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PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX PROCEDES DE FABRICATION D'ANTIBIOTIQUES.
L'invention est relative à la fabrication d'un antibiotique dénommé carbomycine (appelé initialement P.A.97); et elle concerne, plus par- ticulièrement, la préparation de ce produit par fermentation, les méthodes pour sa récupération et sa concentration à partir de solutions brutes telles que des bouillons de fermentation, des procédés pour sa purification et des procédés pour la préparation de ses sels. L'antibiotique peut être utilisé tel quel, sous la forme de ses sels dans des solutions diluées, sous la forme de produits concentrés bruts et à l'état cristallisé pur. Ces produits sont particulièrement intéressants, in vitro, comme désinfectants ou par application locale ou interne comme agents thérapeutiques pour combattre les mycobactéries pathogéniques et divers micro-organismes gram-positifs.
L'antibiotique est formé pendant la culture dans des conditions convenablement réglées, d'une souche qui n'a pas été décrite jusqu'ici et qui appartient à une espèce de micro-organismes connus sous le nom de Streptomyces halstedii. Cette culture a été plantée et essayée sur un milieu utilisé normalement pour l'identification d'actinomycètes et, en se basant sur les résultats obtenus, elle a été identifiée comme étant une nouvelle souche de Streptomyces halstedii en se servant de la description des actinomycètes qui se trouve dans.le traité de Bergey : of Determinative Bacterio- logy" 6ème édition (1948). Les caractéristiques de cette souche diffèrent, en certains points, de la description des Streptomyces halstedii donnée par Bergey.
Des cultures vivantes de la nouvelle souche ont été déposées auprès de la Division de Fermentation du North Regional Research Laboratory à Peoria (Illinois) aux E.U.A. et ont été ajoutées à sa collection permanente de micro-organismes sous le n NRRL-2331.
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Les caractéristiques culturelles de la nouvelle souche, désignée ci-après par NRRL-2331 (initialement on la désignait par "souche isolée n 13040-30 A) sont indiquées dans le tableau. suivant. (Les couleurs accom-- pagnées de la lettre R sont celles de Hidgway, Color Standards and Nomencla- ture).Les indications sont basées sur celles obtenues avec six éprouvettes à moins qu'on le spécifie autrement.
TABLEAU Streptamyces Halstedii
NRRL - 2331
EMI2.1
<tb>
<tb> Couleur
<tb> Culture <SEP> Degré <SEP> mycélium <SEP> Pigment
<tb> de <SEP> aérien <SEP> et <SEP> Remarques
<tb> culture <SEP> sporula- <SEP> soluble
<tb> tion
<tb> Glucose <SEP> modéré <SEP> Bonne <SEP> sporu- <SEP> aucun <SEP> Bord <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie
<tb> aspara- <SEP> lation; <SEP> gris <SEP> lisse; <SEP> colonie <SEP> légègine <SEP> souris <SEP> (R) <SEP> à <SEP> rament <SEP> en <SEP> saillie; <SEP> engris <SEP> olive <SEP> vers <SEP> blanc <SEP> à <SEP> brun <SEP> très
<tb> foncé <SEP> (R), <SEP> clair <SEP> ; <SEP> spores <SEP> gram-poquelques <SEP> sec- <SEP> sitives; <SEP> tiges <SEP> mesurant
<tb> teurs <SEP> de <SEP> my- <SEP> 2,27 <SEP> x <SEP> 1,95/u; <SEP> quelques
<tb> celium <SEP> aérien <SEP> spirales <SEP> libres;
<SEP> chaines
<tb> blanc, <SEP> séparées <SEP> recourbées <SEP> au
<tb> bout.. <SEP> Plaques <SEP> en <SEP> dilution. <SEP> Colonies <SEP> semblables <SEP> excepté <SEP> qu'elles
<tb> ont <SEP> des <SEP> degrés <SEP> variables
<tb> de <SEP> couleur <SEP> depuis <SEP> le
<tb> gris <SEP> olive <SEP> (R) <SEP> jusqu-,au
<tb> gris <SEP> olive <SEP> foncé <SEP> (R).
<tb>
Glucose <SEP> modéré <SEP> mycélium <SEP> aé- <SEP> aucun <SEP> Colonie <SEP> plissée <SEP> envers
<tb> Agar <SEP> rien <SEP> blanc; <SEP> blanc <SEP> crémeux
<tb> pas <SEP> de <SEP> spores; <SEP> bord <SEP> lichénique
<tb> Agar <SEP> pauvre <SEP> mycélium <SEP> aé- <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crè@eux
<tb> nutri- <SEP> à <SEP> rien <SEP> blanc;
<tb> tif <SEP> modéré <SEP> un <SEP> peu <SEP> de
<tb> sporulation
<tb> blanche <SEP> autour <SEP> du <SEP> bord
<tb> de <SEP> la <SEP> colonne; <SEP> un <SEP> peu <SEP> de
<tb> colonies <SEP> cireuses
<tb> Morceaux <SEP> pauvre <SEP> mycélium <SEP> aé- <SEP> gris
<tb> de <SEP> pom- <SEP> à <SEP> rien <SEP> blanc;
<SEP> clair
<tb> mes <SEP> de <SEP> modéré <SEP> aucune <SEP> spo- <SEP> brun
<tb> terre <SEP> rulation
<tb> Malate <SEP> pauvre <SEP> Bonne <SEP> sporu- <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crèmeux
<tb> de <SEP> à <SEP> lation <SEP> gris
<tb> calcium <SEP> modéré <SEP> souris <SEP> foncé
<tb> (R) <SEP> colonies
<tb> étalées.
<tb>
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TABLEAU l (Suite)
EMI3.1
<tb>
<tb> Plaques <SEP> modéré <SEP> mycelium <SEP> aé- <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc; <SEP> hydrolyse
<tb> d'ami- <SEP> rien <SEP> blanc; <SEP> pauvre.
<tb> don <SEP> sporulation
<tb> pauvre <SEP> ;
<tb> blanc <SEP> grisâtre
<tb> Agar <SEP> bon <SEP> bonne <SEP> sporu- <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> gris <SEP> foncé <SEP> à <SEP> gris
<tb> synthé- <SEP> lation <SEP> gris <SEP> clair <SEP> ;
<SEP> de <SEP> spirales <SEP> en
<tb> tique <SEP> souris <SEP> (R) <SEP> présence.
<tb> à <SEP> gris <SEP> souris <SEP> foncé <SEP> (R)
<tb> Cellu- <SEP> pauvre
<tb> lose
<tb> Emerson <SEP> brun <SEP> sur <SEP> oertai- <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crémeux
<tb> nes <SEP> parties
<tb> du <SEP> tube <SEP> aucune <SEP> sporulation; <SEP> mycelium <SEP> aérien
<tb> blanc <SEP> ; <SEP> sur
<tb> d'autres <SEP> parties <SEP> une <SEP> sporulation <SEP> gris
<tb> souris <SEP> (R)
<tb> Bouil- <SEP> modéré <SEP> nitrates <SEP> réduits
<tb> lon <SEP> à
<tb> la <SEP> dextrose
<tb> et <SEP> au
<tb> nitrate
<tb> Gélati- <SEP> bon <SEP> mycélium <SEP> aé- <SEP> aucun <SEP> liquéfaction <SEP> pauvre <SEP> ;
<tb> ne <SEP> à <SEP> 21 <SEP> rien <SEP> blanc <SEP> ;
<SEP> blanc.
