'ttlCZSl 8=55205 3$13 0,39 S. ²YOfpne±1 Typo z 0,78 imrinvoccut3 pnouiiion ne 0 Il it 156 0 78 t' 'G t: r 111II1 W'y'1 Lycobactcgluia p e 50 12,5 Champignon AstHrr:i 11u2 nigex; yan U2Zhec%' rril up. aup.à 50 Nup.à 50 1'enicilliulIl M aupoà 50 eup.t 50 candida" al.V.1 cr tia aupià 50 tUptà 50 Sacçharoiayc 9 a ceravik3ingL tacçharoYcQ 7.'MC'97 8up.A 50 aup.à 50 frlchophytpq F!enta.(r t'l1:L-te! supea 50 t;up.à 50 Abréviations t Iî # résistant PO t p'n101111n.
OU . ntI'optomyciDe EU. r)'th%'omyc1ne ST tstreptothrloine OU * 04rboo1n.
NO a noôbioo1ne 2C tûtrnoycl1ne
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On détermina également les concentration* iDh1- bïtrîceo minimales de la notomyoiM Par la méthode de
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double dilution en tube, en opérant avec du bouillon nu-
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tritif, sauf pour les streptocoques et les pn.umooo,u8. bémol)1:1cl'l.\", qui l'on essaie avo un bouil10D...d'1Dtua:Loza. de cerveau et de coeur.
Les résultats sont groupée ot- dessous en tableau, en môme temps que le rapport 4'aot1v1t' de la noto1n' et de la novobiooinet t9..pR.......omA.a.rhc.,.PM. au la
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Org1etlu ,!BSa !!p9YCIn, .lJpQ;:i Klebsiella pneuaoniaq 3,15 og/al 6,29 og/sal 2 "'""" "#'"""ihs"y9p 0,0019 0,049 52 sïêh:,oCOOQU eraj1m& 0,00075 0,012 StMhyloooQoua aweus r Stehx220QUUI itn- a 0,0015 0,024 16 ffayqinfl luq POl 1001 0,006 0,049 0^x,,aat 0,0007' 0,024 53 "K-1IU 0,00075 0,024 Baollluc oereui ATCO ... 10702 0,78 0,78 pso11us enthroi8 115 o,9 0,199 1/2 '" ype 3 0,049 0,'9 8 R10900uO oUliat !J<1 l 0,098 0,098 1
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Lu notomyuina brr9tar le développement! dot diveratw bactérien 0:L1U1I1-pou1UvOQ, l'exception du 13,,,b.,,: 11! ot des buo111oD lactiques, qui sont donniblen à la novobiooine.
Lu l1otolll;yclnlt out part1ou116rowont activa contre leo atuPtlYlocucluent cette uotivité étant de 10 in
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30 fois supérieure à celle de la novobiocines Elle pré- sente cependant une activité réduite envers le* atapb71o- , coques qui ont été rendus résistants à la novobiocine au laboratoire.
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XntlMen2e- de ula JU-11 ggaaegu: 9n tnibttr9 Mipimal! En utilisant du (souche de Smith) et du 6tapht aureus (souche 193) comme organiaaee d'essai* dans du bouillon nutritif, on procédé à des dilutions en
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tubes avec diverses dimensions d'ineoulua, Les résultat$ dont réunis ci-dessous sous forme de 'tableau et on peut voir que l'influence des inocula importants est similaire à celle obtenue avec la novobiocine.
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Influca, de, le dIncMi on inooulum sur lft..,,O,|ij[
EMI26.5
Onanisme lm ce de Ilicoeulum (cell/rn) d'essai AatioiotiQ XO' , 10 10 LO 4 10g 10 (019 a Uog./MX.)
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<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Notomyoine <SEP> 0,012 <SEP> 0,012 <SEP> 0,003 <SEP> 0,003 <SEP> 0,003 <SEP> 0,003
<tb>
<tb> Smith
<tb>
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sureuls Novobiooine 0,39 0$>g otl95 0,098 0,098 0,098 amith 8.
Aurella Uotomycîne 0,024 0,003 O,OOJ.;o,001.5 O,u,," 0,0015 etrain it aurtug Novobigoine 0OV8 0,195 0,098 0,098 01098 0,098
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<tb> strain <SEP> 193
<tb>
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Ïluenpe mil i ou sur Oonoentgation Inhibitoe Minimale
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J:i Jl'tl'l
On détermine la CIM de la notoayoine par la mé- thode de dilution du bouillon, le pH des milieux étant '
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ajusté à diverses valeurs.
On utilise comme milieux d'eaeai au bouillon nutritif et du bouillon d'infusion de cerveau et de coeur et on inocule dans chaque tube une dilution
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10** 4 'um cultur. de 16 heurta de Btpun. aureue Smith (105 c.ll./#l). comme on peut le voir C1-480'OU't l'.ativ1t' de la notomwine augmente en pH acide et diminue en pH alcalin. Les r'sultuts comparatif a obtenue avec la novobio- cine indiquent que la notomycîne est influenoée par le pH des milieux dans une mesure plus importante que la no- vobiooine.
Influença du pH milieu sur CIM
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Not9oin â2voblo2ipl pp du .. IM et tcg./ar1.
Milieu N' i3Ca HN ln
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<tb> 6,3 <SEP> 0,0001 <SEP> 0,00005 <SEP> 0,024 <SEP> 0,024
<tb>
<tb> 7,0 <SEP> 0,003 <SEP> 0,006 <SEP> 0,098 <SEP> 0,098
<tb>
<tb> 7,6 <SEP> 0,049 <SEP> 0,098 <SEP> 0,195 <SEP> 0,39
<tb>
<tb> 8,2 <SEP> 0,39 <SEP> 0,78 <SEP> 0,78 <SEP> 0,78
<tb>
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605 .r5' 3113 1,56 .6 - BN - bouillon nutritif BCC = bouillon d'infusion de cerveau et de coeur
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1&.tlll2nge., d!l, mllllâ,jsur la Conaentpation Inhibitrioe tf1tql!.
On a étudié cette influence en utilisant quatre espèces de milieux 1 le bouillon nutritif , le bouillon d'infusion de cerveau et de coeur (Difoo), le bouillon de tryptioase et de soja et le bouillon à 1 % d'extrait de levure.
La OIM n'est pas influencée par Ils milieux dont on s'est servi pour la détermination, pour autant qu'on contrôle le pli des milieux.
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nt uennu 8!Ium our la OoX\q,otrntion Inh1bt1'1o. lUnil11) 10 On ajoute des concetitrations croisfiluitea de sérum
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humain à du bouillon nutritif renfermant un tampon phos- phate à la concentration finale de 1/10 M, pour maintenir le pH des Milieux à 7,2.
On utilise comme organisme d'ennui
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du dt2l)hyloopc22.o auèt la dil1l.o!U.ion de Ilincoulum étant de 105 celle/ml@ Corne l'indique Io tableau oi-deesoue, le 011-1 est net Marnent influencé par le sérum Influence, du sérum sur la CIM
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CIL en mok;olmlb xonoentr!tion du sacrum pot9myo1n bi22ln2
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<tb> sans <SEP> sérum <SEP> 0,003 <SEP> 0,098
<tb>
<tb> 2,5% <SEP> 0,024 <SEP> 0,195
<tb>
<tb> 5 <SEP> % <SEP> 0,098 <SEP> 0,195
<tb>
<tb> 10 <SEP> % <SEP> 0,098 <SEP> 0,39
<tb>
<tb> 20 <SEP> % <SEP> 0,098 <SEP> 0,18
<tb>
<tb> 50 <SEP> % <SEP> 0,195 <SEP> 3,13
<tb>
EMI28.4
ot1té d! la notomyaine oontre des stqoQUS ftléj .\U:
tfü Q\1emfJn On examine in vitro des culture variées de Si1!..ur'l (1*> souches), isolées en provenance de sources cliniques, contre la notomycîne et six antibiotiques du comiuerce 1 à savoir la bontylp6nieillinst la dix1- dxoutreptomyoîne, la tétracycline, Ilérythromyoinel la kanamycino et la novobiooine.
