Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique Dans le brevet principal, on a décrit un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique qui a été dénommé antibiotique C . Le présent brevet concerne un procédé de préparation d'un autre nouvel antibiotique. Dans la description qui suit, ce nouvel antibiotique sera dénommé antibiotique D , à titre de simplification.
L'antibiotique D est un corps solide amor phe basique, contenant seulement les éléments carbone, hydrogène, azote et oxygène. Il fond à 252 C ; son pouvoir rotatoire
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est de 116 (C = 0,5 % dans de l'acide chlorhydri- que 0,1 N). Il est très soluble dans l'eau et le méthanol, et soluble dans l'éthanol chaud, duquel il est séparé par refroidissement. Il est insoluble dans l'acétone, l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle et le benzène.
Il est en outre caractérisé par les maxima d'absorption qu'il présente dans l'ultraviolet à 314 mu avec un
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de 123 dans l'acide chlorhydrique 0,1 N, à 302 mu avec un
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de 125 dans un tam pon de phosphate<I>pH 7,0,</I> et à 321,5 mtc avec un
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de 143 dans de la soude caustique 0,1 N. A une concentration de 12,5 icg/cms, l'antibiotique D empêche complètement la croissance du Mycobacterium <I>tuberculoses</I> var.
hominis H 37 Rv. L'antibiotique<I>D</I> a un Rf de 0,0 dans un mélange de solvants composé de 3 parties en poids d'acétate d'éthyle, de 3 parties en poids d'eau et d'une partie en poids d'acide acétique, il a un Rf de 0,19 dans un mélange de solvants composé de 10 parties en poids de n-butanol, d'une partie en poids d'acide acétique et de 4 parties en poids d'eau.
L'antibiotique D donne aussi une réaction né gative pour le groupement arylamino avec le réactif d'Ehrlich et une réaction Bratton - Marshall également négative pour le même groupement.
Il peut être précipité de ses so lutions aqueuses par plusieurs des agents de précipation usuels pour les bases, par exem <B>ple</B> l'acide p-hydroxyazobenzène-sulfonique, l'acide picrique, l'Orange II, l'acide flaviani- que, l'acide p-nitrobenzèneazo-chromotropi- que, le rouge Congo, le jaune Milling 3G. Les précipités formés sont des solides ou gommes insolubles dans l'eau, mais solubles, pour la plupart, dans les alcools inférieurs et le mé- thylcellosolve.
L'antibiotique D est très actif contre cer taines bactéries z < résistantes aux acides , qui sont les agents causant la tuberculose. L'acti vité de l'antibiotique D contre le Mycobacte- rium <I>tuberculoses</I> var.
hominis <I>H</I> 37 Rv, est à peu près égale à celle de plusieurs antibioti ques connus tels que celui produit par le Streptomyces puniceus, la streptothricine et la néomycine, et supérieure à celle de la chlor- tétracycline. Ce nouvel antibiotique est aussi fortement actif, au point de vue bactériostati que, contre les bactéries gram-positives de même que certaines bactéries gram-négatives. La table I montre de façon plus frappante le spectre antibiotique remarquable de l'antibio tique D.
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Le procédé selon l'invention, de prépara tion de ce nouvel antibiotique, est caractérisé en- ce qu'on inocule un milieu nutritif stérile avec le microorganisme<I>Streptomyces C 1730,</I> en ce qu'on cultive<B>le</B> milieu nutritif inoculé dans des conditions aérobies à une tempéra ture de 20 à 40 C pendant une période de 1 à 15 jours, et en ce qu'on isole du milieu de culture un antibiotique basique fondant sous forme pure à 252 C.
Cet antibiotique est une nouvelle substance dont le pouvoir rotatoire
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est de 116 à une concentration de 1,5% dans de l'acide chlorhydrique 0,1 N. Ses autres propriétés physiques et chimiques ont déjà été indiquées plus haut.
Streptomyces C 1730 est un actinomycète du genre Streptomyces. Ce microorganisme se trouve entre autres dans les sols. On peut ob tenir des cultures en mélangeant des cultures des bactéries spécifiques inhibées par l'anti biotique b avec de l'agar aqueux et en y ajoutant un sol contenant le Streptomyces C 1730 désiré. Après incubation du mélange pendant un à dix jours, il apparaît des colo nies de l'actinomycète désiré et d'autres anta gonistes. Les colonies du<I>Streptomyces C 1730</I> sont séparées des autres, et transférées dans un milieu nutritif frais, puis isolées comme cul tures pures selon les méthodes usuelles.
Une culture vivante de ce microorganisme a été dé posée au Bureau de Culture Parke, Davis & Company, à Detroit (Michigan), sous N 04918.
Examiné au microscope, cet organisme est un actinomycète aérobie qui forme un faible mycélium aérien ramifié, rarement ou pas cloi sonné, et qui donne naissance à des chaînes de conidies unicellulaires ; il est donc un membre du genre Streptomyces. Lorsqu'il a crû sur un milieu glucose-thryptone-agar, le jeune mycé lium primaire humide apparaît incolore à jau nâtre, devenant ensuite gris ; le mycélium se condaire aérien est d'abord blanc, et devient ensuite gris. Il n'apparaît que peu ou pas de pigements dans l'agar. Les colonies en surface sont circulaires, exhaussées, ridées ou à crê tes radiales, avec un bord continu ou ondulé. Le mycélium primaire humide est hyalin et excessivement ramifié.
Il présente des embran chements primaires, secondaires et quelquefois tertiaires, qui peuvent être alternes, opposés, et parfois verticillés. Le mycélium aérien est on dulé et forme souvent des boucles terminales ou des spires lâches. Les portions distales de ce mycélium aérien se subdivisent en chaînes de conidies d'une longueur de 15 à 55 microns. Les conidies sont hyalines, sphéroïdales à ovoïdales, d'un diamètre moyen de 0,85 mi cron (compris entre 0,5 et 1,2), et d'une lon gueur moyenne de 1,3 micron (entre 0,8 et 1,8).
Cet organisme liquéfie lentement la géla tine, sans formation de pigments, et peptonise le lait tournesolé usuellement avec une réac tion basique. En milieu synthétique (de Gott- lieb), l'organisme utilise de nombreuses sour ces de carbone y compris le 1-arabinose, le dextrose, le d-fructose, le d-galactose, l'i-ino- site, le lactose, le maltose, la d-mannite, le rhamnose, l'amidon et le d-xylose ;
il utilise moins facilement l'inuline, le raffinose, la d- sorbite et le sucrose; et ne peut utiliser la dul- cite. Cet organisme utilise les sources d'azote organiques et inorganiques.
Lorsqu'on exécute le présent procédé à l'aide de milieux nutritifs aqueux, la matière solide présente dans le mélange de culture est enlevée et l'antibiotique cherché est isolé à par tir du liquide de culture par les méthodes dé crites dans la suite. Lorsqu'on emploie un mi lieu nutritif solide, le mélange de culture est bien lavé avec un solvant de l'antibiotique, tel que l'eau ou le méthanol, et l'antibiotique cher ché est isolé à partir de cet extrait. Durant la phase d'incubation, on maintient la tempéra ture de préférence dans le voisinage de 22 à 29 C. Lorsque l'on utilise des milieux nutri tifs aqueux, le<I>pH</I> initial est d'ordinaire entre 6 et 8,2, et de préférence du côté alcalin entre environ 7,3 et 7,7.
