L'invention a trait aux facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086
<EMI ID=1.1>
facteurs A, B et D sont dérivés. Les composés antibiotiques sont utilisables comme agents antibactériens, antifongiques, antivirus, comme agents destructeurs des organismes provoquant des maladies comme la pleuro-pneumonie, comme agents anticoccidiens, insecticides ou acari.cides et pour améliorer l'efficacité d'utilisation de l'alimentation chez les ruminants.
La présente invention fournit un procédé de préparation du complexe antibiotique A-28086 présentant un facteur A, un facteur B et un facteur D, qui comprend la culture de Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 ou Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucides, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobie immergée jusqu'à ce que l'on ait obtenu grâce audit organisme dans ledit milieu de culture une quantité importante d'activité antibiotique.
<EMI ID=2.1>
contenant des facteurs A, B et D comme il est décrit ci-après.
Le facteur A de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc
<EMI ID=3.1> .alcools inférieurs, le diméthylformamide, le diméthyl sulfoxyde, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le benzène ; mais il est seulement <EMI ID=4.1>
environ 98-100[deg.]C, se resolidifie et refond à environ 195-200[deg.]C et il présente :
a) un poids moléculaire de 764, par détermination par spectrométrie ; b) une composition élémentaire approximative de 66,69 de carbone, 9,85 % d'hydrogène et 23,10 % d'oxygène ; <EMI ID=5.1> d'absorption distinguables suivants : 2,85, 3,34, 5,83, 6,82, 7,22, 7,53 (faible), 7,78 (faible), 8,75 (fort), 8,95 (fort), 9,15, 9,50
(fort), 9,55 (fort), 9,60, 9,85, 10,15, 10,45 et 10,70 (faible) mi crons ; f) dans son spectre ultraviolet dans l'éthanol seulement une bande <EMI ID=6.1>
g) un spectre de résonance magnétique nucléaire dans le chloroforme
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BREVET D'INVENTION'
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Priorité Conventionnelle des. demandes de Brevets américaines
Nos 477.954, 569.740 et 569.719 déposées aux Etats-Unis d'Amérique les 10 juin 1974 et 21 avril 1975 par David Herbert Berg,
<EMI ID=9.1>
<EMI ID=10.1>
1,47, 1,39, 1,31, 1,25, 1,13, 0,95, 0,93, 0,90, 0,88, 0,85, 0,77, 0,75, 0,73, 0,6S et 0,66 ppm ;
h) un groupement titrable avec une valeur pKa de 7,9 dans le diméthylfor-
mamide aqueux à 80 %.
i) un diagramme caractéristique ce diffraction de poudre aux rayons X
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suivantes entre les plans d'atomes en angstroms (d) :
<EMI ID=12.1>
<EMI ID=13.1>
silice dans un système de solvant benzène-acétate d'étyle (3:2, en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisée détecteur ;
<EMI ID=14.1>
papier indiqués ci-dessous, en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme de détection :
<EMI ID=15.1>
0,75 Eau : MIBK : acétate d'éthyle (98:1:1)
1) une fonction acide susceptible de former des sels et des dérivés
ester ; et
m) au moins un groupement hydroxyle susceptible d'estérification ;
<EMI ID=16.1>
physiologique.
Le facteur B de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc lorsqu'on le cristallise dans un mélange acétone-eau, il est soluble dans des alcools inférieurs, le diméthylformamide, le diméthyl sulfoxyde, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le benzène ; mais il est seulement
<EMI ID=17.1> a) un point de fusion d'environ 150-153[deg.]C ; b) un poids moléculaire de 762, par détermination par spectrométrie de masse à forte résolution ; <EMI ID=18.1> de masse à résolution élevée d) un spectre infrarouge dans le chloroforme avec les maxima d'absorption distinguables suivants :
2,82, 3,30, 5,77, 5,85, 6,80, 7,20, 7,50 (faible), 7,72 (faible)
7,80 (faible), 8,57 (fort), 8,68, 8,90 (fort). 9,10, 9,50, 9,83 (fort), 9,90, 10,10, 10,17 (fort), 10,43 (faible), 10,80 (faible), 11,20 (faible),
11,35 (faible), 11,73 (faible), et 12,03 (faible) microns ; e) un maximum d'absorption observé dans l'éthanol sur son spectre ultra- <EMI ID=19.1> f) un spectre de résonance magnétique nucléaire dans le chloroforme deutérié avec les caractéristiques suivantes : S 7,20, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3,78, 3,62, 3,59, 3,52, 3,48, 2,81, 2,73, 2,63, 2,54, 2,52, 1,99, 1,91, 1,84, 1,71, 1,67, 1,64, 1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11, 0,96, 0,94, 0,90, 0,87, 0,84, 0,77, 0,74 et 0,68 ppm ;
g) une valeur Rf de 0,42 pour la chromatographie en couche mince sur gel de
silice dans un mélange benzène-acétate d'éthyle (3:2), en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme de détection ;
h) les valeurs suivantes Rf pour des systèmes de chromatographie sur
papier indiqués ci-dessous, en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme de détection ;
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<EMI ID=21.1>
avec NH40H puis diminué à pH 7,5 avec H3P04
<EMI ID=22.1>
1) une fonction acide susceptible de donner des sels et des dérivés ester ;
j) deux fractions cétoniques ; et
k) au-moins une fraction hydroxyle
et ses sels acceptables sur le plan physiologique.
Le facteur D de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc lorsqu'on le cristallise dans un mélange acétone-eau ; il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, le dimëthylformamide, le diméthyl sulfoxyde, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le benzène ; mais il est seulement légèrement soluble dans l'hexane ; et il est insoluble dans l'eauau ; il fend à environ 96-98[deg.]C, et il présente : a) un poids moléculaire de 778, par détermination par spectrométrie de masse à forte résolution ; <EMI ID=23.1> nation à 25[deg.]C ; e) un spectre d'absorption infrarouge dans le chloroforme avec les maxir.a d'absorption observables suivants : 2,89, 3,39, 3,43, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60, 7,84, 9,00, 9,26, 9,62, 10,31, 10,58, 11,10 et
11,49 microns ; f) pas d'absorption observable dans l'ultraviolet dans l'éthanol aqueux à 95 % ;
g) un spectre de résonance magnétique nucléaire dans le chloroforme avec
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0,84, 0,74 et 0,68 ppm ;
<EMI ID=26.1>
<EMI ID=27.1>
j) les valeurs de Rf suivantes dans des systèmes de chromatographie en
couche mince sur gel de silice indiqués ci-dessous, en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme de détection :
Valeur Rf Système de solvants
0,26 Benzène acétate d'éthyle (3:2)
0,66 Acétate d'éthyle-diéthylamine (95:5)
k) les valeurs Rf suivantes sur des systèmes de chromatographie sur papier
indiqués ci-dessous, en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme de détection :
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0,64 Eau : MIBK : acétate d'éthyle (98:1:1)
1) une fonction acide susceptible de donner des sels et des dérivés
ester ; et
m) au-moins un groupement hydroxyle susceptible d'estérification ;
et ses dérivés ester d'acyle en C2-C6 et, ses sels acceptables sur le plan physiologique.
Bien que l'on connaisse actuellement de nombreux agents antibactériens,
il y a une demande continue pour de nouveaux antibiotiques améliorés. Un problème dans la thérapeutique courante par antibiotique est le fait que les antibiotiques diffèrent du point de vue de leur efficacité vis-à-vis des organismes pathogènes. Un autre problème est le développement des souches d'organismes qui sont résistantes aux antibiotiques normaux. Un autre problème également est le fait que certains malades souffrent souvent de réactions sérieuses à des antibiotiques spécifiques, compte tenu de l'hypersensibilité et/ou des effets toxiques. Compte tenu de ces problèmes dans la thérapeutique courante, il existe une demande continue pour de nouveaux antibiotiques.
En plus des demandes pour de nouveaux antibiotiques qui soient utilisables dans le traitement des maladies humaines, il existe également une demande pour des antibiotiques améliorés dans le domaine vétérinaire. Dans un domaine important, il existe une demande pour des antibiotiques améliorés pour améliorer la croissance de la volaille et du bétail. Par exemple, on obtient l'augmentation de la croissance en réduisant les maladies et en augmentant l'efficacité d'utilisation d'alimentation.
Une maladie bien ronnue de la science vétérinaire quant à son importance économique, plus particulièrement dans l'industrie de la volaille, est la coccidiose protozoaire. La coccidiose résulte de l'infection par une ou plusieurs espèces d'Eimeria ou Isospora (pour un résumé, voir Lund et Farr
<EMI ID=29.1>
State University Press, Ames, la., 1965, pages 1056 à 1096). Compte tenu des pertes économiques importantes dues à la coccidiose et des inconvénients des agents anticoccidiens bien connus, la recherche pour de nouveaux agents anticoccidiens se poursuit.
L'entérite est une autre maladie qui peut provoquer des pertes économiques sévères aux producteurs de cheptel vif. L'entérite se produit chez les poulets, les porcs, les bêtes à cornes et les moutons et on l'attribue essentiellement
à des bactéries anaérobies, plus particulièrement Clostridium perfringen , et à
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C. perfringens.
L'amélioration de la croissance chez des ruminants, tels que des bêtes <EMI ID=31.1>
rinaire. D'un intérêt plus particulier est l'amélioration de la croissance obtenue par l'augmentation de l'efficacité d'utilisation de la nourriture. Le mécanisme d'utilisation de la plus grande partie de la fraction nutritive
(glucides) ces aliments pour ruminants est bien connu. Des microorganismes présents dans le rumen de l'animal dégradent les glucides
pour donner des monoglucides, puis transforment ces monoglucides en pyruvates. Les pyruvates sont métabolisés par des processus microbiologiques pour donner des acétates, des butyrates ou des propionates que l'on connait
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<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
<EMI ID=35.1>
On prépare le complexe antibiotique A-28086 par culture de la nouvelle souche de Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 dans des conditions de fermentation aérobie immergée jusqu'à ce que l'on obtienne un taux important d'activité antibiotique. On peut également préparer le complexe antibiotique A-28086 par culture d'une autre nouvelle souche de Streptomyces aureofaciens, NRRL 8092. Lorsqu'il est préparé soit par S. aureofaciens NRRL 5758 ou par
S. aureofaciens NRRL 8092, on extrait le complexe antibiotique A-28086 du bouillon de fermentation et du mycélium à l'aide de solvants organiques polaires. On sépare le mélange antibiotique extrait par concentration des solvants, par addition des concentrés des excès d'éther de pétrole pour précipiter les impuretés, par filtration et par évaporation des filtrats pour obtenir le mélange antibiotique A-28086. On purifie ultérieurement le mélange antibiotique et on le sépare en facteurs individuels par chromatographie sur colonne.
Les composés A-28086 arrêtent la croissance des organismes qui sont
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anti-PPLO (organismes provoquant des maladies du genre pleuro-pneumonie), insecticides et acaricides et ils améliorent l'efficacité d'utilisation de 1'alimentation chez les ruminants.
Les spectres d'absorption infrarouges suivants dans le chloroforme sont présentés sur les dessins : figure 1 - facteur A de l'antibiotique A-28086 figure 2 - facteur B de l'antibiotique A-28086 figure 3 - dérivé ester d'acétyle du facteur A de l'antibiotique
<EMI ID=37.1> figure 5 - dérivé ester de butyryle du facteur A de l'antibiotique
<EMI ID=38.1>
A-2S036 figure 7 - dérive ester de caproyle du facteur A de l'antibiotique
<EMI ID=39.1> figure 3 - facteur D de l'antibiotique A-28086
Les facteurs de l'antibiotique A-28036 sont reliés d'une manière: structu-
<EMI ID=40.1>
relance. Cn sépare les facteurs les uns des autres, et on isole les facteurs <EMI ID=41.1>
Le mélange des facteurs A-28086 est soluble dans la plupart des solvants organiques, mais il est insoluble dans l'eau.
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
<EMI ID=44.1>
<EMI ID=45.1>
Le facteur 8 de l'antibiotique A-28036 est un composé cristallin blanc
(par cristallisation dans un mélange acétone-eau) qui présente un point de fusicr. d'environ 150-153[deg.]C.
Par détermination par spectrométrie de masse à forte résolution, le
facteur B présente un poids moléculaire ipparent de 762 et on suggère la
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Le spectre infrarouge du facteur B dans le chloroforme est représenté sur la figure 2 des dessins ci-joints. On observe les maxima d'absorption
<EMI ID=47.1>
7,80 (faible), 8,57 (fort), 8,68, 8,90 (fort), 9,10, 9,50, 9,83 (fort), 9,90,
10,10, 10,17 (fort), 10,43 (faible), 10,80 (faible), 11,20 (faible), 11,35
(faible), 11,73 (faible), et 12,03 (faible) microns.
Le spectre ultraviolet du facteur B dans l'éthanol présente un maximum
<EMI ID=48.1>
Le spectre de résonance magnétique nucléaire du facteur B de l'antibiotique A-28086 dans le chloroforme deutérié présente les caractéristiques suivantes : S 7,20, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3,78, 3,62,
<EMI ID=49.1>
1,64, 1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11, 0,96, 0,94, 0,90, 0,87, 0,84, 0,77, 0,74, et 0,68 ppm.
Le facteur B de l'antibiotique A-28086 est soluble dans un certain nombre
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thylformamide, le diméthyl sulfoxyde, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le benzène ; mais il est seulement légèrement soluble dans des solvants organiques non polaires tels que l'hexane ; et il est insoluble dans l'eau.
<EMI ID=51.1>
soit pas élucidée, les données physico-chimiques précédentes montrent que ce facteur B présente une fraction acide carboxylique unique, deux fractions cétoniques et une ou plusieurs fractions hydroxyles.
Le facteur B de l'antibiotique A-28086, lorsqu'on le prépare à l'aide de
S. aureofaciens NRRL 5758, est un facteur peu important. Toutefois, lorsqu'on le prépare à partir de S. aureofaciens NRRL 8092, le facteur D de l'antibiotique
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récupérée.
Le facteur D de l'antibiotique A-28086 est un produit cristallin blanc
(par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un point de fusion d'environ 96-98[deg.]C. Le facteur D de l'antibiotique A-28085 présente un poids
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<EMI ID=54.1>
<EMI ID=55.1>
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
Les valeurs Rf des facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086 dans différents systèmes de chromatographie sur papier, en utilisant comme orga-
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Tableau 1
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Dans le tableau II on donne les valeurs Rf des facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086 dans deux systèmes de chromatographie en couche mince sur gel de silice (plaques enduites de E. Herck, Darmstadt, F-254, épaisseur de couche 0,25 mm), en utilisant également comme organisme de détection Bacillus subtilis ATCC 6633.
Tableau II
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Une autre substance, arbitrairement désignée sous le nom deA-28086-I, est produite simultanément avec le complexe antibiotique A-28086. Bien que le produit A-28086-I ne soit pas microbiologiquement actif, il est structurellement en relation avec les facteur'' antibiotiques du produit A-28G36.