<tb> aucune <SEP> sporulation
<tb> -lait <SEP> modéré <SEP> aucun <SEP> lait <SEP> coagulé <SEP> dans <SEP> 2 <SEP> éprou-
<tb> écrémé <SEP> vettes <SEP> ; <SEP> lait <SEP> non <SEP> changé <SEP> dans
<tb> (15 <SEP> 2 <SEP> éprouvettes; <SEP> aucune <SEP> pepjours) <SEP> tonisation <SEP> ; <SEP> protéolysetrès
<tb> faible
<tb>
La nouvelle souche de Streptomyces halstedii NRRL-2331 diffère de la descritpion donnée dans le traité de Bergey à plusieurs points de vue.
Les différences sont indiquées dans le tableau suivant :
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TABLEAU II
EMI4.1
<tb>
<tb> Milieu <SEP> Souche <SEP> NRRL-2331 <SEP> Description <SEP> de <SEP> Bergey
<tb> Amidon <SEP> Croissance <SEP> modérée; <SEP> Croissance'abondante; <SEP> croisAgar <SEP> mycelium <SEP> aérien <SEP> blanc; <SEP> sance <SEP> brunâtre <SEP> et <SEP> brillant
<tb> sporulation <SEP> pauvre
<tb> d'un <SEP> blanc <SEP> grisâtre.
<tb>
Glucose <SEP> Bord <SEP> lichénique, <SEP> res- <SEP> Bord <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie <SEP> lichénique <SEP> deveAgar <SEP> te <SEP> blanc, <SEP> nant <SEP> brun.
<tb>
Morceaux <SEP> Croissance <SEP> pauvre <SEP> à <SEP> Croissance <SEP> abondante; <SEP> croissance
<tb> de <SEP> pom- <SEP> modérée <SEP> avec <SEP> du <SEP> my- <SEP> humide, <SEP> plissée, <SEP> de <SEP> couleur <SEP> crème
<tb> mes <SEP> de <SEP> celium <SEP> blanc <SEP> ; <SEP> pas <SEP> de <SEP> teintée <SEP> de <SEP> vert.
<tb> terre <SEP> spores.
<tb>
Agar <SEP> syn- <SEP> Spirales <SEP> en <SEP> présence <SEP> Pas <SEP> de <SEP> spirales.
<tb> thétique <SEP> mais <SEP> pas <SEP> nombreuses.
<tb>
Il est à noter que, pour la production de carbomycine, l'inven- tion n'est pas limitée à cet organisme particulier ou à des organismes qui correspondent entièrement à la description donnée ci-dessus et qui n'est indiquée qu'à titre d'exemple. En réalité, il est spécialement désiré et envisagé d'inclure l'usage de dérivés obtenus à partir de l'organisme décrit par des méthodes ou agents tels qu'une exposition aux rayons X ou aux rayons ultraviolets, des moutardes à l'azote et analogues.
La carbomycine montre une activité élevée contre plusieurs micro-organismes. Comme indiqué plus haut, elle est particulièrement remarquable pour son action sur des mycobactéries et les micro-organismes gram-positifs. Elle montre une certaine activité contre les micro-organismes gram-négatifs mais à un degré moins élevé. Le tableau ci-dessous donne le spectre antibiotique de la carbomycine contre une variété de micro-organismes gramnégatifs et gram.-positifs. Les essais ont été faits en inoculant du bouillon nutritif contenant diverses concentrations de l'antibiotique pur avec l'organisme particulier essayé. Les chiffres marqués dans la colonne "croissance" indiquent la concentration la plus élevée qui a été essayée (en mcg/ml) pour laquelle la croissance des micro-organismes a encore lieu.
L'essai a été fait dans les conditions normalisées, les éprouvettes étant incubées pendant une période normalisée.
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TABLEAU III
EMI5.1
<tb>
<tb> Croissance <SEP> Pas <SEP> de
<tb> croissance
<tb>
EMI5.2
----¯--4---<='-oCI...A1..:>Q."I8:I--" --q''''- ........-}aMl----¯......."".b....,. - Á.-- 1 J - 'T ...---..-..
EMI5.3
<tb>
<tb> Strep. <SEP> faecalis <SEP> - <SEP> 0,19 <SEP> mcg/ml
<tb> Brucella <SEP> bronchiseptica <SEP> 6,25 <SEP> mcg/ml <SEP> 12,5
<tb> A. <SEP> aerogenes <SEP> 2 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 21 <SEP> 100
<tb> Proteus <SEP> Sp. <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> 173 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> M.- <SEP> albicans <SEP> 8 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> typhosa <SEP> 344 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 132 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 134 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> S.
<SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 139 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes
<tb> var.aureus <SEP> 5 <SEP> 0,19 <SEP> 0,39
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> 219 <SEP> 0,39 <SEP> 0,78
<tb>
En plus des micro-organismes susdits, certaines souches ré- sistantes ont été utilisées pour déterminer l'activité de l'antibiotique.
Par exemple, en se servant d'une souche de Auromyces aerogenes, qui résiste à l'auréomycine et au chloramphénicol, on constate que la croissance se pro- duit à une concentration de 25 mcg de carbomycine par ml de bouillon nutri- tif mais qu'une croissance n'a pas lieu pour une concentration de 50 mcg/ml.
Pour un deuxième essai de ce genre, une souche de A. aerogenes, résistant à la fois à la streptomycine et à la streptothricine, on a constaté également une croissance de cette souche en présence de 25 mcg/ml de carbomy@ine alors qu'aucune croissance n'a lieu pour une concentration de 50 mcg/ml. Par ail- leurs, pour montrer l'efficacité de l'antibiotique contre des souches résis- tantes de ce genre, cet essai prouve également que l'antibiotique est nette- ment différent de l'auréomycine, le chloramphénicol, la streptothricine et -la streptomycine. Il est également à noter que la carbomycine est même plus active contre les souches résistant au A. aerogenes qu'il l'est contre la souche normale de A. aerogenes, comme visible dans le Tableau III susdit.
On a constaté qu'une souche de staphylococcus aureus est résis- tante in vitro à l'action de pénicilline à une concentration de 100 unités/ml; à la dihydrostreptomycine avec 100 unités/ml; à la polymixine avec 100 unités/ ml; alors qu'elle est sensible à l'action du chloramphénicol avec 100 mcg/ml et à l'auréomycine avec 12,5 mcg/ml. La croissance de l'organisme en question est empêchée par une concentration de 3,1 mcg/ml de carbomycine.
La carbomycine est très efficace contre une variété de types de mycobactéries. Le tableau ci-dessous donne les résultats de ces essais. Dans ces cas, des éprouvettes, contenant un milieu liquide de Dubos avec 0,5 % d'al- bumine, sont utilisées pour les essais. La carbomycine est ajoutée au milieu avec des concentrations différentes comme montré dans la première colonne du tableau suivant. Des éprouvettes du milieu contenant plusieurs concentrations de l'antibiotique, comme indiqué, sont ensuite inoculées avec des cultures de diverses mycobactéries. Le nom de l'espèce est indiqué en tête de chacune des colonnes du tableau. Sous le nom des espèces on donne les résultats de l'essai. Celui-ci a lieu en incubant les tubes dans des conditions stériles pendant 18 heures.
