ANTIBIOTIQUE ET PROCEDE POUR SA PRODUCTIONo
La présente invention se rapporte à un antibiotique nouveau et utile, l'Amphomycine, et à sa productiono Elle se rapporte plus particulièrement aux procédés pour sa production et sa fermentation, aux procédés d'extraction et de concentration à partir de solutions brutes comprenant les bouillons de fermentation, à sa purification et à la production de sels de ses formes acides et basiques. L9invention s'étend à l'antibiotique et à ses sels en solutions diluées, sous forme de produits concentrés bruts, et sous forme solide plus pureo
<EMI ID=1.1>
la présente description soit à une substance séparée soit à un groupe de substances parentes, dont le rapport mutuel est défini par leur comportement et leur formation analogues pendant les opérations d'isolement et de purification décrites ci-dessous.
Au cours des dernières années, un certain nombre de produits métaboliques de la croissance des bactéries et des moisissures ont été isolés
et des propriétés thérapeutiques de valeur leur ont été reconnues. On peutmentionner parmi ces produits la pénicilline, la streptomycine, la gramicidinB, la tyrocidine, la bactracine, la subtiline, la streptothricine, l'auréomicine
<EMI ID=2.1>
à cause de leur efficacité contre les organismes pathogènes. D'autres ne présentent qu'une utilité réduite à cause de leur toxicité, par exemple.
La pénicilinne est un élément important de la classe formée par les antibiotiques principalement efficaces contre les organismes Gram-positifs. Cependant la pénicilline présente plusieurs points faibles. 0-'est ainsi qu'elle exerce des effets toxiques sur certains patients, qu'elle est relativement inactive par voie buccale, instable en présence d9eau, inactivée par la pénicillinase, et qu'elle tend à perdre son efficacité par développement
de souches d'organismes résistant au médicamento La présente invention a pour but de fournir un nouvel antibiotique puissante en particulier contre les organismes infectieux Gram-positifs, et convenant pour les applications thérapeutiques. Un autre but de l'invention consiste à fournir des procédés de préparation de cette substance antibiotique sous une forme commercialement acceptable.
Suivant la présente invention, on a découvert un procédé de production d'Amphomycine dans lequel on cultive une souche de Streptomyces BL-456786 dans un milieu nutritif aqueux contenant une solution d'hydrate de carbone dans des conditions aérobiques submergées jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne appréciable soit.communiquée à ces solutions, puis on sépare l'Amphomycine ainsi obtenue du bouillon de fermentation.
Dans le cadre de l'invention et suivant une de ses formes de réalisation, on a découvert diverses opérations du procédé ci-dessus, à savoir
<EMI ID=3.1>
l'extraction de l'antibiotique dans un solvant organique non miscible à l'eau dans des conditions fortement acides, la précipitation de l'Amphomycine de la solution aqueuse par réglage du pH à une valeur comprise entre 3,0 et 4,0, l'élimination des impuretés de la solution aqueuse fortement acide de l'Ampho-
<EMI ID=4.1>
d9acétate d'amyle, l'extraction de l'Amphomycine d'une solution fortement acide dans le butanol au moyen d'eau ayant un pH supérieur à 4, l'extraction de l'Amphomycine d'une solution en solvant organique non miscible à l'eau dans l'eau dont le pH est supérieur à 6s0, la précipitation de l'Amphomycine en solution par formation de dérivés insolubles de la fonction basique, et la précipitation de l'Amphomycine en solution par formation de dérivés insolubles de la fonction acide.
On a également découvert suivant l'invention des substances ca-
<EMI ID=5.1>
StaphoAuréus, et Bosubtilis choisies dans le groupe formé par les matières amphotères susceptibles de former des sels avec les acides et les métaux, qui sont solubles dans l'eau, présentent une solubilité minimum dans l'eau
<EMI ID=6.1>
aussi bien sous la forme acide que sous la forme de sel, sont solubles dans les alcools supérieurs uniquement sous la forme acide, peuvent être extraites de l'eau au pH 2 par le butanol et le pentanol, ne peuvent pas en être extraites au pH 2 par la méthyl-isobutyl-cétone, le benzène, l'éther, l'acétate d'éthyle et l'acétate d'amyle, fournissent des dérivés solides, présentant une activité antibactérienne, d'hydroxyde d'ammonium et de sel de Reinecke, absorbent la lumière ultra-violette uniquement dans la région de 210
<EMI ID=7.1>
Sakaguchi, Molisch et Ehrlich-Pauly,, et qui sont stables pendant au moins
10 jours en solution aqueuse du pH 2 au pH 10, et les sels d'acides et de métaux de ces substances.