Pour l'inoculation du' mi lieu nutritif, on peut employer des suspensions de spores, des subcultures ou des cultures en tube couché du<I>Streptomyces C 1730.</I> La culture du microorganisme en milieu nu tritif aqueux peut être effectuée de bien des manières différentes. Par exemple, le micro organisme peut être cultivé dans des conditions aérobies à la surface du milieu, ou bien il peut être cultivé au-dessous de ladite surface, c'est- à-dire en condition submergée; à condition de fournir en même temps de l'oxygène.
La mé thode préférée pour produire l'antibiotique D sur une large échelle est celle à culture sub mergée ou en profondeur<I>du Streptomyces C</I> <I>1730.</I> Selon cette manière d'exécuter l'inven tion, un milieu nutritif aqueux stérile est ino culé avec du<I>Streptomyces C 1730</I> et incubé avec agitation et aération à une température entre 20 et 401, C, de préférence au voisinage de 25 à 35 C, pendant un à quatre jours. Dans ces conditions, l'organisme se développe en nombreuses particules plus ou moins séparées, réparties dans tout le milieu, en contraste avec la pellicule plus ou moins continue présente à la surface du milieu, dans la méthode de cul ture en surface.
Grâce à cette distribution de l'organisme dans tout le milieu, on peut cul tiver en une seule fois de grands volumes du milieu nutritif inoculé dans de grands réser voirs et cuves utilisés ordinairement dans l'in dustrie des fermentations. Des foudres de fer mentation stationnaires munis de moyens con venables d'agitation et d'aération, de même que des tambours rotatifs horizontaux, sont parti culièrement avantageux à ces fins. Cependant, pour la préparation de petites quantités de l'antibiotique ou de cultures du microorga- nisme, cette méthode de culture submergée peut être exécutée dans de petites bouteilles qui sont secouées ou agitées par des moyens mécaniques convenables.
L'agitation et l'aération du mélange de cul ture peuvent être obtenues de diverses ma nières. L'agitation peut être produite par un propulseur ou par un dispositif mécanique semblable d'agitation, par rotation ou secouage du récipient lui-même, par différents dispositifs de pompage, ou par passage à travers le mi lieu d'air ou d'autres gaz contenant de l'oxy gène. L'aération peut être produite en injec tant dans le mélange en fermentation de l'air ou antres gaz contenant de l'oxygène à tra vers des tuyaux ouverts, des tuyaux perforés, des organes poreux de diffusion tels que des bougies de charbon, du carborundum, du verre aggloméré et semblables ; elle peut aussi être produite en pulvérisant, projetant ou versant le mélange à travers une atmosphère contenant de l'oxygène.
Le gaz contenant l'oxygène est dé barrassé de spores, de bactéries ou autres agents de contamination avant d'être introduit dans le mélange de culture. Ceci peut être obtenu très commodément en le filtrant à travers un lit de noir animal activé. L'intensité d'aération as surant un rendement maximum en antibiotique D dépendra, il va de soi, quelque peu du genre de réservoir employé, de l'intensité et du genre de l'agitation, du<I>pH,</I> de la température et d'autres conditions de ce genre.
En tout cas, le gaz contenant de l'oxygène est de préférence fourni en quantité suffisante pour maintenir une faible pression positive dans le récipient et éliminer ainsi toute possibilité de contamina tion de la culture par rentrée d'air extérieur. Avec des récipients du type à réservoir de 30 litres de capacité, une quantité de 10 à 15 li tres d'air par minute donne de bons résultats, quand on l'utilise avec un propulseur mécani que type turbine à six pales, de 10 cm de dia mètre, tournant à 100-200 tours à la minute en regard de quatre déflecteurs périphériques ver ticaux de 2,5 cm sur 40.
On peut employer une grande variété de milieux nutritifs. De tels milieux comprennent d'ordinaire une source de carbone assimilable, une substance protéinique, des sels minéraux et des traces de diverses substances nutritives, vitamines et autres stimulants de croissance, qui se trouvent en général comme impuretés dans les autres constituants du milieu. Pour une production maximum de l'antibiotique D, le milieu nutritif contiendra aussi avantageuse ment une source de graisse. Comme source de carbone assimilable, on comprend ici les al cools polyhydroxyliques, et les mono-, di- et polysaccharides, tandis que par matière pro-.
téinique , on comprend des protéines non mo difiées et des produits de dégradation des pro téines, en particulier ceux provenant de l'hy- drolyse de protéines. De tels produits de dé gradation sont les protéases, les peptones, les polypeptides, les peptides et les aminoacides.
Comme source de carbone assimilable, on peut employer l'arabinose, le fructose, le galac tose, le lactose, le maltose, le rhamnose, le xy- lose, la glycérine, la mannite, la rhamnite et semblables, de même que des matières com plexes à base d'hydrates de carbone, tels que les amidons, la dextrine, les lavasses de fer mentation et de distillation, les céréales solides trempées à l'eau, des liquides de trempage de céréales, des résidus séchés de fermentation et autres semblables.
Parmi les matières protéiniques utilisables dans les divers milieux, on peut citer l'extrait de boeuf, la caséine hydrolysée à l'acide, la peptone de boeuf, la farine de tourteau de soya; des résidus secs de fermentation, la fa rine de fèves de soya, soluble à l'eau, dégrais sée et partiellement hydrolysée, des mélanges d'acides aminés provenant de sources naturel les ou synthétiques, l'urée, les purines et sem blables. L'emploi de farine de tourteau de soya ou de dérivés de protéines de soya comme constituant du milieu est avantageux et four nit une faible quantité de graisse, utilisable par le microorganisme.
On peut satisfaire aux prin cipaux besoins en constituants minéraux par ad dition de 0,1 à 0,5 % d'un ou plusieurs sels inorganiques tels que le chlorure de sodium, le carbonate de calcium, le phosphate dipotas- sique, le phosphate monopotassique et sembla bles. Les autres constituants du milieu nutritif, c'est-à-dire les vitamines, les stimulants de croissance et semblables, sont généralement présents en quantités suffisantes dans les sour ces de carbone assimilable impures et/ou les matières protéiniques.
L'antibiotique D peut être isolé du mélange brut de culture par de nombreuses voies dif férentes. Lorsqu'on a utilisé un milieu de cul ture solide, le mycélium est traité pour extrac tion avec un dissolvant de l'antibiotique D, tel que l'eau, et le produit est isolé de l'extrait comme décrit dans la suite. Quand on a em ployé un milieu de culture liquide, le mélange peut être filtré pour enlever le mycélium, ou bien on peut amener le<I>pH</I> du mélange avec un acide à environ 2 à 4, et éliminer ensuite le mycélium par filtration.
Pour obtenir "l'antibiotique à partir des ex traits ainsi formés, on peut procéder par ex traction par solvant, avec des alcools alipha tiques inférieurs miscibles à l'eau, tels que le n-butanol ou par les méthodes d'adsorption et élution, en employant du charbon activé ou des échangeurs d'ions comme absorbants et du méthanol acidifié ou de l'ammoniaque aqueuse, respectivement, comme éluants.