Les valeurs de la CIM sont obtenues de la manière suivante par dilution de dix fois en série de l'agar :
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penalbUité de cultures cliniques Isolées (etiaphyloqqquea !Ja jaajtom'yoine ,a<: nmc 6ntibioin'ueB co
EMI29.2
,A.nt'U.otlaux 019 ta-àxlm, 1'Qmrçi1J. gag .ami ::g, 1:
1 lu la à 100 0 0 3 0 0 0 0
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<tb> 100 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 16 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 103 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 1'
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<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 89 <SEP> 2 <SEP> 8 <SEP> 117 <SEP> 123 <SEP> 0
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<tb>
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<tb> 0,1 <SEP> 1" <SEP> 21 <SEP> 0 <SEP> 114 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 122
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<tb> 0,01 <SEP> 52 <SEP> 7 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1
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<tb> 0,001 <SEP> 48 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2
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<tb> 0,0001 <SEP> 21 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
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0,00001 .
1 " 4 0 0 .0 0 0 0 même souche
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PO Benzylpenioilline DU Dihydrootreptomyoint 10 Tétracycline Eu Erythromyoïne KM - kansmycine
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NB Novobiooie Ces résultats indiquant que la KOto#yoin est extrêmement activa contre le* staphylocoques et qu'elle n'a pas une activité antlgon1.t. vin-à-vis d'autres anti- biotiques, On n'a trouvé qu'une souche seulement sur 126
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souches, r4siltant z la novobiooine, et qui soit moins sensible z la notomyo1ne. mais la valeur de la OIM de la notomycine pour cette souche est de 011 mog/mI. i-q--viv2-.ÊUL. lu notosycine Toxicité
La notomycine est un antibiotique de faible
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toxicité.
On a trouvé que la DL50 par voie 1ntr&-musoula1re est de 500 ag/kg pour la souris, Hf fût o hi !ai oth dreuue ou a ttudi4 l1 nativité in vivo de la nntomyoine
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chez la écurie, contre l'infection, expérimentale par Bouche de Smith. On a infecte des
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sourie par voie intra-p6r1tonÓal, avec 100 foie la DL 50 de l'agent pathogène et on a administré l'antibiotique par voie intramusculaire ou perorale, juste après l'attaque
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bactérienne.
On a obtenu une seule valeur intra-muaoulaire de la DO 50 (50 /c de la dose curative) de 0,3 mg/kg# et une seule DO,, perorale de 415 Mg/kat Dans = essai comparatif, on a trouvé que les valeurs intramusculaire et perorale
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de la D05, sont respectivement de 6,0 mg/kg et de 30,0 mg/kSI Les résultats sont expoe6a ci-donnous .Effet chimiothtapeutic d$ 1 notoM.yne 'X'tlp.,UtiJ1!a ntramungulaire
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<tb> Dose <SEP> en
<tb>
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57--s JOVOItY$'nt {9yoQç!nt
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<tb> 50 <SEP> 5/5' <SEP> 6/6
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<tb> 25 <SEP> 5/5 <SEP> 6/6
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<tb> 1, <SEP> 5 <SEP> 5/5 <SEP> 4/6
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<tb> 6,25 <SEP> il/il <SEP> 4/6
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<tb> ',la <SEP> 6/6 <SEP> 1/6
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<tb> 1,
56 <SEP> 6/6 <SEP> 0/6
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<tb> 0,78 <SEP> 12/12 <SEP> 0/6
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb> 0,39 <SEP> 4/6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,19 <SEP> 1/6
<tb>
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<tb> 0,10 <SEP> 1/6
<tb>
<tb>
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<tb>
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<tb> 0,05 <SEP> 0/6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Témoin <SEP> 0/iL, <SEP> 0/12
<tb>
EMI30.7
* Nombre do ourla iàyiuit mitrvécu / Nombre de "ourla infestent
<Desc/Clms Page number 31>
EMI31.1
Effet çhimiot,héàn2¯utiLug, de la 'Uot2rnyoîL r ligus nel2Eal2
EMI31.2
<tb> Dose <SEP> on <SEP>
<tb>
EMI31.3
M&4e Notom,yoin â2veblegln
EMI31.4
<tb> 100 <SEP> 5/5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 50 <SEP> 11/11 <SEP> 6/6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 25 <SEP> 6/6 <SEP> 6/6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12,5 <SEP> 6/6 <SEP> 5/6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,
25 <SEP> 10/12 <SEP> 1/6
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,12 <SEP> 1/6 <SEP> 1/6
<tb>
<tb>
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<tb> 1,56 <SEP> 0/6 <SEP> 0/6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,78 <SEP> 0/6 <SEP> 0/6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Témoin <SEP> 0/12 <SEP> 0/12
<tb>
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La notoayoine aat un agent utile pour le traite- ment de la mammite dans les cas de diarrhée des bestiaux
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ou des veaux; on de sort par exemple à oet effet de auspon- lion. dans une huile végétale, à lantiller dan*-Ion tétine$ pour traiter la mammite, et renfermant de 1 à 1.000 ag/ml, et de préférence 50 mg environ de l'antibiotique, ou exen
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.utt1oamm.nt de capeulec pour Garnir une dose totale de 0, à 2,0 8 pour l'adm1niatration perorale, par exemple de la diarrhée des veaux.
Quand on le désire pour des application parti-
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oulières et une fois qu'on les a rendus pharaMeutiquement compatible., on peut M61anger avec les com?Atds de la pré- sente invention d'autren médicaments comme des antihistani. nique$$ des sulfamides (par exemple la sultadiatines la aulfabentamide, la eult.c'tù4., la sultanilamide, la .ult.p141n't le aultathlacolt la aulfapyratine, la culte- suanidinst la sultathalîdinob la tultaouxidint# le nul-
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tinoxasol, le sultaM11on, la phtalyleulfacétamidéi la U'.',4-dimôthylbenzoyl-Dullan11amide.
la bQnI11-lullanrla-
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mido et la des agents
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lipotropiques (en particulier la méthionionînel la ehlolne, l'inositol et le bêta-aitootdrol et leurs mélange*), des
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stimulants du système nerveux central (par exemple la
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caféine, des amphétamines, des unenthéniques locaux, des analogiques (par exemple l'aspirine, la salicylamidet le Sontîsate de sodium, de p-aoétylam1noph6nol, la phénacétinst la codéine), don s6dat1ts (pur exemple des barbiturates,
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des bromures), des sala de la benzyl pénicilline (par exemple
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le dérivé potassique de la pénicilline G, la prooaTne pé- nicillino 0, la l-ÓphJnW:l1no pénicilline 0, la diboncylamine
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pénicilline G, et d'autres suis décrits dans le brevet des
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Etats Unis d'brique NO J.627.491 du ;
ce*
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mélangea sont particulièrement intéressante pour permettre
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de faire varier les taux Quinquina obtenue), la ph'nox;ym'thI1- pénicilline, In phanéthieillines la méthicillinet l'oxacil- Une* la cloxoilline, lu natoilline, la c4pho.lotb1ne et d'autres pénicillines tlYlltih.jt.1quo et leurs Mêla, d'autres aimanta untibiut.iqueo lhll1 oKcunplo lu streptomycine* la dihydrOD1ireptOL,yc1ne, la bacitracine, la polyuixint, la tyrothricine, t l 1 {;rythNl,uyc 1ua la chlorotütruoyullne, l'o.x.;rtJtl'ncyc11nu, lu tutr'oyclinu, l'ol:u1(1ol41c1no, le cblormnph6nicol.
In m.-iiiumycliio, 1:" wJyoù1oc1no, la oyolo'- e61'lno. lu nl.om$1u(j. la i;...I.J.C1ul,'fIJin4.1; (I.&IIU oort.J1ho cas ces mélUf'-±1;elJ abluquolit uno t;:.1IJ1JJO pluo ,)t<JnJuu Ù 'ol'gau1aw"to ou bien font pruuve d'une ofl'1ow=! tJ s,yu<.Irt;é.-tiqUat. ou bien ont une toxicité Moindre z effioacitu ÓIl.&h), des vitamines (par exemple u, A, ali 13it B, B t deM ruproawntttnta de cette famille, l'acide i'oUque ot des roprécojitants de oatt@
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famille des vitamines cl, D2, D5 et bzz des hormones (par exemple la oortisone, 1'hydrocortisone, la 9 aûaw'xuara
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cortisone, la 9 alpha-fluorohydrooortisone, la prédaisoaa et la prédnisolone), des agents aoboliques (par excelle la ,i,,x7d,hydraxy ..alpha s.uara l alpha"méthyl-4-aAdpostene- 5-onô;
la 17 ulpha-éthyl-19 nor-toutoi3térons), et des agnta antifungiquoa (par exemple la myooatatine).
