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La présente invention se rapporte à la production de tétracycline
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par fermentation et concerne plus spécialement la production ae tétracycline par fermentv': 'ln submergée aérobie d'une espèce ae Streptomyces proàuisant de la çh.orét;r.cyal3rfè en présence d'un agent d'inhibition de la chloration ae fermentu..¯..4
Au cours ae ces dernières années, on a isolé un certain nombre de produits au métabolisme au développement de bactéries et ae champignons
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microscopiques (fungus) et on -1, ' -- "TIr>' ""pO' propriétés thérapeutiques utiles. La chlorotétracYc1ineJlloéXrYQlinabétla0tètracyc1ine sent particulièrement utiles par leur large spectre d'activité.
De ces troiu composée la téhracyè1..:1ne est surtout utile parce qu'elle donne de meilleurs niveaux sanguins eu i.,uins de réactions seconaaires, et est plus stable dans les milieux alcalins.
Le procédé préféré ae production de tte.ts'accÏ.l&eE! est par fermenta- tion aérobie submergée, mais l'isolation et la purification au produit sont renaues difficiles et coûteuses dans ce procédé par le production simultanée
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par l'organisme ae chloro-têtr ycline en plus ae la tttracYel!ne ,En fait le premier ae ces deux composes prédomine souvent,
Le but de l'invention est de procurer un procédé perfectionné pour
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la production de târacyclîne par f ermentation.
Un autre but de l'invention est de procurer une fermentation dans laquelle le rendement en ttray2in est augmenté au 'dépens ae celui ue la hlortétracY911ne normalement produite.
Un autre but ae l'invention est de procurer un procédé de fermentation d'organismes produisant de la chlorotétracypline en présence d'agents d'inhibition ae la chloration de fermentation pour obtenir des bouillons contenant de la ra.cytr1itJ.e et pratiqïuement pas de chlorotétracyne .
On a découvert, suivant la présente invention un procédé de production de t.éiJ#ay.g11:# dans lequel on cultive une culture d'une espèce d'organismes produisant de la chlorotétrac1.1ne dç4,présence d'un agent d'inhibition de la chloration de fermentation jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne appréciable soit communiquée à la solution.
Un aspect de la présente invention comprend un procédé de pro-
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duction de té;racycl1ne' dans lequel on cultive dans des conditions aérobies une culture d'une espèce de streptonuc8S produisant de la ohlorotétraoya1.1J# dans une solution aqueuse d'hydrate de carbone contenant un élément nutritif azoté dans des conditions aérobies submergées., en présence d'un agent d'inhibition de la chloration de fermentation jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne appréciable soit communiquée à cette solution.
Un des aspects les plus limités de la présente invention comprend
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un procédé de production de acyo/U# suivant lequel on cultive dans des conditions aérobies une culture d'une espèce de Streptomyces produisant de la chlorotétracycline dans une solution aqueuse d'hydrate de carbone contenant un élément nutritif azoté dans des conditions aérobies submergées en présence de quantités supplémentaires d'un membre du groupe formé par les ions
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bromure, iocl-are et thiocyanate, jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne appréciable soit communiquée à cette solution.
Une autre forme plus spécifique encore de - la présente invention
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comprend un procédé de préparation de tétracycline dans lequel on cultive dans des conditions aérobies une culture d'une espèce de streptonuces pro- duisant de la chlorotétracycline dans une solution aqueuse d'hydrate de carbone, contenant un élément nutritif azoté dans des conditions aérobies submer-
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gées en présence de 0 01 â 5,0% en poids du milieu d'un bromure jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne appréciable soit communiquée à cette solu- tion.
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La tétracycline est préparée par culture dans des conditions réglées particulières, de nombreuses espèces et Streptomyces et notamment de S. aureofaciens (NRRL 2209) et d'une espèce de microorganisme non décrite jusqu'à présent que la Demanderesse a dénommée provisoirement Streptomyces BL 567201 et. qu'elle a isolée d'un échantillon de sol. La description de cet
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organis- eat donnée ci-après.