Le manque de croissance dans les éprouvettes à la fin de
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la période d'essai normalisée est indiqué par (-), une croissance douteuse par (¯) et une croissance par (+).
TABLEAU IV
EMI6.1
<tb>
<tb> Activité <SEP> de <SEP> la <SEP> carbomycine <SEP> contre <SEP> les <SEP> mycobactéries
<tb> mcg/ml <SEP> rande <SEP> phlei <SEP> smegmatis <SEP> 607 <SEP> berolinen- <SEP> butyrise <SEP> cum
<tb> 12,5 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 6,25 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 3,12 <SEP> ¯ <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 1,56 <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 0,78 <SEP> + <SEP> ¯ <SEP> - <SEP> ¯ <SEP> -
<tb> 0,39 <SEP> + <SEP> +- <SEP> ¯ <SEP> ¯
<tb> 0,19 <SEP> + <SEP> + <SEP> ¯ <SEP> + <SEP> ¯ <SEP> +
<tb>
Le tableau ci-dessus montre que la carbomycine présente un degré d'activité extraordinaire contre ces mycobactéries.
On a constaté que la carbomycine a un niveau relativement bas de toxicité quand elle est utilisée pour des essais sur des animaux. Par exemple la valeur LDo, quand l'antibiotique est administré en étant injecté dans les veines de souris sous la forme d'une solution dans de l'eau acidulée, est approximativement égale à 7 mg/20g de souris. La toxicité pour d'autres es- meces et pour d'autres méthodes d'administration est comparable.
L'invention a pour objet, entre autres, un procédé pour cultiver la souche,qui n'a pas encore été décrite jusqu'ici, de S. halstedii. La culture de ce micro-organisme a lieu, de préférence, dans un milieu nutritif aqueux à une température d'environ 24 - 30 et à l'état submergé en ce qui concerne l'agitation et l'aération. Des milieux nutritifs qui sont utiles pour ce procédé, comprennent des hydrates de carbone, tels que des sucres, de.l'amidon, du glycerol, de la farine de mais et une source d'azote organi- que, telle que la caséine, la farine de soja, la farine d'arachides, le gluten de blé, la farine de graines de coton, l'albumine du lait, l'extrait enzymatique de caséine, le trypton.
Une source d'agents favorisant la croissance, tels que des produits de macération solubles fournis par les distilleries, l'extrait de levure,les résidus de fermentation des mélasses ainsi que des sels minéraux, tels que le chlorure de sodium, le phosphate de potassium, le nitrate de sodium, le sulfate de mangéisum et des traces de matières inorganiques telles que le cuivre, le zinc et le fer peuvent également être utilisés avec des résultats avantageux. Si une production excessive de mousse est obtenue pendant la fermentation, des agents anti-mousse, tels que des huiles végétales, peuvent être ajoutés au milieu de fermentation. Le pH de la fermentation tend à rester plus constant mais, si des variations se produisent, un agent tampon tel que le carbonate de calcium peut également être ajouté au milieu.
Un inoculum pour la préparation de carbomycine, pour la croissance de la souche de S. Halstedii, peut être obtenu en utilisant des cultures fournies par des germes de cette souche sur des milieux tels que l'agar d'Emerson ou le lactose de boeuf. Les cultures peuvent être utilisées pour inoculer des flacons secoués ou des cuves d'inoculation pour la culture submergée. Suivant une variante on peut également ensemencer des cuves d'inoculation avec le contenu de flacons secoués. La croissance du micro-organisme atteint généralement son maximum en environ 2 à 3 jours. Toutefois, la constitution particulière des appareils utilisés, le degré d'aération, l'importance de l'a-
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gitation, etc. peuvent influencer la vitesse à laquelle l'activité maximum est atteinte.
En général, une période comprise entre environ 24 heures et-4 jours est une période désirable pour obtenir l'antibiotique. L'aération du milieu dans des cuves pour la culture submergée est poursuivie avec un débit d'environ un demi à deux volumes d'air frais par volume de bouillon et par minute. L'agitation peut être effectuée par des agitateurs appropriés bien connus de ceux qui s'occupent de l'industrie de fermentation. Des conditions aseptiques doivent, évidemment, être maintenues pendant le transfert de l'ino- culum et pendant toute la croissance du micro-organisme.
Après la croissance" du micro-organisme, le mycelium, qui est généralement très abondant et fin, peut être séparé du bouillon de fermenta- tion en se servant de divers appareils normalisés, tels que des filtres-pres- ses, des centrifuges, etc.. On a trouvé qu'en diminuant le pH de l'ensemble du bouillon de fermentation jusqu'à environ 3,0 on facilite la filtration.
Comme l'antibiotique n'est pas très stable dans des conditions acides, le bouillon de fermentation est réglé de manière à être à peu près neutre quand il a été filtré. La carbomycine peut être séparée du bouillon de fermenta- tion par un grand nombre de procédés différents. Suivant une variante, tout le bouillon peut être utilisé tel quel ou il peut être séché. L'antibiotique peut être purifié davantage de différentes manières. Par exemple, le composé peut être extrait hors de la solution aqueuse à des pH neutres ou légèrement alcalins, compris de préférence entre environ 6 et environ 10 par divers solvants organiques non miscibles à l'eau, ces solvants comprenant des éthers, des hydrocarbures aromatiques, des esters, des cétones, des alcools inférieurs et des hydrocarbures halogénés.
Parmi ces solvants, on peut citer à titre d'exemples l'éther diéthylique, le benzène, le toluène, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, la méthyl-isobutyle-cétone, le butanol et le chlorofor- me. Même pour des pH acides, certains de ces solvants extraient une quantité appréciable de l'antibiotique. Ceci est surtout vrai pour des alcools nonmiscibles à l'eau, tels que le butanol, les pentanols, etc. L'antibiotique peut être extrait hors de la plupart des solutions dans le solvant et après dans de l'eau acidulée, de préférence à un pH inférieur à environ 2,5. Si on le désire, l'extrait dans le solvant peut être concentré avant l'extraction dans l'eau acidulée. En réglant le pH pour la neutralité ou l'alcalinité, l'antibiotique peut être extrait à nouveau dans un des solvants.
Après l'évaporation du solvant et concentration de la solution, l'antibiotique forme des cristaux. Il cristallise généralement sous la forme d'aiguilles blanches épointées. Toutefois, dans certains cas, on obtient des cristaux en paillettes. Le produit peut être recristallisé à nouveau hors du benzène, de l'éther, des cétones inférieurs ou d'alcools inférieurs. Si on le désire, une solution dans un des alcools ou cétones miscibles à des cétones est concentrée et de l'eau est ajoutée pour faciliter la cristallisation. Suivant une variante, l'antibiotique peut être récupéré par adsorption du bouillon ou des produits concentrés par du charbon activé. Une reprise dans de l'acide ou dans l'eau, en même temps qu'un solvant miscible à l'eau contenant de l'acide, permet d'obtenir le composé sous une forme purifiée.