Les méthodes ci-dessus conduisent à l'ob tention de concentrats bruts, lesquels peuvent ensuite être purifiés par fractionnement avec des solvants organiques, par exemple par dis solution dans du méthanol et précipitation frac tionnée avec de l'éther éthylique, ou par pré cipitation avec un acide arylsulfonique suivie d'une régénération à partir du sel colorant ainsi formé.
La séparation de l'antibiotique D à partir des concentrats bruts purifiés peut être effec tuée de diverses façons. Par exemple, l'anti biotique D peut être obtenu à partir de la li queur mère provenant de la séparation, par cristallisation, d'un corps solide du résidu de concentration de l'effluent aqueux.
Selon une variante; l'antibiotique D peut être obtenu à partir de la liqueur mère provenant du traite ment d'une' solution aqueuse du concentré brut avec de l'ammoniaque en vue d'éliminer une fraction indésirée. Finalement, l'antibiotique D peut aussi être obtenu à partir de la liqueur mère subsistant après addition d'acétate de po tassium à une solution aqueuse du concentré, pour précipiter une fraction indésirée par ajus tement du<I>pH</I> et par relargage.
Les liqueurs mères provenant d'une des méthodes susindiquées sont utilisées efficace ment pour l'obtention de l'antibiotique D. Une chromatographie à la cellulose permet un iso lement convenable de l'antibiotique D. Ce der nier est adsorbé par la cellulose à partir de sa solution dans un mélange d'acide acétique, acétate d'éthyle et eau. L'élution avec de l'eau donne un liquide effluent à partir duquel l'an- tibiotique D -peut être obtenu facilement par concentration.
A côté de l'antibiotique D, il se forme tou jours dans le milieu de culture un autre anti biotique, dénommé antibiotique C. Ce dernier constitue un 'sous-produit de valeur, suscepti ble d'être également récupéré et purifié en vue de son utilisation thérapeutique.
L'invention est illustrée par les exemples sui vants <I>Exemple 1</I> Un mélange formé de -180 g d'amidon de blé en poudre, 180 g de caséine hydrolysée à l'acide, 90 g de farine de tourteau de soya, 90 g de chlorure de sodium, et d'eau en suf fisance pour faire un volume de 18 litres, est mis dans un récipient de verre type cuve sta tionnaire, pourvu d'une calotte d'acier inoxy dable et d'un propulseur à turbine. Le récipient est revêtu de verre et possède quatre déflec teurs intérieurs verticaux de 2,5 cm sur 40. Il est équipé pour introduire trois courants d'air dans les eaux du propulseur.
On règle le<I>pH</I> du mélange dans le réci pient à 7,5 avec une solution de soude caus tique 10 N. On additionne le mélange de 72 g de saindoux brut et d'huiles végétales contenant des mono- et di-glycérides et 18 g de carbo nate de calcium. Le récipient et le milieu de culture sont stérilisés sous 1,35 atm de vapeur pendant deux heures, puis le récipient et son contenu sont refroidis et sortis de l'autoclave. Le milieu est inoculé aseptiquement avec 10 cmD d'une suspension de spores de<I>Strepto-</I> <I>myces C 1730</I> préparée en secouant une cul ture en tube couché de<I>Streptomyces C 1730</I> de 7 jours sur glucose-tryptone-agar avec 10 ce d'une solution aqueuse de savon blanc dit de Castille à 0,01 %.
Après inoculation, le mélange de culture est incubé à 24-26 C pendant 24 heures. Pen dant l'incubation, on fait passer de l'air stérile à travers l'anneau de diffusion à raison de 0,9 à 1,16 litre d'air à la minute par litre du milieu, e on fait tourner l'agitateur à une vi tesse d'environ 200 tours à la minute.
On suit la production d'antibiotique durant l'incubation en prélevant de temps en temps des échantillons et en les essayant par rapport <I>à</I> l'Escherichia coli. Au bout de 64 heures, cha que millilitre de culture équivaut à 920 ,ug de l'étalon, dans l'essai par rapport<I>à</I> l'Escheri- chia coli. L'étalon est un concentrai de l'anti biotique D d'une activité telle qu'une solution de 2,5 ,ug de l'étalon par cm8 produit une inhi bition de 50 % de l'Escherichia coli.
Les bières de plusieurs fermentations effec tuées comme décrit ci-dessus, sont combinées à la fin de la période d'incubation. Le<I>pH</I> du mélange est amené 'à 2,47 avec de l'acide sul furique, et le mycélium est enlevé par filtra tion et lavé à fond avec de l'eau. Le filtrat et les eaux de lavage combinés (41,1 litres) sont amenés à un<I>pH</I> de 9,10 et extraits avec six portions de 10 litres de n-butanol. Les extraits au n-butanol combinés sont concentrés à 10,6 litres dans un évaporateur à une température au-dessous de 29,) C. Un précipité jaune pâle, sensiblement inerte, qui se forme pendant cette concentration, est éliminé par filtration.
Le fil trat est extrait avec 8 portions de 1,5 litre d'acide chlorhydrique aqueux 0,01 N. Les ex traits acides combinés sont traités avec suffi samment d'un échangeur d'ions résineux (phase basique) pour éliminer l'excès d'acide, et la solution est concentrée à l'évaporateur à 30o C, jusqu'à 1,5 litre. Cette solution est alors sé chée à l'état congelé, et le résidu, du poids de 20,08 g, contient, d'après l'essai avec l'Escherichia coli, <I>452</I> pg de l'étalon par mg.
Pour purifier encore ce concentrat brut, on en ajoute 5,0 g à 25 ml de méthanol absolu. Il se sépare environ 1,4 g d'un solide insolu ble blanc, que l'on lave avec quatre portions de 5 ml de méthanol absolu. Les liquides surna- geants combinés sont dilués à 50 ml avec du méthanol absolu. On ajoute alors 100 ml d'éther éthylique et le précipité jaune brun qui se forme est séparé par centrifugation, lavé avec de l'éther éthylique, et séché dans le vide. Le rendement est de 2,4 g et le produit con tient, selon l'essai avec l'Escherichia coli, 900 ,ug de l'étalon par par mg.
Ce produit brut purifié est très soluble dans l'eau. Pour isoler l'antibiotique D, on dissout 150 mg de concentre brut purifié dans un mélange de 3 parties d'acétate d'éthyle, 3 par ties d'eau et 1 partie d'acide acétique. Cette solution est introduite à raison de 3-4 ml à l'heure, dans une colonne contenant 35 g d'une cellulose connue sous la marque Solka Floc . La colonne est alors développée avec du solvant frais, et l'on recueille des fractions de 3 ml à intervalles de 1 heure. Lorsque les fractions de l'effluent deviennent négatives au réactif d'Ehrlich, la colonne est éluée avec 100 ml de solvant, puis avec de l'eau. L'éluat aqueux (environ 100 ml) est séché à l'état congelé, et l'on obtient une poudre brune.
En dissolvant ce produit dans du méthanol et pré cipitant avec de l'éther éthylique, on a obtenu une poudre légèrement bronzée, dont l'activité envers l'Escherichia coli a été trouvée être de 1070 yg/mg de l'étalon.