L'organisme BL 567201 sp.nov. qui produit la tétracycline appartient au genre généralement appelé Streptomyces. Le développement de cet
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organisme est bon sur le glycérol-asparagié-axtrait de boeu-agar à 30 0.
Sur'ce milieu, des hyphes aériennes gris souris-se forment et un pigment vert jaunâtre est sécrété dans l'agar. Le mycélium se compose d'hyhes ra-
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mifiées dont les éléments les plus jeunes sont Gras-positifs. Des ocnidies se forment sur les hyphes aériennes.
D'autres organismes produisant de la chlorotétracycline et de-,la tétracycline et utiles dans la présente invention sont les Streptomyces
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BL-456,-782.q 56?.l'l, 567.203, 56?.2?0, 567.714; 467.762, 678.033. 678.035, 678.036, 678.040, 678.046,. 678.079, 678.110, 678.379, 678.414, et 678.650.
Pour la production de la tétracycline,la Demanderesse ne désire pas se limiter à ces organismes particuliers ou à des organismes répondant entièrement à la descriptiosn ci-dessus,donnée uniquement à titre d'illustration.
Elle entend particulièrement, se réserver l'emploi dtorganismes qui sont des produits de mutation dérivés des organismes décrits par Inaction d'agents
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de mutation tels que les. rayons X, les rayons ultra-violstsTes gaz <n%otés, etc..
On trouvera ci-dessous la méthode d'essai de plaque de diffusion pour déterminer l'activité de la tétracycline.
Milieu de culture
L'agar d'essai pour streptomycine (avec extrait de levure) est fourni par les Baltimore Biological Laboratories, Baltimore, Maryland et utilisé comme indiqué sur 1-'étiquette. Une préparation appropriée peut être obtenue en mettant en suspension dans un litre d'eau distilliée à un pH final de 6,2,un mélange de 1,5 gramme d'extrait de boeuf, 3 grammes d'ex-
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trait de levure, 6p0 grammes de peptone ( par exemple Galysate) et 15 gram- mes d'agar. On laisse reposer la suspension pendant cinq minutes, on la mélange jusqu'à ce qu'on obtienne une suspension uniforme et on chauffe modérément en agitant. On fait bouillir la suspension pendant une ou deux minutes ou jusqu'à ce qu'elle se dissolve.
Le milieu de culture est alors introduit
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et stérilisé à 121eC (15 livres/pouce carré (1 kg/cm2 env.) de pression de vapeur , manomètre? pendant 15 minutes). Inoculum :
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L'organisme d'essai est le Bacillus subtilis A.T.C.C.6633. On ajoute une suspension de spores contenant 50.000.000 de spores viables par cm3 à l'agar d'essai fondu (refroidi à 53 C) pour obtenir un inoculum final de 2%.
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Pré#ratiàn des Plaques dn place 21 cm3 d'agar stérile pour essai dans dea vases de Pétri stériles remplis à ras et on laisse se solidifier. On répartit alors régulièrement 4 cm3 d'agar inoculé sur la surface de la couche de base. On place des plaques d'acier inoxydable percées d'une série de trous sur le milieu après que celui* ci se soit refroidi à la température ordinaire et on place les échantillons dans les trous.
Tampon :
On utilise un tampon au citrate au pH 6,2 pour préparer les dilutions. On le prépare en mélangeant 192,12 grammes d'acide citrique anhydre avec 106,3 grammes d'hydroxyde de sodium dans 1 litre d'eau distilliée et on di-
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lue le mélange à 1/10 de la concentration à l'eau distilliez. Le pH du tampon
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doit être vérifié potentiométriquement., et si nécessaire ramené au pH 6,2 par addition d'acide citrique ou d'hydroxyde de sodium. Les variations du pH ou de la concentration du tampon affectent fortement les grandeurs des
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zones d'inhibition. On n'a pas trouV1t-nc.esaire de stériliser le tampon. La solution mère est conservée par du chloroforme ou du toluène et de nouvelles solutions de travail sont préparées journellement.
