ANTIBIOTIQUE ET PROCEDE POUR SA PRODUCTIONo
La présente invention se rapporte à un antibiotique nouveau et utile, l'Amphomycine, et à sa productiono Elle se rapporte plus particulièrement aux procédés pour sa production et sa fermentation, aux procédés d'extraction et de concentration à partir de solutions brutes comprenant les bouillons de fermentation, à sa purification et à la production de sels de ses formes acides et basiques. L9invention s'étend à l'antibiotique et à ses sels en solutions diluées, sous forme de produits concentrés bruts, et sous forme solide plus pureo
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la présente description soit à une substance séparée soit à un groupe de substances parentes, dont le rapport mutuel est défini par leur comportement et leur formation analogues pendant les opérations d'isolement et de purification décrites ci-dessous.
Au cours des dernières années, un certain nombre de produits métaboliques de la croissance des bactéries et des moisissures ont été isolés
et des propriétés thérapeutiques de valeur leur ont été reconnues. On peutmentionner parmi ces produits la pénicilline, la streptomycine, la gramicidinB, la tyrocidine, la bactracine, la subtiline, la streptothricine, l'auréomicine
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à cause de leur efficacité contre les organismes pathogènes. D'autres ne présentent qu'une utilité réduite à cause de leur toxicité, par exemple.
La pénicilinne est un élément important de la classe formée par les antibiotiques principalement efficaces contre les organismes Gram-positifs. Cependant la pénicilline présente plusieurs points faibles. 0-'est ainsi qu'elle exerce des effets toxiques sur certains patients, qu'elle est relativement inactive par voie buccale, instable en présence d9eau, inactivée par la pénicillinase, et qu'elle tend à perdre son efficacité par développement
de souches d'organismes résistant au médicamento La présente invention a pour but de fournir un nouvel antibiotique puissante en particulier contre les organismes infectieux Gram-positifs, et convenant pour les applications thérapeutiques. Un autre but de l'invention consiste à fournir des procédés de préparation de cette substance antibiotique sous une forme commercialement acceptable.
Suivant la présente invention, on a découvert un procédé de production d'Amphomycine dans lequel on cultive une souche de Streptomyces BL-456786 dans un milieu nutritif aqueux contenant une solution d'hydrate de carbone dans des conditions aérobiques submergées jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne appréciable soit.communiquée à ces solutions, puis on sépare l'Amphomycine ainsi obtenue du bouillon de fermentation.
Dans le cadre de l'invention et suivant une de ses formes de réalisation, on a découvert diverses opérations du procédé ci-dessus, à savoir
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l'extraction de l'antibiotique dans un solvant organique non miscible à l'eau dans des conditions fortement acides, la précipitation de l'Amphomycine de la solution aqueuse par réglage du pH à une valeur comprise entre 3,0 et 4,0, l'élimination des impuretés de la solution aqueuse fortement acide de l'Ampho-
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d9acétate d'amyle, l'extraction de l'Amphomycine d'une solution fortement acide dans le butanol au moyen d'eau ayant un pH supérieur à 4, l'extraction de l'Amphomycine d'une solution en solvant organique non miscible à l'eau dans l'eau dont le pH est supérieur à 6s0, la précipitation de l'Amphomycine en solution par formation de dérivés insolubles de la fonction basique, et la précipitation de l'Amphomycine en solution par formation de dérivés insolubles de la fonction acide.
On a également découvert suivant l'invention des substances ca-
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StaphoAuréus, et Bosubtilis choisies dans le groupe formé par les matières amphotères susceptibles de former des sels avec les acides et les métaux, qui sont solubles dans l'eau, présentent une solubilité minimum dans l'eau
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aussi bien sous la forme acide que sous la forme de sel, sont solubles dans les alcools supérieurs uniquement sous la forme acide, peuvent être extraites de l'eau au pH 2 par le butanol et le pentanol, ne peuvent pas en être extraites au pH 2 par la méthyl-isobutyl-cétone, le benzène, l'éther, l'acétate d'éthyle et l'acétate d'amyle, fournissent des dérivés solides, présentant une activité antibactérienne, d'hydroxyde d'ammonium et de sel de Reinecke, absorbent la lumière ultra-violette uniquement dans la région de 210
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Sakaguchi, Molisch et Ehrlich-Pauly,, et qui sont stables pendant au moins
10 jours en solution aqueuse du pH 2 au pH 10, et les sels d'acides et de métaux de ces substances.