Le produit A-28036-I est un compose cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) et il présente un point de fusion d'environ 160-162[deg.]C. Des études comparatives des spectres RMN et des autres propriétés du produit
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préparé par voie synthétique, montrent d'une manière évidente que le produit A-28OS6-I est l'ester de méthyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 ou un . composé très voisin tel qu'un stéréoisomère.
Bien que le produit A-28086-I co-précipite initialement avec les facteurs antibiotiques actifs du produit A-28086, on le sépare facilement de ceux-ci par
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Rf approximative de 0,53 dans une chromatographie de couche mince sur gel de silice avec l'acétate d'éthyle en utilisant pour la détection un réactif pulvé-
<EMI ID=65.1>
pour 100 ml de solution). Après avoir pulvérisé la vanilline et après avoir chauffé, le produit A-28086-I donne une tâche bleue tandis que les facteurs antibiotiques du produit A-28086 donnent des tâches rose brillant qui deviennent rapidement bleu brunâtre foncé.
Les facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086 et les dérivés ester d'acyle spécifiés des facteurs A et D sont susceptibles de former des sels. Des sels "physiologiquement acceptables" sont des sels qui sont également acceptables sur le plan pharmaceutique, c'est-à-dire des sels pour lesquels la toxicité du composé dans son entier vis-à-vis des animaux à sang chaud
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et appropriés de métal alcalin etde métal alcalino-terreux des facteurs A et B de l'antibiotique A-28086 comprennent les sels de sodium, de potassium, de lithium, de césium, de rubidium, de baryum, de calcium et de magnésium. Des sels d'amine appropriés des facteurs A et B de l'antibiotique A-28086 compren-
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illustratifs comprennent ceux préparés par réaction des facteurs A et B de l'antibiotique A-28086 avec l'hydroxyde d'ammonium, la mêthylamine, la butylamine secondaire, l'isopropylamine, la diéthylamine, la diisopropylamine, l'éthanolamine, la triéthylamine, le 3-amino-1-propanol et des amines semblable:.
On prépare les sels cationiques de métal alcalin et de métal alcalinoterreux des facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086 et des dérivés ester d'acyle des facteurs A et D selon des procédés habituellement utilises pour
la préparation des sels cationiques. Par exemple, on dissout la forme acide libre du facteur antibiotique ou du dérivé ester dans un solvant approprie
<EMI ID=68.1>
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isoler le sel ainsi formé par des procédés habituels, tels que la filtration, l'évaporation du solvant.
On peut préparer les sels formés avec des amines organiques d'une manière semblable. Par exemple, on peut ajouter l'amine gazeuse ou liquide à une solution du facteur antibiotique dans un solvant approprié tel que l'acétone, ci on peut éliminer le solvant et l'excès.d'amine par évaporation.
Il est bien connu dans la technique pharmaceutique vétérinaire que la
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par antibiotique. Dans la plupart des cas, les conditions chez l'animal modifient le médicament pour donner une forme autre que celle sous laquelle il est administré. Par conséquent, la forme de sel sous laquelle on l'administre n'est pas significative du procédé de traitement. Cependant, on peut choisir la forme sel pour des raisons d'économie, de facilité et de toxicité.
Le facteur A de l'antibiotique A-28086 donne des dérivés esters d'acyle. L'estérification se produit sur un des groupement hydroxyles du facteur A de l'antibiotique A-28086 par traitement avec un anhydride ou un chlorure d'acier
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facteur A de l'antibiotique A-28086 avec, par exempte, l'anhydride d'acide correspondant à température ambiante. Ces dérivés esters sont également utilisables comme antibiotiques et comme agents d'amélioration de l'efficacité d'utilisation de l'alimentation.
Les paragraphes suivants décrivent les caractéristique-; de ces dérivés esters d'acyle du facteur A de l'antibiotique A-280S6.
<EMI ID=72.1>
composé cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un point de fusion d'environ 100-103'C. Le dérivé ester d'acétyle du
<EMI ID=73.1>
un poids moléculaire d'environ 807, par rapport à la formule empirique
<EMI ID=74.1>
du dérivé ester d'acétyle du facteur A donne la conposition suivante en pourcentage :
<EMI ID=75.1>
Trouvé : C, 67,67 ; H, 8,71 ; 0, 23,13
Le spectre infrarouge du dérivé ester d'acétyle du facteur de l'antibiotique A-28086 dans le chloroforme est représenté sur la figure 3 des dessins
<EMI ID=76.1>
10,25 (faible) et 10,50 microns.
Le spectre ultraviolet de l'ester .. acétyle du facteur A de l'antibi que A-28086 dans l'éthanol présente seulement une absorption finale.
La titrage électrométrique du dérivé ester d'acétyle du facteur A de
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présence d'un groupement titrable avec une valeur pK de 8,5.
Le dérivé ester de propionyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un point de fusion d'environ 96-98[deg.]C. Le dérivé ester de propionyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 a la formule empirique C46H76012et un poids moléculaire d'environ 821, par rapport à la formule empirique proposée pour le facteur A de l'antibiotique A-28086. L'analyse élémentaire du dérivé ester de propionyle du facteur A donne la composition suivante en pourcentage :
Calculé pour C46H76012 : C, 67,29 ; H, 9,33 ; 0, 23,38
Trouvé C, 66,06 ; H, 9,17 ; 0, 23,41
Le spectre infrarouge du dérivé ester de propionyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 dans le chloroforme est représenté sur la figure 4 des dessins ci-joints. On observe les maxima d'absorption suivants ; 2,85, 3,33, 3,38 (fort), 3,45 (fort), 5,75 (fort), 5,82, 6,81, 7,22, 7,30 (fort), 7,50
(faible), 7,60 (faible), 7,80, 8,43, 8,75 (fort), 8,90, 9,05, 9,15 (fort), 9,50 (fort), 9,63, 9,83.(faible), 10,05 (fort), 10,13, 10,20 (fort), 10,45
et 10,63 microns.
Le spectre ultraviolet du dérivé ester de propionyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 dans l'éthanol présente seulement une absorption finale.
Le dérivé ester de butyryle du facteur A de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un point de fusion d'environ 96-98[deg.]C. Le dérivé ester de butyryle du
<EMI ID=78.1>
rique proposée pour le facteur A de l'antibiotique A-28086.
Le spectre infrarouge du dérivé ester de butyryle du facteur A de
<EMI ID=79.1>
<EMI ID=80.1>
3,45, 3,51, 5,85, 5,92 !fort), 5,97 (fort), 6,90, 7,30, 7,84 (faible), 8,55,
<EMI ID=81.1>
Le dérivé ester de valéryle du facteur A de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un pôint de fusion d'environ 173-175[deg.]C. Le dérivé ester de valéryle du
<EMI ID=82.1> <EMI ID=83.1>
proposée pour le facteur A de l'antibiotique A-28086.
Le spectre infrarouge du dérivé ester de valéryle du facteur A de
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
(faible), 8,16, 8,58, 8,85 (faible), 9,26, 9,76, 10,00 (faible), 10,31 et
10,64 microns.
Le dérivé ester de caproyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un point de fusion d'environ 163-167'C. Le dérivé ester de caproyle du
<EMI ID=87.1>
Le spectre infrarouge du dérivé ester de caproyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 dans le chloroforme est représenté sur la figure 7 des dessins
<EMI ID=88.1>
L'acylation du facteur A de l'antibiotique A-2S036 donne comme résultats les changements suivants dans le spectre de résonance magnétique nucléaire
<EMI ID=89.1>
environ 5,3 ppm (la position exacte varie légèrement selon les différents dérivés acyles), et les signaux des protons vinyliques se déplacent également. Ceci est caractéristique du changement représenté dans la structure partielle par :
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
découplage homonucléaire <1>H et ce résonance magnétique nucléaire <1><3>C à partir des dérivés esters d'acétyle et de propicryle.
<EMI ID=92.1> le méthanol, l'éthanol, le diméthylformamide, le diméthyl sulfoxyde, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le benzène ; mais ils sont
<EMI ID=93.1>
l'hexane ; et ils sont insolubles dans l'eau.
<EMI ID=94.1>
présente une fonction acide susceptible de donner des sels et des dérivés esters.
On prépare les nouveaux antibiotiques en cultivant une souche de
<EMI ID=95.1>
aérobie immergée dans un milieu de culture approprié jusqu'à ce qu'il se produise une activité antibiotique importante. On récupère les antibiotiques
<EMI ID=96.1>
utilisés et compris de la technique.
Un des nouveaux organismes utilisables pour la préparation des antibiotiques est isolé d'un échantillon de terre recueilli sur le Mont Ararat en
<EMI ID=97.1>
Species Descriptions from First and Second Studies", International Bulletin Systematic Bacteriology 18, 279-392 (1968). Cette classification est basée sur
<EMI ID=98.1>
and D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces species", International Bulletin Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966)] en r.êre temps que certains essais supplémentaires. On définit les noms de couleur
<EMI ID=99.1>
Commerce, Circulaire 553, 1955, Washington, D.C.). Les chiffres entre parer-
<EMI ID=100.1>
<EMI ID=101.1>
New York, N.Y. 1950). On réalise les cultures à 30'C pendant 14 jours sauf indication contraire.
<EMI ID=102.1>
Morphologie
Les hyphes aériens sporulants comprennent des griffes, des boucles et des spirales ouvertes. On observe également une morphologie représentative du type rectus flexibilis. Les spores sont courtes et cylindriques et se
<EMI ID=103.1>
<EMI ID=104.1>
microscope électronique, est régulière.
Caractéristiques de culture de la souche NLRL 5753 dans différents milieux
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
- ..
On étudie l'organisme NRRL 5758 du point de vue de propriétés physiologiques choisies, selon des procédés normaux. Les propriétés observées et les caractéristiques trouvées sont les suivantes :
<EMI ID=107.1>
Impératif de température (plan 26-30[deg.]C bonne croissance ; 30-37[deg.]
<EMI ID=108.1>
de levure, extrait de malt) 45[deg.] croissance légèrement végétative;
pigment soluble rougeâtre.
Les résultats des essais d'utilisation de carbone réalisés avec l'organisme NRRL 5758 sont reportés ci-dessous. Les symboles utilisés pour indiquer la réponse de croissance sont :
+ Bonne croissance, utilisation positive
(+) Croissance faible à moyenne
(-) Croissance faible, probablement pas d'utilisation
Pas de croissance, pas d'utilisation.
<EMI ID=109.1>
Un second nouveau organisme donnant l'antibiotique à 28086 est dérivé de
<EMI ID=110.1>
d'une mutation chimique. Cet organisme, identifié comme étant NRRL 8092, est également classé comme une souche de Streptomyces aureofaciens Duggar. Cette classification est basée sur des études de l'organisme NRRL 8092 en
<EMI ID=111.1>
et des conditions de croissance identiques. Les caractéristiques de 1 'organisée NRRL 8092 observées dans ces études sont réunies dans les paragraphes suivants.
Caractérisation de la souche NRRL 8092 produisant
l'antibiotique A 28C86
Morphologie
<EMI ID=112.1>
occasionnels, mais donne essentiellement des sporophores courts, droits. Les chaines de spores ont moins de 10 spores par chaîne, habituellement 4 à 7 spores par chaîne. On observe des chaînes de spores courtes droites dans les
<EMI ID=113.1>
une corémie abondante sur la gélose d'Emerson. On pratique des observations
<EMI ID=114.1>
<EMI ID=115.1>
Caractëristiques de culture de la souche NRRL 8092
dans différents milieux
<EMI ID=116.1>
<EMI ID=117.1>
On a également étudié l'organisme NRRL 8092 vis à vis de propriétés physiologiques choisies, selon des procèdes normaux. Les propriétés observées et les caractéristiques trouvées sont les suivantes :
<EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
<EMI ID=120.1>
me NRRL 8092 sont résumés ci-après. Les symboles utilisés pour indiquer la réponse de croissance sont :
+ bonne croissance, utilisation positive
(+) croissance faible à modérée
(-) croissance faible, probablement pas d'utilisation
pas de croissance, pas d'utilisation
<EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
l'antibiotique A-28036 diffèrent des caractéristiques de l'organisme décrit par Shirling et Gottlieb. Ces différences sont résumes dans le tableau III :
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
caractéristiques de l'organisme NRRL 8092 sont résumées dans le tableau IV :
<EMI ID=125.1>
<EMI ID=126.1>
des antibiotiques A-28086 ont été déposées et font partie de la collection de cultures du Northen Marketing and Nutrition Research Division, Ministère de l'Agriculture des E.U.A. Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, USA
61604, où elles sont disponibles au public sous les N[deg.] NRRL 5758 et NRRL
8092.
Le milieu de culture utilisé pour la croissance de Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 ou de Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 peut être
l'un quelconque d'un certain nombre de milieux. Toutefois, pour des raisons d'économie de préparation, de rendement optimal, et de facilité d'isolation du produit, on préfère certains milieux de culture. Par conséquent, par exemple, des sources préférées de glucides pour une fermentation à grande échelle
sont la dextrine de tapioca et le saccharose, bien que l'on puisse utiliser
du glucose, de l'amidon de mais, du fructose, du mannose, du maltose,
du lactose, et des glucides semblables. L'huile de mais, l'huile d'arachide, l'huile de soja et l'huile de poisson sont d'autres sources de carbone utilisables. Une source préférée d'azote est la caséine hydrolysée par enzyme, bien que l'on puisse également utiliser des peptones, de la farine de soja,
de la farine de graines de coton, des aminoacides tels que l'acide glutamique, etc. Parmi les sels minéraux nutritifs que l'on peut incorporer dans le
milieu de culture, sont les sels solubles habituels susceptibles de donner
des ions sodium, magnésium, calcium, ammonium, chlorure, carbonate, sulfate, nitrate et des ions semblables.
On doit également introduire dans le milieu de culture des éléments essentiels sous forme de traces nécessaires pour la croissance et le développement de l'organisme. De tels éléments sous forme de traces sont habituellement sous forme d'impuretés des autres constituants du milieu en quantités suffisantes pour satisfaire aux exigences de croissance de l'organisme.
Il peut être nécessaire d'ajouter de petites quantités (comme par exemple 0,2 ml/1) d'un agent anti-mousse tel que du polypropylène glycol dans des milieux de fermentation à grande échelle si le moussage devient un problème.
Bien que ceci ne soit pas essentiel, on améliore la préparation de l'antibiotique des souches de Streptomyces aureofaciens donnant l'antibiotique A-23086 par addition d'une petite quantité d'huile telle que de l'huile de soja.
Pour la préparation de quantités importantes d'antibiotiques A-28086,
on préfère une fermentation aérobie immergée dans des réservoirs. On peut obtenir des quantités faibles de l'antibiotique A-28086 par une culture en ballon agité. Compte tenu de la perte de temps dans la préparation de l'antibiotique qui est en général associée à l'inoculation de réservoirs importants avec la forme spore de l'organisme, il est préférable d'utiliser un inoculum végétatif. On prépare l'inoculum végétatif en inoculant un petit volume du milieu de culture avec la forme spore ou des fragments de mycelium
de l'organisme pour obtenir une culture fraiche, à croissance active de l'organisme. On transfère ensuite l'inoculum végétatif au réservoir de grande dimension. Le milieu utilisé pour la croissance de l'inoculum végétatif peut être le même que celui utilisé pour dss fermentations plus importantes, mais
on peut également utiliser d'autres milieux.