Essai
Les échantillons inconnus sont dilués en cas de besoin dans le
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tampon au citrate au pH 6, 2. On utilise 3 trous de chaque plaque pour; recevoir une mené dilution de l'échantillon. Après incubation à 3200o on mesure les diamètres des zones et on fait la moyenne entre ces diamétres.
On a distingué le streptonvcète donnant la variété Bol 567201 d'une souche de S.auregLfagiens (NRRL 2209) obtenue du Northern 'Régional Research Laboratory Péoria, Illinois.. où elle était déposée comme souche authentique productrice d-auréomycine, en observant les caractéristiques de développe- ment sur un milieu glycérol-asparagine-extrait de boeuf-agar et agar CzapekDox contenant 1% de dextrine.
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Gvcérol-amara.g1ne4trait de boeuf-asar :
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<tb>
<tb> Glycérol <SEP> 1%
<tb>
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Aàparagine 0 05%
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<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 0,2%
<tb> K2HP04 <SEP> 0,05%
<tb> Agar <SEP> 1,5%
<tb>
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PH. 79 2 56201 Streptoeces aureofaciens Développement.- bon bon Sporulation; bonne bonne Pigment diffusible:
vert Jaunâtre pas Formation de spirales abondantes, peu pas enroulées Hyphes aériennes., gris souris gris rosé Envers.* brun khaki olive
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Dextrine Czapek-Dox
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NaNO3 02% K2HP04 0, l;
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<tb>
<tb> MgS04 <SEP> 0,05
<tb>
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xci 0,05:'
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<tb>
<tb> FeS04 <SEP> trace
<tb> Agar <SEP> 1,5%
<tb>
pH 7,2 BL 567201 Streptonyces aureofaciens Développement: assez bon à bon assez bon Sporulations bonne faible Pigment diffusible pas pas Formation de spirales.* abondante s, peu rares, très peu enroulées enroulées Hyphes aériennes: gris souris chamois à gris Envers :
brun clair chamois à brun rouge
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Le $treptoweète HL 567201 est encore caractérisé par la produetion d-lun pigmnt vert-bleuâtre intense en culture submergée dans un milieu contenant 1% de sucrose, 1% de farine de soya 1% de peptone de soya, 1,5% de KH2P04 e+ O5 de (NH4)2HP04 Le Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209) ne produit pas ce pigment.
La présente invention comprend un procédé de culture d'une espéce
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de Streptomyces produisant de la chlorotétracycline à 24-30,dut environ dans des conditions submergées d'agitation et d'aération sur des milieux contenant une source de carbone, une source d'azote, une source de substances de développement., des sels minéraux comme le sulfate de potassium, le sulfate de magnésium et le nitrate de sodium et si on le désire un agent tampon
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CQrw# Je arbona- de calcium, avec addition tau. milieu d'un agent d'inhibition métabolique de , la chloration de fermentation. Ces agents d'inhï1ition métabm.ies de chloration comprennent des ions bromures, iodure et thiocya- nate. On les ajoute au milieu sous la forme de leurs composés, par exemple sous celle de sels de métaux alcalins ou métaux alcalino-terreux.
L'agent d'inhibition préféré est l'ion bromure, on l'ajoute avantageusement sous forme de bromure de sodium, bromure de potassium, bromure de calcium, bromure d'ammonium ou acide bromhydrique. En termes de bromure de sodium, des
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quantités utiles varient entre 0901 et 5$10% en poids du milieu, environ O,l à 2$1 0 sont préférés.
On suppose sans que la chose soit certaine, que l'inhibition de la chloration de fermentation suivant l'invention peut être produite par interférence avec des processus enzymatiques 'Si- peut être par le processus généralement appelé 'inhibition compétive". Toutefois ,l'invention ne dépend pas de cette théorie et n'y est pas limitée.