L'antibiotique solide D présente une activité prononcée quand on l'essaie contre le Mycrobacterium <I>tuberculoses</I> var. hominis <I>H 37</I> Rv. Les spectres d'absorp tion de l'antibiotique<I>D</I> à des<I>pH</I> différents ne présentent qu'un maximum à 314 m,p,
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est de 103 dans l'acide chlorhydrique 0,1 N, est de 125 dans un tampon à 302 mu, au phosphate<I>pH 7,0,</I> et à<B>321,5</B> mie,
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est de 143 dans une solution de soude causti-
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que 0,1 N.
<I>Exemple 2</I> Un mélange formé de 1,5 g de cérélose, 1,5 g de glycérine, 0,9 g de caséine partielle ment hydrolysée, 0,75 g de peptone, 0,3 g de levure de brasserie, 0,75 g de céréales solides trempées à l'eau, 0,75 g de farine de tour teau de soya, 1,5 g de résidus de fermentation butanol-acétonique, 1,5 g de chlorure de so dium, 0,3 g de carbonate de calcium et suffi samment d'eau pour porter le volume à 300 ml, est mis dans plusieurs flacons d'Erlen- meyer de 1 litre.
Les flacons sont couverts par de la gaze de coton et stérilisés sous 1,25 atm de vapeur pendant 25 minutes, puis chaque fla con est inoculé aseptiquement avec 1 cm-3 d'une suspension de spores de<I>Streptomyces C 1730</I> préparée à l'aide d'une culture en tube cou ché de trente jours sur glucose-tryptone-agar. Les flacons sont secoués sur une machine se- coueuse du type rotatif, à 150 tours par mi nute, pendant quatre jours. La température pendant la période d'incubation est maintenue à 22-24 C. A la fin de cette période d'incu bation, la bière de culture a un<I>pH</I> d'environ 6,7.
En l'essayant par rapport au Staphylococ- cus aureus, on a constaté que cette bière de culture produit une inhibition de 63 % de la croissance de l'organisme d'essai à une dilution de 1 à 100.
Le mycélium est séparé par filtration du bouillon contenu dans les flacons ci-dessus mentionnés, et le<I>pH</I> du filtrat est amené de 8,6 à<B>7,17</B> avec de l'acide sulfurique 3 N. L'antibiotique est retiré de 100 ml du filtrat par quatre extractions avec des portions de 25 ml de n-butanol. Les extraits alcooliques combinés sont évaporés à siccité à moins de 45,# C et l'on obtient un concentrat brut.
1,0 g de ce concentrat brut est dissous dans 20 cm-3 d'eau. On ajoute alors une solu tion de 550 mg d'acide p-hydroxyazobenzène- p-sulfonique dans 11 cm3 d'eau, ce qui provo que la formation immédiate d'un précipité gommeux. Le mélange est centrifugé, et le li quide surnageant, décanté. Le résidu gommeux est lavé à l'eau et recristallisé à partir de 6 ml d'éthanol absolu et 9 ml d'eau. Le précipité qui se forme par refroidissement est retiré par centrifugation, bien lavé à l'eau, et séché dans le vide (poids .: 570 mg).
Le complexe de couleur est alors dissous dans 10 ml de mé thanol et précipité sous forme de poudre jaune orange par addition de 30 ml d'éther éthylique (poids : 475 mg).
450 mg de ce complexe coloré sont dis sous dans 20 ml de méthanol à 50 0/a, et on y ajoute une solution aqueuse d'acétate de ba ryum jusqu'à ce que la précipitation de p-hy- droxyazobenzène-p-sulfonate de baryum soit complète. Le précipité est éliminé par centri fugation et au liquide surnageant, on addi tionne 1 ml en excès d'acide sulfurique 2 N après que tout ion baryum a été éliminé comme sulfate de baryum. Ce dernier est enlevé par centrifugation. Le liquide jaune clair surna geant est alors envoyé à travers une colonne d'échangeur d'ions en résine synthétique (phase basique). Le liquide effluent jaune clair a un<I>pH</I> de 7,6.
La colonne est lavée à l'eau jusqu'à ce que les eaux de lavage ne réagis sent plus avec le réactif d'Ehrlich. L'effluent et les eaux de lavage donnent, par séchage à partir de l'état congelé, une poudre légère ment jaune (poids : 173 mg) d'une activité par mg de 1150 ,ug de l'étalon, quand on l'es saie par rapport<I>à</I> l'Escherichia coli.
A 49 mg du concentrai brut purifié, on ajoute 1 cm3 d'eau et assez d'hydroxyde d'am monium 1 N pour porter le pH à 9,0. Il se forme un précipité blanc que l'on sépare par centrifugation. L'antibiotique-D peut être isolé du liquide aqueux ammoniacal surnageant par le procédé chromatographique à la cellulose, comme décrit dans l'exemple 1. <I>Exemple 3 : ,</I> Un mélange formé de 180 g de glycérine, 90 g de farine de tourteau de soya, 180 g de caséine hydrolysée à l'acide, 90 g de chlorure de sodium et assez d'eau pour avoir un volume total de 18 litres, est introduit dans un réci pient de verre type cuve stationnaire pourvu d'une calotte en acier inoxydable et d'un pro pulseur type turbine.
Le récipient est revêtu de verre et possède quatre déflecteurs intérieurs verticuax de 2,5 cm sur 40. Il est équipé pour introduire trois courants d'air dans les eaux du propulseur.
Le<I>pH</I> du mélange est réglé à 7,5 avec une solution 10 N de soude caustique. On ajoute au mélange 180 g de saindoux pour em pêcher la formation d'écume et 18 g de car bonate de calcium. Le récipient et le milieu de culture sont stérilisés sous 1,35 atm de vapeur pendant deux heures. Le récipient et son con tenu sont refroidis et sortis de l'autoclave.
Le milieu est .inoculé aseptiquement avec 10 ml d'une suspension de spores de<I>Streptomyces C</I> <I>1730</I> préparée en agitant une culture en tube couché de 7 jours sur glucose-tryptone-agar avec 10 ml d'une solution aqueuse à 0,01 % de savon blanc dit de Castille. Après inoculation, le mélange de culture est incubé à 251, C pendant 88 heures.
Pendant l'incubation, -on fait passer de l'air stérile à travers l'anneau de diffusion à raison de 0,3 à 1,0 litre à la minute par litre du milieu, et fait tourner l'agitateur à environ 200 tours par minute.
On suit la production d'antibiotique durant l'incubation, en prélevant de temps en temps . des échantillons et en les essayant par rapport <I>à</I> l'Escherichia coli. Au bout de quarante heu res, chaque millilitre de culture équivaut à 188 ,ug de l'étalon dans l'essai avec l'Escheri- clzia coli <I>;</I> après soixante heures, chaque milli litre équivaut à 410 p.g ; et nu bout de 88 heures, chaque millilitre est l'équivalent de 636 ,icg de l'étalon.
La culture brute acidifiée est filtrée pour éliminer le mycélium et le filtrat est amené à un<I>pH</I> de 7,0 avec de la soude caustique di luée. A une colonne contenant 600 cm2 d'une résine échangeuse de cations dans le cycle de l'hydrogène, on ajoute 7,5 litres du filtrat-bouil- lon de<I>pH</I> 7,0. Après lavage de la colonne avec de l'eau, la fraction antibiotique est com- plètemént évacuée de la colonne par élution avec de l'ammoniaque aqueuse 5 N.
La frac tion antibiotique peut être obtenue à partir de cet éluat comme concentré brut, purifiable par les méthodes décrites aux exemples 1 et 2.