Le nouvel antibiotique de l'invention se forme pendant la culture sous condition contrôlée d'une variété de micro-organismes qui n'a pas encore fait l'objet d9une description et qu'on a appelés provisoirement Strep-
<EMI ID=8.1>
L'organisme BL-456o786 spo nova qui produit la nouvelle matière antibiotique appartient au genre généralement appelé streptomyceso Il se forme un mycélium présentant des hyphes ramifiéso Les hyphes jeunes sont Grampositifs (les hyphes plus vieux sont variables). Les conidies sont formées
<EMI ID=9.1>
riens et inhibéeo
On comprendra que la production d'Amphomyeine n'est pas limitée à cet organisme particulier ou à des organismes correspondant entièrement à la description ci-dessus, donnée uniquement à titre d'exemple. L'invention comprend au contraire l'emploi d'organismes mutants obtenus à partir de l'organisme décrit par des agents de mutation;, tels que les rayons X, les rayons ultra-violets les "moutardes" d'azote^, etc.,
L9Amphomycine possède comme la pénicille une faible toxicité et une puissante activité contre les bactéries, en particulier les bactéries
<EMI ID=10.1>
sur la pénicilline des avantages particuliers parce qu'elle n'est pas inactivée par la pénicillinase et qu'elle agit dans certains cas d'infection
due à des souches résistantes à la pénicilline, dans des cas où la pénicilline est inefficace et lorsque les patients présentent une sensibilité particulière à la pénicillineo L'Amphomycine présente une résistance remarquable à la dégradation par la chaleur ou l'eauo
<EMI ID=11.1>
ficace contre les bactéries Gram-positives, notamment Stephy�ococcus aureus, Bacillus aureus., Bacillus subtilis, Bacillus myco�des et Micrococcus tetragenouso Le tableau ci-dessous montre l'activité antibiotique de deux des
<EMI ID=12.1>
(5 mg par cm de matières solides)
<EMI ID=13.1>
<EMI ID=14.1> puis on creuse une tranchée de 8 mm sur 40 mm dans l'agar à l'aide d'une spatule stérileo Le fond de la tranchée est fermé au moyen d'une ou deux gouttes d'agar fondu. On trace ensuite une bande de bouillon de culture nutritif vieux de 24 heures contenant chacune des bactéries soumises à l'es-
<EMI ID=15.1>
allant du bord de la tranchée jusqu'à la paroi du vase de Pétri. La tranchée est ensuite remplie d'une solution aqueuse d'antibiotique à 5 milligram-
<EMI ID=16.1>
tue ensuite une mesure linéaire de la zone d'inhibition à partir du bord de
la tranchée jusqu'au point où on relève un développement de l'organisme sou- mis à l'essaie
On trouvera ci-dessous la méthode d'essai de diffusion sur p laque utilisée pour déterminer l'activité de l'Amphomycineo
Milieu de culture
L'agard pour l'essai de la Streptomycine (contenant de l'extrait de levure) est fourni par la firme "Baltimore Biological Laboratories" Bal-
<EMI ID=17.1>
se reposer la suspension pendant 5 minutes, on la mélange jusqu'à obtenir me suspension uniforme et on chauffe lentement tout en agitant. On laisse bouillir la suspension pendant 1 ou 2 minutes ou jusqu'à formation d'une solutions Le milieu de culture est ensuite placé dans un récipient et stérilisé à 121[deg.]G
(15 livres/pouce carré de pression de vapeur pendant 15 minutes).
Inoculum
<EMI ID=18.1>
tée à l�agar fondu (chauffé à 53[deg.]C) de façon à obtenir une concentration fi-
<EMI ID=19.1>
tri stériles placés de niveau et on laisse solidifiero On répartit alors uniformément 4 cm3 d�agar inoculé sur la surface de la couche de baseo Des pla- ques d'essai en acier inoxydable sont placées sur le milieu après refroidis-
<EMI ID=20.1>
Tampono
On utilise un tampon au phosphate au pH 8,0 pour effectuer les
<EMI ID=21.1>
ou de l'autre solution de phosphate molaire. Les variations du pH ou de la concentration affectent notablement les dimensions des zones d'inhibition.
<EMI ID=22.1>
mères sont conservées à l'aide de chloroforme et de toluène et de nouvelles solutions de travail sont préparées journellement.
Essai
On dilue si nécessaire des échantillons inconnus dans la solu-
<EMI ID=23.1> d'activité in vitro à l'égard d'une souche de la moisissure pathogène Tricho-
<EMI ID=24.1>
le à la surface une suspension aqueuse de spores de To mentasrophytes provenant d'une culture sur agar, on place sur cette surface des cylindres d'acier et on incube les plaques à 30[deg.]C pendant 24 ho On place une solution aqueuse
<EMI ID=25.1>
tre d9inhibition autour de chaque cylindre est ensuite mesuré en prenant la moyenne de 3 zones au moins. On obtient les résultats suivants :
<EMI ID=26.1>
L'invention comprend un procédé de développement d'une nouvelle espèce de microorganismes n'ayant pas encore fait l'objet d'une description,
<EMI ID=27.1>
tion et d'aération sur un milieu formé d'une source de carbone, d'une source d'azote, d9une source de substances favorisant le développement, de sels minéraux comme le chlorure de sodium, le phosphate de potassium, le sulfate de magnésium, le nitrate de sodium et éventuellement un agent tampon comme le carbonate de calciumo
Comme source de carbone dans le milieu nutritif on peut utiliser:
<EMI ID=28.1>
Ces sources de carbone peuvent être introduites dans le milieu sous forme purifiée ou sous forme de produits concentrés.. La quantité de ces sources de carbone dans le milieu peut varier considérablement, de 1 1/2 % à 5 % en poids du poids total du milieu de f ermentation assurant les meilleures conditions de production de l1 antibiotiques
Les sources d'azote, comprenant certaines sources de substances favorisant le développement comprennent pour le processus de fermentation des substances très diverses, par exemple :
Amino-acides
Caséine, hydrolysée ou non hydrolysée
Farine de poisson
Farine de soya
Extraits de viande
Extraits de foie
Urée
Nitrates
Composés d'ammonium
Moût de distillation de grain
Liqueur de macération de mais
Liqueur de macération de froment
Petit lait ou concentrés de petit lait
Gluten de mais hydrolyse en conditions acides
Gluten de froment hydrolysé en conditions acides
Peptone Abatis
Levure de brasserie
Farine de graine de coton
Lactalbumine
Tryptone
Il est inutile de fournir ces ingrédients protéiques à un haut degré de pureté: Les matières les moins pures contenant des traces de facteurs favorisant le développement et des quantités considérables d'agents nutritifs minéraux peuvent conveniro II n'est évidemment pas possible, vu l'état brut
de la plupart de ces matières azotées de fixer des p roportions définies pour
<EMI ID=29.1>
part des cas au milieuo
Le pH du milieu de fermentation doit être égal à 7,0-7,2 au début de la fermentationo La température préférée pour le processus de fermentation est 26-27[deg.]C envo On obtient généralement un rendement maximum du produit en deux à sept jours suivant le procédé de culture de Streptomyces.