On peut développer les organismes donnant l'antibiotique A-28086 à des températures comprises entre environ 20[deg.] et environ 40[deg.]C. Il apparaît que l'optimum de production de l'antibiotique A-28086 se produit à des températures d'environ 27-30[deg.]C.
On injecte de l'air stérile dans le milieu de culture comme il est
habituel dans des procédés de culture aérobie immergée. Pour une croissance efficace de l'organisme, le volume d'air utilisé dans le réservoir de fabrication est de préférence supérieur à 0,1 volume d'air par volume'de milieu de culture par minute. Pour une production efficace des antibiotiques A-28086, le volume d'air utilisé dans le réservoir de fabrication est de préférence supérieur
à 0,25 volume d'air par volume de milieu de culture par minute. Des teneurs importantes d'oxygène dissous ne diminuent pas la production d'antibiotiques.
On peut suivre la production des antibiotiques pendant la fermentation
en prélevant des échantillons de bouillon ou d'extraits des solides
du mycelium afin d'examiner l'activité antibiotique vis à vis des organismes connus comme étant sensibles aux antibiotiques. Un organisme d'examen utilisable pour l'essai des antibiotiques selon la présente invention est Bacillus subtilis ATCC 6533. On réalise d'une manière facile l'examen biologique par un essai
au disque de papier sur des plaques.de gélose.
Le pH initial du milieu de culture inoculé varie avec le milieu utilisé.
En général, le pH doit être dans l'intervalle de 6,0 à 7,5. Le pH de la culture à la fin de la fermentation est habituellement légèrement plus élevé, dans l'intervalle de 6,5 à 8,0.
En général, l'activité antibiotique est détectable le second jour de la fermentation. La production maximale d'activité antibiotique se produit habituellement entre le sixième et le dixième jour.
Après la préparation dans des conditions de fermentation aérobie immergée, on peut récupérer les antibiotiques A-28086 précédemment décrits à partir du milieu de fermentation par des procédés habituellement utilisés dans la technique de la fermentation. L'activité antibiotique produite pendant la
<EMI ID=127.1>
<EMI ID=128.1> procédés comprenant la filtration, l'extraction, et la chromatographie d'absorption. Un solvant préféré pour la séparation des antibiotiques A-28086 soit à partir du bouillon total soit à partir du bouillon de fermentation
filtré est l'acétate d'éthyle, bien que d'autres solvants habituellement utilisés soient satisfaisants.
Un procédé plus particulièrement avantageux de séparation des facteurs
A, B et D de l'antibiotique A-28086 est de diminuer le pH du bouillon de ' fermentation complet à environ pH 3,0. A ce pH 3,0, on sépare facilement
les facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086 et lamasse de mycélium par filtration. Un autre procédé avantageux de séparation du facteur de l'antibiotique A-28086 comprend l'addition d'un bicarbonate tel que, par exemple, le bicarbonate de sodium, au bouillon total en quantités d'approxinativement
1 gramme par litre. De cette façon, on sépare facilement les facteurs de l'antibiotique A-28086 de la masse de mycelium sous la forme de sel. On préfère le méthanol comme solvant pour la séparation des antibiotiques de la masse de mycélium, mais d'autres alcools inférieurs et des cétones sont également appropriés.
On peut également utiliser avantageusement la distillation azéotropique pour la récupération des antibiotiques A-28086. Dans ce procédé, on ajoute au bouillon aqueux de fermentation un solvant organique qui donne un azéotrope approprié avec l'eau. On soumet ce mélange solvant-bouillon à une distillation azétropique en vue d'éliminer au moins la moitié de l'eau du bouillon, en laissant un mélange eau-solvant dans lequel les antibiotiques A-28086 sont en solution dans le solvant organique. On peut séparer les sous-produits insolubles par des moyens appropriés tels que la filtration ou la centrifugation. On peut ensuite récupérer les antibiotiques A-28086 de la solution organique par des procédés bien connus tels que l'évaporation de solvants, la précipitation
par addition d'un non-solvant, ou l'extraction.
Des solvants organiques qui donnent des azéotropes appropriés avec l'eau afin de mettre en oeuvre un tel procédé de récupération comprennent, à titre illustratif, l'alcool butylique, l'alcool amylique, l'alcool hexylique, l'alcool benzylique, l'acétate de butyle, l'acétate d'amyle, le 1,2-dichloroéthane, la 3-pentanone, la 2-hexanone, le benzène, la cyclohexa-none, le toluène, les xylènes et des solvants semblables.
Il est particulièrement avantageux de pratiquer une récupération par distillation azéotropique dans des procédés de fermentation à échelle importante. L'eau et le solvant qui distillent en tête dans l'azéotrope peuvent être séparés par des procédés connus puis ensuite être recyclés pour une utilisation ultérieure. L'eau ainsi récupérée ne contient pas de contaminants et ne nécessite
<EMI ID=129.1> manière recycler dans le procédé le solvant ainsi éliminé.
Une purification ultérieure des antibiotiques A-28036 comprend des procédés supplémentaires d'extraction et d'adsorption. On peut utiliser avantageusement des produits adsorbants, tels que le gel de silice, le carbone,
<EMI ID=130.1>
Fla.) et des adsorbants semblables.
Dans une autre variante, on peut utiliser les solides de culture, comprenant les constituants du milieu et le mycélium sans extraction ou séparation, mais de préférence après l'élimination de l'eau, comme source des antibiotiques A-28086. Par exemple, après la production de l'activité antibiotique A-28086, on peut sécher le milieu de culture par lyophilisation et le mélanger directement dans un pré-mélange d'alimentation.
Dans un autre aspect, après la production de l'activité de l'antibiotique A-28086 dans le milieu de culture, on peut séparer et sécher le mycelium pour obtenir un produit que l'on peut utiliser directement dans un pré-mélange d'alimentation. Lorsque l'on sépare le mycelium pour une telle utilisation, l'addition de carbonate de calcium (environ 10 g/1) aide à la filtration et donne un produit séché amélioré.
<EMI ID=131.1>
aureofaciens décrites précédemment et désignées sous les N[deg.] NRRL 5753 et
NRRL 8092 donnent comme facteur prédominant le facteur A de l'antibiotique A-28086. Bien que le rapport des facteurs varie en fonction des conditions de fermentation utilisées, en général, le facteur A représente plus de 99 \_ de l'activité antibiotique totale récupérée à partir de NRRL 5758 et environ 90 �
<EMI ID=132.1>
de l'antibiotique A-28086 représente la plus grande partie de l'activité antibiotique restante à partir de NRRL 5758, et le facteur D est un facteur mineur. Par ailleurs, le facteur D de l'antibiotique A-28086 représente environ 8 à 10 % de l'activité antibiotique totale récupérée à partir de NRRL 8092,
et le facteur B est un facteur mineur.
On sépare les facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28036 les uns des autres et on les isole en tant que composés individuels en utilisant des procédés bien connus tels la chromatographie de colonne, la chromatographie de couche mince et les procédés semblables. Par exemple, on utilise une chromatographie de colonne sur gel de silice pour séparer les facteurs A, B et D
par élution de la colonne avec différents mélanges de solvants, tels que un mélange benzène-acétate d'éthyle. Lorsqu'on utilise des mélanges de solvants benzène-acétate d'éthyle sur colonne de gel de silice, le facteur B est d'abord élue, puis les facteurs A et D sont ensuite élues. La chromatographie de couche mince, comme décrite précédemment, est un procédé facile pour contrôle^ la <EMI ID=133.1>
progression de l'élution.
Les composés de l'antibiotique A-28086 arrêtent la croissance des
<EMI ID=134.1>
plantes. Les activités ;nicrobiologiques relatives des facteurs A et B de l'antibiotique A-28086 sont décrites ci-dessous dans le tableau V.
Le procédé d'essai est le procédé habituel de diffusion sur disque
<EMI ID=135.1>
par ml de solution ; les tampons sont placés sur des plaques de gélose ensemencées avec l'organisme à l'essai).
TABLEAU V
<EMI ID=136.1>
Dans un aspect important, les composés de l'antibiotique A-23036 arrêtent la croissance des bactéries anaérobies. Les concentrations inhibitrices minimales (CIM) pour lesquelles le facteur A de l'antibiotique A-28086 inhibe les diverses bactéries anaérobies, déterminées par un essai normalisé de dilution sur gélose sont résumées dans le tableau VI. Les lectures sont faites après 24 heures d'incubation.
TABLEAU VI
<EMI ID=137.1>
<EMI ID=138.1>
A-28086 présentent également une activité antimicrobienne et fongicide. Dans un aspect, ces dérives présentent une activité gram- positive améliorée. Les activités gram- positives relatives de certains de ces dérivés sont comparées avec l'activité du facteur A. On examine les composés par un essai
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
<EMI ID=141.1>
utilise les paramètres d'essai suivants : Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 dans un milieu de bouillon nutritif (pH 7), incubé pendant 4 heures à 37[deg.]C. On dissout les échantillons d'essai et le témoin dans un mélange éthanol-eau (10:90). On présente le témoin, le facteur A de l'antibiotique <EMI ID=142.1>
5 mcg/m1. On dilue les composés d'essai pour qu'ils contiennent approximativement 3 ou 4 mcg d'activité par ml, lorsqu'ils se présentent sur le carrousel. On donne ci-dessous les activités relatives des composés examinés, comparativement à celles du témoin.
<EMI ID=143.1>
L'activité vis à vis de Mycoplasma est un autre aspect utilisable de l'activité antimicrobienne des composés A-28086. Les espèces Mycoplasma, également connues comme organismes provoquant la pleuropneumonie (PPLO), sont des organismes pathogènes vis à vis de l'homme et de différents animaux. Des agents actifs vis à vis des organismes PPLO sont plus particulièrement demandés pour l'industrie de la volaille. Les concentrations inhibitrices minimales
<EMI ID=144.1>
telles qu'elles sont déterminées in vitro par des études de dilution de bouillon, sont résumées dans le tableau VII ci-dessous.
TABLEAU VII
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Des solutions contenant aussi peu que 10 microgrammes d'antibiotique A-28086 par ml de solution sont utilisables pour désinfecter des surfaces pour protéger les animaux des différentes espèces de mycoplasma.
Les composés A-28086 sont également des composes anti-virus. Le facteur A de l'antibiotique A-28086 est actif vis à vis du poliovirus type III, du virus vaccinia, du virus de l'herpès et du virus Semliki Forest, comme on le démontre par des essais in vitro de suppression de plaques, semblable à celui
<EMI ID=146.1>
gastro-enteritis, du virus de la maladie de Newcastle, et du virus rhinotracheitis d'infection des bovins, comme on le démontre par des essais semblables de culture de tissus.
Par conséquent, dans un des aspects de l'invention, on peut administrer un composé A-28086 par voie orale, par voie locale ou parentérale à des mammifères pour détruire les virus. Des niveaux utiles de doses pour la prévention ou le traitement des maladies virales varient d'environ 1 à environ 5 mg/kg de poids corporel de mammifère, en fonction du virus et de l'utilisation prophylactique ou thérapeutique du médicament.
En plus, on peut également utiliser des solutions contenant un composé A-28086, de préférence conjointement avec un agent surfactif, pour décontaminer l'habitat in vitro sur.lequel sont présents des virus tels que des virus polio ou de l'herpes. Des solutions contenant d'environ 1 à environ 1500 mcg/ml d'un composé A-28086 sont efficaces pour détruire les virus.
La toxicité aiguë du facteur A de l'antibiotique A-28086, administré par
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7,5 mcg/kg.
Les composés A-28086 sont également des insecticides et des acaricides. Les composés A-28086 sont actifs vis à vis des insectes tels que l'épilachne
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<EMI ID=149.1>
des taux aussi faibles que 500 ppm. En plus, les composés A-28086 sont actifs vis à vis des larves de moustiques lorsqu'on les applique à des taux aussi faibles que 1 ppm.
L'activité anticoccidienne est une propriété importante des composés A-28086. Par exemple, des expériences d'alimentation montrent qu'un composé A-28086, lorsqu'il est présent dar.s l'alimentation de jeunes poulets à des teneurs aussi faibles que 0,003 améliore les gains de poids, et, à des teneurs aussi faibles que 0,005 %, évite la mortalité et diminue le nombre
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des essais avec le facteur A chez des poulets inoculés avec différentes espèces Eimeria sont représentés dans les tableaux VIII à X.
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Pour la prévention ou le traitement des coccidioses de la volaille, on administre aux oiseaux une quantité anticcocidienne non toxique d'un composé A-28086, de préférence par voie orale, sous la forme d'une dose quotidienne. On peut fournir le composé A-28086 de nombreuses façons, frais on le fournit plus facilement avec un support acceptable sur le plan physiologique, de
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un certain nombre de facteurs dans la détermination d'une concentration appropriée du composé A-28086, les taux d'administration seront en général dans l'intervalle de 0,003 à 0,04 % en poids de l'alimentation non traitée, et
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L'aptitude à améliorer l'efficacité d'utilisation de l'alimentation des animaux est une autre propriété importante des composés A-28086. Par exemple, les composés A-28086 améliorent l'efficacité.d'utilisation de l'alimentation chez des ruminants qui possèdent une fonction développée du rumen.
Comme on l'a discuté ci-dessus, on augmente l'efficacité d'utilisation
des glucides chez des ruminants par des traitements qui stimulent
la flore dan� le rumen des animaux pour donner des composés de propionate plutôt que des composés d'acétate ou de butyrate. On peut contrôler l'efficacité d'utilisation de l'alimentation en observant la production et la concentration des composés de propionate dans le rumen, en utilisant les procédés suivants :
On obtient du fluide de rumen à partir d'un jeune boeuf à l'aide d'une fistule installée par voie chirurgicale et s'ouvrant dans le rumen. On maintient le jeune boeuf avec une ration riche en grains. On fait égoutter un échantillon du fluide du rumen à travers quatre couche de gaze, et on recueille le filtrat. On remet en suspension le produit particulaire retenu sur la gaze dans suffisamment de tampon physiologique pour revenir au volume initial du fluide du rumen, et on égoutte à nouveau cette suspension. Le tampon utilisé
à la composition suivante :
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<EMI ID=159.1>
quatre Dallons par traitement. On utilise égalèrent deux enser.bles ce quatre flacons témoins chacun. On utilise un témoin au terps zéro et un témoin à
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<EMI ID=161.1>
dans les ballons témoins.
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<EMI ID=163.1>
L'efficacité de l'utilisation des glucides est en plus démontrée par des essais in vivo réalisés sur des animaux chez lesquels on a installé des fistules dans le rumen, ce qui permet de prélever des échantillons
du contenu du rumen.
On réalise l'essai décrit dans le tableau XII avec des jeunes boeufs arrivés à maturité et munis d'une fistule, pesant environ 450 kg chacun. On alimente deux jeunes boeufs avec une nourriture normale, et quatre jeunes boeufs dans chaque groupe de traitement avec une nourriture identique à laquelle on a ajouté le facteur A de A-28086. A chaque prélèvement (100 ml)
<EMI ID=164.1>
On laisse reposer les échantillons, et on analyse les liquides surnageants par des procédés de chromatographie gazeuse pour déterminer les concentrations en acide propionique.