L'antibiotique de la présente invention constitue
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un ozont utile pour déceler la contamination par des bacté- ries Qrum-n6at1veg, des ahump,nane, des levure*, Ito, au cours de la production industrielle des ensymot btreptoki- nase et Streptodornase par culture de 3txeptooaquea et la production d'amylase par fermentation de 'wsubt1l! ou de . cereua. Ainsi le fait d'ajouter de 1 à 1.000 mcg/ml et de préférence 10 mog/ml environ de l'antibiotique de l'in- vention à une partie aliquote de milieu inoculé, puis en faisant suivre d'une incubation, on peut développer des impuretés indésirables et les déceler à l'oeil nu.
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B..J.JL!LJ1JI A. Procédé de production d'une substance antibiotique,
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désignée sous le nom de notontyoine, caractérisé par les pointu suivante, pris isolément ou en combinaisons 1) On cultive une souche de trtPomY'1 1thi1.: 11a dans une solution aqueuse d'hydrates de carbone renier- tant un agent nutritif azoté, en milieu aérobie immergé, - jusqu'à ce qu'une activité importante envers des bactéries
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arumpaaiivaa soit communiquée à ladite solution, puia on récupère la notomyoine à partir de la oolution.
2) L'organisme eut le iltreptoluyope rblr1eOB'.
A.TtO.C. 14.812.
3) On aépure 1,nnt1b1ot!.11UO notomyaine du bouillon
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de fermentation par extraction à un pH acide de cet antible- tique à l'aide d'un solvant non miscible à l'eau, dans le- quel ledit antibiotique est soluble$
4) On concentre ensuite le solvant renfermant la
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oto=1Cin..
B.A titre de produit industriel nouveau, une substance antibiotique efficace pour inhiber le développement de bactéries Gram-positives, caractérisée par les points suivants, pris isolément ou en combinaisons :
5) Bile est choisie parai le groupe constitué par
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une substance acide, la notomyoine, qui est facilement soluble dans l'acétone, le dioxanne et l'eau alcalines mo- dérident soluble dans l'éthanol, le butanol, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle et la méthyl isobutyl oétone, moins soluble dans le benzène, le méthanol et le chloro- forme, et insoluble dans le tétrachlorure de carbone,
l'éther de pétrole et l'eau acide, qui donne des réactions de Feh- ling et de Molisch positives, décolore le brome et donne
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une réaction avec la ninhydrine, une réaction de Tollens et une réaction avec l'anthrone négatives, et qui sous forme
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purifiée fond à 222-224* 0, a un alpha 20de -134* (0 . 1,0, acétone), présente dans l'éthanol des spectres d'absorption dans l'ultra-violet ayant des maxima à 275 millimierons ' (m am - 595) et z 335 milliolierons (3 1 P. 498)9 dan.
H01 N/10 des maxîma à 275 millimicrons (1 i m . 287) et à 349 mil,im3,aranr (111 t ou w 277) et ayant dirir fet3i N/10 un maximum à te30 millimiorons (1 i :# . 766), a UA équi- ! valent de neutralisation de 548 et dont l'analyse élémon- taire moyenne est la suivante 0 " 99,1 96i H ,3 %# N - 5,90 % et O (par différence): 29,65%; et qui lorsqu'elle
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est Paettllée avec du bromure de potancium Présent$ dan. la région infra-rouge du spectre une absorption caracté-
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rintique et leu solo de cette substance acide.
6) Le sel de sodium de ce compose.
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7) Le sol de ouloitm de ce compose.
8) Un sel de de compose et d'une base organique non toxique.
9) Un sel d'aminé de ce componé.
10) Le sel de streptomycine de ce composa*
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11) Le sol de 41hydx'oatrePtomyo1n. de ce oompond.
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process for the preparation of a new antibacterial agent
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The * invention in relation * to a new and useful substance called notomyeia, thus * * # *,
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a process for its production; it concerns more by-
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particularly a process to produce it by t'f # .na-
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tion and methods for recovering and purifying it *
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The invention is aimed at this acid antibacterial aaent and its alkaline 0410 in dilute aolutioa, we form crude ooncentr44, .ou. purified solid product form and 10 = 0 cri $ tal11n. pure. Natamyaine is effective in inhibiting the growth of Gram-positive bacteria ...
The notomy-
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cine is not torque and it manifests a therapeutic effect.
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can in mice Infected with Ga # - positive bacteria. Notomyoine is also useful in curing # in human $ the infections caused by det
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Gram-positive bacteria, eg pneumonia. The
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natomoina has also been referred to as the antibiotic Du 620.
The Applicant now provides, ocaforméoeat to the present invention, an effective antibiotic substance.
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cient to inhibit the growth of Gram-
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positive, selected from the group, ooaetituee by a sustained acid stance, notoaycine, which is easily soluble in acetone, d10xane and alkaline water, moderately
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soluble in ethanol, butanol, ethyl acetate,
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butyl acetate and mithyl l80but11 oétoae, less soluble in beneône, methanol and ohloroferme and
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insoluble in carbon tetrachloride petroleum ether and acidulated water, which gives reactions of
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Fehling and ldaliaah positive, discolors bromine and gives negative reactions with nlnh74rine, Tollens and anthrone,
and which in purified form melts at 222-224 "z un; lPh! 7 of -134 * (0 - 1.0i acetone),
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exhibits an ultra violet absorption spectrum in
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'ethanol having maxima. 275 millimicrons (2 | Ja 595) and at 555 millimierons (1 ex si 498) in Hal If / 10 having maxims at 275 taillimic = no (n 1 * ffl - 287) and t '4' = il- limicrons (1 Ja 277), and in Naon N / 10 having a maxi- aum at 280 willioiorons (m 3 '- 766), has a neutralization equivalent of 548 and whose mean elemental analysis is as follows 0 w 59 # 1% î H. 5155%;
N m 5tgo% and 0 (by difference) * 29.65%; and when we pellet it in
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potassium bromide exhibits caraotdviatic absorption in the infrared region of the spectrum; as shown in Figure 1; and mixes them with said acidic substance, referring to the drawings
Figure 1 is a plot of the infrared absorption spectrum of notomyoine, free acid, when pelletized in potassium bromide.
Figure 2 this a curve of the spectrum of absorp-
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tion in the ultraviolet of notomyoine in solution in ethanol, 0.1 N dbna H01 and in 0.1 N NaOH.
The Applicant further provides, in accordance with the present invention $ the method of producing a
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antibiotic substance called notomyoine, which consists in cultivating a layer of tr, omy "itbr, n8ft in an aqueuna carbohydrate solution containing a nitrogenous nutrient, in an aerobic immersed medium,
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until 1ptte activity towards Fat-positive bacteria is imparted to this solution, and notomyoine is recovered from this solution.
The organism producing the antibiotic of the pre-
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This invention is isolated from a soil sample collected in the island of Richirit Hokkaidot Japan, and it con-
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identifies a new species called tretoilo's ish1, n! Lot of the genus Strectomyces. A culture of the living organism, to which has given the laboratory designations 404 y 3 and A 979 ;, has been deposited in the American Type culture Collection, in Washington, D # 0.9 Biais-Unie 41 AM4- rique, and has been added to its permanent collection of micro- ', Organisms $ OR the designation of A.Iri.0.0j, 14812.
The characteristics of the mouth representativet. 404 Y 3, from 8. rishirenais. are the following! PAHA0T8RIOTIQUBB. PB OUX / PUft $.
C a growth 6 '- soluble pigment A a Aerial mycelium B a biochemical property 1. Czapek agar moderate, yellowish gray. to light brownish gray, or ivory yellow At poor, powdery, white S: none
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2o u of Oeapek at moderate cg, yellowish gray or gyyrool light brownish gray to pale yellow with slightly pronounced brown A; mediocre, powdery, white S: none or light yellowish brown not very pronounced
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3. Asar with glycerol and nice moderate bone, from yellowish gray to clear ammonium to yellowish white
A: scarce, powdery, light yellowish gray to light gray.
S: nothing
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4.Ear to glucose and ot poor, thin, shiny, asparasin Light yellowish gray
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A: none
S: none 5. Agar @ 1 .starch C: good, with pale yellowish cries. ivory yellow
A: moderate, powdery, not spreading, from washed brown to light brown with gray
S: nothing
B: hydrolysis is moderately strong 6. Nutrient agar C: moderate, burnt umber to brown
A: mediocre, powdery, white.