Comme source de -:carbone dans le milieu nutritif, on peut utiliser un des composés suivants :
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Amidon ordinaire X,ylose Amidon soluble Arabinose Sucrose Rhamnose
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Glucose Pructose maltose Lactose
Dextrose Inuline
Glycérol Dextrine
Galactose Ces sources de carbone sont introduites dans le milieu à l'état purou sous la forme de produits coneentrés. La quantité de ces sources de carbone pour une préparation antibiotique optimum varie considérablement dans le milieu de 1/2 % à 5% en poids du poids total du milieu de fermentation.
Des sources d'azote appropriées comprenant certaines sources de substances de développement pour le procédé de fermentation sont très nombreuses et on peut citer entre autres les amino-acides la caséine, hydrolysée et non hydrolysé. la farine de poisson la farine de soya les extraits de viande le tourteau de foie
Purée les nitrates les composés d'ammonium les bouillies de grain pour la distillation la liqueur de macération du mais la liqueur de macération du froment le petit-lait ou les concentrés de petit-lait le gluten de mais traité par hydrolyse acide
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le gluten de froment traité par hydrolyse acide la peptone les abatis la levure de brasserie la farine de graines de coton la lactalbumine la tryptone Ces ingrédients protéiques ne doivent pas être appliqués à un haut degré de pureté.
Les matières moins pures qui contiennent des traces de facteurs de développement et des quantités considérables d'agents nutritifs minéraux peuvent convenir. Il n'est évidemment pas possible, à cause de la nature brute de la plupart de ces substances azotées de spécifier des proportions défi-
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nies de la matière à ajouter. Une quantité d'environ 0$1. à 50% en poids sur base solide correspond à la gamme utile de substanc*n*zU%éei'µ,îàjb%%er au milieu dans la plupart deS"" cas.
Il pH du milieu de fermentation doit être environ 6,0 à 6,2 au début de la fermentation. La température préférée pour le procédé de
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fermentation est environ 26 à 2SOC" Le rendement maximum du produit est généralement obtenu en 1 à 3 jours suivant le procédé de culture du Strep- tomyces.
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EXEMPLE Io
On prépare un inoculum pour la production de tétracycline dans un milieu de fermentation contenant en poids :
1% de liqueur de macération de mais 1% de sucrose
0,5% de (NH4)2HP04
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le54 de XE2P0 ou de MGSO4- 7 H 20 O.,5 de NaBr pH 6,2 - 6,4 on l'etend à un volume de 2500 c3 et on l'introduit dans un flacon de 2 1/2 gallons (9,5 1. env.). Le milieu est stérilisé à la vapeur à 118-1200-pendant une heure .
Refroidi le milieu est inoculé avec environ 0,5 % en volume d'une
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suspension aqueuse trouble de spores de streptonwces provenant d'une souche sur agar. Le contenu du flacon est alors incubé à 26-28 C pendant 48 heures dans un agitateur à va-et-vient et de l'air stérile est.soufflé à la surface
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du, liquide. Du flacon à inoculum, le bouillon, contenant le Strept2Mcea SPi est déversé dans le réservoir de fermentation dans des conditions parfaitement aseptiques. Le moment venu, la liqueur peut être traitée comme décrit plus loin et on peut isoler la tétracycline.
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La tétracycline fournie par Stre-ptomveee EL 567201. Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209) et d'autres espèces de Streptomyces produisant de la tétracycline peut être préparée à grande échelle par culture submergée ou profonde. Des cuves de fermentation fixes équipées de moyens d'agitation et d'aération appropriés sont utiles à cette fin. Un milieu nutritif formé
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de 56,8 litres de liqueur de macération de mais, 56,8 kg de sucr-ôse, 28,4 kg de (NH) 2HPD9 85,2 kg de TH2P0 11,3 kg de ..50. 7 H20' 28,4 kg de NaBr et de l'eau jusqu'à 1500 gallons (4.600 1.) peut convenir.
Ce milieu peut être préparé dans un récipient de fermentation de 2000 gallons (7.500 1.)
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doublé de verre et équipé d'une chemise à circulation d'eau pour le régiage ie la température,d'un dispositif agitateur approprie en scier 'inoxydable e't
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d'un dispositif arroseur pour l'aération.Le milieu est stérilisé en chacun fant à la vapeur sous pression,puis refroidï..Aprèastérilïsat2on,la concentration en ion Isogone'du milieu doit corresphtidre environ au e 6 s .Ia 'm.er.