Le nouvel antibiotique de l'invention se forme pendant la culture sous condition contrôlée d'une variété de micro-organismes qui n'a pas encore fait l'objet d9une description et qu'on a appelés provisoirement Strep-
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L'organisme BL-456o786 spo nova qui produit la nouvelle matière antibiotique appartient au genre généralement appelé streptomyceso Il se forme un mycélium présentant des hyphes ramifiéso Les hyphes jeunes sont Grampositifs (les hyphes plus vieux sont variables). Les conidies sont formées
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riens et inhibéeo
On comprendra que la production d'Amphomyeine n'est pas limitée à cet organisme particulier ou à des organismes correspondant entièrement à la description ci-dessus, donnée uniquement à titre d'exemple. L'invention comprend au contraire l'emploi d'organismes mutants obtenus à partir de l'organisme décrit par des agents de mutation;, tels que les rayons X, les rayons ultra-violets les "moutardes" d'azote^, etc.,
L9Amphomycine possède comme la pénicille une faible toxicité et une puissante activité contre les bactéries, en particulier les bactéries
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sur la pénicilline des avantages particuliers parce qu'elle n'est pas inactivée par la pénicillinase et qu'elle agit dans certains cas d'infection
due à des souches résistantes à la pénicilline, dans des cas où la pénicilline est inefficace et lorsque les patients présentent une sensibilité particulière à la pénicillineo L'Amphomycine présente une résistance remarquable à la dégradation par la chaleur ou l'eauo
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ficace contre les bactéries Gram-positives, notamment Stephy�ococcus aureus, Bacillus aureus., Bacillus subtilis, Bacillus myco�des et Micrococcus tetragenouso Le tableau ci-dessous montre l'activité antibiotique de deux des
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(5 mg par cm de matières solides)
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<EMI ID=14.1> puis on creuse une tranchée de 8 mm sur 40 mm dans l'agar à l'aide d'une spatule stérileo Le fond de la tranchée est fermé au moyen d'une ou deux gouttes d'agar fondu. On trace ensuite une bande de bouillon de culture nutritif vieux de 24 heures contenant chacune des bactéries soumises à l'es-
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allant du bord de la tranchée jusqu'à la paroi du vase de Pétri. La tranchée est ensuite remplie d'une solution aqueuse d'antibiotique à 5 milligram-
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tue ensuite une mesure linéaire de la zone d'inhibition à partir du bord de
la tranchée jusqu'au point où on relève un développement de l'organisme sou- mis à l'essaie
On trouvera ci-dessous la méthode d'essai de diffusion sur p laque utilisée pour déterminer l'activité de l'Amphomycineo
Milieu de culture
L'agard pour l'essai de la Streptomycine (contenant de l'extrait de levure) est fourni par la firme "Baltimore Biological Laboratories" Bal-
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se reposer la suspension pendant 5 minutes, on la mélange jusqu'à obtenir me suspension uniforme et on chauffe lentement tout en agitant. On laisse bouillir la suspension pendant 1 ou 2 minutes ou jusqu'à formation d'une solutions Le milieu de culture est ensuite placé dans un récipient et stérilisé à 121[deg.]G
(15 livres/pouce carré de pression de vapeur pendant 15 minutes).
Inoculum
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tée à l�agar fondu (chauffé à 53[deg.]C) de façon à obtenir une concentration fi-
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tri stériles placés de niveau et on laisse solidifiero On répartit alors uniformément 4 cm3 d�agar inoculé sur la surface de la couche de baseo Des pla- ques d'essai en acier inoxydable sont placées sur le milieu après refroidis-
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Tampono
On utilise un tampon au phosphate au pH 8,0 pour effectuer les
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ou de l'autre solution de phosphate molaire. Les variations du pH ou de la concentration affectent notablement les dimensions des zones d'inhibition.
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mères sont conservées à l'aide de chloroforme et de toluène et de nouvelles solutions de travail sont préparées journellement.