Les résultats du tableau XII sont les augmentations moyennes en pour cent de la concentration en acide propionique du rumen, moyennes sur cinq analyses pendant une période de traitement de 14 jours. Les témoins présentent environ
20 % molaires d'acide propionique.
TABLEAU XII
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En plus, des essais in vivo démontrent que le facteur A de A-28086 augmentent l'efficacité d'utilisation de l'alimentation des moutons. Les résultats de ces essais, réalisés pendant une période de 56 jours, sont résumés dans le tableau XIII.
<EMI ID=166.1>
Les composés du facteur D de l'antibiotique A-28086 sont des agents antiviraux. Le facteur D de A-28086 est actif vis-à-vis du virus Maryland B, du
<EMI ID=167.1>
D de A-28086 est également actif vis à vis du virus gastro-enteritis transmissible, du virus de la maladie de Newcastle, du virus rhinotracheitis d'infection des bovins, comme on le démontre par des essais semblables de culture de tissus.
Le fait que les composés du facteur D de A-28086 présentent une activité
à la fois vis-à-vis des virus et vis-à-vis des bactéries anaérobies rend ces composés particulièrement intéressants pour le traitement ou la prévention de l'entérite chez les poulets, les porcs, les bêtes à cornes et les moutons. Les composés du facteur D de l'antibiotique A-28086 sont également utilisables pour le traitement de l'entérotoxémie chez les ruminants.
L'activité anticoccidienne est une propriété importante des composés
du facteur D de l'antibiotique A-28086 de la présente invention. Des expériences in vitro démontrant l'activité anticoccidienne du facteur D de l'antibiotique A-28086 vis à vis de Eimeria tenella. On utilise le procédé suivant (pour plus de détails, voir L. R. McDougald et R. B. Galloway dans Exper. Parasitology
34, 189-196 (1973)) .
On prépare des cultures de cellules hôtes par des techniques conventionnelles en utilisant des tubes de Leighton, des récipients de plastique ou des plaques, ou d'autres récipients de culture appropriés. Au bout de 2 à 3 jours de croissance dans un milieu de culture approprié (milieu essentiel minima de Eagle, hydrolysat de lactalbumine dans une solution saline de Earle ou dans une solution saline équilibrée de Hank, milieu 199, etc., il se forme habituellement une mono-couche appropriée et elle est prête pour l'infection et le traitement par le médicament. On utilise pour ces études des cultures primaires de cellules de rein de poulets.
On obtient des ovocystes viables Eimeria Tenella à partir des matières fécales de poulets infectés et on les purifie et on les stérilise avant l'utilisation. Les ovocystes sont sporulés par incubation à température ambiante tout en faisant barboter de l'air à travers la suspension ou en agitant modérément sur un agitateur rotatif ou à l'aide de tout autre moyen approprié. On peut utiliser du bichromate de potassium ou de l'acide sulfurique ou un autre composé chimique, pour éviter la croissance bactérienne ou la croissance des moisissures pendant la sporulation.
La réparation des sporozoïtes infectieux et des ovocystes est réalisée par une combinaison de rupture mécanique de la paroi de l'ovocyste, suivie par un <EMI ID=168.1>
à se libérer eux-mêmes des sporocystes.
On infecte les cultures de cellules par introduction de sporozoïtes aptes à vivre dans le récipient de culture. On peut introduire à ce moment, ou ultérieurement, des produits chimiques d'essai. On introduit le produit
<EMI ID=169.1>
10 % dans une solution saline physiologique. La fin de l'essai est l'inhibition des phases de développement asexuées, et on la détermine par examen microscopique des cultures fixées et colorées 96 heures après infection. On enregistre
les résultats comme étant actif (A), inactif (N) et cytotoxique (C) en fonction de la présence ou de l'absence des schizontes de deuxième génération et d'une toxicité apparente vis à vis de la mono-couche cellulaire.
L'activité anti-coccidienne du facteur D de l'antibiotique A-28086 démontrée par cet essai est résumée dans le tableau XIV.
TABLEAU XIV
<EMI ID=170.1>
* Résultats de deux essais
Une autre caractéristique utilisable des composés du facteur D de l'antibiotique A-28086 est leur aptitude à améliorer l'efficacité d'utilisation de l'alimentation chez des ruminants qui présentent une fonction développée du rumen. Le mécanisme d'utilisation de la fraction nutritive la plus importante
(glucides) des aliments de ruminants est bien connu. Des micro-organismes dans
<EMI ID=171.1>
puis transforment ces monoglucides en composés pyrivates. Les composés <EMI ID=172.1>
des acétates, des butyrates ou des propionates, qui sont collectivement connus comme étant des acides gras volatils (VFA). Pour une discussion plus
<EMI ID=173.1>
Ruminant", Phillipson et coll., Eds. Orien Press, Newcastle upon Tyne, Grande-Bretagne, 1970, pp. 408-410.
L'efficacité relative de l'utilisation des VFA est discutée par McCullough dans Feedstuffs, 19 juin 1971, page 19 ; Eskeland et coll., dans J. An. Sci.
33, 282 (1971) ; et par Church et coll., dans "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Vol. 2, 1971, pp. 622 et 625. Bien que les acétates et butyrates soient utilisés, les propionates sont utilisés avec une plus grande efficacité. En plus, lorsqu'il n'y a pas assez de propionate disponible, les animaux peuvent développer une cétose. Par conséquent, un composé bénéfique stimule la production chez les animaux d'une proportion plus importante de propionates à partir des glucides, ce qui permet d'améliorer l'efficacité d'utilisation des glucides et également de réduire l'apparition de la cétose.
On peut déterminer l'activité d'un tel composé bénéfique, en observant son effet dans la production et la concentration des composés de propionate dans le rumen par le même procédé que celui utilisé comme facteur A ci-dessus.
On compare statistiquement des résultats d'essai avec des résultats témoins. Le Tableau XV donne le rapport des concentrations d'acides aras volatils
dans des flacons traités par le facteur D de A-28086 par rapport aux concentrations dans des flacons témoins.
<EMI ID=174.1>
Les composés sont typiquement efficaces pour améliorer la teneur en propionates et, par conséquent, l'efficacité d'utilisation de l'alimentation lorsqu'on les administre à des ruminants par voie orale, à des taux d'environ 0,05 mg/kg/jour, à environ 5 mg/kg/jour. On obtient les résultats les meilleurs
<EMI ID=175.1>
tation des animaux ; cependant, on peut l'administrer de toute autre manière, par exemple, sous la forme de comprimés, de breuvages, de bols ou de capsules. On peut réaliser la formulation de ces différentes formes de dosage selon des procédés bien connus dans la technique pharmaceutique vétérinaire. Chaque unité de dosage individuelle doit contenir une quantité de composé directement en relation avec la dose quotidienne appropriée pour l'animal à traiter.
On peut utiliser les antibiotiques.de A-28086, dans des compositions d'alimentation adaptées pour engraisser les bêtes à cornes, comprenant l'alimentation du bétail et de 1 à 30 g par tonne de composé.
Comme les techniciens le reconnaîtront, les alimentations pour bétail sont différentes des autres alimentations telles que pour les alimentations pour volailles. Les rations pour bétail contiennent des fourrages tels que,
<EMI ID=176.1>
En plus, des alimentations pour bétail contiennent un pourcentage élevé, souvent
<EMI ID=177.1>
protéinique habituelle est l'urée.
Comme on l'a décrit ci-dessus, les composés A-28086 sont des agents antivirus et sont également des composés actifs contre les bactéries anaérobies, plus particulièrement Clostridium perfringens. Par conséquent, les composés A-28086 sont bénéfiques dans le traitement ou la prévention de l'entérite chez le poulet, le porc, le bétail et le mouton. Les composés A-28086 sont
<EMI ID=178.1>
On donne ci-après les exemples suivants :
Exemple 1
A. Fermentation par la technique du ballon agité de A-28086 en utilisant
S. aureofaciens NRRL 5758
<EMI ID=179.1>
maintient sur de la gélose inclinée, présentant la composition suivante :
<EMI ID=180.1>
<EMI ID=181.1>
recouvre la culture inclinée arrivée à maturité avec du sérum de boeuf, et on la gratte avec une anse stérile, pour détacher les spores. On lyophilise
<EMI ID=182.1>
des spores et des fragments de mycelium.
<EMI ID=183.1>
végétatif présentant la composition suivante :
<EMI ID=184.1>
<EMI ID=185.1>
<EMI ID=186.1>
d'un arc de diamètre 5,1 cm, à 250 tours par minute.
<EMI ID=187.1>
Afin d'obtenir un plus grand volume d'inoculum. on utilise 10 ml du milieu végétatif incubé décrit ci-dessus pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance
<EMI ID=188.1>
végétatif. On fait incuber ce milieu de deuxième étape, dans un ballon d'une
<EMI ID=189.1>
arc de 5,1 cm de diamètre, à 250 tours par minute.
On utilise ce milieu végétatif de deuxième étape (1 litre) pour inoculer
100 litres d'un milieu de production stérile ayant la composition suivante :
<EMI ID=190.1>
<EMI ID=191.1>
pendant 30 minutes sous une pression de 1,05 à 1,40 kg/cm . On met à fermenter dans un récipient de fermentation d'une capacité de 165 litres le milieu de
<EMI ID=192.1>
de ferrentation par de l'air stérile sous un débit de 0,4 volume d'air par volume
<EMI ID=193.1>
conventionnels à 250 tours par minute.
<EMI ID=194.1>
On prépare les antibiotiques A-28086 selon le procédé de l'exemple 1, mais en utilisant un milieu de production dans un ballon présentant la composition suivante :
<EMI ID=195.1>
Exempte
<EMI ID=196.1>
<EMI ID=197.1>
<EMI ID=198.1> <EMI ID=199.1>
obtenue à partir du filtrat pèse 20,6 g.
Exemple 4
Isolation des facteurs A et B individuels de l'antibiotique A-28086
<EMI ID=200.1>
préparé comme décrit dans l'exemple 3) dans environ 80 ml de benzène. On soumet cette solution benzénique à une chromatographie sur colonne contenant du gel de silice (9 x 130 cm, 8 1, gel de silice Matheson qualité 62). On élue la colonne
à l'aide de mélanges variables benzène-acétate d'éthyle. On suit la progression d'élution à l'aide d'une chromatographie de couche mince. En utilisant un
système de solvant benzène-acétate d'éthyle (90:10) on élue d'abord le facteur B et
<EMI ID=201.1>
dans un mélange acétone-eau, p.f. 150-153[deg.]C.
En poursuivant l'élution avec des mélanges benzène-acétate d'éthyle mais en augmentant progressivement le rapport de l'acétate d'éthyle présent, on élue
le facteur A ; on combine les différentes fractions contenant le facteur A et on les concentre sous vide jusqu'à obtention d'un résidu. On dissout ce résidu
dans l'acétone (environ 150 ml) ; on ajoute environ 150 ml d'eau à la solution acétonique. On ajuste le pH de la solution résultante à pH 3 par addition d'acide
<EMI ID=202.1>
pendant lequel il se forme un précipité. On sépare ce précipité par filtration et le recristallise dans l'acétone (environ 150 ml) par addition d'eau (environ
60 ml). On sèche le produit pendant une nuit sous vide pour obtenir le facteur A
(environ 6,6 g). Après évaporation partielle de l'acétone du filtrat, on obtient une deuxième récolte de facteur A (environ 1,2 g).
<EMI ID=203.1>
Dérivé ester d'acétyle du facteur A de l'antibiotique A-28086
<EMI ID=204.1>
pyridine. On ajoute à cette solution 50 ml d'anhydride acétique. On mélange intimement la solution résultante et on la laisse au repos pendant une nuit à température ambiante.
<EMI ID=205.1>
ce mélange pendant 4 heures à température ambiante. Il précipite un solide blanc ; on sépare ce solide par filtration, on le lave à l'eau et on le sèche
<EMI ID=206.1>
la solution acétonique à siccité sous vide (on répète cette opération trois
<EMI ID=207.1>
eau (50 ml), pour obtenir 6,14 g du dérivé ester d'acétyle du facteur A de
<EMI ID=208.1>
Exemples 6 à 9 ...........
On prépare le dérivé ester de propionyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 par réaction du facteur A avec l'anhydride propionique en présence de pyridine selon le procédé de l'exemple 5, point de fusion 96-93[deg.]C.
On prépare le dérivé ester de n-butyryle du facteur A de l'antibiotique A-280S6, par réaction du facteur A avec ae l'anhydride n-butyrique en présence de pyridine selon le procédé de l'exemple 5, point de fusion 79-81[deg.]C.
On prépare le dérivé ester de n-caproyle du facteur A de l'antibiotique A-28036 par réaction du facteur A avec de l'anhydride caproique en présence
<EMI ID=209.1>
On prépare le dérivé ester de n-valéryle du facteur A de l'antibiotique A-28086, par réaction du facteur A avec de l'anhydride valérique en présence de pyridine selon le procédé de l'exemple 5, point de fusion 173-175[deg.]C.
Exemple 10
Préparation du sel de sodium du facteur A de l'antibiotique A-23086
<EMI ID=210.1>
On ajoute à cette solution 50 ml d'eau, et on ajoute de l'hydroxyde de sodium
5 N pour porter le pH de cette solution à 10,5-11. On agite la solution résultante pendant une heure puis on l'extrait à l'acétate d'éthyle. On évapore
<EMI ID=211.1>
partir d'une solution acétone-eau pour obtenir 378 mg du sel de sodium du
<EMI ID=212.1>
Exemples 11 à 15
On prépare le sel de baryum du facteur A de l'antibiotique A-2Su86 à partir de 5CO mg du facteur A de l'antibiotique A-28036 et en saturant d'hydroxyde de
<EMI ID=213.1>
<EMI ID=214.1>
<EMI ID=215.1>
<EMI ID=216.1>
<EMI ID=217.1>
de potassium du facteur A de l'antibiotique A-28036, point de fusion 165-167'C.
<EMI ID=218.1>
procédé de l'exemple 10.
Exemple 16
<EMI ID=219.1>
maintient sur une plaque inclinée de gélose présentant là composition suivante :
<EMI ID=220.1>
<EMI ID=221.1>
d'un milieu végétatif ayant la composition suivante :
<EMI ID=222.1>
<EMI ID=223.1>
<EMI ID=224.1>
<EMI ID=225.1>
<EMI ID=226.1>
Exemple 17
<EMI ID=227.1>
On utilise également le procédé initial décrit dans l'exemple 16 pour la
<EMI ID=228.1>
<EMI ID=229.1>
végétatif incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu végétatif de deuxième étape
<EMI ID=230.1>
minute sous un arc de 5,1 cm.
<EMI ID=231.1>
inoculer 100 litres d'un milieu de fermentation stérile présentant la composition suivante :
<EMI ID=232.1>
<EMI ID=233.1>
<EMI ID=234.1>
tionnels à 300 tours par minute.
Exemple 18
<EMI ID=235.1>
utilisant un milieu de production de flacon agité/cuve présentant la composition suivante :
<EMI ID=236.1>
<EMI ID=237.1>
décrit dans l'exemple 10.