Une fois le développement achevé, le mycélium est séparé du bouillon qui contient alors l'antibiotique Amphomycine, et l'Amphomycine est séparée du bouillon par extraction à l'aide de solvants organiques, par précipitation au point iso-électrique ou par tout autre procédé connu dans la partieo
Le nouvel antibiotique ou l'Amphomycine, obtenu comme décrit cidessus possède des propriétés intéressantes et uniques qui le distinguent de tous les antibiotiques connus et antérieurement décrits.
<EMI ID=30.1>
vitro et manifeste une activité chimiothérapeutique marquée contre les infections expérimentales chez les souriso Les résultats des essais et des déterminations de toxicité sont repris dans le tableau ci-dessous.
Résultats des essais in vivoo
<EMI ID=31.1>
<EMI ID=32.1>
L9infection est communiquée aussitôt après la première du.,$ du médicament sous essaio Celui-ci est administré en deux doses égales à un intervalle de
18 heures environ. Les animaux sont observés pendant 4 jours et les morts de chaque groupe sont exprimés sous forme de pourcentage du total des animaux du groupeo Le pourcentage de morts est transformé en valeurs de probit et cellesci sont reportées sur un graphique et comparées au logarithme de la dose en milligrammes par kilog de poids de souriso Le point d'intersection de la ligne de probit 5 et de la meillezure ligne construite diaprés les points expérimentaux correspond à la concentration du médicament susceptible de protéger la
<EMI ID=33.1>
facilement soluble dans le méthanol soit sous la forme diacide soit sous la forme de sel et dans les alcools supérieurs sous la forme diacide. Elle est extraite de l'eau par le butanol ou l'alcool amylique au pH 2 mais non par la méthyl-iso-butylcétone ou l'acétate d'amyleo Elle peut être extraite de la solution acide de butanol dans l'eau à un pH supérieur à 3 ou 4.
Les solutions acides d'Amphomycine dans le butanol peuvent être décolorées au moyen de carbone, et la forme acide de l'antibiotique peut être précipitée par addition de solvants non polaires comme l'acétate d'éthyle,
15'éther, etc..
Une solution aqueuse (5-2�) de l'Amphomycine acide dans l'eau donne une précipitation copieuse lorsqu'on amène le pH à 3,4 - 3,5 au moyen d'alcalio Ce précipité repasse en solution lorsque le pH est relevé ou abaissée
Des dérivés insolubles de la fonction basique ont été obtenus. Le traitement du sel de sodium dans l'eau avec le sel de Reinecke ne donne pas de précipitation mais l'abaissement du pH à 2-3 donne un bon rendement de reineckate actif. L'antibiotique est facilement régénéré en dissolvant le reineckate dans l'acétone et en ajoutant de l'hydroxyde d'ammonium de façon
à précipiter le sel d'ammonium actif d'Amphomycine. Le reineckate n'a pas été cristallisé à ce jour. Un micrate huileux à été préparé d'une manière analogueo
L'Amphomycine est stable dans l'eau, des solutions aqueuses au
<EMI ID=34.1>
ture ambiante pendant 10 jours. L'amphomycine solide est stable à la température ordinaireo
Lanatière la plus pure préparée à ce jour absorbe la lumière ultra-
<EMI ID=35.1>
tient du carbone, de 1-'hydrogène, de l'oxygène et de l'azoteo Les échantillons actuels sont des poudres non cristallines blanche ou crèmeo Ils donnent lieu à une réaction positive avec le biuret et l'essai à la ninhydrine est égale-
<EMI ID=36.1>
tographie sur papier met en évidence l'existence de plusieurs matières différentes réagissant avec la ninhydrine dans l'hydrolysato
Les propriétés de l'Amphomycine permettent de la distinguer d'au- - très antibiotiques obtenus à partir d'actinomycètes. Parmi les antibiotiques
<EMI ID=37.1>
posés exempts d'azote ne présentant pas de propriétés basiqueso L'acide libre de ces composés est soluble dans les solvants non polaires (éther benzène, etc..) tandis que l'Amphomycine ne l'est paso
La lithmocidine et la rhodomycétine sont des pigments tandis que les préparations d'Amphomycine de grande puissance sont des poudres blanches.