Essai
On dilue si nécessaire des échantillons inconnus dans la solu-
<EMI ID=23.1> d'activité in vitro à l'égard d'une souche de la moisissure pathogène Tricho-
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le à la surface une suspension aqueuse de spores de To mentasrophytes provenant d'une culture sur agar, on place sur cette surface des cylindres d'acier et on incube les plaques à 30[deg.]C pendant 24 ho On place une solution aqueuse
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tre d9inhibition autour de chaque cylindre est ensuite mesuré en prenant la moyenne de 3 zones au moins. On obtient les résultats suivants :
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L'invention comprend un procédé de développement d'une nouvelle espèce de microorganismes n'ayant pas encore fait l'objet d'une description,
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tion et d'aération sur un milieu formé d'une source de carbone, d'une source d'azote, d9une source de substances favorisant le développement, de sels minéraux comme le chlorure de sodium, le phosphate de potassium, le sulfate de magnésium, le nitrate de sodium et éventuellement un agent tampon comme le carbonate de calciumo
Comme source de carbone dans le milieu nutritif on peut utiliser:
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Ces sources de carbone peuvent être introduites dans le milieu sous forme purifiée ou sous forme de produits concentrés.. La quantité de ces sources de carbone dans le milieu peut varier considérablement, de 1 1/2 % à 5 % en poids du poids total du milieu de f ermentation assurant les meilleures conditions de production de l1 antibiotiques
Les sources d'azote, comprenant certaines sources de substances favorisant le développement comprennent pour le processus de fermentation des substances très diverses, par exemple :
Amino-acides
Caséine, hydrolysée ou non hydrolysée
Farine de poisson
Farine de soya
Extraits de viande
Extraits de foie
Urée
Nitrates
Composés d'ammonium
Moût de distillation de grain
Liqueur de macération de mais
Liqueur de macération de froment
Petit lait ou concentrés de petit lait
Gluten de mais hydrolyse en conditions acides
Gluten de froment hydrolysé en conditions acides
Peptone Abatis
Levure de brasserie
Farine de graine de coton
Lactalbumine
Tryptone
Il est inutile de fournir ces ingrédients protéiques à un haut degré de pureté: Les matières les moins pures contenant des traces de facteurs favorisant le développement et des quantités considérables d'agents nutritifs minéraux peuvent conveniro II n'est évidemment pas possible, vu l'état brut
de la plupart de ces matières azotées de fixer des p roportions définies pour
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part des cas au milieuo
Le pH du milieu de fermentation doit être égal à 7,0-7,2 au début de la fermentationo La température préférée pour le processus de fermentation est 26-27[deg.]C envo On obtient généralement un rendement maximum du produit en deux à sept jours suivant le procédé de culture de Streptomyces.
Une fois le développement achevé, le mycélium est séparé du bouillon qui contient alors l'antibiotique Amphomycine, et l'Amphomycine est séparée du bouillon par extraction à l'aide de solvants organiques, par précipitation au point iso-électrique ou par tout autre procédé connu dans la partieo
Le nouvel antibiotique ou l'Amphomycine, obtenu comme décrit cidessus possède des propriétés intéressantes et uniques qui le distinguent de tous les antibiotiques connus et antérieurement décrits.
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vitro et manifeste une activité chimiothérapeutique marquée contre les infections expérimentales chez les souriso Les résultats des essais et des déterminations de toxicité sont repris dans le tableau ci-dessous.
Résultats des essais in vivoo
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L9infection est communiquée aussitôt après la première du.,$ du médicament sous essaio Celui-ci est administré en deux doses égales à un intervalle de
18 heures environ. Les animaux sont observés pendant 4 jours et les morts de chaque groupe sont exprimés sous forme de pourcentage du total des animaux du groupeo Le pourcentage de morts est transformé en valeurs de probit et cellesci sont reportées sur un graphique et comparées au logarithme de la dose en milligrammes par kilog de poids de souriso Le point d'intersection de la ligne de probit 5 et de la meillezure ligne construite diaprés les points expérimentaux correspond à la concentration du médicament susceptible de protéger la
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facilement soluble dans le méthanol soit sous la forme diacide soit sous la forme de sel et dans les alcools supérieurs sous la forme diacide. Elle est extraite de l'eau par le butanol ou l'alcool amylique au pH 2 mais non par la méthyl-iso-butylcétone ou l'acétate d'amyleo Elle peut être extraite de la solution acide de butanol dans l'eau à un pH supérieur à 3 ou 4.
Les solutions acides d'Amphomycine dans le butanol peuvent être décolorées au moyen de carbone, et la forme acide de l'antibiotique peut être précipitée par addition de solvants non polaires comme l'acétate d'éthyle,
15'éther, etc..