L'antibiotique D est obtenu à partir du con- centrat brut purifié par la méthode décrite à l'exemple 1.
<I>Exemple 4</I> 100 cm3 de bouillon filtré, obtenu dans des conditions analogues à celle de l'exemple 3 et dont<I>le pH</I> a été amené à 7,5 avec une solu tion aqueuse de soude caustique, sont agités pendant 20 minutes avec 300 mg de charbon activé. La suspension est filtrée et le gâteau de charbon est agité avec 25 cm3 de métha nol acidifié (contenant 0,05 cm3 d'acide chlor hydrique 5 N par 100 cm-3 de méthanol). Le mélange est filtré, et l'élution est répétée.
Les extraits au méthanol sont réunis et concentrés dans le vide ; le concentrat brut contient en- viron 50 % de l'activité du bouillon original. L'antibiotique D peut être isolé à partir du bouillon de culture par chacune des métho- de & décrites dans les exemples précédents.
<I>Exemple 5</I> Un mélange formé de 1,0 g de glycérine, 0,5 g de farine de tourteau de soya, 0,5 g de peptone du commerce, 0,5 g de chlorure de sodium, et d'eau en suffisance pour porter le volume à 100 ml, est mis dans plusieurs fla cons d'Erlenmeyer. Les contenus de ces fla cons sont réglés à un<I>pH</I> de 7,5 avec une so lution 10 N de potasse caustique, et on y ajoute 0,1 g de carbonate de calcium.
Les flacons sont recouverts avec de la gaze de coton, et stéri lisés sous 1,02 atm de vapeur pendant 20 mi nutes ; chaque flacon est alors inoculé avec 1 ml d'une suspension de spores d'une culture en tube couché de vingt-sept jours sur glucose- tryptone-agar. Les flacons sont secoués sur une machine secoueuse du type rotatif, à 160 tours par minute, pendant six jours. La température est maintenue à 24-26 C pendant la période d'incubation. A la fin de cette période, le bouil lon de culture a un<I>pH</I> de 8,3. Essayé par rap port<I>à</I> l'Escherichia coli, un millilitre de bouil lon est équivalent à 800 pg de l'étalon.
L'antibiotique D peut être isolé de ce bouil lon de culture par chacune des méthodes dé crites aux exemples 1, 2 et 3.
Des résultats analogues peuvent être obte nus en remplaçant la peptone par de la levure de brasserie débarrassée de ses substances amè res. <I>Exemple 6</I> Un milieu nutritif formé de 1,25 g de gly cérine, 0,75 g de caséine hydrolysée à l'acide, 1,25 g de céréales solides trempées à l'eau, 1,25 g de chlorure de sodium, et d'assez d'eau pour porter le volume à 250 ml, est rendu alcalin à un<I>pH</I> de 7,3 avec une solution 10<I>N</I> de soude caustique. Après addition de 0,25 g de carbonate de calcium, le mélange est mis dans un flacon de Fernbach bouché avec un tampon de coton, et stérilisé sous pression de vapeur de 1,25 atm pendant 25 minutes.
Le milieu est inoculé avec 2 ml d'une suspension de spores de<I>Streptomyces C 1730</I> provenant d'une culture en tube couché de 7 jours sur glucose-tryptone-agar. Le mélange résultant est incubé à 29o C pendant 11 jours. Au bout de ce temps, le bouillon de culture a une activité, déterminée par rapport<I>à</I> l'Escherichia coli, équivalant à 273 ,ug de l'étalon, par millilitre de bouillon.
L'antibiotique D peut être isolé à partir du bouillon de culture par chacune des méthodes décrites aux exemples 1, 2 et 3.
Process for preparing a novel antibiotic In the main patent, a process for preparing a novel antibiotic has been described which has been called antibiotic C. The present patent relates to a process for the preparation of another novel antibiotic. In the following description, this new antibiotic will be called antibiotic D, by way of simplification.
Antibiotic D is a basic amorphous solid, containing only the elements carbon, hydrogen, nitrogen and oxygen. It melts at 252 C; its rotary power
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is 116 (C = 0.5% in 0.1N hydrochloric acid). It is very soluble in water and methanol, and soluble in hot ethanol, from which it is separated by cooling. It is insoluble in acetone, ethyl ether, ethyl acetate and benzene.
It is further characterized by the absorption maxima that it presents in the ultraviolet at 314 mu with a
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of 123 in 0.1 N hydrochloric acid, at 302 mu with a
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of 125 in a phosphate buffer <I> pH 7.0, </I> and at 321.5 mtc with a
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of 143 in 0.1N caustic soda. At a concentration of 12.5 icg / cms, the antibiotic D completely prevents the growth of Mycobacterium <I> tuberculosis </I> var.
hominis H 37 Rv. The <I> D </I> antibiotic has an Rf of 0.0 in a mixture of solvents composed of 3 parts by weight of ethyl acetate, 3 parts by weight of water and one part of weight of acetic acid, it has an Rf of 0.19 in a mixture of solvents composed of 10 parts by weight of n-butanol, one part by weight of acetic acid and 4 parts by weight of water.
Antibiotic D also gives a negative reaction for the arylamino group with Ehrlich's reagent and a Bratton - Marshall reaction also negative for the same group.
It can be precipitated from its aqueous solutions by several of the usual precipitating agents for bases, eg p-hydroxyazobenzenesulfonic acid, picric acid, Orange II, l flavianic acid, p-nitrobenzeneazo-chromotropic acid, Congo red, Milling yellow 3G. The precipitates formed are solids or gums insoluble in water, but soluble, for the most part, in lower alcohols and methylcellosolve.
Antibiotic D is very active against certain acid resistant bacteria z <, which are the causative agents of tuberculosis. The activity of antibiotic D against Mycobacterium <I> tuberculosis </I> var.
hominis <I> H </I> 37 Rv, is approximately equal to that of several known antibiotics such as that produced by Streptomyces puniceus, streptothricin and neomycin, and superior to that of chlor-tetracycline. This new antibiotic is also strongly active, from a bacteriostatic point of view, against gram-positive bacteria as well as certain gram-negative bacteria. Table I shows in a more striking way the remarkable antibiotic spectrum of the antibiotic D.
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The process according to the invention for the preparation of this novel antibiotic is characterized in that a sterile nutrient medium is inoculated with the microorganism <I> Streptomyces C 1730, </I> in that <B > the nutrient medium inoculated under aerobic conditions at a temperature of 20 to 40 ° C. for a period of 1 to 15 days, and in that a basic antibiotic is isolated from the culture medium, melting in pure form at 252 C.
This antibiotic is a new substance whose rotatory power
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is 116 at a concentration of 1.5% in 0.1N hydrochloric acid. Its other physical and chemical properties have already been indicated above.
Streptomyces C 1730 is an actinomycete of the genus Streptomyces. This microorganism is found among others in soils. Cultures can be obtained by mixing cultures of the specific bacteria inhibited by anti-biotic b with aqueous agar and adding thereto a soil containing the desired Streptomyces C 1730. After incubation of the mixture for one to ten days, colonies of the desired actinomycete and other antagonists appear. The colonies of <I> Streptomyces C 1730 </I> are separated from the others, and transferred to a fresh nutrient medium, then isolated as pure cultures according to the usual methods.