Exemple 19
<EMI ID=238.1>
<EMI ID=239.1>
On ajuste 60 litres de bouillon de fermentation total obtenu par le procédé
<EMI ID=240.1>
sous agitation. Après séparation de cet extrait, on extrait à nouveau le gâtesde mycélium avec à nouveau 30 litres de méthanol . On réunit les deux extraits
<EMI ID=241.1>
<EMI ID=242.1>
laisse reposer pendant 16 heures la solution résultante pour qu'il se produise
<EMI ID=243.1>
sèche sous vide pour obtenir 74 g d'un produit cristallin brut contenant les facteurs A et D de l'antibiotique A-28086 et d'autres impuretés cristallines.
<EMI ID=244.1>
62). On élue la colonne successivement avec 40 litres de chacun des solvants suivants :
<EMI ID=245.1>
On recueille des fractions de 1 litre. Gn examine chaque fraction par essai
<EMI ID=246.1>
successivement par :
<EMI ID=247.1>
<EMI ID=248.1>
<EMI ID=249.1>
<EMI ID=250.1>
<EMI ID=251.1>
en utilisant un milieu de production en ballon présentant la composition suivante :
<EMI ID=252.1>
* Staley Dextrin N[deg.] 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111.
** Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.
Exemple 23
On prépare les antibiotiques de A-28086 selon le procédé de l'e;.emple 21 mais en utilisant un milieu végétatif intermédiaire de troisième étape ayant la composition suivante :
<EMI ID=253.1>
<EMI ID=254.1>
<EMI ID=255.1>
On prépare un aliment équilibré, énergétique, adapte pour l'alimentation de la volaille pour une croissance rapide selon la recette suivante :
<EMI ID=256.1>
<EMI ID=257.1>
(représentant les vitamines A, D, E,
<EMI ID=258.1>
l'acide pantothénique, la riboflavine
la biotine, avec un diluant qui est le
<EMI ID=259.1>
<EMI ID=260.1>
aliments. On protège la volaille nourrie avec cet aliment, avec de l'eau
ad libitum, vis-à-vis de l'exposition à la coccidiose ; les gains de poids sont comparables à ceux de la volaille sans coccidiose alimentée par une nourriture semblable ne contenant pas de médicament.
Exemple 25
Aliment cour bétail amélioré par A-28086
On prépare un aliment équilibré riche en grains pour bétail comme suit :
<EMI ID=261.1>
<EMI ID=262.1> <EMI ID=263.1>
ajoutée.
.. Graines séchées de distillation du mais avec des produits solubles <EMI ID=264.1>
tion fournit environ 300 mg du facteur A de A-2S086 par animât par jour.
Exemple 26
<EMI ID=265.1>
mélange intimement la solution résultante puis on l'abandonne pendant une nuit à température ambiante.
On ajoute ensuite un excès d'eau, on mélange intimement et on abandonne au repos le mélange pendant quelques heures à température ambiante. On sépare par filtration le précipité qui se forme, on le lave à l'eau et on le sèche.
On dissout le solide résultant dans l'acétone et on l'évaporé à siccité sous vide pour obtenir le dérivé ester d'acétyle du facteur D de l'antibiotique A-28086.
Exemples 27 à 30
On prépare le dérivé d'ester de propionyle du facteur D de l'antibiotique A-23086 par réaction du facteur D de l'antibiotique A-28036 avec l'anhydride
<EMI ID=266.1>
On prépare le dérivé ester de n-butyryle du facteur D de 1 'antibiotique A-28036 par réaction du facteur D de l'antibiotique A-2SG36 avec l'anhydride
<EMI ID=267.1>
<EMI ID=268.1>
<EMI ID=269.1>
<EMI ID=270.1>
Exemples 32 à 34
<EMI ID=271.1>
du facteur D de l'antibiotique A-280S6 et d'hydroxyde de césiun 1 N en utilisant le procédé de l'exemple 31.
Exemple 35
<EMI ID=272.1>
empêcher la coccidiose.
On prépare un aliment équilibré, à pouvoir énergétique élevé adapte à la nourriture de la volaille pour un gain de peias rapide, selon la recette suivante :
<EMI ID=273.1>
<EMI ID=274.1> <EMI ID=275.1>
sont comparables a ceux obtenus avec de la volaille non atteinte de coccidiose recevant une alimentation semblable sans médicament.
Exemple 36
<EMI ID=276.1>
<EMI ID=277.1>
la manière suivante :
<EMI ID=278.1>
<EMI ID=279.1>
REVENDICATIONS
<EMI ID=280.1>
un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucides d'azote
<EMI ID=281.1>
jusqu'à ce qu'une quantité substantielle d'activité antibiotique soit produite par ledit micro-organisme dans ledit.milieu de culture.
2. Complexe antibiotique A-280S6 contenant des facteurs A, B et D tels que décrits présentement.
The invention relates to factors A, B and D of antibiotic A-28086
<EMI ID = 1.1>
factors A, B and D are derived. The antibiotic compounds can be used as antibacterial, antifungal, antivirus agents, as agents for destroying organisms causing diseases such as pleuro-pneumonia, as anticoccidial agents, insecticides or acari.cides and for improving the efficiency of food use in ruminants.
The present invention provides a process for preparing the A-28086 antibiotic complex exhibiting a factor A, a factor B and a factor D, which comprises culturing Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 or Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 in culture medium containing assimilable sources. of carbohydrates, nitrogen and inorganic salts under conditions of submerged aerobic fermentation until a significant amount of antibiotic activity has been obtained by means of said organism in said culture medium.
<EMI ID = 2.1>
containing factors A, B and D as described below.
Antibiotic A-28086 Factor A is a white crystalline compound
<EMI ID = 3.1>. Lower alcohols, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, ethyl acetate, chloroform, acetone and benzene; but it is only <EMI ID = 4.1>
about 98-100 [deg.] C, re-solidifies and re-melts at about 195-200 [deg.] C and it presents:
a) a molecular weight of 764, by determination by spectrometry; b) an approximate elemental composition of 66.69 carbon, 9.85% hydrogen and 23.10% oxygen; <EMI ID = 5.1> following distinguishable absorption: 2.85, 3.34, 5.83, 6.82, 7.22, 7.53 (weak), 7.78 (weak), 8.75 ( strong), 8.95 (strong), 9.15, 9.50
(strong), 9.55 (strong), 9.60, 9.85, 10.15, 10.45 and 10.70 (weak) mi crons; f) in its ultraviolet spectrum in ethanol only one band <EMI ID = 6.1>
g) a nuclear magnetic resonance spectrum in chloroform
<EMI ID = 7.1>
PATENT'
<EMI ID = 8.1>
Conventional priority of. American patent applications
Nos. 477.954, 569.740 and 569.719 filed in the United States of America on June 10, 1974 and April 21, 1975 by David Herbert Berg,
<EMI ID = 9.1>
<EMI ID = 10.1>
1.47, 1.39, 1.31, 1.25, 1.13, 0.95, 0.93, 0.90, 0.88, 0.85, 0.77, 0.75, 0, 73, 0.6S and 0.66 ppm;
h) a titratable group with a pKa value of 7.9 in dimethylfor-
80% aqueous mamide.
i) a characteristic diagram of this X-ray powder diffraction
<EMI ID = 11.1>
between the planes of atoms in angstroms (d):
<EMI ID = 12.1>
<EMI ID = 13.1>
silica in a benzene-ethyl acetate solvent system (3: 2, using Bacillus subtilis ATCC 6633 as organized detector;
<EMI ID = 14.1>
paper shown below, using Bacillus subtilis ATCC 6633 as the detection organism:
<EMI ID = 15.1>
0.75 Water: MIBK: ethyl acetate (98: 1: 1)
1) an acid function capable of forming salts and derivatives
ester; and
m) at least one hydroxyl group capable of esterification;
<EMI ID = 16.1>
physiological.
Antibiotic A-28086 factor B is a white crystalline compound when crystallized from acetone-water, it is soluble in lower alcohols, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, ethyl acetate, chloroform, acetone and benzene; but it is only
<EMI ID = 17.1> a) a melting point of about 150-153 [deg.] C; b) a molecular weight of 762, determined by high resolution mass spectrometry; High resolution mass <EMI ID = 18.1> d) an infrared spectrum in chloroform with the following distinguishable absorption maxima:
2.82, 3.30, 5.77, 5.85, 6.80, 7.20, 7.50 (weak), 7.72 (weak)
7.80 (weak), 8.57 (strong), 8.68, 8.90 (strong). 9.10, 9.50, 9.83 (strong), 9.90, 10.10, 10.17 (strong), 10.43 (weak), 10.80 (weak), 11.20 (weak) ,
11.35 (weak), 11.73 (weak), and 12.03 (weak) microns; e) an absorption maximum observed in ethanol on its ultra- spectrum <EMI ID = 19.1> f) a nuclear magnetic resonance spectrum in deuterated chloroform with the following characteristics: S 7,20, 7,09, 6 , 26, 6.15, 4.19, 4.12, 4.05, 3.95, 3.89, 3.78, 3.62, 3.59, 3.52, 3.48, 2.81 , 2.73, 2.63, 2.54, 2.52, 1.99, 1.91, 1.84, 1.71, 1.67, 1.64, 1.55, 1.43, 1 , 33, 1.18, 1.11, 0.96, 0.94, 0.90, 0.87, 0.84, 0.77, 0.74 and 0.68 ppm;
g) an Rf value of 0.42 for thin layer chromatography on gel of
silica in a benzene-ethyl acetate mixture (3: 2), using Bacillus subtilis ATCC 6633 as a detection organism;
h) the following values Rf for chromatography systems on
paper shown below, using Bacillus subtilis ATCC 6633 as the detection organism;
<EMI ID = 20.1>
<EMI ID = 21.1>
with NH40H then reduced to pH 7.5 with H3PO4
<EMI ID = 22.1>
1) an acid function capable of giving salts and ester derivatives;
j) two ketone fractions; and
k) at least one hydroxyl moiety
and its physiologically acceptable salts.
Antibiotic A-28086 factor D is a white crystalline compound when crystallized from acetone-water; it is soluble in methanol, ethanol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, ethyl acetate, chloroform, acetone and benzene; but it is only slightly soluble in hexane; and it is insoluble in water; it splits at about 96-98 [deg.] C, and it exhibits: a) a molecular weight of 778, determined by high resolution mass spectrometry; <EMI ID = 23.1> nation at 25 [deg.] C; e) an infrared absorption spectrum in chloroform with the following observable absorption maxima: 2.89, 3.39, 3.43, 3.50, 5.88, 6.90, 7.27, 7.60, 7.84, 9.00, 9.26, 9.62, 10.31, 10.58, 11.10 and
11.49 microns; f) no observable absorption in the ultraviolet in 95% aqueous ethanol;
g) a nuclear magnetic resonance spectrum in chloroform with
<EMI ID = 24.1>
<EMI ID = 25.1>
0.84, 0.74 and 0.68 ppm;
<EMI ID = 26.1>
<EMI ID = 27.1>
j) the following Rf values in chromatography systems in
thin layer on silica gel shown below, using Bacillus subtilis ATCC 6633 as the detection organism:
Rf value Solvent system
0.26 Benzene ethyl acetate (3: 2)
0.66 Ethyl acetate-diethylamine (95: 5)
k) the following Rf values on paper chromatography systems
indicated below, using Bacillus subtilis ATCC 6633 as the detection organism:
<EMI ID = 28.1>
0.64 Water: MIBK: ethyl acetate (98: 1: 1)
1) an acid function capable of giving salts and derivatives
ester; and
m) at least one hydroxyl group capable of esterification;
and its C2-C6 acyl ester derivatives and, its physiologically acceptable salts.
Although many antibacterial agents are currently known,
there is a continuing demand for new and improved antibiotics. A problem in current antibiotic therapy is that antibiotics differ in their efficacy against pathogenic organisms. Another problem is the development of strains of organisms that are resistant to normal antibiotics. Another problem is also the fact that some patients often suffer from serious reactions to specific antibiotics, due to hypersensitivity and / or toxic effects. In view of these problems in current therapy, there is a continuing demand for new antibiotics.
In addition to the demands for new antibiotics which can be used in the treatment of human diseases, there is also a demand for improved antibiotics in the veterinary field. In one important area, there is a demand for improved antibiotics to improve the growth of poultry and livestock. For example, increased growth is achieved by reducing disease and increasing feed utilization efficiency.
A disease well recognized in veterinary science as to its economic importance, especially in the poultry industry, is protozoan coccidiosis. Coccidiosis results from infection with one or more species of Eimeria or Isospora (for a summary, see Lund and Farr
<EMI ID = 29.1>
State University Press, Ames, la., 1965, pages 1056-1096). In view of the significant economic losses due to coccidiosis and the drawbacks of the well-known anticoccidial agents, the search for new anticoccidial agents continues.
Enteritis is another disease that can cause severe economic losses to producers of live herds. Enteritis occurs in chickens, pigs, horned animals and sheep and is mainly attributed to
to anaerobic bacteria, more particularly Clostridium perfringen, and to
<EMI ID = 30.1>
C. perfringens.
Improved growth in ruminants, such as animals <EMI ID = 31.1>
rinary. Of particular interest is the improvement in growth achieved by increasing the efficiency of feed utilization. The mechanism for using most of the nutrient fraction
(carbohydrates) these feeds for ruminants is well known. Microorganisms present in the rumen of the animal break down carbohydrates
to give monoglucides, then convert these monoglucids into pyruvates. Pyruvates are metabolized by microbiological processes to give known acetates, butyrates or propionates
<EMI ID = 32.1>
<EMI ID = 33.1>
<EMI ID = 34.1>
<EMI ID = 35.1>
The antibiotic complex A-28086 is prepared by culturing the new strain of Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 under conditions of submerged aerobic fermentation until a significant level of antibiotic activity is obtained. The antibiotic complex A-28086 can also be prepared by culturing another new strain of Streptomyces aureofaciens, NRRL 8092. When prepared either by S. aureofaciens NRRL 5758 or by
S. aureofaciens NRRL 8092, the antibiotic complex A-28086 is extracted from fermentation broth and mycelium using polar organic solvents. The antibiotic mixture extracted is separated by concentration of the solvents, by adding the concentrates of the excess petroleum ether to precipitate the impurities, by filtration and by evaporation of the filtrates to obtain the antibiotic mixture A-28086. The antibiotic mixture is further purified and separated into individual factors by column chromatography.
Compounds A-28086 stop the growth of organisms that are
<EMI ID = 36.1>
anti-PPLO (organisms causing diseases of the pleuro-pneumonia genus), insecticides and acaricides and they improve the efficiency of feed use in ruminants.
The following infrared absorption spectra in chloroform are shown in the drawings: figure 1 - factor A of antibiotic A-28086 figure 2 - factor B of antibiotic A-28086 figure 3 - acetyl ester derivative of factor Has antibiotic
<EMI ID = 37.1> figure 5 - butyryl ester derivative of factor A of the antibiotic
<EMI ID = 38.1>
A-2S036 figure 7 - caproyl ester derivative of factor A of the antibiotic
<EMI ID = 39.1> figure 3 - D factor of antibiotic A-28086
The factors of the antibiotic A-28036 are related in a way: structu-
<EMI ID = 40.1>
relaunch. Cn separates the factors from each other, and we isolate the factors <EMI ID = 41.1>
The mixture of factors A-28086 is soluble in most organic solvents, but it is insoluble in water.