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nutritif est inoculé avec 15% en volume d'une culture végétative obtenue dans un récipient de fermentation semblable., préalablement inoculé avec un inoculum décrit plus haut ou avec un inoculum préparé au laboratoire.
La culture dans le récipient de fermentation de 2000 gallons est incubée à une température de 83 F (28 C) pendant 44 heures environ. Pendant l'incubation, l'agitateur tourne à raison de 90 tours/minute et on introduit de l'air stérile dans le milieu par l'arroseur à raison de 100 pieds cube par minute (47 1/sec.). A la fin de la période d'incubation, le fluide de culture contient normalement une quantité appréciable de tétracycline qui dépasse la quantité de chlorotétracycline présente. La tétracycline est isolée comme décrit plus loin, les matières solides obtenues avant la recristallisation contiennent au moins 19 parties de tétracycline par parties de chlorotétracycline.
EXEMPLE II.
On produit suivant le procédé de l'exemple 1, une liqueur de fermentation contenant de la tétracycline et pas plus d'une partie de chlorotétracycline pour deux parties de tétracycline avec le milieu de culture suivant 1% de gluten de blé
1% de glycérol
0,055 de matièressolubles de distillation
0,1% de CaCO3
0,5% de NaBr EXEMPLE III.
On produit suivant le procédé de l'exemple I, une liqueur de fermentation-contenant de la tétracycline et pas plus d'une partie de chlorotétracycline pour deux parties de tétracycline avec le milieu de culture suivant : 1% de farine de coton
1% de glucose 0,05% de matières 1 soluble s de distillation
0,1% de CaCO3
0,5% de NaBr EXEMPLE IV.
On produit suivant le procédé de l'Exemple I, une liqueur de fermentation contenant de la tétracycline et pas plus d'une partie de chlorotétracycline pour deux parties de tétracycline avec le milieu de culture suivants
1% de liqueur de fermentation de mais
1% de cérélose
0,1% de CaCO3
1,0% de NaBr EXEMPLE V.
On produit suivant le procédé de l'Exemple I, une liqueur de fermentation contenant de la tétracycline et pas plus d'une partie de chlorotétracycline pour deux parties de tétracycline avec le milieu de culture suivant
1% de farine se soya 1% de cérélose
0,05% d'extrait de levure
0,1% de CaCO3
0,1% deNaBr
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EXEMPLE VI-. on produit suivant le procédé de l'Exemple I, une liqueur de fermentation contenant de la tétracycline et pas plus d'une partie de chlo- rotétracycline pour deux parties de tétracycline en utilisant le milieu de culture suivant : 3% de farine de soya
0,5% de' amidon de mais
0,1% de N-Z -amine B(produit de digestion enzymatique de la caséine)
0,3% de NaNO3
0,5% de CaCO3
0,5% de KBr EXEMPLE VII.
On produit suivant le procédé de l'Exemple I, une liqueur de fermentation contenant de la tétracycline et pas plus d'une partie de chlorotétracycline pour deux parties de tétracycline avec le milieu de culture suivant :
1% de N-Z-amine B
1% de cérélose
0,5% d'extrait de levure
0,1% de CaCO3
0,5% de GaBr2 EXEMPLEVIII.
On produit suivant le procédé de l'Exemple I, une liqueur de fermentation contenant de la tétracycline et pas plus d'une partie de chlorotétracycline pour deux parties de tétracycline en utilisant le milieu de culture suivant
1% de sucrose
1% de farine de soya
1% de peptcpe de soya
1,5% de KH2PO4
0,5% de (NH4)2HP04
0,5% de NaBr.
EXEMPLE IX.
On effectue le procédé de l'exemple I avec et sans 0,5% de bromure de sodium dans des conditions comparables en utilisant le Streptomyces BL 567201, les quantités de tétracycline et de chlorotétracycline dans les bouillons obtenus sont déterminées par chromatographie sur bande de papier en utilisant le système solvant D décrit plus loin ou par essai biologique différentiel sur de l'agar au pH 6, 2 et 8, 0.