Une solution aqueuse (5-2�) de l'Amphomycine acide dans l'eau donne une précipitation copieuse lorsqu'on amène le pH à 3,4 - 3,5 au moyen d'alcalio Ce précipité repasse en solution lorsque le pH est relevé ou abaissée
Des dérivés insolubles de la fonction basique ont été obtenus. Le traitement du sel de sodium dans l'eau avec le sel de Reinecke ne donne pas de précipitation mais l'abaissement du pH à 2-3 donne un bon rendement de reineckate actif. L'antibiotique est facilement régénéré en dissolvant le reineckate dans l'acétone et en ajoutant de l'hydroxyde d'ammonium de façon
à précipiter le sel d'ammonium actif d'Amphomycine. Le reineckate n'a pas été cristallisé à ce jour. Un micrate huileux à été préparé d'une manière analogueo
L'Amphomycine est stable dans l'eau, des solutions aqueuses au
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ture ambiante pendant 10 jours. L'amphomycine solide est stable à la température ordinaireo
Lanatière la plus pure préparée à ce jour absorbe la lumière ultra-
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tient du carbone, de 1-'hydrogène, de l'oxygène et de l'azoteo Les échantillons actuels sont des poudres non cristallines blanche ou crèmeo Ils donnent lieu à une réaction positive avec le biuret et l'essai à la ninhydrine est égale-
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tographie sur papier met en évidence l'existence de plusieurs matières différentes réagissant avec la ninhydrine dans l'hydrolysato
Les propriétés de l'Amphomycine permettent de la distinguer d'au- - très antibiotiques obtenus à partir d'actinomycètes. Parmi les antibiotiques
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posés exempts d'azote ne présentant pas de propriétés basiqueso L'acide libre de ces composés est soluble dans les solvants non polaires (éther benzène, etc..) tandis que l'Amphomycine ne l'est paso
La lithmocidine et la rhodomycétine sont des pigments tandis que les préparations d'Amphomycine de grande puissance sont des poudres blanches.
Parmi les antibiotiques actinomycétiques acides contenant de
<EMI ID=38.1> pH acide, au contraire de l'Amphomycineo
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Pour produire de faibles quantités d'Amphomycine on dirige la fermentation dans des flacons agitateurs en communication avec l'air mais protégés de la contamination par des tampons de coton.
Le Streptomyces BL-456786 est cultivé sur un milieu nutritif approprié par le procédé de culture submergée, l'agitation et l'aération du mélange de culture étant effectuées en plaçant les flacons dans un dispositif secoueur du type à va-et-vient qui assure l'agitation et la projection de gouttes de bouillie dans une atmosphère contenant de l'oxygène.
Dans un cas typique on introduit dans des flacons de 4 litres
et on stérilise 500 ce d'un milieu de culture contenant
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myces provenant d9une souche cultivée sur agaro
Le pH est 7,0 - 7,2 au début de la fermentation. Le contenu du
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fois par minute, d'un mouvement d'une amplitude de 1 - 1 1/4 pouce.
Après cette période d'incubation le liquide présente l'activité suivante exprimée par le diamètre en millimètres de la zone d'inhibition
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EXEMPLE 2 - Préparation de l'inoculum pour installation pilote
Pour une production d'Amphomycine à plus grande échelle on prépare un milieu de fermentation contenant en poids
1 % de farine de soya
1 % de cerelose
0,5 % de NaCl <EMI ID=43.1>
d'une suspension aqueuse trouble de spores de Streptomyces BL-456786 provenant d'une souche cultivée sur agaro
Le contenu de la bouteille est ensuite incubé à 26-28[deg.]C pendant
72 à 96 ho dans un dispositif secoueur du type à va-et-vient. Le bouillon contenant Streptomyces BL-456786 est chassé du flacon d'inoculation dans le réservoir de fermentation, dans des conditions parfaitement aseptiques.
EXEMPLE 3 - Production d'Amphomycine à grande échelle.
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submergée ou profonde de 1-'organisme. Des barattes fixes de fermentation équipées de dispositifs d'agitation et d'aération appropriés conviennent pour ce procédéo
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après la stérilisation, dans une cuve de fermentation verticale en acier doublé de verre d'une contenance de 2o000 gallons, équipée d'une chemise de circulation d'eau pour le contrôle de la température, d'un agitateur en acier inoxydable en forme d9ancre et d'un arroseur en acier inoxydable perforé à deux braso
Le milieu est stérilisé par chauffage avec de la vapeur sous pression puis refroidi.