Parmi les antibiotiques actinomycétiques acides contenant de
<EMI ID=38.1> pH acide, au contraire de l'Amphomycineo
<EMI ID=39.1>
Pour produire de faibles quantités d'Amphomycine on dirige la fermentation dans des flacons agitateurs en communication avec l'air mais protégés de la contamination par des tampons de coton.
Le Streptomyces BL-456786 est cultivé sur un milieu nutritif approprié par le procédé de culture submergée, l'agitation et l'aération du mélange de culture étant effectuées en plaçant les flacons dans un dispositif secoueur du type à va-et-vient qui assure l'agitation et la projection de gouttes de bouillie dans une atmosphère contenant de l'oxygène.
Dans un cas typique on introduit dans des flacons de 4 litres
et on stérilise 500 ce d'un milieu de culture contenant
<EMI ID=40.1>
myces provenant d9une souche cultivée sur agaro
Le pH est 7,0 - 7,2 au début de la fermentation. Le contenu du
<EMI ID=41.1>
fois par minute, d'un mouvement d'une amplitude de 1 - 1 1/4 pouce.
Après cette période d'incubation le liquide présente l'activité suivante exprimée par le diamètre en millimètres de la zone d'inhibition
<EMI ID=42.1>
EXEMPLE 2 - Préparation de l'inoculum pour installation pilote
Pour une production d'Amphomycine à plus grande échelle on prépare un milieu de fermentation contenant en poids
1 % de farine de soya
1 % de cerelose
0,5 % de NaCl <EMI ID=43.1>
d'une suspension aqueuse trouble de spores de Streptomyces BL-456786 provenant d'une souche cultivée sur agaro
Le contenu de la bouteille est ensuite incubé à 26-28[deg.]C pendant
72 à 96 ho dans un dispositif secoueur du type à va-et-vient. Le bouillon contenant Streptomyces BL-456786 est chassé du flacon d'inoculation dans le réservoir de fermentation, dans des conditions parfaitement aseptiques.
EXEMPLE 3 - Production d'Amphomycine à grande échelle.
<EMI ID=44.1>
submergée ou profonde de 1-'organisme. Des barattes fixes de fermentation équipées de dispositifs d'agitation et d'aération appropriés conviennent pour ce procédéo
<EMI ID=45.1>
après la stérilisation, dans une cuve de fermentation verticale en acier doublé de verre d'une contenance de 2o000 gallons, équipée d'une chemise de circulation d'eau pour le contrôle de la température, d'un agitateur en acier inoxydable en forme d9ancre et d'un arroseur en acier inoxydable perforé à deux braso
Le milieu est stérilisé par chauffage avec de la vapeur sous pression puis refroidi.
<EMI ID=46.1>
re végétative vieille de 48 ho développée dans un appareil de fermentation
<EMI ID=47.1>
La culture dans l'appareil de f ermentation de 20000 gallons est soumise à l'incubation à 29[deg.]C pendant 50 heures. Pendant cette incubation l'agitateur tourne à 90 tours/mine et on fait passer de l'air stérile dans le mélange à raison de 100 pieds cubes/mino
L'analyse d'une partie du liquide de culture à la fin de la période d'incubation montre que le pH est égal à 7968 et l'activité déterminée par l'essai de diffusion sur plaque décrit plus haut correspond à
<EMI ID=48.1>
et 4x une dilution à quatre fois le volume initiale
On isole l'Amphomycine solide à partir de ce bouillon suivant le procédé décrit dans les exemples 5 et 60' EXEMPLE 4 - Isolement et purification
<EMI ID=49.1>
et du cylindre, la réaction étant mesurée en millimètres Les solutions sont essayées à divers degrés de dilution et comparées de la façon suivante;
On acidifie 30 litres de bouillon filtré au pH 1,95 au moyen de
<EMI ID=50.1>
solution claireo Le filtrat clair est agité avec 15 litres de n-butanol pendant 15 minutes puis on sépare les deux phases en présence. On reprend le procédé avec une nouvelle quantité de 48 litres de bouillon, on combine les deux extraits par le butanol (40 litres) et on lave au moyen de 10 litres
<EMI ID=51.1>
second extrait aqueux du butanol fournit après traitement analogue 6,6 grs de plus de poudre brune. Les résultats des essais s'établissent comme suit:
<EMI ID=52.1>
EXEMPLE 5 - Isolement
Au cours d'une autre opération, on amène 775 gallons de bouil-
<EMI ID=53.1>
L'extrait de butanol est séparé et lavé par 40 gallons d'eau au pH 2, puis extrait successivement par 40 et 20 gallons d'eau, le mélange étant amené dans chaque cas au pH 7,3 - 7,4 au moyen d'hydroxyde de sodium. Les extraits aqueux sont combinés et soumis à une seconde extraction par butanol acide et eau alcaline, fournissant finalement un extrait aqueux riche, d'un volume de 12,1
<EMI ID=54.1>
EXEMPLE 6 - Clairification au carbone et précipitation en solvant de la matière brute.