S: dark brown 7. Bennett's Agar C: moderate, from greyish olive brown to greyish brown
A: moderate, from white to light brown to brownish gray
S: yellow brown, S: flour agar C: good, yellow pays with oat brown and boyton wash
A: moderate, white to gray with faded brown
So pale yellow with faded brown
9. C apple cap: good, shiny, earthen surface wrinkled
A: none
S: the plug turns brownish black 10.
Pitting on gelatin C: brownish black colony on the surface
A: none S: dark brown
B: negative liquefaction
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11 Sting on gelatin at C: brownish black colony with tyrosine yeast surface
A: none
S: dark brown
B: negative liquefaction 12, Milk Ci formation of a brown ring * tre
A: none
So faded brown
B: undigested 13. Nitrate solution Ci white granular mass on the surface
B: reduction to positive nitrite.
14. Training media C: aediooric, thin, grayish melanin black
A: rare, blano
S: brownish gray to greyish brown
B: melanin positive, 15. C dextrose agar: good, shiny, dark brownish potatoes
AT:
moderate, white to pale pink to pale brown with washed hair
S: shout or shout hot.
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muotillsàej ± n 9, .o 2.0mge of oeyipono
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XIVVI-000 ++ Inulin t "t 'Arabiaose ++ salloine Olucont ++ Manaitol Qalaotone ++ Sorbitol Fructose -' ')' 0 <llobia Scrbose Rh & cmc'Nt r + sucrose + <- boa citrate = 1; aai ** 8uoo , uxtr de sodlua -t- Laatoee - * "'- lucaitol + # Raffinons + * Witness
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++ m good growth + fair growth t * questionable growth
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- M no growth
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paraatg'8 molq1Qu. The morphological properties of the strain were observed on starch agar and on Bennett's agar.
Microscopic examination of the aerial mycelium reveals entangled and branched hyphae, sometimes in tufts, and aporophorea which produce sinuous spirals. On examination under a microscope the spores are found to have a
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elliptical to oval shape and smooth surface *
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3Gratomvcer 41a Y 3 has an aerial mycelium
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brownish gray ot it produces a brown or dark brown pigment on organic media. The liquefaction of gelatin is negative both as a prick on the gelatin and as a prick
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on Sdlatine with tyrosine and yeast, and it shines
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is not digested * Nitrite forms from nitrate and starch is hydrolyzed.
Strain 404 Y 3 resembles
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di, rnta.nclrō. to 8. sriaooruber, to 8. r al1voohro,:, m ('} fenop, to S. nUl "!: 1Ut., b to U. r; rifJoochroItIO [Emo .1 to t3. ha-
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waiiensis and 3. nasanish & some points of view, such as the formation of npiralou, the color of the aerial mycelium and the pigment m61anotde, but it differed from it in certain cultural and physiological properties, as indicated below. didd'tgS :, According to Waksman and Ourt1s, the aporophorea are straight and according to Jonsen, it forms sin-
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strorsua. The color of the aerial mycelium is indicated to vary from white to ash gray on Osapek's act and is
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gray on Q8ar with glucose and asporagin The bite quifaction in gdiatin is quite rapid.
8 * ¯.iip; riseoru'bert It is stated that the spores have a cylindrical shape. The color of the development is reddish orange on Ozapek's agar and adorned reddish olal to reddish purple on starch agar. Differences in the use of carbon sources are also found.
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such as sucrose, raff.nvdd, citrate and 8uo01- matte S "oli .."! 9ch.t'Qrnor: en.
Differences are found in developmental color, soluble pigment in glucose and asparagine agar, and in the digestion of gelatin and milk.
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S. jaureus Developmental color is dark brown on Ozapek's agar and gold -. AnsÓ light on 3.4aaar on glucose and asparagine. The gelatin liquefies quickly and then slows down later.
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grieQOahrçloe: lJne The color of the aerial mycelium ranges from white to gray
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clear neutral. The liquefaction of gelatin is .04 '' ..
Milk did not coagulate. Differences were also found in the use of carbon sources * such as rhamiose, inulin, salicin, citrate and auccinates. Hawaiians ta The color of development on glucose aga * and Aspuraaine is light brown, and aerial myoeus ranges from blano to gray. Ditrivenota are also found in
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The use of carbon sources such as sorbitol and
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the l3uoo: l.nate. ti's., n2, eiiniuh.à The color of development on igar & starch is cranium with rouseutte violet and the soluble pigment on starch aga est- rosy weak: *, Gelatin this mode- retains liquefied milk is coagulated and poptonjui. Differences are observed in the use of carbon sources, such as acarOBe and sorbitol.
In order to choose Bites with high productivity, we proceed to irradiation of pure ultraviolet light in the primitive strain and we choose mutant colonizers. One studies uycolofjiquamont among these layers cer tuina dpjj-lua strong producers, but one does not observe any
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notable difference except that we get something. touches of white aerial mycelium.
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In view of the above-mentioned characteristics of this strain, it was decided that Utroptomyces 404 Y 3 eon "caused a new outbreak and it was designated 8treptomyees Ziahirîenais nov. Sp.
The species UtreptoNyeea described here-% dot includes all strains of streptomyoea which form
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, notomyoine and which cannot be clearly
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, 41 * f ereneées of the layer Ni 404 Y 3 and its aoufaulturea,;
including mutants and variant $$ The properties of netomycin are deopiton ioi-inûrae and, although these properties are known, it is easy to differentiate notomyoine-producing strains from others.
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The., Of3-tjoi, vitncigt cultivated under suitable conditions * product of notomyointo A fermentation broth containing notomwine is prepared by inoculating sports or myoelia of the organism producing notomyoine in a medium. appropriate, and then growing under aerobic conditions. It is possible, to produce notomyoine,
to grow on solid medium, but for large quantity production, liquid medium is preferable. The temperature of the culture can be varied over a wide area, between
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20 and 550 0, in which the organism can and grow, but a temperature of 26 to 300 0 and the pH being substantially neutral are preferred.
In the submerged aerobic fermentation of the body to produce notoayoine, the medium contains as a carbon source a commercial clyeeride oil or a carbohydrate such as
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ClyC6rol Glucose, maltoses, sucrose, lactose, dextrin, starch, etc., in the pure state or in the raw state, and as a source of nitrogen an organic substance such as soybean flour, produces them distillery solubles, the.
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peanut flour, Craines flour:
cotton wool, meat extract, peptone, fish meal, yeast extract, mate maceration water, etc. and, if desired, mineral sources of nitrogen such as nitrates
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and ammonium salts, and mineral soils such as chlo.
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rare sodium, potassium chloride and sulphate
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potassium, as well as s-buffering agents like calcium carbonate or phosphates and traces of heavy metal salts;
these constituent elements of the medium include those listed in Canadian patent 513,324 and in the British patents
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N 730,341 du and 736,325 du and in the patents of the United States of America J. 2,691,618 du, 2.6S.t7,8 du, 2,653,899 du, 2,586,762 du t 2,516 * 080 du, 2,843,892 du 2,609,329 of, and 2,709,672 of. His culture
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aerated submerged, an anti-munse agent such as liquid paraffin, fatty oils or a silicone is used.
More than one kind of carbon source can be used for the production of notomyoine. Cultivation is generally continued until at least several hundred mcg / ml of notomyoine have accumulated in the medium. In some cases the pH of the broth decreases initially and then rises slightly.
The following examples are intended. , illustrate this invention, but not limit it.
EXAMPLE 1 The fermentation conditions suitable for the production of the antibiotic referred to as noto are studied.
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myosin and the following composition of Medium. is useful in shake culture 1.5% soluble starch, 2% cottonseed endosporm meal (Fharaamedia), 0.1% K2HPOlf .. 0.1z laOl, 0.05z5 * % 6 (> v 7 8201 0.05% Oa012 '0.001 i ZnS04t? H20 and 0.% yeast extract.
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Notomycin is digested within 3-5 days of fermentation with adequate aeration and agitation, and activity is found in both the broth filtrate and in the mycelium. We dose notomyoine against
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taphylococcuB aurus IDA 209 P by the paper disc or cylindrical plate method.
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example Jo The submerged aerobic fermentation of S. ri8hirie & - 'aie (strain 404 Y 3) in shaken flasks, in a medium containing 6% starch (Staclipae J), 3% brewer's yeast freed of its bitter ingredients and 1% of Oa003 'gives 300 & 400 raog / m3, of notomyoine.
EXE! .Fi) LI 3 The submerged aerobic fermentation of, 8 "," iahir, i ": sis (strain 404 Y 3) in shaken flasks, in medium containing 6% starch (Staclipae J) 3% flour of-
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cottonseed sperm (Miarmamedia), 215% soluble distillery product and 1 tt of OAOO gives 150 to 200 mcg / ml of notomyoine.