<EMI ID = 42.1>
<EMI ID = 43.1>
<EMI ID = 44.1>
<EMI ID = 45.1>
Antibiotic A-28036 factor 8 is a white crystalline compound
(by crystallization in an acetone-water mixture) which has a fusicr point. of about 150-153 [deg.] C.
By determination by high resolution mass spectrometry, the
factor B has an apparent molecular weight of 762 and it is suggested that
<EMI ID = 46.1>
The infrared spectrum of factor B in chloroform is shown in Figure 2 of the accompanying drawings. We observe the absorption maxima
<EMI ID = 47.1>
7.80 (weak), 8.57 (strong), 8.68, 8.90 (strong), 9.10, 9.50, 9.83 (strong), 9.90,
10.10, 10.17 (strong), 10.43 (weak), 10.80 (weak), 11.20 (weak), 11.35
(weak), 11.73 (weak), and 12.03 (weak) microns.
The ultraviolet spectrum of factor B in ethanol shows a maximum
<EMI ID = 48.1>
The nuclear magnetic resonance spectrum of antibiotic A-28086 factor B in deuterated chloroform has the following characteristics: S 7.20, 7.09, 6.26, 6.15, 4.19, 4.12, 4.05, 3.95, 3.89, 3.78, 3.62,
<EMI ID = 49.1>
1.64, 1.55, 1.43, 1.33, 1.18, 1.11, 0.96, 0.94, 0.90, 0.87, 0.84, 0.77, 0, 74, and 0.68 ppm.
Antibiotic A-28086 factor B is soluble in a number of
<EMI ID = 50.1>
thylformamide, dimethyl sulfoxide, ethyl acetate, chloroform, acetone and benzene; but it is only slightly soluble in nonpolar organic solvents such as hexane; and it is insoluble in water.
<EMI ID = 51.1>
is not elucidated, the preceding physicochemical data show that this factor B has a single carboxylic acid fraction, two ketone fractions and one or more hydroxyl fractions.
Antibiotic A-28086 factor B, when prepared using
S. aureofaciens NRRL 5758, is a minor factor. However, when prepared from S. aureofaciens NRRL 8092, the factor D of the antibiotic
<EMI ID = 52.1>
recovered.
Antibiotic A-28086 Factor D is a white crystalline product
(by crystallization from an acetone-water mixture) with a melting point of about 96-98 [deg.] C. The D factor of antibiotic A-28085 has a
<EMI ID = 53.1>
<EMI ID = 54.1>
<EMI ID = 55.1>
<EMI ID = 56.1>
<EMI ID = 57.1>
<EMI ID = 58.1>
<EMI ID = 59.1>
The Rf values of factors A, B and D of antibiotic A-28086 in different paper chromatography systems, using as organ-
<EMI ID = 60.1>
Table 1
<EMI ID = 61.1>
In Table II, the Rf values of factors A, B and D of antibiotic A-28086 are given in two silica gel thin-layer chromatography systems (plates coated with E. Herck, Darmstadt, F-254, thickness layer 0.25 mm), also using Bacillus subtilis ATCC 6633 as a detection organism.
Table II
<EMI ID = 62.1>
Another substance, arbitrarily referred to as A-28086-I, is produced simultaneously with the antibiotic complex A-28086. Although product A-28086-I is not microbiologically active, it is structurally related to the antibiotic factors of product A-28G36.
Product A-28036-I is a white crystalline compound (by crystallization from an acetone-water mixture) and has a melting point of about 160-162 [deg.] C. Comparative studies of NMR spectra and other product properties
<EMI ID = 63.1>
synthetically prepared show clearly that the product A-28OS6-I is the factor A methyl ester of the antibiotic A-28086 or one. closely related compound such as a stereoisomer.
Although product A-28086-I initially co-precipitates with the active antibiotic factors of product A-28086, it is readily separated from these by
<EMI ID = 64.1>
Rf approximately 0.53 in thin layer chromatography on silica gel with ethyl acetate using a spray reagent for detection.
<EMI ID = 65.1>
per 100 ml of solution). After spraying the vanillin and after heating, product A-28086-I gives a blue spot while the antibiotic factors of product A-28086 give shiny pink spots which quickly turn dark brownish blue.
Antibiotic A-28086 factors A, B and D and the specified acyl ester derivatives of factors A and D are capable of forming salts. "Physiologically acceptable" salts are salts which are also pharmaceutically acceptable, i.e. salts in which the toxicity of the compound as a whole to warm-blooded animals
<EMI ID = 66.1>
and suitable alkali metal and alkaline earth metal factors A and B of Antibiotic A-28086 include sodium, potassium, lithium, cesium, rubidium, barium, calcium and magnesium salts. Appropriate amine salts of factors A and B of antibiotic A-28086 include
<EMI ID = 67.1>
illustrative include those prepared by reacting factors A and B of antibiotic A-28086 with ammonium hydroxide, methylamine, secondary butylamine, isopropylamine, diethylamine, diisopropylamine, ethanolamine, triethylamine, 3-amino-1-propanol and similar amines :.
The cationic alkali metal and alkaline earth metal salts of factors A, B and D of antibiotic A-28086 and acyl ester derivatives of factors A and D are prepared according to methods usually used for
the preparation of cationic salts. For example, the free acid form of the antibiotic factor or the ester derivative is dissolved in a suitable solvent.
<EMI ID = 68.1>
<EMI ID = 69.1>
isolating the salt thus formed by usual methods, such as filtration, evaporation of the solvent.
The salts formed with organic amines can be prepared in a similar manner. For example, the gaseous or liquid amine can be added to a solution of the antibiotic factor in a suitable solvent such as acetone, and the solvent and excess amine can be removed by evaporation.
It is well known in the veterinary pharmaceutical art that the
<EMI ID = 70.1>
by antibiotic. In most cases, conditions in the animal change the medicine to form a form other than that in which it is given. Therefore, the form of salt in which it is administered is not significant to the method of treatment. However, the salt form can be chosen for reasons of economy, convenience and toxicity.
Antibiotic A-28086 factor A gives acyl ester derivatives. Esterification occurs on one of the hydroxyl groups of factor A of antibiotic A-28086 by treatment with an anhydride or a steel chloride
<EMI ID = 71.1>
factor A of antibiotic A-28086 with, for example, the corresponding acid anhydride at room temperature. These ester derivatives can also be used as antibiotics and as agents for improving the efficiency of food use.
The following paragraphs describe the features-; of these acyl ester derivatives of factor A of the antibiotic A-280S6.
<EMI ID = 72.1>
white crystalline compound (by crystallization from acetone-water mixture) with a melting point of about 100-103 ° C. The acetyl ester derivative of
<EMI ID = 73.1>
a molecular weight of about 807, based on the empirical formula
<EMI ID = 74.1>
of the acetyl ester derivative of factor A gives the following composition in percentage:
<EMI ID = 75.1>
Found: C, 67.67; H, 8.71; 0, 23.13
The infrared spectrum of the acetyl ester derivative of antibiotic factor A-28086 in chloroform is shown in Figure 3 of the drawings.
<EMI ID = 76.1>
10.25 (weak) and 10.50 microns.
The ultraviolet spectrum of antibiotic factor A acetyl ester A-28086 in ethanol shows only final absorption.
Electrometric titration of the acetyl ester derivative of factor A of
<EMI ID = 77.1>
presence of a titratable group with a pK value of 8.5.
The factor A propionyl ester derivative of antibiotic A-28086 is a white crystalline compound (by crystallization from acetone-water mixture) with a melting point of about 96-98 [deg.] C. The propionyl ester derivative of factor A of antibiotic A-28086 has the empirical formula C46H76012 and a molecular weight of about 821, compared to the empirical formula proposed for factor A of antibiotic A-28086. Elemental analysis of the propionyl ester derivative of factor A gives the following composition in percentage:
Calculated for C46H76012: C, 67.29; H, 9.33; 0, 23.38
Found C, 66.06; H, 9.17; 0, 23.41
The infrared spectrum of the factor A propionyl ester derivative of antibiotic A-28086 in chloroform is shown in Figure 4 of the accompanying drawings. The following absorption maxima are observed; 2.85, 3.33, 3.38 (strong), 3.45 (strong), 5.75 (strong), 5.82, 6.81, 7.22, 7.30 (strong), 7, 50
(weak), 7.60 (weak), 7.80, 8.43, 8.75 (strong), 8.90, 9.05, 9.15 (strong), 9.50 (strong), 9, 63, 9.83. (Weak), 10.05 (strong), 10.13, 10.20 (strong), 10.45
and 10.63 microns.
The ultraviolet spectrum of the factor A propionyl ester derivative of antibiotic A-28086 in ethanol shows only final absorption.
Antibiotic A-28086 Factor A butyryl ester derivative is a white crystalline compound (by crystallization from acetone-water mixture) with a melting point of about 96-98 [deg.] C. The butyryl ester derivative of
<EMI ID = 78.1>
proposed risk for factor A of antibiotic A-28086.
The infrared spectrum of the butyryl ester derivative of factor A of
<EMI ID = 79.1>
<EMI ID = 80.1>
3.45, 3.51, 5.85, 5.92! Strong), 5.97 (strong), 6.90, 7.30, 7.84 (weak), 8.55,
<EMI ID = 81.1>
The factor A valeryl ester derivative of antibiotic A-28086 is a white crystalline compound (by crystallization from acetone-water mixture) with a melting point of about 173-175 [deg.] C. The valeryl ester derivative of
<EMI ID = 82.1> <EMI ID = 83.1>
proposed for factor A of antibiotic A-28086.
The infrared spectrum of the valeryl ester derivative of factor A of
<EMI ID = 84.1>
<EMI ID = 85.1>
<EMI ID = 86.1>
(weak), 8.16, 8.58, 8.85 (weak), 9.26, 9.76, 10.00 (weak), 10.31 and
10.64 microns.
Antibiotic A-28086 Factor A caproyl ester derivative is a white crystalline compound (by crystallization from acetone-water) with a melting point of about 163-167 ° C. The caproyl ester derivative of
<EMI ID = 87.1>
The infrared spectrum of the caproyl ester derivative of antibiotic A-28086 factor A in chloroform is shown in Figure 7 of the drawings.
<EMI ID = 88.1>
Acylation of antibiotic A-2S036 factor A results in the following changes in the nuclear magnetic resonance spectrum
<EMI ID = 89.1>
about 5.3 ppm (the exact position varies slightly between different acyl derivatives), and the signals of the vinyl protons also move. This is characteristic of the change represented in the partial structure by:
<EMI ID = 90.1>
<EMI ID = 91.1>
homonuclear <1> H decoupling and nuclear magnetic resonance <1> <3> C from acetyl and propicryl ester derivatives.
<EMI ID = 92.1> methanol, ethanol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, ethyl acetate, chloroform, acetone and benzene; but they are
<EMI ID = 93.1>
hexane; and they are insoluble in water.
<EMI ID = 94.1>
has an acid function capable of giving salts and ester derivatives.
New antibiotics are prepared by growing a strain of
<EMI ID = 95.1>
aerobic immersed in an appropriate culture medium until significant antibiotic activity occurs. We collect the antibiotics
<EMI ID = 96.1>
used and understood in the art.
One of the new organisms that can be used for the preparation of antibiotics is isolated from a sample of soil collected on Mount Ararat in
<EMI ID = 97.1>
Species Descriptions from First and Second Studies ", International Bulletin Systematic Bacteriology 18, 279-392 (1968). This classification is based on
<EMI ID = 98.1>
and D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces species", International Bulletin Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966)] in addition to certain additional tests. We define the color names
<EMI ID = 99.1>
Commerce, Circular 553, 1955, Washington, D.C.). The numbers between parer-
<EMI ID = 100.1>
<EMI ID = 101.1>
New York, N.Y. 1950). Cultures are performed at 30 ° C for 14 days unless otherwise specified.
<EMI ID = 102.1>
Morphology
The sporulating aerial hyphae include claws, loops and open spirals. A representative morphology of the rectus flexibilis type is also observed. The spores are short and cylindrical and se
<EMI ID = 103.1>
<EMI ID = 104.1>
electron microscope, is regular.
Culture characteristics of strain NLRL 5753 in different media
<EMI ID = 105.1>
<EMI ID = 106.1>
- ..
The NRRL 5758 organism is studied for selected physiological properties, according to normal procedures. The properties observed and the characteristics found are as follows:
<EMI ID = 107.1>
Temperature imperative (plan 26-30 [deg.] C good growth; 30-37 [deg.]
<EMI ID = 108.1>
yeast, malt extract) 45 [deg.] slightly vegetative growth;
reddish soluble pigment.
The results of the carbon utilization tests carried out with the NRRL 5758 organism are reported below. The symbols used to indicate the growth response are:
+ Good growth, positive use
(+) Low to medium growth
(-) Low growth, probably no use
No growth, no use.
<EMI ID = 109.1>
A second new organism giving the antibiotic to 28086 is derived from
<EMI ID = 110.1>
a chemical mutation. This organism, identified as NRRL 8092, is also classified as a strain of Streptomyces aureofaciens Duggar. This classification is based on studies by NRRL 8092 in
<EMI ID = 111.1>
and identical growth conditions. The characteristics of the organized NRRL 8092 observed in these studies are gathered in the following paragraphs.
Characterization of strain NRRL 8092 producing
antibiotic A 28C86
Morphology
<EMI ID = 112.1>
occasional, but mainly short, straight sporophores. Spore chains have less than 10 spores per chain, usually 4-7 spores per chain. Short, straight spore chains are observed in the
<EMI ID = 113.1>
abundant coremia on Emerson's agar. We practice observations
<EMI ID = 114.1>
<EMI ID = 115.1>
Culture characteristics of strain NRRL 8092
in different settings
<EMI ID = 116.1>
<EMI ID = 117.1>
The NRRL 8092 organism was also studied with respect to selected physiological properties, according to normal procedures. The properties observed and the characteristics found are as follows:
<EMI ID = 118.1>
<EMI ID = 119.1>
<EMI ID = 120.1>
me NRRL 8092 are summarized below. The symbols used to indicate the growth response are:
+ good growth, positive use
(+) low to moderate growth
(-) weak growth, probably no use
no growth, no use
<EMI ID = 121.1>
<EMI ID = 122.1>
antibiotic A-28036 differ from the characteristics of the organism described by Shirling and Gottlieb. These differences are summarized in Table III:
<EMI ID = 123.1>
<EMI ID = 124.1>
characteristics of the organism NRRL 8092 are summarized in Table IV:
<EMI ID = 125.1>
<EMI ID = 126.1>
antibiotics A-28086 have been deposited and are part of the culture collection of the Northen Marketing and Nutrition Research Division, U.S. Department of Agriculture. Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, USA
61604, where they are available to the public under N [deg.] NRRL 5758 and NRRL
8092.