A live culture of this microorganism has been deposited with the Parke, Davis & Company Culture Office, Detroit, Michigan, under No. 04918.
Examined under a microscope, this organism is an aerobic actinomycete which forms a weak branched aerial mycelium, rarely or not septate, and which gives rise to chains of unicellular conidia; it is therefore a member of the genus Streptomyces. When grown on glucose-thryptone-agar medium, the young, moist primary myceium appears colorless to nish-yellow, subsequently turning gray; the aerial mycelium is first white, and then becomes gray. Little or no pigmentation appears in the agar. Surface colonies are circular, raised, wrinkled, or radially crested, with a continuous or wavy edge. The primary moist mycelium is hyaline and excessively branched.
It presents primary, secondary and sometimes tertiary branches, which can be alternate, opposite, and sometimes whorled. The aerial mycelium is undulated and often forms terminal loops or loose coils. The distal portions of this aerial mycelium are subdivided into chains of conidia 15 to 55 microns long. The conidia are hyaline, spheroidal to ovoidal, with an average diameter of 0.85 microns (between 0.5 and 1.2), and an average length of 1.3 microns (between 0.8 and 1.8).
This organism slowly liquefies the gelatin, without the formation of pigments, and peptonizes the sunflower milk, usually with a basic reaction. In synthetic medium (from Gott- lieb), the organism uses many carbon sources including 1-arabinose, dextrose, d-fructose, d-galactose, i-ino- site, lactose , maltose, d-mannite, rhamnose, starch and d-xylose;
it uses inulin, raffinose, d-sorbite and sucrose less easily; and cannot use dulcite. This organism uses organic and inorganic nitrogen sources.
When carrying out the present method using aqueous nutrient media, the solid material present in the culture mixture is removed and the antibiotic sought is isolated from the culture liquid by the methods described below. When employing a solid nutrient medium, the culture mixture is washed well with a solvent for the antibiotic, such as water or methanol, and the expensive antibiotic is isolated from this extract. During the incubation phase, the temperature is preferably maintained in the vicinity of 22 to 29 C. When using aqueous nutrient media, the initial <I> pH </I> is usually between 6 and 8.2, and preferably on the alkaline side between about 7.3 and 7.7.
For inoculation of the nutrient medium, spore suspensions, subcultures or coated tube cultures of <I> Streptomyces C 1730 can be employed. </I> Culture of the microorganism in aqueous nutrient medium can be performed. in many different ways. For example, the microorganism can be cultivated under aerobic conditions on the surface of the medium, or it can be cultivated below said surface, ie under submerged condition; provided that oxygen is supplied at the same time.
The preferred method of producing antibiotic D on a large scale is that in submerged or deep culture <I> Streptomyces C </I> <I> 1730. </I> According to this manner of carrying out the test. invention, a sterile aqueous nutrient medium is inoculated with <I> Streptomyces C 1730 </I> and incubated with agitation and aeration at a temperature between 20 and 401 ° C., preferably in the region of 25 to 35 ° C., for one to four days. Under these conditions, the organism develops in numerous more or less separated particles, distributed throughout the medium, in contrast to the more or less continuous film present on the surface of the medium, in the surface culture method.
Thanks to this distribution of the organism throughout the medium, large volumes of the inoculated nutrient medium can be grown all at once in large tanks and vats commonly used in the fermentation industry. Stationary fermenting casks with suitable means of agitation and aeration, as well as horizontal rotating drums, are particularly advantageous for these purposes. However, for the preparation of small amounts of the antibiotic or cultures of the microorganism, this submerged culture method can be performed in small bottles which are shaken or agitated by suitable mechanical means.
Agitation and aeration of the culture mixture can be achieved in various ways. Agitation can be produced by a propellant or similar mechanical agitation device, by rotating or shaking the container itself, by various pumping devices, or by passing through the medium of air or others. gas containing oxygen. Aeration can be produced by injecting into the fermenting mixture of air or other gases containing oxygen through open pipes, perforated pipes, porous diffusers such as charcoal candles, carborundum, sintered glass and the like; it can also be produced by spraying, blasting or pouring the mixture through an atmosphere containing oxygen.
The oxygen-containing gas is stripped of spores, bacteria or other contaminants before it is introduced into the culture mixture. This can be achieved very conveniently by filtering it through a bed of activated animal black. The intensity of aeration to ensure maximum yield of antibiotic D will, of course, depend somewhat on the type of reservoir used, the intensity and type of agitation, the <I> pH, </ I > temperature and other such conditions.
In any case, the oxygen-containing gas is preferably supplied in an amount sufficient to maintain a low positive pressure in the vessel and thus eliminate any possibility of contamination of the culture by the entry of outside air. With containers of the tank type of 30 liters capacity, a quantity of 10 to 15 liters of air per minute gives good results, when used with a mechanical propellant type turbine with six blades, of 10 cm. of diameter, rotating at 100-200 revolutions per minute opposite four vertical peripheral deflectors 2.5 cm by 40 cm.
A wide variety of nutrient media can be employed. Such media usually include a source of assimilable carbon, a proteinaceous substance, mineral salts and traces of various nutrients, vitamins and other growth promoters, which are generally found as impurities in the other constituents of the medium. For maximum production of antibiotic D, the nutrient medium will also advantageously contain a source of fat. As a source of assimilable carbon are understood here polyhydric alcohols, and mono-, di- and polysaccharides, while by material pro-.
teinic include unmodified proteins and protein degradation products, particularly those derived from protein hydrolysis. Such degradation products are proteases, peptones, polypeptides, peptides and amino acids.
As a source of assimilable carbon, there can be employed arabinose, fructose, galac tose, lactose, maltose, rhamnose, xylose, glycerin, mannite, rhamnite and the like, as well as materials Complexes based on carbohydrates, such as starches, dextrin, fermenting and distillation lavas, solid cereals soaked in water, cereal steep liquids, dried fermentation residues and others alike.
Among the protein materials which can be used in the various media, mention may be made of beef extract, acid hydrolyzed casein, beef peptone, soybean meal flour; dry fermentation residues, soybean flour, water soluble, degreased and partially hydrolyzed, mixtures of amino acids from natural or synthetic sources, urea, purines and the like. The use of soybean meal or soy protein derivatives as a component of the medium is advantageous and provides a small amount of fat, usable by the microorganism.
The main requirements for mineral constituents can be met by adding 0.1 to 0.5% of one or more inorganic salts such as sodium chloride, calcium carbonate, dipotassium phosphate, monopotassium phosphate. and looked bleak. The other constituents of the nutrient medium, i.e. vitamins, growth promoters and the like, are generally present in sufficient amounts in impure assimilable carbon sources and / or proteinaceous materials.
Antibiotic D can be isolated from the crude culture mixture by many different routes. When a solid culture medium is used, the mycelium is treated for extraction with an antibiotic D solvent, such as water, and the product is isolated from the extract as described below. When a liquid culture medium has been used, the mixture can be filtered to remove the mycelium, or the <I> pH </I> of the mixture with an acid can be brought to about 2 to 4, and then removed. mycelium by filtration.
To obtain "the antibiotic from the extracts thus formed, it is possible to proceed by extraction by solvent, with lower aliphatic alcohols miscible with water, such as n-butanol or by the methods of adsorption and elution. , using activated charcoal or ion exchangers as absorbents and acidified methanol or aqueous ammonia, respectively, as eluents.