La carbomycine est un composé organique blanc et faiblement basique qui est soluble dans des acides aqueux dilués mais elle est seulement légèrement soluble dans l'eau (environ 0,5 mg/ml). Elle est extrêmement soluble das plusieurs solvants organiques tels que l'acétone, l'éther, le benzène, le chloroforme et le dioxane et un peu moins soluble dans le méthanol et l'éthanol. Elle est insoluble dans l'hexane. En concentrant une solution de carbomycine dans un solvant, on tend à former des solutions sursaturées et les cristaux qui se forment ont une tendance à retenir un peu du solvant utilisé. La stabilité du composé diminue dans des solutions fortement acides et basiques, même à la température ambiante.
Le composé est très instable après chauffage dans des solutions acides et alcalines et sa stabilité est maximum avec un pH compris entre 3 et 7. Sa stabilité à l'état sec ou après dissolution dans des solvants secs est bonne.
Un produit de base à la carbomycine cristallisée et fortement purifiée, comme celui obtenu par quatre recristallisations hors de solvants
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tels que l'éthanol, le benzène, etc., tend à se former à 1?état de cristaux imprégnés de solvants dont on peut séparer le solvant, dune manière plus ou moins complète, par un séchage sous vide à 100 . Quand une telle matière est séchée dans ces conditions pendant trois heures, elle 1 un point de fu- sion de 217 - 218 avec une légère décomposition. L'échantillon est intro- duit à 196 dans le bain,qui sert à la détermination du point de fusion et la température du bain est augmentée à une vitesse de 3,6 .par minute.
La matière anhydre cristallisée forme un monohydrate quand elle est exposée à ' l'humidité atmosphérique. Ce monohydrate analysé a la composition suivante : carbone = 59,01; hydrogène = 8,35; azote = 1,66; oxygène (par différence) = 30,98.
Le produit de base cristallisé, fortement purifié et séché sous vide à 100 , pendant trois heures, est analysé et on trouve qu'il a la com- position suivante : carbone : 60,04 ; hydrogène = 8,24; azote = 1,55; oxygène (par différence) = 30,17.
La rotation optique de la matière est d'environ [a] = -55 (solution à 1% dans du chloroforme). en titrant le composé dans un mélange de deux volumes de formamide de diméthyle et un volume d'eau on obtient un pKa = 6,4 et un poids moléculaire d'environ 866. Le spectre d'absorption ul- traviolet du produit de base, quand il est dissous dans l'éthanol, a deux maxima, dont un-se présente à 240 m /u (# = 16.080) et l'autre à 327,5 m /u. (# = 113). Quand le produit de case cristallisé et anhydre est dissous dans le chloroforme, il a un certain nombre de sommets caractéristiques dans la région de l'infra-rouge.
Parmi ces sommets on peut citer les fréquences suivantes (en cm-1) : 3510, 2920, 1732, 1690, 1630, 1460, 1375, 1300, 1230, 1160, 1122, 1077, 1052, 1025, 1015, 976, 916, 910, 873 et 837. Le spectre infra-rouge est montré sur la figure 1 des dessins ci-annexés. Le diagramme de la figure 1 indique en abscisses supérieures les fréquences f en cm-1 avec en abscisses inférieures les longueurs d'ondes \ en microns /u et en ordonnées les valeurs de transmittance en %.
Les sels de la carbomycine, obtenus à l'aide d'acides, peuvent être préparés en traitant le produit de base avec l'acide approprié. Par exemple, si la base est dissoute dans l'éther et si on fait barboter un cou- rant d'acide chlorhydrique dans la solution, le chlorhydrate de carbomycine précipite immédiatement. D'autres acides peuvent être utilisés pour des pro- cédés identiques ou similaires en vue d'obtenir les sels acides de l'anti- biotique. Le traitement de la base avec l'acide peut être effectué dans un milieu aqueux dans lequel le sel acide formé est soluble. Le sel peut alors être récupéré par évaporation du milieu aqueux.
Toutefois, comme indiqué plus haut, la carbomycine n'est pas très stable dans des solutions acides aqueu- ses de sorte que l'on doit procéder avec soin.
Le chlorhydrate cristallisé et séché de carbomycine, qui est dissous dans le chloroforme, présente, entre autres, les sommets caractéris- tiques dans la région de l'infra-rouge (en cm-1) : 3220, 2870, 1715, 1670, 1610, 1450, 1358, 1296, 1230, 1160, 1140, 1120, 1100, 1074, 1060, 975, 914, 890 et 860. Le spectre d'absorption dans l'infra-rouge de ce sel est montré sur la figure 2 avec les mêmes coordonnées que celles de la figure 1.
Plusieurs micro-organismes différents peuvent être utilisés pour déterminer l'activité des préparations de carbomycine. Ils comprennent le K. pneumoniae, le B. subtilis, le Staph. aureus et d'autres organismes d'es- sais normalisés. Quand on utilise le K. pneumoniae, on peut se servir de l'es- sai pour la mesure de la turbidité ou de l'essai à la plaque. Du chloramphé- nicol cristallisé peut être utilisé comme repère en accordant 'une valeur de 1000 unités/mg à cet antibiotique. Sur cette base, la carbomycine cristalli- sée a une activité de 750 à 850 unités de chloramphénicol par mg. Quand on prépare la carbomycine par fermentation on obtient une activité d'environ 15 à environ 100 unités/ml.
La carbomycine se distingue des autres antibiotiques par ses propriétés. Celles qui ont été utilisées pour cette comparaison sont celles
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indiquées plus haut ainsi que les mesures faites avec du papier chromographi- que, ces mesures montrant une différence très nette. Des comparaisons ont également été faites avec des micro-organismes résistant à divers autres an- tibiotiques.
Les exemples ci-dessous n'ont qu'un caractère illustratif et ne limitent en rien la portée de la protection de l'invention.
EXEMPLE l
Des spores d'un germe de S. halstedii NRRL-2331, obtenu sur de l'agar d'Emerson, sont transférés, dans des conditions aseptiques, dans un milieu nutritif ayant la composition suivante : cérélose 10 g farine de soja 10 chlorure de sodium 5 solubles de distillerie 5 carbonate de calcium 1
Le mélange est dilué jusqu'à avoir le volume d'un litre et son pH est réglé jusqu'à être égal à 7 avec de la potasse caustique avant la stérilisation. Quand le milieu a refroidi, on ajoute les spores. On cultive -l'organisme dans des flacons secoués pendant deux jours à environ 28 .
Le bouillon contenant le mycélium est ensuite-transféré dans un milieu stérile, ayant un volume vingt fois plus grand et la composition suivante : amidon 20 g caséine 10 farine de soja 15 carbonate de calcium 1
Ce mélange est dilué jusqu'à faire un litre et son pH est réglé à 7 avant l'introduction dans l'autoclave et l'ensemencement. Après agitation et aération, dans des conditions stériles pendant deux jours, l'activité du bouillon est de 100 unités/ml. Le pH du mélange est réglé à 3,0 et le mycelium est enlevé par filtration. Le pH du filtrat est réglé à 6,5 et il est ensuite extrait deux fois avec un quart de volume de méthyl isobutyle cétone.