<EMI ID=55.1>
comme dans l'exemple 5, dans 500 ce d'eau amenée au pH 2 au moyen d'acide phosphorique et on extrait par 300 ce de n-butanol de façon à obtenir un extrait brun foncé. La couche de butanol séparée est filtrée sur diatomées afin d'éliminer les traces d'eau non dissoute et agitée avec 20 grs. de charbon activé (Darco KB) pendant 30 minutes Le carbone est séparé par filtration et la solution jaune clair de butanol concentrée dans le vide de façon à obtenir un volume de 100 ce. Ce produit concentré est ajouté à 2.000 ce d'acétate d'éthyle et on obtient ainsi un précipité copieux d'Amphomycine qu'on sé-
<EMI ID=56.1>
res solides de couleur crème. Les essais donnent les résultats suivants:
<EMI ID=57.1>
EXEMPLE 7 - Précipitation iso-électrique
On dissout dans 100 ce d'eau un échantillon de 10 grso d'Amphomycine préparée par extraction par le butanol et purification par le traitement au carbone et la précipitation dans l'acétate d'éthyle décrits ci-dessus, de
<EMI ID=58.1>
yen d'hydroxyde de sodium et solubilisée de façon à obtenir 4,55 grs. de matières solides (A). Le précipité est dissous dans l'eau, amené au pH 6,8 et
<EMI ID=59.1>
<EMI ID=60.1>
EXEMPLE 8 - Purification par le sel de Reinecke
<EMI ID=61.1>
necke dissous dans 200 ce d�eau au pH 1,9 et on ajoute cette solution à la solution d'Amphomycineo Le précipité obtenu est séparé par filtration après un séjour d'une nuit dans le réfrigérateuro Le précipité est redissous dans
<EMI ID=62.1>
matière reprécipitée est séparée par filtration, lavée à l'eau, dissoute dans
150 ce d'acétone et filtrée. Par addition d'un litre d'acétone et d'hydroxy-
<EMI ID=63.1>
Les essais de diffusion sur plaque donnent les résultats suivants;
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
On prépare un échantillon n[deg.] 28 du produit de la façon décrite
dans l'exemple 8 ci-dessus
REVENDICATIONS
lo Procédé de production d'Amphomycine caractérisé en ce qu'on
cultive une souche de Streptomyces BL-456786 dans une solution aqueuse d'hydrate de carbone contenant des éléments nutritifs dans des conditions aérobiques submergées jusqu'à ce que cette solution présente une activité antibactérienne appréciable, puis on sépare l'Amphomycine produite du bouillon de fermentationo
2o Procédé de production d'Amphomycine caractérisé en ce qu'on
cultive une souche de Streptomyces BL-456786 dans une solution aqueuse d'hydrate de carbone contenant des éléments nutritifs dans des conditions aérobi-
<EMI ID=66.1>
envo jusqu'à ce que cette solution présente une activité antibactérienne appréciables puis on sépare l'Amphomycine obtenue du bouillon de fermentation.
<EMI ID=67.1>
ANTIBIOTIC AND PROCESS FOR ITS PRODUCTION o
The present invention relates to a new and useful antibiotic, Amphomycin, and to its production. It relates more particularly to the processes for its production and its fermentation, to the processes of extraction and concentration from crude solutions comprising the broths fermentation, its purification and the production of salts of its acidic and basic forms. The invention extends to the antibiotic and its salts in dilute solutions, in the form of crude concentrates, and in a more pure solid form.
<EMI ID = 1.1>
the present description either to a separate substance or to a group of parent substances, the relationship of which is defined by their similar behavior and formation during the isolation and purification operations described below.
In recent years, a number of metabolic products of the growth of bacteria and molds have been isolated
and valuable therapeutic properties have been recognized. Among these products can be mentioned penicillin, streptomycin, gramicidinB, tyrocidin, bactracin, subtilin, streptothricin, aureomicin
<EMI ID = 2.1>
because of their effectiveness against pathogenic organisms. Others are only of reduced utility because of their toxicity, for example.
Penicillin is an important member of the class of antibiotics which are primarily effective against Gram-positive organisms. However, penicillin has several weak points. 0-'Thus it exerts toxic effects on certain patients, that it is relatively inactive by the oral route, unstable in the presence of water, inactivated by penicillinase, and that it tends to lose its effectiveness by development.
of strains of organisms resistant to the drug. The object of the present invention is to provide a novel antibiotic potent in particular against Gram-positive infectious organisms, and suitable for therapeutic applications. Another object of the invention is to provide methods of preparing this antibiotic substance in a commercially acceptable form.
According to the present invention, we have discovered a process for the production of Amphomycin in which a Streptomyces strain BL-456786 is cultured in an aqueous nutrient medium containing a carbohydrate solution under aerobic submerged conditions until. appreciable antibacterial activity is imparted to these solutions, then the Amphomycin thus obtained is separated from the fermentation broth.
In the context of the invention and according to one of its embodiments, various operations of the above method have been discovered, namely
<EMI ID = 3.1>
extracting the antibiotic in an organic solvent immiscible with water under strongly acidic conditions, precipitating Amphomycin from the aqueous solution by adjusting the pH to a value between 3.0 and 4.0, removal of impurities from the strongly acidic aqueous solution of Ampho-
<EMI ID = 4.1>
amyl acetate, the extraction of Amphomycin from a strongly acidic solution in butanol by means of water having a pH greater than 4, the extraction of Amphomycin from a solution of an organic solvent immiscible with water in water whose pH is greater than 6s0, precipitation of Amphomycin in solution by formation of insoluble derivatives of the basic function, and precipitation of Amphomycin in solution by formation of insoluble derivatives of the function acid.