The above methods lead to the production of crude concentrates, which can then be purified by fractionation with organic solvents, for example by dissolving in methanol and fractional precipitation with ethyl ether, or by precipitation. with an arylsulfonic acid followed by regeneration from the coloring salt thus formed.
Separation of antibiotic D from the purified crude concentrates can be accomplished in various ways. For example, anti-biotic D can be obtained from the mother liquor resulting from the separation, by crystallization, of a solid body from the concentration residue of the aqueous effluent.
According to a variant; Antibiotic D can be obtained from the mother liquor resulting from treating an aqueous solution of the crude concentrate with ammonia to remove an unwanted fraction. Finally, antibiotic D can also be obtained from the mother liquor remaining after addition of potassium acetate to an aqueous solution of the concentrate, to precipitate an unwanted fraction by adjusting the <I> pH </I> and by release.
The mother liquors obtained from one of the above-mentioned methods are used effectively to obtain the antibiotic D. A cellulose chromatography allows a suitable isolation of the antibiotic D. The latter is adsorbed by the cellulose from of its solution in a mixture of acetic acid, ethyl acetate and water. Elution with water gives an effluent liquid from which antibiotic D-can be readily obtained by concentration.
Besides the antibiotic D, another antibiotic, called antibiotic C, is always formed in the culture medium. The latter constitutes a valuable by-product, which can also be recovered and purified with a view to its therapeutic use.
The invention is illustrated by the following examples <I> Example 1 </I> A mixture formed of -180 g of powdered wheat starch, 180 g of acid hydrolyzed casein, 90 g of meal flour of soy, 90 g of sodium chloride, and water sufficient to make a volume of 18 liters, is placed in a glass container type stationary tank, provided with a stainless steel cap and a turbine thruster. The vessel is glass lined and has four vertical interior baffles measuring 2.5 x 40 cm. It is equipped to introduce three air streams into the thruster waters.
The <I> pH </I> of the mixture in the container is adjusted to 7.5 with a 10 N sodium hydroxide solution. The mixture of 72 g of crude lard and vegetable oils containing mono- and diglycerides and 18 g of calcium carbonate. The container and the culture medium are sterilized under 1.35 atm of steam for two hours, then the container and its contents are cooled and taken out of the autoclave. The medium is aseptically inoculated with 10 cmD of a <I> Strepto- </I> <I> myces C 1730 </I> spore suspension prepared by shaking a coated tube culture of <I> Streptomyces C 1730 </I> for 7 days on glucose-tryptone-agar with 10 cc of an aqueous solution of 0.01% Castile white soap.
After inoculation, the culture mixture is incubated at 24-26 C for 24 hours. During incubation, sterile air is passed through the diffusion ring at a rate of 0.9 to 1.16 liters of air per minute per liter of medium, and the stirrer is rotated. at a speed of about 200 revolutions per minute.
Antibiotic production is monitored during incubation by occasionally taking samples and testing them for <I> </I> Escherichia coli. After 64 hours, each milliliter of culture is equivalent to 920 µg of the standard in the test against <I> </I> Escherichia coli. The standard is a concentrate of anti-biotic D with an activity such that a solution of 2.5 µg of the standard per cm 2 produces a 50% inhibition of Escherichia coli.
Beers from several fermentations carried out as described above are combined at the end of the incubation period. The <I> pH </I> of the mixture is brought to 2.47 with sulfuric acid, and the mycelium is removed by filtration and washed thoroughly with water. The combined filtrate and washings (41.1 liters) are brought to a <I> pH </I> of 9.10 and extracted with six 10 liter portions of n-butanol. The combined n-butanol extracts are concentrated to 10.6 liters in an evaporator at a temperature below 29 ° C. A pale yellow, substantially inert precipitate which forms during this concentration is removed by filtration.
The treated wire is extracted with 8 portions of 1.5 liters of 0.01 N aqueous hydrochloric acid. The combined acid extracts are treated with sufficient resinous ion exchanger (basic phase) to remove the excess. of acid, and the solution is concentrated in an evaporator at 30o C, up to 1.5 liters. This solution is then dried in the frozen state, and the residue, weighing 20.08 g, contains, according to the test with Escherichia coli, <I> 452 </I> pg of standard per mg.
To further purify this crude concentrate, 5.0 g thereof is added to 25 ml of absolute methanol. About 1.4 g of a white insoluble solid separated, which was washed with four 5 ml portions of absolute methanol. The combined supernatant liquids are diluted to 50 ml with absolute methanol. 100 ml of ethyl ether are then added and the yellow-brown precipitate which forms is separated by centrifugation, washed with ethyl ether, and dried in vacuo. The yield is 2.4 g and the product contains, according to the test with Escherichia coli, 900 µg of the standard per per mg.
This purified crude product is very soluble in water. To isolate the antibiotic D, 150 mg of purified crude concentrate is dissolved in a mixture of 3 parts of ethyl acetate, 3 parts of water and 1 part of acetic acid. This solution is introduced at a rate of 3-4 ml per hour, into a column containing 35 g of a cellulose known under the trademark Solka Floc. The column is then developed with fresh solvent, and 3 ml fractions are collected at 1 hour intervals. When the effluent fractions become negative for Ehrlich's reagent, the column is eluted with 100 ml of solvent, then with water. The aqueous eluate (about 100 ml) is dried in the frozen state, and a brown powder is obtained.
By dissolving this product in methanol and precipitating with ethyl ether, a slightly tanned powder was obtained, the activity of which against Escherichia coli was found to be 1070 µg / mg of the standard.
The solid antibiotic D shows pronounced activity when tested against Mycrobacterium <I> tuberculosis </I> var. hominis <I> H 37 </I> Rv. The absorption spectra of the antibiotic <I> D </I> at different <I> pH </I> show only a maximum at 314 m, p,
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is 103 in 0.1 N hydrochloric acid, is 125 in 302 mu buffer, <I> pH 7.0, </I> and <B> 321.5 </B> crumb ,
EMI0006.0040
is 143 in a caustic soda solution
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than 0.1 N.
<I> Example 2 </I> A mixture formed of 1.5 g of cerelose, 1.5 g of glycerin, 0.9 g of partially hydrolyzed casein, 0.75 g of peptone, 0.3 g of yeast brewery, 0.75 g of solid cereals soaked in water, 0.75 g of soybean meal, 1.5 g of butanol-acetone fermentation residues, 1.5 g of sodium chloride, 0.3 g of calcium carbonate and sufficient water to bring the volume to 300 ml is placed in several 1 liter Erlenmeyer flasks.
The vials are covered with cotton gauze and sterilized under 1.25 atm of steam for 25 minutes, then each vial is aseptically inoculated with 1 cm-3 of a spore suspension of <I> Streptomyces C 1730 </ I> prepared using a culture in a 30-day coated tube on glucose-tryptone-agar. The vials are shaken on a rotary type sewing machine at 150 revolutions per minute for four days. The temperature during the incubation period is maintained at 22-24 C. At the end of this incubation period, the cultured beer has a <I> pH </I> of approximately 6.7.
When tested against Staphylococcus aureus, this cultured beer was found to produce 63% inhibition of the growth of the test organism at a dilution of 1 to 100.