The culture medium used for the growth of Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 or Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 can be
any one of a number of backgrounds. However, for reasons of economy of preparation, optimum yield, and ease of product isolation, certain culture media are preferred. Therefore, for example, preferred sources of carbohydrates for large scale fermentation
are tapioca dextrin and sucrose, although one can use
glucose, corn starch, fructose, mannose, maltose,
lactose, and similar carbohydrates. Corn oil, peanut oil, soybean oil, and fish oil are other useful carbon sources. A preferred source of nitrogen is enzyme hydrolyzed casein, although peptones, soybean meal, etc. can also be used.
cottonseed meal, amino acids such as glutamic acid, etc. Among the mineral nutrient salts that can be incorporated into the
culture medium, are the usual soluble salts capable of giving
sodium, magnesium, calcium, ammonium, chloride, carbonate, sulfate, nitrate, and similar ions.
Essential elements in the form of traces necessary for the growth and development of the organism must also be introduced into the culture medium. Such trace elements are usually in the form of impurities of other constituents of the medium in sufficient amounts to meet the growth requirements of the organism.
It may be necessary to add small amounts (eg 0.2 ml / L) of an anti-foaming agent such as polypropylene glycol in large scale fermentation media if foaming becomes a problem.
Although this is not essential, the preparation of the antibiotic from the strains of Streptomyces aureofaciens giving the antibiotic A-23086 is improved by the addition of a small amount of oil such as soybean oil.
For the preparation of large quantities of antibiotics A-28086,
preferred is aerobic fermentation submerged in tanks. Small amounts of antibiotic A-28086 can be obtained by shake flask culture. In view of the loss of time in the preparation of the antibiotic which is generally associated with the inoculation of large reservoirs with the spore form of the organism, it is preferable to use a vegetative inoculum. The vegetative inoculum is prepared by inoculating a small volume of the culture medium with the spore form or fragments of mycelium.
of the organism to obtain a fresh culture, with active growth of the organism. The vegetative inoculum is then transferred to the large reservoir. The medium used for the growth of the vegetative inoculum may be the same as that used for larger fermentations, but
other media can also be used.
The organisms giving antibiotic A-28086 can be grown at temperatures between about 20 [deg.] And about 40 [deg.] C. It appears that the optimum production of antibiotic A-28086 occurs at temperatures of about 27-30 [deg.] C.
Sterile air is injected into the culture medium as it is
usual in aerobic submerged culture methods. For efficient growth of the organism, the volume of air used in the manufacturing tank is preferably greater than 0.1 volume of air per volume of culture medium per minute. For efficient production of A-28086 antibiotics, the volume of air used in the manufacturing tank is preferably greater.
at 0.25 volume of air per volume of culture medium per minute. High levels of dissolved oxygen do not decrease the production of antibiotics.
Antibiotic production can be monitored during fermentation
by taking samples of broth or solids extracts
mycelium to examine the antibiotic activity against organisms known to be sensitive to antibiotics. An examination organism usable for the testing of antibiotics according to the present invention is Bacillus subtilis ATCC 6533. Biological examination is easily performed by an assay.
disc on agar plates.
The initial pH of the inoculated culture medium varies with the medium used.
In general, the pH should be in the range of 6.0 to 7.5. The pH of the culture at the end of fermentation is usually slightly higher, in the range of 6.5-8.0.
In general, antibiotic activity is detectable on the second day of fermentation. The maximum production of antibiotic activity usually occurs between the sixth and tenth day.
After preparation under submerged aerobic fermentation conditions, the A-28086 antibiotics described above can be recovered from the fermentation medium by methods commonly used in the fermentation art. Antibiotic activity produced during
<EMI ID = 127.1>
<EMI ID = 128.1> processes including filtration, extraction, and absorption chromatography. A preferred solvent for the separation of antibiotics A-28086 either from the total broth or from the fermentation broth
filtered is ethyl acetate, although other commonly used solvents are satisfactory.
A more particularly advantageous process for the separation of factors
A, B and D of antibiotic A-28086 is to decrease the pH of the complete fermentation broth to about pH 3.0. At this pH 3.0, it is easy to separate
antibiotic A-28086 factors A, B and D and mycelium mass by filtration. Another advantageous method of separating factor from antibiotic A-28086 comprises adding a bicarbonate such as, for example, sodium bicarbonate, to the total broth in amounts of approximately
1 gram per liter. In this way, the factors of antibiotic A-28086 are easily separated from the mycelium mass in the form of salt. Methanol is preferred as the solvent for the separation of antibiotics from the mycelium mass, but other lower alcohols and ketones are also suitable.
Azeotropic distillation can also be used advantageously for the recovery of antibiotics A-28086. In this process, an organic solvent is added to the aqueous fermentation broth which gives a suitable azeotrope with water. This solvent-broth mixture is subjected to azetropic distillation in order to remove at least half of the water from the broth, leaving a water-solvent mixture in which the antibiotics A-28086 are in solution in the organic solvent. Insoluble by-products can be separated by suitable means such as filtration or centrifugation. Antibiotics A-28086 can then be recovered from the organic solution by well known methods such as solvent evaporation, precipitation.
by addition of a non-solvent, or extraction.
Organic solvents which give suitable azeotropes with water in order to carry out such a recovery process include, by way of illustration, butyl alcohol, amyl alcohol, hexyl alcohol, benzyl alcohol, Butyl acetate, amyl acetate, 1,2-dichloroethane, 3-pentanone, 2-hexanone, benzene, cyclohexa-none, toluene, xylenes and similar solvents.
It is particularly advantageous to practice recovery by azeotropic distillation in large scale fermentation processes. The water and the solvent which overhead in the azeotrope can be separated by known methods and then be recycled for further use. The water thus recovered does not contain contaminants and does not require
<EMI ID = 129.1> way to recycle the solvent thus removed into the process.
Further purification of A-28036 antibiotics includes additional extraction and adsorption processes. One can advantageously use adsorbent products, such as silica gel, carbon,
<EMI ID = 130.1>
Fla.) And similar adsorbents.
In another variation, one can use the culture solids, comprising the constituents of the medium and the mycelium without extraction or separation, but preferably after the removal of water, as the source of the antibiotics A-28086. For example, after the production of antibiotic activity A-28086, the culture medium can be dried by lyophilization and mixed directly into a feed premix.
In another aspect, after the production of the activity of antibiotic A-28086 in the culture medium, the mycelium can be separated and dried to obtain a product which can be used directly in a premix of. food. When separating the mycelium for such use, the addition of calcium carbonate (about 10 g / l) aids filtration and gives an improved dried product.
<EMI ID = 131.1>
aureofaciens described above and designated under N [deg.] NRRL 5753 and
NRRL 8092 gives as predominant factor the factor A of the antibiotic A-28086. Although the factor ratio will vary depending on the fermentation conditions used, in general, factor A represents more than 99% of the total antibiotic activity recovered from NRRL 5758 and about 90% of the total antibiotic activity recovered from NRRL 5758;
<EMI ID = 132.1>
Antibiotic A-28086 accounts for most of the remaining antibiotic activity from NRRL 5758, and factor D is a minor factor. Moreover, the factor D of antibiotic A-28086 represents approximately 8 to 10% of the total antibiotic activity recovered from NRRL 8092,
and factor B is a minor factor.
Antibiotic A-28036 factors A, B and D are separated from each other and isolated as individual compounds using well known methods such as column chromatography, thin layer chromatography and the like. . For example, column chromatography on silica gel is used to separate factors A, B and D
by eluting the column with different mixtures of solvents, such as a benzene-ethyl acetate mixture. When using benzene-ethyl acetate solvent mixtures on a silica gel column, factor B is first eluted, then factors A and D are then eluted. Thin layer chromatography, as previously described, is an easy method for testing <EMI ID = 133.1>
progress of elution.
The compounds of the antibiotic A-28086 stop the growth of
<EMI ID = 134.1>
plants. The relative microbiological activities of factors A and B of antibiotic A-28086 are described below in Table V.
The test method is the usual disc broadcast method
<EMI ID = 135.1>
per ml of solution; the buffers are placed on agar plates seeded with the test organism).
TABLE V
<EMI ID = 136.1>
In an important aspect, the compounds of the antibiotic A-23036 stop the growth of anaerobic bacteria. The minimum inhibitory concentrations (MIC) for which factor A of the antibiotic A-28086 inhibits the various anaerobic bacteria, determined by a standard agar dilution test are summarized in Table VI. Readings are taken after 24 hours of incubation.
TABLE VI
<EMI ID = 137.1>
<EMI ID = 138.1>
A-28086 also exhibit antimicrobial and fungicidal activity. In one aspect, these drifts exhibit improved gram-positive activity. The relative gram-positive activities of some of these derivatives are compared with the activity of factor A. The compounds are examined by a test.
<EMI ID = 139.1>
<EMI ID = 140.1>
<EMI ID = 141.1>
uses the following test parameters: Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 in nutrient broth medium (pH 7), incubated for 4 hours at 37 [deg.] C. The test samples and the control are dissolved in an ethanol-water mixture (10:90). We present the control, the factor A of the antibiotic <EMI ID = 142.1>
5 mcg / m1. The test compounds are diluted to contain approximately 3 or 4 mcg of activity per ml, when they appear on the carousel. The relative activities of the compounds examined, compared to those of the control, are given below.
<EMI ID = 143.1>
Another useful aspect of the antimicrobial activity of compounds A-28086 is Mycoplasma activity. The Mycoplasma species, also known as organisms causing pleuropneumonia (PPLO), are organisms that are pathogenic to humans and various animals. Agents active with respect to PPLO organisms are more particularly in demand for the poultry industry. Minimum inhibitory concentrations
<EMI ID = 144.1>
as determined in vitro by broth dilution studies, are summarized in Table VII below.
TABLE VII
<EMI ID = 145.1>
Solutions containing as little as 10 micrograms of antibiotic A-28086 per ml of solution can be used to disinfect surfaces to protect animals from different species of mycoplasma.
Compounds A-28086 are also anti-virus compounds. The factor A of the antibiotic A-28086 is active against poliovirus type III, vaccinia virus, herpes virus and Semliki Forest virus, as demonstrated by in vitro plaque suppression assays, similar to that
<EMI ID = 146.1>
gastroenteritis, Newcastle disease virus, and bovine infection rhinotracheitis virus, as demonstrated by similar tissue culture assays.
Therefore, in one aspect of the invention, a compound A-28086 can be administered orally, topically or parenterally to mammals to destroy viruses. Useful dose levels for the prevention or treatment of viral diseases vary from about 1 to about 5 mg / kg mammalian body weight, depending on the virus and the prophylactic or therapeutic use of the drug.
In addition, solutions containing a compound A-28086, preferably together with a surfactant, can also be used to decontaminate the habitat in vitro in which viruses such as polio or herpes viruses are present. Solutions containing from about 1 to about 1500 mcg / ml of a compound A-28086 are effective in destroying viruses.
The acute factor A toxicity of the antibiotic A-28086, administered by
<EMI ID = 147.1>
7.5 mcg / kg.
Compounds A-28086 are also insecticides and acaricides. Compounds A-28086 are active against insects such as epilachne
<EMI ID = 148.1>
<EMI ID = 149.1>
rates as low as 500 ppm. In addition, compounds A-28086 are active against mosquito larvae when applied at levels as low as 1 ppm.
Anticoccidial activity is an important property of compounds A-28086. For example, feeding experiments show that a compound A-28086, when present in feeding young chickens at levels as low as 0.003 improves weight gains, and, at levels as well. as low as 0.005%, avoids mortality and reduces the number
<EMI ID = 150.1>
tests with factor A in chickens inoculated with different Eimeria species are shown in Tables VIII to X.
<EMI ID = 151.1>
<EMI ID = 152.1>
<EMI ID = 153.1>
<EMI ID = 154.1>
For the prevention or treatment of coccidiosis in poultry, birds are administered a non-toxic anticocidal amount of a compound A-28086, preferably orally, in the form of a daily dose. Compound A-28086 can be supplied in many ways, fresh it is more readily supplied with a physiologically acceptable carrier, such as
<EMI ID = 155.1>
a number of factors in determining an appropriate concentration of compound A-28086, rates of administration will generally be in the range of 0.003-0.04% by weight of the untreated feed, and
<EMI ID = 156.1>
Another important property of compounds A-28086 is the ability to improve the efficiency of animal feed use. For example, compounds A-28086 improve the efficiency of feed utilization in ruminants which have developed rumen function.
As discussed above, the efficiency of use is increased
carbohydrates in ruminants by treatments that stimulate
flora in � rumen of animals to give propionate compounds rather than acetate or butyrate compounds. The efficiency of feed use can be monitored by observing the production and concentration of propionate compounds in the rumen, using the following methods:
Rumen fluid is obtained from a young ox using a surgically installed fistula that opens into the rumen. The young beef is maintained on a ration rich in grains. A sample of the rumen fluid is drained through four layers of gauze, and the filtrate is collected. The particulate product retained on the gauze is resuspended in sufficient physiological buffer to return to the original volume of rumen fluid, and this suspension is again drained. The tampon used
to the following composition:
<EMI ID = 157.1>
<EMI ID = 158.1>
<EMI ID = 159.1>
four Dallons per treatment. Two sets were used equal to four control vials each. A control at the zero point and a control at
<EMI ID = 160.1>
<EMI ID = 161.1>
in the control balloons.
<EMI ID = 162.1>
<EMI ID = 163.1>
The effectiveness of the use of carbohydrates is further demonstrated by in vivo tests performed on animals with established fistulas in the rumen, allowing samples to be taken.
rumen content.
The test described in Table XII is carried out with young oxen which have reached maturity and are provided with a fistula, weighing approximately 450 kg each. Two young oxen were fed normal feed, and four young oxen in each treatment group were fed identical feed to which the A-factor of A-28086 was added. At each sample (100 ml)
<EMI ID = 164.1>
The samples were allowed to stand, and the supernatants were analyzed by gas chromatography methods to determine the concentrations of propionic acid.
The results in Table XII are the average percent increases in rumen propionic acid concentration, averaged over five analyzes during a 14 day treatment period. The witnesses present approximately
20 mol% of propionic acid.
TABLE XII
<EMI ID = 165.1>
In addition, in vivo tests demonstrate that factor A of A-28086 increases the efficiency of sheep feed utilization. The results of these tests, carried out over a period of 56 days, are summarized in Table XIII.
<EMI ID = 166.1>
Antibiotic A-28086 factor D compounds are antiviral agents. Factor D of A-28086 is active against Maryland B virus,
<EMI ID = 167.1>
D of A-28086 is also active against transmissible gastroenteritis virus, Newcastle disease virus, bovine infection rhinotracheitis virus, as demonstrated by similar tissue culture assays.
The fact that the factor D compounds of A-28086 exhibit activity
both against viruses and against anaerobic bacteria makes these compounds particularly useful for the treatment or prevention of enteritis in chickens, pigs, horned animals and sheep. Antibiotic A-28086 factor D compounds can also be used for the treatment of enterotoxemia in ruminants.