It has also been discovered according to the invention substances ca
<EMI ID = 5.1>
StaphoAuréus, and Bosubtilis selected from the group consisting of amphoteric substances capable of forming salts with acids and metals, which are soluble in water, exhibit minimum solubility in water
<EMI ID = 6.1>
both in the acid form and in the salt form, are soluble in higher alcohols only in the acid form, can be extracted from water at pH 2 by butanol and pentanol, cannot be extracted therefrom at pH 2 by methyl isobutyl ketone, benzene, ether, ethyl acetate and amyl acetate, provide solid derivatives, exhibiting antibacterial activity, ammonium hydroxide and salt of Reinecke, absorb ultraviolet light only in the region of 210
<EMI ID = 7.1>
Sakaguchi, Molisch and Ehrlich-Pauly ,, and which are stable for at least
10 days in aqueous solution from pH 2 to pH 10, and the acid and metal salts of these substances.
The novel antibiotic of the invention is formed during the cultivation under controlled conditions of a variety of microorganisms which have not yet been described and which have been tentatively called Strep-.
<EMI ID = 8.1>
The organism BL-456o786 spo nova which produces the new antibiotic material belongs to the genus generally called streptomyceso A mycelium is formed with branched hyphae o Young hyphae are Grampositive (older hyphae are variable). Conidia are formed
<EMI ID = 9.1>
nothings and inhibited
It will be understood that the production of Amphomyeine is not limited to this particular organism or to organisms fully corresponding to the description above, given by way of example only. On the contrary, the invention comprises the use of mutant organisms obtained from the organism described by mutation agents, such as x-rays, ultra-violet rays, nitrogen "mustards", etc. ,
L9Amphomycin has, like the penicil, a low toxicity and a powerful activity against bacteria, in particular bacteria
<EMI ID = 10.1>
on penicillin special advantages because it is not inactivated by penicillinase and works in some cases of infection
due to strains resistant to penicillin, in cases where penicillin is ineffective and when patients are particularly sensitive to penicillin o Amphomycin shows remarkable resistance to degradation by heat or water o
<EMI ID = 11.1>
effective against Gram-positive bacteria, including Stephy � ococcus aureus, Bacillus aureus., Bacillus subtilis, Bacillus myco � des and Micrococcus tetragenouso The table below shows the antibiotic activity of two of the
<EMI ID = 12.1>
(5 mg per cm of solids)
<EMI ID = 13.1>
<EMI ID = 14.1> then an 8 mm by 40 mm trench is dug in the agar using a sterile spatula. The bottom of the trench is closed using one or two drops of molten agar. A 24 hour old nutrient culture broth strip containing each of the bacteria tested is then drawn.
<EMI ID = 15.1>
from the edge of the trench to the wall of the Petri vessel. The trench is then filled with a 5 milligram aqueous antibiotic solution.
<EMI ID = 16.1>
then kills a linear measurement of the inhibition zone from the edge of
the trench to the point where there is a development of the organism under test
The lacquer diffusion test method used to determine the activity of Amphomycino is shown below.
Culture centre
Agard for the Streptomycin test (containing yeast extract) is supplied by the firm "Baltimore Biological Laboratories" Bal-
<EMI ID = 17.1>
stand the suspension for 5 minutes, mix until a uniform suspension is obtained and heat slowly while stirring. The suspension is left to boil for 1 or 2 minutes or until a solution forms. The culture medium is then placed in a container and sterilized at 121 [deg.] G
(15 pounds / square inch of steam pressure for 15 minutes).
Inoculum
<EMI ID = 18.1>
with molten agar (heated to 53 [deg.] C) so as to obtain a fi
<EMI ID = 19.1>
steriles placed level and allowed to solidify o 4 cm3 of inoculated agar is then evenly distributed over the surface of the base layer o Stainless steel test plates are placed on the medium after cooling.
<EMI ID = 20.1>
Tampono
Phosphate buffer pH 8.0 is used to perform the
<EMI ID = 21.1>
or the other molar phosphate solution. Changes in pH or in concentration significantly affect the size of the inhibition zones.
<EMI ID = 22.1>
mothers are preserved with chloroform and toluene and new working solutions are prepared daily.
Test
If necessary, unknown samples are diluted in the solution.
<EMI ID = 23.1> of activity in vitro against a strain of the pathogenic mold Tricho-
<EMI ID = 24.1>
On the surface an aqueous suspension of spores of To mentasrophytes obtained from culture on agar, steel cylinders are placed on this surface and the plates are incubated at 30 [deg.] C for 24 hours. An aqueous solution is placed.