The mycelium is separated by filtration from the broth contained in the above-mentioned flasks, and the <I> pH </I> of the filtrate is brought from 8.6 to <B> 7.17 </B> with 3 N sulfuric acid. The antibiotic is removed from 100 ml of the filtrate by four extractions with 25 ml portions of n-butanol. The combined alcoholic extracts are evaporated to dryness at less than 45 ° C and a crude concentrate is obtained.
1.0 g of this crude concentrate is dissolved in 20 cm-3 of water. Then added a solution of 550 mg of p-hydroxyazobenzene-p-sulfonic acid in 11 cm 3 of water, which causes the immediate formation of a gummy precipitate. The mixture is centrifuged, and the supernatant liquid, decanted. The gummy residue is washed with water and recrystallized from 6 ml of absolute ethanol and 9 ml of water. The precipitate which forms on cooling is removed by centrifugation, washed well with water, and dried in vacuo (weight: 570 mg).
The color complex is then dissolved in 10 ml of methanol and precipitated in the form of an orange-yellow powder by adding 30 ml of ethyl ether (weight: 475 mg).
450 mg of this colored complex are dissolved in 20 ml of 50 0 / a methanol, and an aqueous solution of ba ryum acetate is added thereto until the precipitation of p-hydroxyazobenzene-p-sulfonate of barium is complete. The precipitate is removed by centrifugation and to the supernatant liquid is added 1 ml in excess of 2N sulfuric acid after all barium ion has been removed as barium sulfate. The latter is removed by centrifugation. The clear yellow liquid supernatant is then sent through an ion exchanger column made of synthetic resin (basic phase). The light yellow effluent liquid has a <I> pH </I> of 7.6.
The column is washed with water until the washing water no longer reacts with Ehrlich's reagent. The effluent and the washings give, on drying from the frozen state, a slightly yellow powder (weight: 173 mg) with an activity per mg of 1150, ug of the standard, when it is are less than <I> to </I> Escherichia coli.
To 49 mg of the purified crude concentrate, 1 cm3 of water and enough 1N ammonium hydroxide are added to bring the pH to 9.0. A white precipitate forms which is separated by centrifugation. Antibiotic-D can be isolated from the aqueous ammoniacal liquid supernatant by the cellulose chromatography method, as described in Example 1. <I> Example 3:, </I> A mixture formed from 180 g of glycerin, 90 g of soybean meal flour, 180 g of acid-hydrolyzed casein, 90 g of sodium chloride and enough water to have a total volume of 18 liters, is placed in a glass receptacle type stationary tank fitted a stainless steel cap and a turbine-type propeller.
The container is lined with glass and has four interior deflectors verticuax 2.5 cm by 40. It is equipped to introduce three currents of air into the waters of the propellant.
The <I> pH </I> of the mixture is adjusted to 7.5 with a 10 N solution of caustic soda. 180 g of lard are added to the mixture to prevent the formation of scum and 18 g of calcium carbonate. The container and the culture medium are sterilized under 1.35 atm of steam for two hours. The container and its contents are cooled and taken out of the autoclave.
The medium is aseptically inoculated with 10 ml of a <I> Streptomyces C </I> <I> 1730 </I> spore suspension prepared by shaking a 7-day coated tube culture on glucose-tryptone-agar. with 10 ml of a 0.01% aqueous solution of so-called Castile white soap. After inoculation, the culture mixture is incubated at 251 ° C. for 88 hours.
During incubation, sterile air is passed through the diffusion ring at a rate of 0.3 to 1.0 liters per minute per liter of the medium, and the agitator is rotated at about 200 revolutions. per minute.
Antibiotic production is monitored during incubation, taking samples from time to time. samples and testing them against <I> </I> Escherichia coli. After forty hours, each milliliter of culture is equivalent to 188, ug of the standard in the test with Escheri- clzia coli <I>; </I> after sixty hours, each milliliter is equivalent to 410 pg ; and after 88 hours each milliliter is equivalent to 636 icg of the standard.
The acidified crude culture is filtered to remove the mycelium and the filtrate is brought to a <I> pH </I> of 7.0 with diluted caustic soda. To a column containing 600 cm 2 of a cation exchange resin in the hydrogen cycle, 7.5 liters of the broth filtrate of <I> pH </I> 7.0 are added. After washing the column with water, the antibiotic fraction is completely removed from the column by elution with 5N aqueous ammonia.
The antibiotic fraction can be obtained from this eluate as a crude concentrate, purifiable by the methods described in Examples 1 and 2.
Antibiotic D is obtained from the crude concentrate purified by the method described in Example 1.
<I> Example 4 </I> 100 cm3 of filtered broth, obtained under conditions similar to those of Example 3 and whose <I> pH </I> was brought to 7.5 with an aqueous solution of caustic soda, are stirred for 20 minutes with 300 mg of activated charcoal. The suspension is filtered and the carbon cake is stirred with 25 cm3 of acidified methanol (containing 0.05 cm3 of 5N hydrochloric acid per 100 cm-3 of methanol). The mixture is filtered, and the elution is repeated.
The methanol extracts are combined and concentrated in vacuo; the crude concentrate contains about 50% of the activity of the original broth. Antibiotic D can be isolated from the culture broth by any of the methods described in the preceding examples.
<I> Example 5 </I> A mixture formed from 1.0 g of glycerin, 0.5 g of soybean meal flour, 0.5 g of commercial peptone, 0.5 g of sodium chloride, and of water sufficient to bring the volume to 100 ml is placed in several Erlenmeyer flasks. The contents of these flasks are adjusted to a <I> pH </I> of 7.5 with a 10 N solution of caustic potash, and 0.1 g of calcium carbonate is added thereto.
The vials are covered with cotton gauze, and sterilized under 1.02 atm of steam for 20 minutes; each vial is then inoculated with 1 ml of a spore suspension from a culture in a twenty-seven day tube lying on glucose-tryptone-agar. The vials are shaken on a rotary type shaker machine at 160 revolutions per minute for six days. The temperature is maintained at 24-26 C during the incubation period. At the end of this period the culture broth has a <I> pH </I> of 8.3. When tested against <I> to </I> Escherichia coli, one milliliter of broth is equivalent to 800 pg of the standard.
Antibiotic D can be isolated from this culture broth by each of the methods described in Examples 1, 2 and 3.
Similar results can be obtained by replacing the peptone with brewer's yeast freed from its bitter substances. <I> Example 6 </I> A nutrient medium formed from 1.25 g of gly cerine, 0.75 g of acid hydrolyzed casein, 1.25 g of solid cereals soaked in water, 1.25 g of sodium chloride, and enough water to bring the volume to 250 ml, is made alkaline to a <I> pH </I> of 7.3 with a 10 <I> N </I> solution of caustic soda. After adding 0.25 g of calcium carbonate, the mixture is placed in a Fernbach flask stoppered with a cotton swab, and sterilized under vapor pressure of 1.25 atm for 25 minutes.
The medium is inoculated with 2 ml of a suspension of <I> Streptomyces C 1730 </I> spores obtained from a culture in tube coated for 7 days on glucose-tryptone-agar. The resulting mixture is incubated at 29o C for 11 days. At the end of this time, the culture broth has an activity, determined relative to <I> to </I> Escherichia coli, equivalent to 273 µg of the standard, per milliliter of broth.
Antibiotic D can be isolated from the culture broth by any of the methods described in Examples 1, 2 and 3.