. & JXE1 \ ÍPLE 4 The submerged aerobic fermentation of, r1ship1n1J! (strain lez Y 3) in shaken flasks, in a medium containing 1.0% soybean meal, 2% cottonseed endosporma flour (Pharmamedia), 2.0% soluble starch, 0.5 % glycerin, 0.2% yeast extracts, 0.2%
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K2 "PO4 '0.1% MgS04' 1.0% OaOO, and 0.05% defoamer silicone, gives pU?, 0 of # ¯¯¯¯¯¯ .... rtaGuya. ao of the following rauniôre!
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Duration Iili z
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<tb> 5 <SEP> (days <SEP> 7.8 <SEP> 70
<tb>
<tb> 6 <SEP> Days <SEP> 8,1 <SEP> 80
<tb>
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7joura 8t3 120
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mM? .mm pnltituo.nts d1fmW!. \ 1 '/ Soybean marinates 2.0% Glycerin 1.5% Yeast extract 0.2%
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Dipotassium Phosphate 0.1.
0.1% sodium chloride
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Calcium chloride 0.05% Magnesium sulphate 0.09% Zinc sulphate 0.001% pH 7.0
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100 ml of a culture containing the above components are sterilized in a 500 ml flask, this medium is inoculated with a seed culture of the sri2top to rit3hirioU strain 404 Y 3 and cultured at 27 t 10 0 for 6 days by shaking it, whereupon the formation of nototayoin in the fermentation broth reaches 150 mes / mi.
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9 = 110LIC - - 9.ens1ii tum} tar du uIpilioM Cottonseed endoapcrme flour (Pharaaaodia) 2 0 S Soluble starch 1.5% Yeast extract 0.2%
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Dipotagoic phosphate 0.1% Sodium chloride 0.1% Calcium chloride 0.05% Magnesium sulphate 0.05% Zinc sulphate 0.001%. pH 7.0
100 ml of a culture medium containing the above components were sterilized in a flask with a volume of 500 ml, inoculated with a culture of on-
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seed of 3treptom, yceg i'Jiah1tqnu11 404 Y -30 (which is a mutant strain of 404 Y 3 obtained by irradiation
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with ultra-violet rays),
and cultivate it at 27 t 10 0 for 9 days by shaking it, whereupon the production of notomycin in the fermentation broth reaches 400 mog / ml,
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30 liters of a culture medium containing the same components as in Example 6 are placed in a stainless steel tank with a volume of 50 liters, inoculated with a seed culture of LtÙ2m.Ug2 rishiriansis and it was grown at 28 × 10 0 for 1 hour, whereupon the production of notomyoine in the fermentation broth reached 120 cog / ml.
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5 liters of fermentation broth are filtered
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PU 8.0, adjusted to 6to 1 * pHfiltrate and extracted
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with 2 liters of methyl isobutyl oetone. We extract the
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Cake c'11.n with JK> 0 al acetone with vigorous stirring, and the all drained extract is evaporated to remove the solvent. The resulting aqueous concentrate is extracted at pH 6 with koO ml of methylioobutyl ketonoi. The two ketone extracts are mixed, washed with 500 ml of water,
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then we run the activity donates 1000 liters of water
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cold whose pH has been adjusted to 10.0 with hydroxide
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sodium. The pH of the aqueous extract was adjusted to 6.0 and
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we extract it again with OO ml of ethyl acetate which we empty to 30 ml.
Zn adding 150 ml of ether
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petroleum in concentrate, a light brown amorphous precipitate appears} it is collected, washed with small
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amount. of methanol to remove colordes impurities and it is dried, which gives 750 mg of notoayaine under
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form of a powder.
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400 mg of the powder de'notoayoine thus obtained are dissolved in 100 ml of ethyl acetate and adsorbed on a column of a0 g of alumina previously treated with sulfuric acid. The column is washed with 200 μl. ethyl acetate and eluted with methanol. We collect '*
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the eluate in fractions of 10 ml, the fractions are mixed
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active and they are concentrated uouo empty up to o1oQ1t6. We reCtiStUllISe notomyoine twice in methanol
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solid of pale yellow color thus obtained, which gives
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70 g of crystalline uotomycin blfJnùhJ, which shears. 218-210 * 0;
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by decomposing.
EMI17.18
The notouyoine was further purified by the Oraig technique of distribution b counter-ouut using a
<Desc / Clms Page number 18>
solvent system of 5 parts (by volume) of carbon tetrachloride, one part of chloroform, five parts of methanol and one part of water. After 50 transfers, the maximum concentration is found in tube N 26, by the biological test curve, by the ultra-violet test curve and by the weight curve; this * curves agree with the theoretical curve.
By freeze-drying 10 tubes around this maximum, pure notoayoine is obtained.
Notomyoine was also purified by recrystallization from aqueous acetone followed by absolute methanol to give a substance melting at 220 0 on decomposition.
Notomyoine was also purified by alumina chromatography, in which 39.7 g (activity 500 mcg / mg) was dissolved in ethyl acetate and adsorbed on 2 g of Al2O3 (pH 4, 7, treated with H2SO4).
After washing the column with ethyl acetate, it is eluted successively with methanol and then with acidic methanol. The active fractions were mixed, neutralized, concentrated in vacuo and then lyophilized to give 12.4 mg as a pale yellowish powder (activity 700 mcg / mg);
480 mg of notomycin are treated with a small amount of activated charcoal in scetonic solution, then recrystallized from hot ethanol, which gives 230 mg of crystalline notomyoine, which is dried under vacuum for 3 hours at 50 ° C. .
Melting point 222-224 0 (with deoomposition); pKa 6.32 in 75% acetone. Equivalent to titrations 526.5 Analysis. Calculated for C26H26N2O10: C - 59.35 H - 4.98 N - 5.32 Found: C - 59.1 H - 5.35 N - 5.90
<Desc / Clms Page number 19>
Molecular weight determination by
EMI19.1
the ovysooopic method in dioxane gives a value of 500 20. te specific rotatory power $ & pha7 | is -134 $ 40 (0 - 1., acetone), in C., ara1.oA with -69.6 'for novobicein under the same conditions. Notomyoine gave a negative reaction (brown) with anthrone, while novobicelne gave with anbron. a positive (green) reaction.
EMI19.2
A solution of 100 mg of aotoayoine in 120 ml of absolute ethanol is stirred with 0125 g of Adam's catalyst, under atmospheric pressure of hydrogen, pen- '. including 30 minutes at room temperature. Almost no hydrogen absorption is observed. After separating the catalyst, 35 ml of water are added to the filtrate with stirring.
EMI19.3
energetically. Adding to the 100 ml solution of normal hydrochloric acid precipitates a white solid product; we collect it, we dry it and we find that it weighed Sa, 7 mg, and that it is the original starting product,
EMI19.4
that is to say, noto01n., as confirmed by the 6bvoma- tographis on paper.
Under the same conditions, 1,000 of novobiooine give 946 mg of dihydronovoblocinst as
EMI19.5
This is confirmed by the ohrOma'co! raph1Q.ue analysis on paper, in accordance with the OF.J. Wolf et al., Antibiotics Annual, 1956-1957 # page 1035).
Notomyol gives positive Pahling and Moliboh reactions and clogs bromine. The reaction with ninhydrino # the reaction of (Pollens and the reaction with anthrone are negative.
The paper strip chromatography of the
EMI19.6
notonyoine gives the following results!
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Moist M lutanol Vnlaur Solvent System 0.15 Ohlorurw 9S Aqueous Solution
EMI20.2
<tb> ammonium <SEP> 0.03
<tb>
<tb> Phenol <SEP> to <SEP> 75 <SEP>% <SEP> 0.95
<tb>
<tb> Acetone <SEP> to <SEP> 50 <SEP>% <SEP>. <SEP> 0.75
<tb>
<tb> Butanol-methanol-water <SEP> (4: 1: 2) <SEP> +
<tb>
EMI20.3
2% methyl orange ## 0.45 Butanol-methanol-water ($ 4 192) 0.40 Benz6ne.-methanol (4il) oto5
EMI20.4
<tb> Distilled <SEP> water <SEP>. <SEP> 0.05
<tb>
EMI20.5
Butanol-water (4:
1) + 0.25% p-tolueneaultonic acid 0.30 ButaNol-water-aoetic acid (21111) ot5o Butanol-water (4tl) + 2% pipdridine 0.25
EMI20.6
Notomyoine dissolves ta1lam.nt dani 1 '& 0'- tonot dloxanno and alkaline water, they have aoderately soluble in 1 $ 6 ethanolt butanol, ethyl acetate butyl acetate and methyl ketonal i8obu1 it this minus 80Juble in bonsènet, môthamol, and chloroform, and it is insoluble in carbon tetrachloride, petroleum ether, and acidulated water.