<EMI ID = 25.1>
The degree of inhibition around each cylinder is then measured by taking the average of at least 3 zones. The following results are obtained:
<EMI ID = 26.1>
The invention comprises a method for developing a new species of microorganisms which have not yet been the subject of a description,
<EMI ID = 27.1>
tion and aeration on a medium formed by a carbon source, a nitrogen source, a source of substances promoting development, mineral salts such as sodium chloride, potassium phosphate, magnesium sulfate , sodium nitrate and optionally a buffering agent such as calcium carbonate
As a source of carbon in the nutrient medium, it is possible to use:
<EMI ID = 28.1>
These carbon sources can be introduced into the medium in purified form or in the form of concentrated products. The amount of these carbon sources in the medium can vary considerably, from 1 1/2% to 5% by weight of the total weight of the product. fermentation medium ensuring the best conditions for the production of antibiotics
Nitrogen sources, including some sources of growth promoting substances include a wide variety of substances for the fermentation process, for example:
Amino acids
Casein, hydrolyzed or not hydrolyzed
Fishmeal
Soy flour
Meat extracts
Liver extracts
Urea
Nitrates
Ammonium compounds
Grain distillation wort
Corn maceration liqueur
Wheat maceration liqueur
Whey or whey concentrates
Corn gluten hydrolyzed under acidic conditions
Wheat gluten hydrolyzed under acidic conditions
Peptone Abatis
Brewer's yeast
Cottonseed flour
Lactalbumin
Tryptone
There is no need to provide these protein ingredients at a high degree of purity: The less pure materials containing traces of development promoting factors and considerable amounts of mineral nutrients may be suitable o Obviously not possible, in view of the raw state
of most of these nitrogenous substances to set defined proportions for
<EMI ID = 29.1>
share of cases in the middle
The pH of the fermentation medium should be 7.0-7.2 at the start of fermentation o The preferred temperature for the fermentation process is 26-27 [deg.] C envo Maximum yield of the product is usually obtained in two to seven days following the Streptomyces cultivation method.
Once development is complete, the mycelium is separated from the broth which then contains the antibiotic Amphomycin, and Amphomycin is separated from the broth by extraction with organic solvents, by isoelectric point precipitation or by any other process. known in the parto
The new antibiotic or Amphomycin, obtained as described above has interesting and unique properties which distinguish it from all the known and previously described antibiotics.
<EMI ID = 30.1>
vitro and shows marked chemotherapeutic activity against experimental infections in mice. The results of tests and toxicity determinations are shown in the table below.
In vivoo test results
<EMI ID = 31.1>
<EMI ID = 32.1>
The infection is communicated immediately after the first day of the trial drug This is given in two doses equal to an interval of
18 hours approximately. The animals are observed for 4 days and the deaths of each group are expressed as a percentage of the total animals in the group o The percentage of deaths is transformed into probit values and these are plotted on a graph and compared to the logarithm of the dose in milligrams per kilog of mouse weight o The point of intersection of the probit line 5 and the best line constructed according to the experimental points corresponds to the concentration of the drug likely to protect the
<EMI ID = 33.1>
readily soluble in methanol either in the diacid form or in the salt form and in higher alcohols in the diacid form. It is extracted from water by butanol or amyl alcohol at pH 2 but not by methyl-iso-butyl ketone or amyle acetate o It can be extracted from the acid solution of butanol in water at a pH greater than 3 or 4.
Acid solutions of Amphomycin in butanol can be decolorized by means of carbon, and the acid form of the antibiotic can be precipitated by the addition of non-polar solvents such as ethyl acetate,
15 'ether, etc.
An aqueous solution (5-2%) of the acid Amphomycin in water gives a copious precipitation when the pH is brought to 3.4 - 3.5 by means of alkali This precipitate returns to solution when the pH is raised or lowered
Insoluble derivatives of the basic function have been obtained. Treatment of the sodium salt in water with Reinecke's salt does not give any precipitation but lowering the pH to 2-3 gives a good yield of active reineckate. The antibiotic is easily regenerated by dissolving the reineckate in acetone and adding ammonium hydroxide so
precipitating the active ammonium salt of Amphomycin. The reineckate has not been crystallized to date. An oily micrate was prepared in an analogous manner.
Amphomycin is stable in water, from aqueous solutions to
<EMI ID = 34.1>
room temperature for 10 days. Amphomycin, solid is stable at room temperature.
The purest lanyard prepared to date absorbs ultra light
<EMI ID = 35.1>
holds carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen o Current samples are white or cream non-crystalline powders o They give a positive reaction with biuret and the ninhydrin test is equal
<EMI ID = 36.1>
tography on paper shows the existence of several different materials reacting with ninhydrin in the hydrolysate
The properties of Amphomycin make it possible to distinguish it from other antibiotics obtained from actinomycetes. Among the antibiotics
<EMI ID = 37.1>
laid free of nitrogen exhibiting no basic properties o The free acid of these compounds is soluble in non-polar solvents (benzene ether, etc.) while Amphomycin is not o
Lithmocidin and rhodomycetin are pigments while high potency Amphomycin preparations are white powders.
Among the acid actinomycetic antibiotics containing
<EMI ID = 38.1> acidic pH, unlike Amphomycino
<EMI ID = 39.1>
In order to produce small quantities of Amphomycin, the fermentation is conducted in shaker flasks in communication with the air but protected from contamination by cotton swabs.
Streptomyces BL-456786 is grown on a suitable nutrient medium by the submerged culture method, with agitation and aeration of the culture mixture being effected by placing the vials in a reciprocating type shaker device which ensures stirring and spraying drops of slurry in an oxygen-containing atmosphere.
In a typical case, we introduce into 4 liter bottles
and 500 cc of a culture medium containing
<EMI ID = 40.1>
myces from a strain cultivated on agaro
The pH is 7.0 - 7.2 at the start of fermentation. The content of
<EMI ID = 41.1>
times per minute, with a movement of 1 - 1 1/4 inch amplitude.