Les phases de solvant mélangées sont concentrées à un dizième de volume sous vide. L'antibiotique est ensuite extrait dans l'eau à un pH d'environ 2,0 en se servant d'acide,sulfurique pour régler le pH. La phase aqueuse est séparée, lavée avec un petit volume de benzène pour enlever la méthyl isobutyle cétone dissoute et le pH de la phase aqueuse est réglé à 6,5. L'antibiotique est extrait plusieurs fois à l'éther et les phases d'éther séparées sont séchées sur du sulfate de sodium anhydre. Le solvant est enlevé par distillation et l'antibiotique cristallise sous forme d'aiguilles blanches. Le produit est recristallisé en le dissolvant dans l'acétone, il est filtré et concentré, après quoi on ajoute de l'eau.
Un schéma du traitement, basé sur le procédé d'extraction susdit, est montré sur le tableau V.
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
1 Mi /jeu Culf .5. tlasf dc'É R d gf9 Acide pH 3.0 '#####' Mycellum Fiffre. p H ,5 ' Cétone 9 ' ârbomyci ,e MetYl C<Tb "Y'n6 150bulyl orssol. Aqueuse 2 X El. XL rac t. &Ons µ xtraj[ H2 504 Céto11e Carbomycine pH2.o hors du solvant ####### L qvage 1 ±)e '(')2 ènel Phase '####### 8enzene C cetone Aqueuse N ev l'r8ti5 é p H 6.5 tir&H:####! r Et he,... l caroomyctne '######' Ether Secé sur Na 2 504 . Dist il lé carbo-rnycine Acit 01') e solides' ######t impure t'e nïe impure tés ######' Carbom ytin
<Desc/Clms Page number 11>
Le produit obtenu est très efficace contre une variété de mycobactéries et de micro-organismes gram-positifs.
EXEMPLE II
Un milieu est préparé ayant la composition suivante : amidon 20 g solubles de distillerie 10 g farine de soja 15 g Le mélange de ces matières est ajouté à un litre d'eau et le pH est réglé à 7 avant l'addition d'un gramme de carbonate de calcium. Le milieu est alors introduit dans un autoclave et est ensemencé avec un inoculum S. halstedii NRRL-2331 dans des conditions stériles. Le mélange est soumis à une aération et à une agitation dans des conditions stériles à environ 28 pendant deux jours. On constate, à 1'essai, que le bouillon filtré contient 25 unités de carbomycine par millilitre de solution.
L'antibiotique sera mis sur le marché sous la marque déposée "MAGNAMYCINE".
REVENDICATIONS.
1. Procédé de fabrication d'un antibiotique, dans lequel on cultive du streptomyces halstedii NRRL-2331 ou un micro-organisme équivalent capable de fournir de la carbomycine dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies et en submersion jusqu'à ce qu'une quantité suffisante de carbomycine (telle que spécifiée plus haut) soit produite pour procurer une activité antibactérienne audit milieu.
<Desc / Clms Page number 1>
IMPROVEMENTS IN ANTIBIOTICS MANUFACTURING PROCESSES.
The invention relates to the manufacture of an antibiotic called carbomycin (initially called P.A.97); and it concerns, more particularly, the preparation of this product by fermentation, the methods for its recovery and its concentration from crude solutions such as fermentation broths, methods for its purification and methods for the preparation of its. salts. The antibiotic can be used as such, in the form of its salts in dilute solutions, in the form of crude concentrates and in the pure crystalline state. These products are particularly useful, in vitro, as disinfectants or by local or internal application as therapeutic agents for combating pathogenic mycobacteria and various gram-positive microorganisms.
The antibiotic is formed during cultivation under suitably controlled conditions from a strain which has not been described so far and which belongs to a species of microorganisms known as Streptomyces halstedii. This culture was planted and tested on a medium normally used for the identification of actinomycetes and, based on the results obtained, was identified as a new strain of Streptomyces halstedii using the description of actinomycetes which can be found in Bergey's treatise: of Determinative Bacteriology "6th edition (1948). The characteristics of this strain differ in some respects from the description of Streptomyces halstedii given by Bergey.
Live cultures of the new strain have been deposited with the Fermentation Division of the North Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, USA. and were added to its permanent collection of microorganisms under number NRRL-2331.
<Desc / Clms Page number 2>
The cultural characteristics of the new strain, hereinafter referred to as NRRL-2331 (initially designated as "isolated strain # 13040-30 A) are shown in the following table. (The colors accompanied by the letter R are those of Hidgway, Color Standards and Nomenclature). Indications are based on those obtained with six specimens unless otherwise specified.
TABLE Streptamyces Halstedii
NRRL - 2331
EMI2.1
<tb>
<tb> Color
<tb> Culture <SEP> Degree <SEP> mycelium <SEP> Pigment
<tb> of air <SEP> <SEP> and <SEP> Remarks
<tb> culture <SEP> sporula- <SEP> soluble
<tb> tion
<tb> Glucose <SEP> moderate <SEP> Good <SEP> sporu- <SEP> none <SEP> Edge <SEP> of <SEP> the <SEP> colony
<tb> aspara- <SEP> lation; <SEP> gray <SEP> smooth; <SEP> colony <SEP> leggin <SEP> mouse <SEP> (R) <SEP> to <SEP> paddle <SEP> in <SEP> breeding; <SEP> gray <SEP> olive <SEP> to <SEP> white <SEP> to <SEP> brown <SEP> very
<tb> dark <SEP> (R), <SEP> light <SEP>; <SEP> spores <SEP> gram-poquelques <SEP> sec- <SEP> sitives; <SEP> rods <SEP> measuring
<tb> <SEP> teurs of <SEP> my- <SEP> 2.27 <SEP> x <SEP> 1.95 / u; <SEP> some
<tb> celium <SEP> aerial <SEP> free <SEP> spirals;
<SEP> chains
<tb> white, <SEP> separated <SEP> curved <SEP> at
<tb> bout .. <SEP> Plates <SEP> in <SEP> dilution. <SEP> Similar <SEP> colonies <SEP> except <SEP> that they
<tb> have <SEP> variable <SEP> degrees <SEP>
<tb> from <SEP> color <SEP> from <SEP> on
<tb> gray <SEP> olive <SEP> (R) <SEP> until, at
<tb> gray <SEP> olive <SEP> dark <SEP> (R).
<tb>
Glucose <SEP> moderate <SEP> mycelium <SEP> a- <SEP> none <SEP> Colony <SEP> folded <SEP>
<tb> Agar <SEP> nothing <SEP> white; <SEP> white <SEP> creamy
<tb> no <SEP> of <SEP> spores; <SEP> edge <SEP> lichenic
<tb> Agar <SEP> poor <SEP> mycelium <SEP> a- <SEP> none <SEP> towards <SEP> white <SEP> crè @ them
<tb> nutri- <SEP> to <SEP> nothing white <SEP>;
<tb> tif <SEP> moderate <SEP> a <SEP> little <SEP> of
<tb> sporulation
<tb> white <SEP> around <SEP> of the <SEP> edge
<tb> from <SEP> the <SEP> column; <SEP> a <SEP> little <SEP> of
<tb> waxy <SEP> colonies
<tb> Pieces <SEP> poor <SEP> mycelium <SEP> a- <SEP> gray
<tb> from <SEP> pom- <SEP> to <SEP> nothing <SEP> white;
<SEP> clear
<tb> mes <SEP> de <SEP> moderate <SEP> none <SEP> spo- <SEP> brown
<tb> land <SEP> regulation
<tb> Malate <SEP> poor <SEP> Good <SEP> sporu- <SEP> none <SEP> towards <SEP> white <SEP> creamy
<tb> from <SEP> to <SEP> lation <SEP> gray
<tb> calcium <SEP> moderate <SEP> dark <SEP> mouse
<tb> (R) <SEP> colonies
<tb> spread out.