EMI20.7
As shown in Figure 2, notoayoin exhibits an absorption spectrum in the ultra-violet comprising the following maxima
EMI20.8
Maxima in ethanol zon5 mil11m1cronl - (3 | Jft m 595) 335 ml111m1orons (1 i JR * 498) Maxiaa in HOI 1;
/ 10 275 millimiorone (1 t: a. 287) 345 milllmiorona (1: .. 277) Maximum in NAOU H / 10 280 mil11miorona (0 c "766)
<Desc / Clms Page number 21>
As shown in Figure 1, the notomyoine, pu * -
EMI21.1
used in bromide d. p.taS / sima, presents l1U1X1111.1. absorption characteristics in the infrared at the following wavelengths, expressed in microns:
EMI21.2
'2.99; 3.36 ('paul.mont). 3145; 5.88 (shoulder); 3.92; 6110; 6.24i 6 $ 451 6 ,; 6 #? 17.2; . -7.63; 7s85l 8.9} 9t2 $ 9.6; 10 # 05; 10.3! 10.6; 11b> i 12 # 251 12.65; 1> #I; 13.39.
Thus notomyoine and novobiooint diffe "easily, for example by the melting point, by elementary analysis, by the specific rotatory power,
EMI21.3
by absorption 1.ur.piQtre8 in the ultraviolet and in the infra-red, by the reaction with anthrone and by their behavior in chromatceraphit on paper bunde.
Notomyoine is an acidic organic compound which is readily soluble in alkaline solutions, such as aqueous solutions of alkali metal hydroxides and
EMI21.4
alkaline-earthy. For example, a solution of nataayoisre in an aqueous solution of sodium hydroxide or calcium
EMI21.5
oium forms respectively I alone of sodium or calcium, which can if desired be isolated, for example by lyophilization.
Salts are formed in an analogous manner with organic bases; the addition of streptomycin or
EMI21.6
from dihydrostreptomycin bases to netoo1n. respectively forms the streptomycin and dihydro-streptomycin salts of notomycin; it is convenient for this reaction to use an organic solvent such as ethyl acetate. Other amine sols which can be used include those which are used therapeutically in all form of salts of penicillin, for example procaîns,
EMI21.7
of N-bansyl-bata-phdndthylamine, of hydrabamins, of phenomine. of N, N '- <Hbons: yl6thylenediaroine, dehydroab16tamine
<Desc / Clms Page number 22>
and dicyclohexylamine.
The acidification of an aqueous solution of the sodium derivative of notomycin is removed to precipitate the purified notomycin in the form of free acid.
A preferred method of isolating notomycin from fermentation broth is to extract the entire broth at pH 6.0 with half of its volume of methyl ieobutyl ketone, to be re-extracted at pH 10.0 in liquid. water (a quarter of the volume of the methyl isobutyl ketone phace), and to be re-extracted at pH 6.0 in ethyl acetate.
/ the or in methyl isobui-yl ketone (one third of the volume of the last aqueous phase), The final concentrated solution of notomyoine in the organic solvent is then concentrated by vacuum distillation to tenth or twentieth of its original volume. The notomycin is coated on precipitated and if it does not precipitate spontaneously, adding mixed lower alkanes, for example by adding 10 volumes of Ukellysolve B.
The notomyoine is also easily recovered from the broths filtered by adsorption on activated charcoal (Daroo KB), then by eluting the latter, but this way of operating is not superior to the extraction of the total broth. with a solvent, since in many broths most of the notomyoine is in the mycelium.
Microbiological studies them- Notomycin antibacterial activity in vitro
The minimum inhibitory concentration (MIC) of notomycino in varied microorganisms was determined by the dilution method or dune agar, using horse arm agar for streptococci and.
<Desc / Clms Page number 23>
EMI23.1
the tiresNoooquea h'olft1qu,
ut of jeagar with SJUOOO * T with yeast extract and 1 lu peptone for the feaoillts 140tiquois nutritive agar for other baot'r1. "from Ilagar de Sabouraud to 2 Glucose for the ohamp1SAoni and broth of K1rhn.r for tuber- culosis bacilli The results are collated below in table format $ Same as those obtained for uovo.bioony, which was used as oopara18o.
<Desc / Clms Page number 24>
EMI24.1
-et 1% lAiiufriori ien tJr ani som oUt (tac., 1 'jDrfianlBm da l 8fll tpNMim ## MVMM G1 "am-nl.hsatl.t.
Racherichia ooli NIHJ eup. & 0 ldilin M1495 aup. To 50 90 Kl'ébâlplia tlttuütal7.t, l Type A 5 13 *? #? a "? tt'1 I! I¯t xl t3 Ï, 1 ± 1. tix7. t 6,2 'riexnorî lup.à; 0 6, a, 1.' 5CifJOlfM A stip at 50 5 (j "i'fl \ op. L-1î) tbup.é 0 12, 'àgr2lialli felt in aup at 50 <t) p. & P0 ####### ji'2UU 4bly Pceudor.10no.o 116.L'u! ': InODI aup.à 50 <upt & 50 Vi'6rlo "v IlwtchTIi1'kovi1 1 U 0.025 0.1 Orwn-polJl tU' leDx-2D9p 0.003 0.049 f3. Aurleus iDA 209P ; 3: u1, UT-il) 0.003 0.049 â 'clult3ua FDA 209P (UB-H) it56 6t23 St aureus 52-34 <T0, 14, CM, P0-R) 0.003 0.1 t'7' hUr'l '\ U3 Siaith utrain 0.006 0.049 ST aureua 193 (pot Ta-11) 0.003 0.049 ST nurcu3 193 ÇPO 1' C, t Ùt OM-R) 0.003 0.1 ST aurou3 193 PO, TO, Ï34-R) 0.003 0.049 ST 3ur6uo Terajima 0.003 0.012.
Ir. ' 91bu; l "0.006 0.049 rrcrococcua elavus 0.006 0.049 .'C I11 logea lot 1001 010.5 0.1 i1e SLl) '. 4' 219 0.1?. SpherrEs 122 0.78 0.1 0 mycoides seen ()" ot? 8 0.39 r cereùs ÀTQG 10702 3. 5 0.76 TT 'unthr'1ci t 115 0, i6 0.1 r? Ctol)> jcï "nu8 cosel .ti'00 769 ########### IUP $ À 50 0.1 L . aGic3orihiina B-406-1 eup. to 50 0.1 ro'i) 'tbco.ccu9 fflgc.alla mt "Óptococua' ttlCZSl 8 = 55205 3 $ 13 0.39 S. ²YOfpne ± 1 Typo z 0.78 imrinvoccut3 pnouiiion ne 0 Il it 156 0 78 t '' G t: r 111II1 W'y'1 Lycobactcgluia pe 50 12.5 Fungus AstHrr: i 11u2 nigex; yan U2Zhec% 'rril up. aup.à 50 Nup.à 50 1'enicilliulIl M aupoà 50 eup.t 50 candida "al.V.1 cr tia aupià 50 tUptà 50 Sacçharoiayc 9 a ceravik3ingL tacçharoYcQ 7.'MC'97 8up.A 50 aup. à 50 frlchophytpq F! enta. (r t'l1: L-te! supea 50 t; up.à 50 Abbreviations t Iî # resistant PO t p'n101111n.
OR . ntI'optomyciDe EU. r) 'th%' omyc1ne ST tstreptothrloine OU * 04rboo1n.
NO a noôbioo1ne 2C tûtrnoycl1ne
<Desc / Clms Page number 25>
EMI25.1
The minimum concentration * iDh1- bïtrîceo of notomyoiM was also determined by the method of
EMI25.2
double dilution in tube, working with nu- broth
EMI25.3
tritif, except for streptococci and pn.umooo, u8. flat) 1: 1cl'l. \ ", which we try to have a boil10D ... of 1Dtua: Loza. of brain and heart.