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re végétative vieille de 48 ho développée dans un appareil de fermentation
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La culture dans l'appareil de f ermentation de 20000 gallons est soumise à l'incubation à 29[deg.]C pendant 50 heures. Pendant cette incubation l'agitateur tourne à 90 tours/mine et on fait passer de l'air stérile dans le mélange à raison de 100 pieds cubes/mino
L'analyse d'une partie du liquide de culture à la fin de la période d'incubation montre que le pH est égal à 7968 et l'activité déterminée par l'essai de diffusion sur plaque décrit plus haut correspond à
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et 4x une dilution à quatre fois le volume initiale
On isole l'Amphomycine solide à partir de ce bouillon suivant le procédé décrit dans les exemples 5 et 60' EXEMPLE 4 - Isolement et purification
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et du cylindre, la réaction étant mesurée en millimètres Les solutions sont essayées à divers degrés de dilution et comparées de la façon suivante;
On acidifie 30 litres de bouillon filtré au pH 1,95 au moyen de
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solution claireo Le filtrat clair est agité avec 15 litres de n-butanol pendant 15 minutes puis on sépare les deux phases en présence. On reprend le procédé avec une nouvelle quantité de 48 litres de bouillon, on combine les deux extraits par le butanol (40 litres) et on lave au moyen de 10 litres
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second extrait aqueux du butanol fournit après traitement analogue 6,6 grs de plus de poudre brune. Les résultats des essais s'établissent comme suit:
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EXEMPLE 5 - Isolement
Au cours d'une autre opération, on amène 775 gallons de bouil-
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L'extrait de butanol est séparé et lavé par 40 gallons d'eau au pH 2, puis extrait successivement par 40 et 20 gallons d'eau, le mélange étant amené dans chaque cas au pH 7,3 - 7,4 au moyen d'hydroxyde de sodium. Les extraits aqueux sont combinés et soumis à une seconde extraction par butanol acide et eau alcaline, fournissant finalement un extrait aqueux riche, d'un volume de 12,1
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EXEMPLE 6 - Clairification au carbone et précipitation en solvant de la matière brute.
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comme dans l'exemple 5, dans 500 ce d'eau amenée au pH 2 au moyen d'acide phosphorique et on extrait par 300 ce de n-butanol de façon à obtenir un extrait brun foncé. La couche de butanol séparée est filtrée sur diatomées afin d'éliminer les traces d'eau non dissoute et agitée avec 20 grs. de charbon activé (Darco KB) pendant 30 minutes Le carbone est séparé par filtration et la solution jaune clair de butanol concentrée dans le vide de façon à obtenir un volume de 100 ce. Ce produit concentré est ajouté à 2.000 ce d'acétate d'éthyle et on obtient ainsi un précipité copieux d'Amphomycine qu'on sé-
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res solides de couleur crème. Les essais donnent les résultats suivants:
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EXEMPLE 7 - Précipitation iso-électrique
On dissout dans 100 ce d'eau un échantillon de 10 grso d'Amphomycine préparée par extraction par le butanol et purification par le traitement au carbone et la précipitation dans l'acétate d'éthyle décrits ci-dessus, de
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yen d'hydroxyde de sodium et solubilisée de façon à obtenir 4,55 grs. de matières solides (A). Le précipité est dissous dans l'eau, amené au pH 6,8 et
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EXEMPLE 8 - Purification par le sel de Reinecke
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necke dissous dans 200 ce d�eau au pH 1,9 et on ajoute cette solution à la solution d'Amphomycineo Le précipité obtenu est séparé par filtration après un séjour d'une nuit dans le réfrigérateuro Le précipité est redissous dans
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matière reprécipitée est séparée par filtration, lavée à l'eau, dissoute dans
150 ce d'acétone et filtrée. Par addition d'un litre d'acétone et d'hydroxy-
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Les essais de diffusion sur plaque donnent les résultats suivants;
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On prépare un échantillon n[deg.] 28 du produit de la façon décrite
dans l'exemple 8 ci-dessus
REVENDICATIONS
lo Procédé de production d'Amphomycine caractérisé en ce qu'on
cultive une souche de Streptomyces BL-456786 dans une solution aqueuse d'hydrate de carbone contenant des éléments nutritifs dans des conditions aérobiques submergées jusqu'à ce que cette solution présente une activité antibactérienne appréciable, puis on sépare l'Amphomycine produite du bouillon de fermentationo
2o Procédé de production d'Amphomycine caractérisé en ce qu'on
cultive une souche de Streptomyces BL-456786 dans une solution aqueuse d'hydrate de carbone contenant des éléments nutritifs dans des conditions aérobi-
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envo jusqu'à ce que cette solution présente une activité antibactérienne appréciables puis on sépare l'Amphomycine obtenue du bouillon de fermentation.
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