<tb>
<Desc / Clms Page number 3>
TABLE l (Continued)
EMI3.1
<tb>
<tb> Plates <SEP> moderate <SEP> mycelium <SEP> a- <SEP> none <SEP> towards white <SEP>; <SEP> hydrolysis
<tb> friend- <SEP> nothing white <SEP>; <SEP> poor.
<tb> donation <SEP> sporulation
<tb> poor <SEP>;
<tb> white <SEP> grayish
<tb> Agar <SEP> good <SEP> good <SEP> sporu- <SEP> none <SEP> backwards <SEP> gray <SEP> dark <SEP> to <SEP> gray
<tb> synthesis - <SEP> lation <SEP> gray <SEP> light <SEP>;
<SEP> of <SEP> spirals <SEP> in
<tb> tick <SEP> mouse <SEP> (R) <SEP> presence.
<tb> to <SEP> gray <SEP> mouse <SEP> dark <SEP> (R)
<tb> Cellu- <SEP> poor
<tb> lose
<tb> Emerson <SEP> brown <SEP> on <SEP> oertai- <SEP> none <SEP> backwards <SEP> white <SEP> creamy
<tb> nes <SEP> parties
<tb> from <SEP> tube <SEP> no <SEP> sporulation; Aerial <SEP> mycelium <SEP>
<tb> white <SEP>; <SEP> on
<tb> other <SEP> parts <SEP> a <SEP> sporulation <SEP> gray
<tb> mouse <SEP> (R)
<tb> Bouil- <SEP> moderate <SEP> nitrates <SEP> reduced
<tb> lon <SEP> to
<tb> the <SEP> dextrose
<tb> and <SEP> at
<tb> nitrate
<tb> Gelati- <SEP> good <SEP> mycelium <SEP> a- <SEP> none <SEP> liquefaction <SEP> poor <SEP>;
<tb> do <SEP> to <SEP> 21 <SEP> nothing <SEP> blank <SEP>;
<SEP> white.
<tb> none <SEP> sporulation
<tb> -milk <SEP> moderate <SEP> no <SEP> milk <SEP> coagulated <SEP> in <SEP> 2 <SEP> tested
<tb> skimmed <SEP> vettes <SEP>; <SEP> milk <SEP> not <SEP> changed <SEP> in
<tb> (15 <SEP> 2 <SEP> test tubes; <SEP> none <SEP> pepjours) <SEP> toning <SEP>; <SEP> very proteolys
<tb> weak
<tb>
The new strain of Streptomyces halstedii NRRL-2331 differs from the description given in Bergey's treatise in several points of view.
The differences are shown in the following table:
<Desc / Clms Page number 4>
TABLE II
EMI4.1
<tb>
<tb> Medium <SEP> Strain <SEP> NRRL-2331 <SEP> Description <SEP> of <SEP> Bergey
<tb> Starch <SEP> Moderate growth <SEP>; <SEP> Abundant growth; <SEP> croisAgar <SEP> mycelium <SEP> aerial <SEP> white; <SEP> sance <SEP> brownish <SEP> and <SEP> shiny
<tb> poor <SEP> sporulation
<tb> with a grayish white <SEP> <SEP>.
<tb>
Glucose <SEP> Edge <SEP> lichenic, <SEP> res- <SEP> Edge <SEP> of <SEP> the <SEP> colony <SEP> lichenic <SEP> deveAgar <SEP> te <SEP> white, <SEP > nant <SEP> brown.
<tb>
Pieces <SEP> Growth <SEP> poor <SEP> to <SEP> Growth <SEP> abundant; <SEP> growth
<tb> from <SEP> pom- <SEP> moderate <SEP> with <SEP> from <SEP> my- <SEP> wet, <SEP> pleated, <SEP> from <SEP> color <SEP> cream
<tb> my <SEP> of <SEP> celium <SEP> white <SEP>; <SEP> not <SEP> of <SEP> tinted <SEP> of <SEP> green.
<tb> earth <SEP> spores.
<tb>
Agar <SEP> syn- <SEP> Spirals <SEP> in <SEP> presence <SEP> No <SEP> of <SEP> spirals.
<tb> thetic <SEP> but <SEP> not <SEP> many.
<tb>
It should be noted that, for the production of carbomycin, the invention is not limited to this particular organism or to organisms which entirely correspond to the description given above and which is indicated only by way of reference. example. In fact, it is especially desired and contemplated to include the use of derivatives obtained from the organism described by methods or agents such as exposure to x-rays or ultraviolet rays, nitrogen mustards and analogues.
Carbomycin shows high activity against several microorganisms. As indicated above, it is particularly remarkable for its action on mycobacteria and gram-positive microorganisms. It shows some activity against gram-negative microorganisms but to a lesser degree. The table below gives the antibiotic spectrum of carbomycin against a variety of gram-negative and gram-positive microorganisms. The tests were done by inoculating nutrient broth containing various concentrations of the pure antibiotic with the particular organism tested. The numbers marked in the "growth" column indicate the highest concentration which has been tested (in mcg / ml) at which the growth of the microorganisms still takes place.
The test was carried out under standard conditions with the specimens incubated for a standard period.
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TABLE III
EMI5.1
<tb>
<tb> Growth <SEP> No <SEP> of
<tb> growth
<tb>
EMI5.2
---- ¯ - 4 --- <= '- oCI ... A1 ..:> Q. "I8: I--" --q' '' '- ........- } aMl ---- ¯ ....... "". b ....,. - Á .-- 1 J - 'T ... --- ..- ..
EMI5.3
<tb>
<tb> Strep. <SEP> faecalis <SEP> - <SEP> 0.19 <SEP> mcg / ml
<tb> Brucella <SEP> bronchiseptica <SEP> 6.25 <SEP> mcg / ml <SEP> 12.5
<tb> A. <SEP> aerogenes <SEP> 2 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 21 <SEP> 100
<tb> Proteus <SEP> Sp. <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> 173 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> M.- <SEP> albicans <SEP> 8 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> typhosa <SEP> 344 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 132 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 134 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> S.
<SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 139 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes
<tb> var.aureus <SEP> 5 <SEP> 0.19 <SEP> 0.39
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> 219 <SEP> 0.39 <SEP> 0.78
<tb>
In addition to the above microorganisms, certain resistant strains have been used to determine the activity of the antibiotic.
For example, using a strain of Auromyces aerogenes which is resistant to aureomycin and chloramphenicol, it is found that growth occurs at a concentration of 25 mcg of carbomycin per ml of nutrient broth but that 'growth does not take place at a concentration of 50 mcg / ml.
For a second such test, a strain of A. aerogenes, resistant to both streptomycin and streptothricin, growth of this strain was also observed in the presence of 25 mcg / ml of carbomyine while no growth takes place at a concentration of 50 mcg / ml. Moreover, to show the efficacy of the antibiotic against resistant strains of this kind, this test also proves that the antibiotic is markedly different from aureomycin, chloramphenicol, streptothricin and -la streptomycin. It should also be noted that carbomycin is even more active against strains resistant to A. aerogenes than it is against the normal strain of A. aerogenes, as shown in Table III above.