The results are grouped below in a table, together with the ratio 4'aot1v1t 'of the noto1n' and of the novobiooinet t9..pR ....... omA.a.rhc.,. PM. at the
EMI25.4
Org1etlu,! BSa !! p9YCIn, .lJpQ;: i Klebsiella pneumoniaq 3.15 og / al 6.29 og / sal 2 "'" "" "#'" "" ihs "y9p 0.0019 0.049 52 sïêh :, oCOOQU eraj1m & 0.00075 0.012 StMhyloooQoua aweus r Stehx220QUUI itn- a 0.0015 0.024 16 ffayqinfl luq POl 1001 0.006 0.049 0 ^ x ,, aat 0.0007 '0.024 53 "K-1IU 0.00075 0.024 Baollluc oereui ATCO ... 10702 0.78 0.78 pso11us enthroi8 115 o, 9 0.199 1/2 '"ype 3 0.049 0,' 9 8 R10900uO oUliat! J <1 l 0.098 0.098 1
EMI25.5
Lu notomyuina brr9tar development! bacterial dot diveratw 0: L1U1I1-pou1UvOQ, except for 13 ,,, b. ,,: 11! ot lactic buo111oD, which are doniblen to novobiooine.
Lu l1otolll; yclnlt out part1ou116rowont activated against leo atuPtlYlocuclude this uotivity being 10 in
<Desc / Clms Page number 26>
EMI26.1
30 times greater than that of novobiocins However, it shows reduced activity towards * atapb71o-, cocci which have been made resistant to novobiocin in the laboratory.
EMI26.2
XntlMen2e- de ula JU-11 ggaaegu: 9n tnibttr9 Mipimal! Using (Smith strain) and 6taphth aureus (strain 193) as the test organism * in nutrient broth, dilutions were made.
EMI26.3
tubes with various dimensions of inoulua, The results $ of which gathered below in the form of 'table and it can be seen that the influence of the important inocula is similar to that obtained with novobiocin.
EMI26.4
Influca, de, the dIncMi on inooulum on lft .. ,, O, | ij [
EMI26.5
Onanism lm ce of Ilicoeulum (cell / rn) test AatioiotiQ XO ', 10 10 LO 4 10g 10 (019 a Uog./MX.)
EMI26.6
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Notomyoine <SEP> 0.012 <SEP> 0.012 <SEP> 0.003 <SEP> 0.003 <SEP> 0.003 <SEP> 0.003
<tb>
<tb> Smith
<tb>
EMI26.7
elderberry Novobiooine 0.39 $ 0> g otl95 0.098 0.098 0.098 amith 8.
Aurella Uotomycin 0.024 0.003 O, OOJ.; O, 001.5 O, u ,, "0.0015 etrain it aurtug Novobigoine 0OV8 0.195 0.098 0.098 01098 0.098
EMI26.8
<tb> strain <SEP> 193
<tb>
EMI26.9
Fluenpe mil i or on Minimal Inhibitory Oonoentgation
EMI26.10
J: i Jl'tl'l
The MIC of notoayoin is determined by the broth dilution method, the pH of the media being
EMI26.11
adjusted to various values.
Nutrient broth and brain and heart infusion broth are used as water media and a dilution is inoculated into each tube.
<Desc / Clms Page number 27>
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10 ** 4 'um cultur. of 16 collided with Btpun. aureue Smith (105 c.ll./#l). as can be seen C1-480 'OR' the activity of notomwine increases in acidic pH and decreases in alkaline pH. The comparative results obtained with novobioocin indicate that notomycin is influenced by the pH of the media to a greater extent than novobiooine.
Influenced medium pH on CIM
EMI27.2
Not9oin â2voblo2ipl pp du .. IM and tcg./ar1.
Medium N 'i3Ca HN ln
EMI27.3
<tb> 6.3 <SEP> 0.0001 <SEP> 0.00005 <SEP> 0.024 <SEP> 0.024
<tb>
<tb> 7.0 <SEP> 0.003 <SEP> 0.006 <SEP> 0.098 <SEP> 0.098
<tb>
<tb> 7.6 <SEP> 0.049 <SEP> 0.098 <SEP> 0.195 <SEP> 0.39
<tb>
<tb> 8.2 <SEP> 0.39 <SEP> 0.78 <SEP> 0.78 <SEP> 0.78
<tb>
EMI27.4
605 .r5 '3113 1.56 .6 - BN - nutrient broth BCC = brain and heart infusion broth
EMI27.5
1 & .tlll2nge., D! L, mllllâ, jsur Conaentpation Inhibitrioe tf1tql !.
This influence was investigated using four species of media 1 nutrient broth, brain and heart infusion broth (Difoo), tryptioase soy broth and 1% yeast extract broth.
The OIM is not influenced by the media used for the determination, as long as the media fold is controlled.
EMI27.6
nt uennu 8! Ium our OoX \ q, otrntion Inh1bt1'1o. lUnil11) 10 Concetitrations are added cross-content of serum
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human to nutrient broth containing a phosphate buffer at the final concentration of 1/10 M, to maintain the pH of the media at 7.2.
We use as a boredom organism
EMI28.1
of dt2l) hyloopc22.o auèt the dil1l.o! U.ion of Ilincoulum being 105 that / ml @ Corne indicates it Io table oi-deesoue, the 011-1 is clear Marnent influenced by the serum Influence, serum on the CIM
EMI28.2
CIL en mok; olmlb xonoentr! Tion of the sacrum pot9myo1n bi22ln2
EMI28.3
<tb> without <SEP> serum <SEP> 0.003 <SEP> 0.098
<tb>
<tb> 2.5% <SEP> 0.024 <SEP> 0.195
<tb>
<tb> 5 <SEP>% <SEP> 0.098 <SEP> 0.195
<tb>
<tb> 10 <SEP>% <SEP> 0.098 <SEP> 0.39
<tb>
<tb> 20 <SEP>% <SEP> 0.098 <SEP> 0.18
<tb>
<tb> 50 <SEP>% <SEP> 0.195 <SEP> 3.13
<tb>
EMI28.4
ot1té d! notomyaine against stqoQUS ftléj. \ U:
Tfü Q \ 1emfJn Various cultures of Si1! .. ur'l (1 *> strains), isolated from clinical sources, against notomycin and six antibiotics of comiuerce 1, namely bontylp6nieillinst ten1-dxoutreptomyoîne, are examined in vitro. , tetracycline, ilerythromyoinel, kanamycino and novobiooine.
The MIC values are obtained as follows by serial ten-fold dilution of the agar:
<Desc / Clms Page number 29>
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Penalty of Isolated Clinical Cultures (etiaphyloqqquea! Ja jaajtom'yoine, a <: nmc 6ntibioin'ueB co
EMI29.2
, A.nt'U.otlaux 019 ta-àxlm, 1'Qmrçi1J. gag .ami :: g, 1:
1 read at 100 0 0 3 0 0 0 0
EMI29.3
<tb> 100 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 16 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 103 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 1 '
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<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 89 <SEP> 2 <SEP> 8 <SEP> 117 <SEP> 123 <SEP> 0
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<tb> 0.1 <SEP> 1 "<SEP> 21 <SEP> 0 <SEP> 114 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 122
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<tb> 0.01 <SEP> 52 <SEP> 7 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1
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<tb> 0.001 <SEP> 48 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2
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<tb> 0.0001 <SEP> 21 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
EMI29.4
0.00001.
1 "4 0 0 .0 0 0 0 same strain
EMI29.5
PO Benzylpenioillin DU Dihydrootreptomyoint 10 Tetracycline Eu Erythromyoin KM - kansmycin
EMI29.6
NB Novobiooie These results indicate that KOto # yoin is extremely active against * staphylococci and that it does not have antlgon1.t activity. wine vis-à-vis other antibiotics, only one strain in 126
EMI29.7
strains, resistant to novobioony, and which is less sensitive to notomyo1ne. but the IMO value of notomycin for this strain is 011 mog / mI. i-q - viv2-.ÊUL. lu notosycin Toxicity
Notomycin is a weak antibiotic
EMI29.8
toxicity.
It was found that the LD50 by the intramuscular route is 500 ag / kg for mice, either druue or has been studied in vivo nativity of the antomyoine.
<Desc / Clms Page number 30>
in the stable, against infection, experimental by Bouche de Smith. We infected
EMI30.1
smiled intra-peritoneally, with 100 liver the LD 50 of the pathogen and the antibiotic was administered intramuscularly or perorally, immediately after the attack
EMI30.2
bacterial.