After this incubation period the liquid presents the following activity expressed by the diameter in millimeters of the zone of inhibition
<EMI ID = 42.1>
EXAMPLE 2 - Preparation of the inoculum for pilot installation
For production of Amphomycin on a larger scale, a fermentation medium containing by weight
1% soy flour
1% cerelose
0.5% NaCl <EMI ID = 43.1>
of a cloudy aqueous suspension of Streptomyces spores BL-456786 from a strain cultivated on agaro
The contents of the bottle are then incubated at 26-28 [deg.] C for
72 to 96 ho in a reciprocating type shaker device. The broth containing Streptomyces BL-456786 is flushed from the inoculation flask into the fermentation tank, under perfectly aseptic conditions.
EXAMPLE 3 - Large Scale Production of Amphomycin.
<EMI ID = 44.1>
submerged or deep in the body. Fixed fermentation churns equipped with suitable agitation and aeration devices are suitable for this process.
<EMI ID = 45.1>
after sterilization, in a glass lined vertical steel fermentation tank with a capacity of 2000 gallons, equipped with a water circulation jacket for temperature control, an anchor shaped stainless steel stirrer and a perforated stainless steel sprinkler with two arms
The medium is sterilized by heating with pressurized steam and then cooled.
<EMI ID = 46.1>
48 ho old vegetative re developed in a fermentation apparatus
<EMI ID = 47.1>
The culture in the 20,000 gallon fermentation apparatus is incubated at 29 [deg.] C for 50 hours. During this incubation the agitator rotates at 90 rpm / min and sterile air is passed through the mixture at a rate of 100 cubic feet / min.
Analysis of part of the culture liquid at the end of the incubation period shows that the pH is equal to 7968 and the activity determined by the diffusion plate assay described above corresponds to
<EMI ID = 48.1>
and 4x a dilution to four times the initial volume
Solid Amphomycin is isolated from this broth according to the method described in Examples 5 and 60 EXAMPLE 4 - Isolation and Purification
<EMI ID = 49.1>
and cylinder, the reaction being measured in millimeters. The solutions are tested at various degrees of dilution and compared as follows;
30 liters of filtered broth are acidified to pH 1.95 using
<EMI ID = 50.1>
clear solution The clear filtrate is stirred with 15 liters of n-butanol for 15 minutes then the two phases are separated. The process is repeated with a further 48 liters of broth, the two butanol extracts (40 liters) are combined and washed with 10 liters.
<EMI ID = 51.1>
second aqueous extract of butanol provides, after similar treatment, 6.6 grams more of brown powder. The test results are as follows:
<EMI ID = 52.1>
EXAMPLE 5 - Isolation
In another operation, 775 gallons of broth are brought in.
<EMI ID = 53.1>
The butanol extract is separated and washed with 40 gallons of water at pH 2, then extracted successively with 40 and 20 gallons of water, the mixture being brought in each case to pH 7.3 - 7.4 by means of 'sodium hydroxide. The aqueous extracts are combined and subjected to a second extraction with acid butanol and alkaline water, finally providing a rich aqueous extract, with a volume of 12.1
<EMI ID = 54.1>
EXAMPLE 6 - Carbon clearing and solvent precipitation of the crude material.
<EMI ID = 55.1>
as in Example 5, in 500 cc of water brought to pH 2 by means of phosphoric acid and extraction is carried out with 300 cc of n-butanol so as to obtain a dark brown extract. The separated layer of butanol is filtered through diatoms in order to remove the traces of undissolved water and stirred with 20 grs. of activated carbon (Darco KB) for 30 minutes The carbon is separated by filtration and the light yellow solution of butanol concentrated in vacuo so as to obtain a volume of 100 cc. This concentrated product is added to 2,000 cc of ethyl acetate and a copious precipitate of Amphomycin is thus obtained which is separated.
<EMI ID = 56.1>
solid cream res. The tests give the following results:
<EMI ID = 57.1>
EXAMPLE 7 - Isoelectric precipitation
A sample of 10 grams of Amphomycin prepared by extraction with butanol and purification by carbon treatment and precipitation in ethyl acetate described above, is dissolved in 100 cc of water.
<EMI ID = 58.1>
yen of sodium hydroxide and solubilized so as to obtain 4.55 grs. of solids (A). The precipitate is dissolved in water, brought to pH 6.8 and
<EMI ID = 59.1>
<EMI ID = 60.1>
EXAMPLE 8 - Purification by Reinecke's salt
<EMI ID = 61.1>
necke dissolved in 200 cc of water at pH 1.9 and this solution is added to the Amphomycin solution o The precipitate obtained is separated by filtration after staying overnight in the refrigerator o The precipitate is redissolved in
<EMI ID = 62.1>
reprecipitated material is separated by filtration, washed with water, dissolved in
150 cc of acetone and filtered. By adding one liter of acetone and hydroxy-
<EMI ID = 63.1>
The plate diffusion tests give the following results;
<EMI ID = 64.1>
<EMI ID = 65.1>
A sample n [deg.] 28 of the product is prepared as described.
in example 8 above
CLAIMS
lo Process for the production of Amphomycin characterized in that
Cultures a strain of Streptomyces BL-456786 in an aqueous carbohydrate solution containing nutrients under submerged aerobic conditions until this solution shows appreciable antibacterial activity, then the produced Amphomycin is separated from the fermentation broth.
2o Amphomycin production process characterized in that
cultivates a strain of Streptomyces BL-456786 in an aqueous carbohydrate solution containing nutrients under aerobic conditions.
<EMI ID = 66.1>
envo until this solution exhibits appreciable antibacterial activity, then the Amphomycin obtained is separated from the fermentation broth.
<EMI ID = 67.1>