A strain of Staphylococcus aureus has been found to be resistant in vitro to the action of penicillin at a concentration of 100 units / ml; to dihydrostreptomycin with 100 units / ml; to polymixin with 100 units / ml; whereas it is sensitive to the action of chloramphenicol with 100 mcg / ml and aureomycin with 12.5 mcg / ml. The growth of the organism in question is prevented by a concentration of 3.1 mcg / ml of carbomycin.
Carbomycin is very effective against a variety of types of mycobacteria. The table below gives the results of these tests. In these cases, test pieces, containing Dubos liquid medium with 0.5% albumina, are used for the tests. Carbomycin is added to the medium with different concentrations as shown in the first column of the following table. Test tubes of the medium containing several concentrations of the antibiotic, as indicated, are then inoculated with cultures of various mycobacteria. The name of the species is indicated at the head of each column of the table. The test results are given under the name of the species. This takes place by incubating the tubes under sterile conditions for 18 hours.
Lack of growth in the test tubes at the end of
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the standardized test period is indicated by (-), doubtful growth by (¯) and growth by (+).
TABLE IV
EMI6.1
<tb>
<tb> <SEP> activity of <SEP> carbomycin <SEP> against <SEP> <SEP> mycobacteria
<tb> mcg / ml <SEP> rande <SEP> phlei <SEP> smegmatis <SEP> 607 <SEP> berolinen- <SEP> butyrise <SEP> cum
<tb> 12.5 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 6.25 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 3.12 <SEP> ¯ <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 1.56 <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 0.78 <SEP> + <SEP> ¯ <SEP> - <SEP> ¯ <SEP> -
<tb> 0.39 <SEP> + <SEP> + - <SEP> ¯ <SEP> ¯
<tb> 0.19 <SEP> + <SEP> + <SEP> ¯ <SEP> + <SEP> ¯ <SEP> +
<tb>
The table above shows that carbomycin exhibits an extraordinary degree of activity against these mycobacteria.
Carbomycin has been found to have a relatively low level of toxicity when used in animal testing. For example the LDo value, when the antibiotic is administered by being injected into the veins of mice as a solution in acidulated water, is approximately equal to 7 mg / 20 g of mice. The toxicity for other species and for other methods of administration is comparable.
The subject of the invention is, inter alia, a method for cultivating the strain, which has not yet been described, of S. halstedii. The cultivation of this microorganism preferably takes place in an aqueous nutrient medium at a temperature of about 24-30 and in a submerged state with regard to agitation and aeration. Nutrient media which are useful for this process include carbohydrates, such as sugars, starch, glycerol, corn flour and a source of organic nitrogen, such as casein, soybean flour, peanut flour, wheat gluten, cottonseed flour, milk albumin, casein enzymatic extract, trypton.
A source of growth promoting agents, such as soluble maceration products from distilleries, yeast extract, fermentation residues of molasses as well as mineral salts, such as sodium chloride, potassium phosphate , sodium nitrate, mangeisum sulfate, and traces of inorganic materials such as copper, zinc and iron can also be used with beneficial results. If excessive foam production is obtained during fermentation, anti-foam agents, such as vegetable oils, can be added to the fermentation medium. The pH of the fermentation tends to remain more constant, but if variations occur, a buffering agent such as calcium carbonate can also be added to the medium.
An inoculum for the preparation of carbomycin, for the growth of the strain of S. Halstedii, can be obtained by using cultures provided by germs of this strain on media such as Emerson's agar or beef lactose. Cultures can be used to inoculate shake flasks or inoculation vessels for submerged culture. According to a variant, it is also possible to inoculate inoculation tanks with the contents of shaken flasks. The growth of the microorganism usually reaches its maximum in about 2 to 3 days. However, the particular constitution of the devices used, the degree of ventilation, the importance of
<Desc / Clms Page number 7>
accommodation, etc. can influence the speed at which maximum activity is reached.
In general, a period of between about 24 hours and -4 days is a desirable period to obtain the antibiotic. Aeration of the medium in tanks for submerged culture is continued with a flow rate of about one-half to two volumes of fresh air per volume of broth and per minute. Agitation can be effected by suitable agitators well known to those in the fermentation industry. Aseptic conditions must, of course, be maintained during the transfer of the inoculum and throughout the growth of the microorganism.
After the growth of the microorganism, the mycelium, which is usually very abundant and fine, can be separated from the fermentation broth using various standard devices, such as filter presses, centrifuges, etc. It has been found that lowering the pH of the whole fermentation broth to about 3.0 facilitates filtration.
Since the antibiotic is not very stable under acidic conditions, the fermentation broth is set to be approximately neutral when it has been filtered. Carbomycin can be separated from fermentation broth by a number of different methods. Alternatively, all of the broth can be used as it is or it can be dried. The antibiotic can be further purified in different ways. For example, the compound can be extracted out of the aqueous solution at neutral or slightly alkaline pHs, preferably between about 6 and about 10 by various organic solvents immiscible with water, these solvents including ethers, aromatic hydrocarbons. , esters, ketones, lower alcohols and halogenated hydrocarbons.
Among these solvents, mention may be made, by way of examples, of diethyl ether, benzene, toluene, ethyl acetate, butyl acetate, methyl-isobutyl-ketone, butanol and chloroform. . Even at acidic pHs, some of these solvents extract an appreciable amount of the antibiotic. This is especially true for water-immiscible alcohols, such as butanol, pentanols, etc. The antibiotic can be extracted out of most solutions in the solvent and afterwards in acidulated water, preferably at a pH below about 2.5. If desired, the solvent extract can be concentrated prior to the acidulated water extraction. By adjusting the pH for neutrality or alkalinity, the antibiotic can be extracted again into one of the solvents.
After evaporation of the solvent and concentration of the solution, the antibiotic forms crystals. It usually crystallizes in the form of blunt white needles. However, in some cases, flake crystals are obtained. The product can be recrystallized again from benzene, ether, lower ketones or lower alcohols. If desired, a solution in one of the ketone miscible alcohols or ketones is concentrated and water is added to facilitate crystallization. According to a variant, the antibiotic can be recovered by adsorption of the broth or products concentrated with activated charcoal. Taking up in acid or in water, together with a water-miscible solvent containing acid, makes it possible to obtain the compound in a purified form.
Carbomycin is a white, weakly basic organic compound which is soluble in dilute aqueous acids but is only slightly soluble in water (approximately 0.5 mg / ml). It is extremely soluble in several organic solvents such as acetone, ether, benzene, chloroform and dioxane and somewhat less soluble in methanol and ethanol. It is insoluble in hexane. By concentrating a solution of carbomycin in a solvent, one tends to form supersaturated solutions and the crystals which form have a tendency to retain some of the solvent used. The stability of the compound decreases in strongly acidic and basic solutions, even at room temperature.
The compound is very unstable after heating in acidic and alkaline solutions and its stability is maximum with a pH between 3 and 7. Its stability in the dry state or after dissolution in dry solvents is good.