A single intra-molar OD 50 value (50 / c of the curative dose) of 0.3 mg / kg # and a single peroral OD of 415 Mg / kat was obtained In = comparative trial, we found than intramuscular and peroral values
EMI30.3
of OD5, are respectively 6.0 mg / kg and 30.0 mg / kSI The results are shown below. Chemothtapeutic effect of notoM.yne 'X'tlp., UtiJ1! a intramungulaire
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<tb> Dose <SEP> in
<tb>
EMI30.5
57 - s JOVOItY $ 'nt {9yoQç! Nt
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<tb> 50 <SEP> 5/5 '<SEP> 6/6
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<tb> 25 <SEP> 5/5 <SEP> 6/6
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<tb> 6.25 <SEP> he / he <SEP> 4/6
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<tb> 1,
56 <SEP> 6/6 <SEP> 0/6
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<tb> 0.78 <SEP> 12/12 <SEP> 0/6
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<tb> 0.39 <SEP> 4/6
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<tb> 0.19 <SEP> 1/6
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<tb> 0.10 <SEP> 1/6
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<tb> 0.05 <SEP> 0/6
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<tb> Witness <SEP> 0 / iL, <SEP> 0/12
<tb>
EMI30.7
* Number of ourla iàyiuit lost / Number of "ourla infest
<Desc / Clms Page number 31>
EMI31.1
Effect çhimiot, héàn2¯utiLug, of the 'Uot2rnyoîL r ligus nel2Eal2
EMI31.2
<tb> Dose <SEP> on <SEP>
<tb>
EMI31.3
M & 4th Notom, yoin â2veblegln
EMI31.4
<tb> 100 <SEP> 5/5
<tb>
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<tb> 50 <SEP> 11/11 <SEP> 6/6
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 25 <SEP> 6/6 <SEP> 6/6
<tb>
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<tb>
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<tb> 12.5 <SEP> 6/6 <SEP> 5/6
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<tb>
<tb>
<tb> 6,
25 <SEP> 10/12 <SEP> 1/6
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3.12 <SEP> 1/6 <SEP> 1/6
<tb>
<tb>
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<tb> Witness <SEP> 0/12 <SEP> 0/12
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Notoayoine is a useful agent for the treatment of mastitis in cases of diarrhea in cattle.
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or calves; one leaves for example with this effect of ausponation. in a vegetable oil, to fall in * -Ion teat $ to treat mastitis, and containing from 1 to 1000 ag / ml, and preferably about 50 mg of the antibiotic, or exen
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.utt1oamm.nt of capeulec to Garnish a total dose of 0, to 2.08 for peroral administration, for example for diarrhea of calves.
When desired for specific applications
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Oils and once they have been made pharaMeutically compatible, one can eat with the compounds of the present invention other drugs such as antihistani. nique $$ sulfonamides (eg sultadiatins aulfabentamide, eult.c'tù4., sultanilamide, .ult.p141n't aultathlacolt aulfapyratin, cult- suanidinst sultathalîdinob la tultaouxidint # null-
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tinoxasol, sultaM11on, phthalyleulfacetamidei U '.', 4-dimethylbenzoyl-Dullan11amide.
the bQnI11-lullanrla-
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mido and the agents
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lipotropics (in particular the methionic agent ehlolne, inositol and beta-aitootdrol and their mixtures *),
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central nervous system stimulants (e.g.
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caffeine, amphetamines, local unenthenics, analogs (for example aspirin, salicylamid and sodium Sontisate, p-aoetylaminophenol, phenacetinst codeine), don s6dat1ts (pure example of barbiturates,
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bromides), benzyl penicillin sala (for example
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the potassium derivative of penicillin G, prooaTne penicillino 0, l-ÓphJnW: l1no penicillin 0, diboncylamine
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penicillin G, and others are described in the
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United States of Brick NO J.627.491 of;
this*
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mix are particularly interesting to allow
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to vary the rates Quinquina obtained), ph'nox; ym'thI1- penicillin, In phanethieillins methicillin and oxacil- A * cloxoillin, natoillin, c4pho.lotb1ne and other penicillins tlYlltih.jt.1quo and their Mêla, others like untibiut.iqueo lhll1 oKcunplo lu streptomycin * dihydrOD1ireptOL, yc1ne, bacitracin, polyuixint, tyrothricin, tl 1 {; rhythNl, uyc 1ua chlorotütruoyullne, o.tl '; ncyc11nu, lu tutr'oyclinu, ol: u1 (1ol41c1no, cblormnph6nicol.
In m.-iiiumycliio, 1: "wJyoù1oc1no, la oyolo'- e61'lno. Lu nl.om $ 1u (j. La i; ... IJC1ul, 'fIJin4.1; (I. & IIU oort.J1ho case these melUf'- ± 1; elJ abluquolit uno t;:. 1IJ1JJO pluo,) t <JnJuu Ù 'ol'gau1aw "to or else make proof of an ofl'1ow =! tJ s, yu <.Irt; é. -tiqUat. or have less toxicity z effioacitu ÓIl. & h), vitamins (for example u, A, ali 13it B, B t deM ruproawntttnta of this family, acid i'oUque ot roprécojitants of oatt @
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vitamin family cl, D2, D5 and bzz hormones (e.g. oortisone, hydrocortisone, 9 aûaw'xuara
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cortisone, 9 alpha-fluorohydrooortisone, predaisoaa and prednisolone), aobolic agents (eg, i ,, x7d, hydraxy ..alpha s.uara l alpha "methyl-4-aAdpostene-5-on6;
17 ulpha-ethyl-19 nor-alloi3terons), and agnta antifungiquoa (eg myooatatin).
The antibiotic of the present invention constitutes
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an ozont useful for detecting contamination by Qrum-n6at1veg bacteria, ahump, nane, yeast *, Ito, during the industrial production of the ensymot btreptokinase and streptodornase by culture of 3txeptooaquea and the production of amylase by fermentation of 'wsubt1l! or from. cereua. Thus, adding from 1 to 1000 mcg / ml and preferably about 10 mog / ml of the antibiotic of the invention to an aliquot of inoculated medium, followed by incubation, can be used. develop unwanted impurities and detect them with the naked eye.
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B..J.JL! LJ1JI A. A method of producing an antibiotic substance,
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referred to as notontyoine, characterized by the following points, taken alone or in combinations 1) A strain of trtPomY'1 1thi1 .: 11a is cultivated in an aqueous solution of carbohydrates denying a nitrogenous nutrient, in submerged aerobic environment, - until significant activity against bacteria
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arumpaaiivaa is communicated to said solution, then the notomyoine is recovered from the solution.
2) The organism had the iltreptoluyope rblr1eOB '.
A.TtO.C. 14.812.
3) One aépure 1, nnt1b1ot! .11UO notomyaine from the broth
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of fermentation by extracting at an acidic pH of this insecticide using a solvent immiscible with water, in which said antibiotic is soluble $
4) The solvent containing the
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oto = 1Cin ..
B. As a new industrial product, an antibiotic substance effective in inhibiting the development of Gram-positive bacteria, characterized by the following points, taken alone or in combinations:
5) Bile is chosen from the group consisting of
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an acidic substance, notomyoine, which is readily soluble in acetone, dioxane and alkaline water moderately soluble in ethanol, butanol, ethyl acetate, butyl acetate and methyl isobutyl oetone, less soluble in benzene, methanol and chloroform, and insoluble in carbon tetrachloride,
petroleum ether and acidic water, which gives positive Fehling and Molisch reactions, discolors bromine and gives
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a reaction with ninhydrin, a reaction of Tollens and a reaction with the anthrone negative, and which in the form
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purified melts at 222-224 * 0, has an alpha 20de -134 * (0. 1.0, acetone), present in ethanol absorption spectra in the ultraviolet having maxima at 275 millimierons' ( m am - 595) and z 335 milliolierons (3 1 P. 498) 9 dan.
H01 N / 10 of the maxima at 275 millimicrons (1 im. 287) and at 349 mil, im3, aranr (111 t or w 277) and having dirir fet3i N / 10 a maximum at te30 millimiorons (1 i: # 766) , a UA equi-! are worth of neutralization of 548 and whose mean elementary analysis is as follows 0 "99.1 96i H, 3% # N - 5.90% and O (by difference): 29.65%; and which when she
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is Paettllée with potancium bromide Present $ dan. the infra-red region of the spectrum an absorption characteristic
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rintique and leu solo of this acidic substance.
6) The sodium salt of this compound.
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7) The ouloitm sol of this compound.
8) A salt of compound and a non-toxic organic base.
9) An amine salt of this component.
10) The streptomycin salt of this compound *
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11) The soil of 41hydx'oatrePtomyo1n. of this oompond.