Anticoccidial activity is an important property of compounds
factor D of the antibiotic A-28086 of the present invention. In vitro experiments demonstrating the anticoccidial activity of factor D of the antibiotic A-28086 against Eimeria tenella. The following method is used (for details, see L. R. McDougald and R. B. Galloway in Exper. Parasitology
34, 189-196 (1973)).
Host cell cultures are prepared by conventional techniques using Leighton tubes, plastic vessels or plates, or other suitable culture vessels. After 2-3 days of growth in a suitable culture medium (Eagle's minimum essential medium, lactalbumin hydrolyzate in Earle's saline or Hank's balanced saline, medium 199, etc., it usually forms a suitable monolayer and ready for infection and drug treatment Primary cultures of chicken kidney cells are used for these studies.
Viable Eimeria Tenella oocysts are obtained from the feces of infected chickens and are purified and sterilized before use. The oocysts are sporulated by incubation at room temperature while bubbling air through the suspension or shaking moderately on a rotary shaker or using any other suitable means. Potassium dichromate or sulfuric acid or another chemical compound can be used to prevent bacterial growth or mold growth during sporulation.
Repair of infectious sporozoites and oocysts is achieved by a combination of mechanical rupture of the wall of the oocyst, followed by an <EMI ID = 168.1>
to free themselves from the sporocysts.
Cultures of cells are infected by the introduction of able-bodied sporozoites into the culture vessel. Test chemicals can be introduced at this time, or later. We introduce the product
<EMI ID = 169.1>
10% in physiological saline solution. The end of the test is the inhibition of asexual developmental phases, and this is determined by microscopic examination of the fixed and stained cultures 96 hours after infection. We record
the results as being active (A), inactive (N) and cytotoxic (C) depending on the presence or absence of the second generation schizonts and an apparent toxicity with respect to the cell monolayer.
The anti-coccidial activity of factor D of antibiotic A-28086 demonstrated by this test is summarized in Table XIV.
TABLE XIV
<EMI ID = 170.1>
* Results of two trials
Another useful characteristic of the factor D compounds of the antibiotic A-28086 is their ability to improve feed utilization efficiency in ruminants which exhibit developed rumen function. The mechanism for using the most important nutrient fraction
(carbohydrate) ruminant feed is well known. Microorganisms in
<EMI ID = 171.1>
then transform these monoglucides into pyrivate compounds. Compounds <EMI ID = 172.1>
acetates, butyrates or propionates, which are collectively known as volatile fatty acids (VFA). For more discussion
<EMI ID = 173.1>
Ruminant ", Phillipson et al., Eds. Orien Press, Newcastle upon Tyne, Great Britain, 1970, pp. 408-410.
The relative effectiveness of the use of VFAs is discussed by McCullough in Feedstuffs, June 19, 1971, page 19; Eskeland et al., In J. An. Sci.
33, 282 (1971); and by Church et al., in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Vol. 2, 1971, pp. 622 and 625. Although acetates and butyrates are used, propionates are used with greater efficiency. Additionally, when there is not enough propionate available, animals can go into ketosis. Therefore, a beneficial compound stimulates the production in animals of a greater proportion of propionates from carbohydrates, which can improve the efficiency of carbohydrate use and also reduce the onset of ketosis.
The activity of such a beneficial compound can be determined by observing its effect in the production and concentration of the propionate compounds in the rumen by the same method as used as Factor A above.
Test results are statistically compared with control results. Table XV gives the ratio of the concentrations of volatile macaw acids
in vials treated with factor D of A-28086 compared to the concentrations in control vials.
<EMI ID = 174.1>
The compounds are typically effective in improving the propionate content and hence the efficiency of feed use when administered to ruminants orally, at levels of about 0.05 mg / kg. / day, approximately 5 mg / kg / day. We get the best results
<EMI ID = 175.1>
tation of animals; however, it can be administered in any other way, for example, in the form of tablets, beverages, bowls or capsules. The formulation of these different dosage forms can be carried out according to methods well known in the veterinary pharmaceutical art. Each individual dosage unit should contain an amount of compound directly related to the appropriate daily dose for the animal to be treated.
The antibiotics of A-28086 can be used in feed compositions suitable for fattening horned animals, comprising feed for cattle and 1 to 30 g per tonne of compound.
As technicians will recognize, livestock feeds are different from other feeds such as poultry feeds. Livestock rations contain fodder such as,
<EMI ID = 176.1>
In addition, livestock feeds contain a high percentage, often
<EMI ID = 177.1>
The usual protein is urea.
As described above, compounds A-28086 are anti-virus agents and are also compounds active against anaerobic bacteria, more particularly Clostridium perfringens. Therefore, compounds A-28086 are beneficial in the treatment or prevention of enteritis in chickens, pigs, cattle and sheep. Compounds A-28086 are
<EMI ID = 178.1>
The following examples are given below:
Example 1
A. Fermentation by the stirred flask technique of A-28086 using
S. aureofaciens NRRL 5758
<EMI ID = 179.1>
maintained on agar slant, having the following composition:
<EMI ID = 180.1>
<EMI ID = 181.1>
cover the mature slant culture with beef serum, and scrape it with a sterile loop, to loosen the spores. We lyophilize
<EMI ID = 182.1>
spores and fragments of mycelium.
<EMI ID = 183.1>
vegetative having the following composition:
<EMI ID = 184.1>
<EMI ID = 185.1>
<EMI ID = 186.1>
of an arc of diameter 5.1 cm, at 250 revolutions per minute.
<EMI ID = 187.1>
In order to obtain a larger volume of inoculum. 10 ml of the incubated vegetative medium described above is used to inoculate 400 ml of a growth medium
<EMI ID = 188.1>
vegetative. This second stage medium is incubated in a flask of
<EMI ID = 189.1>
5.1 cm diameter arc, at 250 revolutions per minute.
This second stage vegetative medium (1 liter) is used to inoculate
100 liters of a sterile production medium having the following composition:
<EMI ID = 190.1>
<EMI ID = 191.1>
for 30 minutes under a pressure of 1.05 to 1.40 kg / cm. The fermentation medium is put to ferment in a fermentation vessel with a capacity of 165 liters.
<EMI ID = 192.1>
of ferrentation with sterile air at a flow rate of 0.4 air volume per volume
<EMI ID = 193.1>
conventional at 250 revolutions per minute.
<EMI ID = 194.1>
Antibiotics A-28086 are prepared according to the process of Example 1, but using a production medium in a flask having the following composition:
<EMI ID = 195.1>
Exempt
<EMI ID = 196.1>
<EMI ID = 197.1>
<EMI ID = 198.1> <EMI ID = 199.1>
obtained from the filtrate weighs 20.6 g.
Example 4
Isolation of individual A and B factors from antibiotic A-28086
<EMI ID = 200.1>
prepared as described in Example 3) in about 80 ml of benzene. This benzene solution is subjected to column chromatography containing silica gel (9 x 130 cm, 8 l, Matheson silica gel, grade 62). We elect the column
using variable benzene-ethyl acetate mixtures. The elution progress is followed using thin layer chromatography. Using a
benzene-ethyl acetate solvent system (90:10) first elute factor B and
<EMI ID = 201.1>
in an acetone-water mixture, m.p. 150-153 [deg.] C.
By continuing the elution with benzene-ethyl acetate mixtures but gradually increasing the ratio of ethyl acetate present, the elution is carried out.
factor A; the various fractions containing factor A are combined and concentrated in vacuo until a residue is obtained. We dissolve this residue
in acetone (about 150 ml); about 150 ml of water are added to the acetone solution. The pH of the resulting solution is adjusted to pH 3 by adding acid.
<EMI ID = 202.1>
during which a precipitate is formed. This precipitate is separated by filtration and recrystallized from acetone (approximately 150 ml) by addition of water (approximately
60 ml). The product is dried overnight in vacuo to obtain factor A
(approximately 6.6 g). After partial evaporation of the acetone from the filtrate, a second crop of factor A is obtained (approximately 1.2 g).
<EMI ID = 203.1>
Antibiotic A-28086 Factor A acetyl ester derivative
<EMI ID = 204.1>
pyridine. 50 ml of acetic anhydride are added to this solution. The resulting solution is mixed thoroughly and allowed to stand overnight at room temperature.
<EMI ID = 205.1>
this mixture for 4 hours at room temperature. It precipitates a white solid; this solid is separated by filtration, washed with water and dried
<EMI ID = 206.1>
the acetone solution to dryness under vacuum (this operation is repeated three times
<EMI ID = 207.1>
water (50 ml), to obtain 6.14 g of the acetyl ester derivative of factor A of
<EMI ID = 208.1>
Examples 6 to 9 ...........
The propionyl ester derivative of factor A of antibiotic A-28086 is prepared by reacting factor A with propionic anhydride in the presence of pyridine according to the method of Example 5, melting point 96-93 [deg.] vs.
The n-butyryl ester derivative of factor A of antibiotic A-280S6 is prepared by reacting factor A with ae n-butyric anhydride in the presence of pyridine according to the method of Example 5, melting point 79 -81 [deg.] C.
The n-caproyl ester derivative of factor A of antibiotic A-28036 is prepared by reacting factor A with caproic anhydride in the presence
<EMI ID = 209.1>
The n-valeryl ester derivative of factor A of antibiotic A-28086 is prepared by reacting factor A with valeric anhydride in the presence of pyridine according to the process of Example 5, melting point 173-175. [deg.] C.
Example 10
Preparation of factor A sodium salt of antibiotic A-23086
<EMI ID = 210.1>
50 ml of water are added to this solution, and sodium hydroxide is added.
5 N to bring the pH of this solution to 10.5-11. The resulting solution was stirred for one hour and then extracted with ethyl acetate. We evaporate
<EMI ID = 211.1>
from an acetone-water solution to obtain 378 mg of the sodium salt of
<EMI ID = 212.1>
Examples 11 to 15
The barium salt of factor A of antibiotic A-2Su86 is prepared from 5CO mg of factor A of antibiotic A-28036 and saturating with hydroxide of
<EMI ID = 213.1>
<EMI ID = 214.1>
<EMI ID = 215.1>
<EMI ID = 216.1>
<EMI ID = 217.1>
A-28036 antibiotic factor A potassium, mp 165-167 ° C.
<EMI ID = 218.1>
method of Example 10.
Example 16
<EMI ID = 219.1>
maintained on an inclined agar plate having the following composition:
<EMI ID = 220.1>
<EMI ID = 221.1>
a vegetative medium having the following composition:
<EMI ID = 222.1>
<EMI ID = 223.1>
<EMI ID = 224.1>
<EMI ID = 225.1>
<EMI ID = 226.1>
Example 17
<EMI ID = 227.1>
The initial process described in Example 16 is also used for the
<EMI ID = 228.1>
<EMI ID = 229.1>
vegetative incubated to inoculate 400 ml of a second stage vegetative medium
<EMI ID = 230.1>
minute under a 5.1 cm arc.
<EMI ID = 231.1>
inoculate 100 liters of a sterile fermentation medium having the following composition:
<EMI ID = 232.1>
<EMI ID = 233.1>
<EMI ID = 234.1>
tional at 300 revolutions per minute.
Example 18
<EMI ID = 235.1>
using a stirred flask / kettle production medium having the following composition:
<EMI ID = 236.1>
<EMI ID = 237.1>
described in Example 10.
Example 19
<EMI ID = 238.1>
<EMI ID = 239.1>
60 liters of total fermentation broth obtained by the process are adjusted
<EMI ID = 240.1>
under agitation. After separation of this extract, the mycelium cake is extracted again with 30 liters of methanol again. We combine the two extracts
<EMI ID = 241.1>
<EMI ID = 242.1>
let the resulting solution sit for 16 hours for it to occur
<EMI ID = 243.1>
dried under vacuum to obtain 74 g of a crude crystalline product containing factors A and D of antibiotic A-28086 and other crystalline impurities.
<EMI ID = 244.1>
62). The column is eluted successively with 40 liters of each of the following solvents:
<EMI ID = 245.1>
1 liter fractions are collected. Gn examines each fraction by test
<EMI ID = 246.1>
successively by:
<EMI ID = 247.1>
<EMI ID = 248.1>
<EMI ID = 249.1>
<EMI ID = 250.1>
<EMI ID = 251.1>
using a balloon production medium having the following composition:
<EMI ID = 252.1>
* Staley Dextrin N [deg.] 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111.
** Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.
Example 23
The antibiotics of A-28086 are prepared according to the method of Example 21 but using a third stage intermediate vegetative medium having the following composition:
<EMI ID = 253.1>
<EMI ID = 254.1>
<EMI ID = 255.1>
We prepare a balanced, energetic feed, suitable for feeding poultry for rapid growth according to the following recipe:
<EMI ID = 256.1>
<EMI ID = 257.1>
(representing vitamins A, D, E,
<EMI ID = 258.1>
pantothenic acid, riboflavin
biotin, with a diluent which is
<EMI ID = 259.1>
<EMI ID = 260.1>
food. We protect the poultry fed with this food, with water
ad libitum, vis-à-vis exposure to coccidiosis; weight gains were comparable to those of coccidiosis-free poultry fed a similar feed containing no drug.
Example 25
Cattle yard feed improved by A-28086
A balanced grain rich feed for livestock is prepared as follows:
<EMI ID = 261.1>
<EMI ID = 262.1> <EMI ID = 263.1>
added.
.. Dried corn distillation seeds with soluble products <EMI ID = 264.1>
tion provides about 300 mg of factor A of A-2S086 per animal per day.
Example 26
<EMI ID = 265.1>
the resulting solution is thoroughly mixed and then left overnight at room temperature.
An excess of water is then added, it is mixed thoroughly and the mixture is left to stand for a few hours at room temperature. The precipitate which forms is separated by filtration, washed with water and dried.
The resulting solid was dissolved in acetone and evaporated to dryness in vacuo to afford the factor D acetyl ester derivative of antibiotic A-28086.
Examples 27 to 30
The propionyl ester derivative of factor D of antibiotic A-23086 is prepared by reacting factor D of antibiotic A-28036 with the anhydride.
<EMI ID = 266.1>
The n-butyryl ester derivative of factor D of antibiotic A-28036 is prepared by reacting factor D of antibiotic A-2SG36 with the anhydride.
<EMI ID = 267.1>
<EMI ID = 268.1>
<EMI ID = 269.1>
<EMI ID = 270.1>
Examples 32 to 34
<EMI ID = 271.1>
antibiotic A-280S6 factor D and 1N cesium hydroxide using the method of Example 31.
Example 35
<EMI ID = 272.1>
prevent coccidiosis.
We prepare a balanced feed, with high energy power suitable for poultry feed for a rapid gain of peias, according to the following recipe:
<EMI ID = 273.1>
<EMI ID = 274.1> <EMI ID = 275.1>
are comparable to those obtained with poultry without coccidiosis fed a similar diet without medication.
Example 36
<EMI ID = 276.1>
<EMI ID = 277.1>
the following way:
<EMI ID = 278.1>
<EMI ID = 279.1>
CLAIMS
<EMI ID = 280.1>
a culture medium containing assimilable sources of nitrogen carbohydrates
<EMI ID = 281.1>
until a substantial amount of antibiotic activity is produced by said microorganism in said culture medium.
2. Antibiotic complex A-280S6 containing factors A, B and D as described herein.