A crystallized and highly purified carbomycin base product, such as that obtained by four recrystallizations from solvents
<Desc / Clms Page number 8>
such as ethanol, benzene, etc. tend to form as crystals impregnated with solvents from which the solvent can be separated, more or less completely, by drying under vacuum at 100. When such material is dried under these conditions for three hours, it has a melting point of 217-218 with slight decomposition. The sample is introduced at 196 into the bath, which serves to determine the melting point, and the bath temperature is increased at a rate of 3.6 per minute.
The crystalline anhydrous material forms a monohydrate when exposed to atmospheric humidity. This monohydrate analyzed has the following composition: carbon = 59.01; hydrogen = 8.35; nitrogen = 1.66; oxygen (by difference) = 30.98.
The crystallized base product, strongly purified and dried under vacuum at 100 for three hours, is analyzed and found to have the following composition: carbon: 60.04; hydrogen = 8.24; nitrogen = 1.55; oxygen (by difference) = 30.17.
The optical rotation of the material is about [a] = -55 (1% solution in chloroform). titrating the compound in a mixture of two volumes of dimethyl formamide and one volume of water gives a pKa = 6.4 and a molecular weight of about 866. The ultraviolet absorption spectrum of the base product, when dissolved in ethanol, has two maxima, one of which is 240 m / u (# = 16.080) and the other is 327.5 m / u. (# = 113). When the crystallized and anhydrous box product is dissolved in chloroform, it has a number of characteristic peaks in the infrared region.
Among these peaks we can cite the following frequencies (in cm-1): 3510, 2920, 1732, 1690, 1630, 1460, 1375, 1300, 1230, 1160, 1122, 1077, 1052, 1025, 1015, 976, 916, 910, 873 and 837. The infra-red spectrum is shown in Figure 1 of the accompanying drawings. The diagram of FIG. 1 indicates on the upper abscissa the frequencies f in cm-1 with the lower abscissa the wavelengths \ in microns / u and on the ordinate the transmittance values in%.
The salts of carbomycin, obtained with the aid of acids, can be prepared by treating the base product with the appropriate acid. For example, if the base is dissolved in ether and a stream of hydrochloric acid is bubbled through the solution, the carbomycin hydrochloride immediately precipitates. Other acids can be used for the same or similar processes to obtain the acid salts of the antibiotic. The treatment of the base with the acid can be carried out in an aqueous medium in which the acid salt formed is soluble. The salt can then be recovered by evaporation of the aqueous medium.
However, as noted above, carbomycin is not very stable in aqueous acid solutions so care must be taken.
The crystallized and dried hydrochloride of carbomycin, which is dissolved in chloroform, shows, among others, the characteristic peaks in the infrared region (in cm-1): 3220, 2870, 1715, 1670, 1610 , 1450, 1358, 1296, 1230, 1160, 1140, 1120, 1100, 1074, 1060, 975, 914, 890 and 860. The absorption spectrum in the infrared of this salt is shown in figure 2 with the same coordinates as those in figure 1.
Several different microorganisms can be used to determine the activity of carbomycin preparations. They include K. pneumoniae, B. subtilis, Staph. aureus and other standardized test organisms. When using K. pneumoniae, the test can be used for turbidity measurement or the plate test. Crystallized chloramphenicol can be used as a benchmark by assigning a value of 1000 units / mg to this antibiotic. On this basis, crystallized carbomycin has an activity of 750 to 850 units of chloramphenicol per mg. When carbomycin is prepared by fermentation, an activity of about 15 to about 100 units / ml is obtained.
Carbomycin differs from other antibiotics by its properties. Those that were used for this comparison are those
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indicated above as well as the measurements made with chromographic paper, these measurements showing a very clear difference. Comparisons have also been made with microorganisms resistant to various other antibiotics.
The examples below are only illustrative and in no way limit the scope of protection of the invention.
EXAMPLE l
Spores of a germ of S. halstedii NRRL-2331, obtained on Emerson's agar, are transferred, under aseptic conditions, to a nutrient medium having the following composition: cerelose 10 g soybean meal 10 sodium chloride sodium 5 distillers' solubles 5 calcium carbonate 1
The mixture is diluted to the volume of one liter and its pH is adjusted to be equal to 7 with caustic potash before sterilization. When the medium has cooled, the spores are added. The organism is grown in shake flasks for two to about 28 days.
The broth containing the mycelium is then transferred to a sterile medium, having a volume twenty times greater and the following composition: starch 20 g casein 10 soybean flour 15 calcium carbonate 1
This mixture is diluted to make one liter and its pH is adjusted to 7 before introduction into the autoclave and inoculation. After stirring and aeration, under sterile conditions for two days, the activity of the broth is 100 units / ml. The pH of the mixture is adjusted to 3.0 and the mycelium is removed by filtration. The pH of the filtrate is adjusted to 6.5 and it is then extracted twice with a quarter volume of methyl isobutyl ketone.
The mixed solvent phases are concentrated to one tenth volume under vacuum. The antibiotic is then extracted into water at a pH of about 2.0 using sulfuric acid to adjust the pH. The aqueous phase is separated, washed with a small volume of benzene to remove the dissolved methyl isobutyl ketone and the pH of the aqueous phase is adjusted to 6.5. The antibiotic is extracted several times with ether and the separated ether phases are dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent is removed by distillation and the antibiotic crystallizes in the form of white needles. The product is recrystallized by dissolving it in acetone, it is filtered and concentrated, after which water is added.
A scheme of the treatment, based on the above extraction process, is shown in Table V.
<Desc / Clms Page number 10>
EMI10.1
1 Mi / set Culf. 5. tlasf dc'É R d gf9 Acid pH 3.0 '#####' Mycellum Fiffre. p H, 5 'Ketone 9' ârbomyci, e MetYl C <Tb "Y'n6 150bulyl orssol. Aqueous 2 X El. XL rac t. & Ons µ xtraj [H2 504 Keto11e Carbomycin pH2.o out of solvent ##### ## L qvage 1 ±) e '(') 2 ènel Phase '####### 8enzene C cetone Aqueous N ev l'r8ti5 é p H 6.5 tir & H: ####! R And he, ... l caroomyctne '######' Ether Dried on Na 2 504. Dist il carbo-rnycin Acit 01 ') e solids' ###### t impure you are not impure ###### 'Carbom ytin
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The product obtained is very effective against a variety of mycobacteria and gram-positive microorganisms.
EXAMPLE II
A medium is prepared having the following composition: starch 20 g distillery soluble 10 g soybean flour 15 g The mixture of these materials is added to one liter of water and the pH is adjusted to 7 before the addition of one gram of calcium carbonate. The medium is then introduced into an autoclave and is inoculated with a S. halstedii NRRL-2331 inoculum under sterile conditions. The mixture is subjected to aeration and stirring under sterile conditions at about 28 for two days. It is found, in the test, that the filtered broth contains 25 units of carbomycin per milliliter of solution.
The antibiotic will be marketed under the registered trademark "MAGNAMYCINE".
CLAIMS.
A method of making an antibiotic, wherein streptomyces halstedii NRRL-2331 or an equivalent microorganism capable of delivering carbomycin in an aqueous nutrient medium under aerobic and submerged conditions is cultured until it is obtained. sufficient carbomycin (as specified above) is produced to provide antibacterial activity to said medium.