Le bouillon d'un réservoir de 120 gallons contenant 80 gallons de milieu y compris 0,5 % de bromure de sodium, après une fermentation de 20 et de 44 heures contient au moins 19 parties de tétracycline par partie de chlorotétracycline. Par essai biologique @prés 20 heures, le bouillon contient 85 microgrammes cm3 de tétracycline et 3 microgrammes/cm3 de chlorotétracycline.
Le bouillon provenant d'un réservoir de 120 gallons contenant 80 gallons de milieu et ne contenant pas d'ion bromure ajouté ne contient pas plus de 1 à 2 parties de tétraoycline pour 8 parties de chlorotétracycline après 44 heures de fermentation.
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Le bouillon provenant d'un réservoir de 600 gallons contenant 350 gallons de milieu et ne contenant pas d'ion bromure ajouté ne contient pas plus de 1 à 2 parties de 'tétracycline pour 8 parties de chlorotétracycline après 45 heures de fermentation.
Le bouillon provenant d'un autre réservoir de 600 gallons contenant 300 gallons de milieu et ne contenant pas d'ion bromure ajoute, ne contient pas plus de 1 partie de tétracycline pour 9 parties de chlarotétra- cycline après 30 heures de fermentation.
EXEMPLE X.
On prépare en double les différents milieux repris dans le tableau
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ci-dessous à raison de 200 cm3 par flacon d'Eflenaeyer d'un litre, on les s soumet à un traitement à l'autoclave pendant 15 minutes sous 15 livres (1 kg env.)., on les refroidit et on les inocule avec un inoculum végétatif de
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24 heures de Streptanyces BL 567201 développé dans un milieu formé de liqueur de macération de mais à raison de 1-cc3 d' inocuLum pour 200 om3 de milieu. Les flacons inoculés sont agités dans un agitateur à va-et-vient à 28 C pendant 48 heures., puis récités pour l'essai.
Les bouillons récoltés sont centrifugés et essayés par chroma- tographie sur bande de papier en utilisant le système D.
Milieu et résultats d'essais.
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<tb>
<tb>
Numéro <SEP> de <SEP> l'essai <SEP>
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Sucrose <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
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KH2PO4 % 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 : (NH4)2HP04 % 05 0,5 0,5 0,5 5: Hg 0 O2 02 flp 2 = 09 2 Oe2
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<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération
<tb> de <SEP> mais <SEP> 1
<tb>
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; NaBr 0 0, 0,5 1,0: e é pH de la récolte 59,4 5,3 # g :=----¯¯¯A¯¯¯¯¯----------------------------------Chlorptetraoycllne % 100 10 95 <5 <5 .
: Tétracycline 1- 0 90 5 > 95 > 95
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L'essai n 2 contient environ 100 microgrammes/cm3 de tétracycline .
F'iFi:b.F: ,j On remplace tour à tourne NaBr de 1-*exemple X par IBr, CaBr2' NH Brp KI ( moins de 0,5%) ou NaSCN pour mettre en relief la mgme produc- tion accrue de tétracycline aux dépens de la chlorotétracycline. EXEMPLE XII.
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Lorsqu'on utilise le Streptomyces aureofac.ens ( NRRL-2209) l'addition d'ions bromure-., iodure ou thiocyanate au milieu comme dans l'exemple X, augmante la production de tétracycline aux dépens de celle de la chlorotétracycline, particulièrement lorsque le milieu est modifié pour
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qu'il convienne à cette souche et pour faciliter une production antibiotique maximum (voir par exemple le brevet américain n 2.482.055).
Lorsque la fermentation est terminée, la'tétracycline, est retirée du bouillon par exemple par filtrage pour éliminer le mycélium, en agitant le bouillon (de préférence au pH 8,5 environ) avec du butanol ou de la méthylisobutyl-cétone, en séparant la couche de solvant contenant la tétracycline en la concentrant à un petit volume par distillation et en la mélangeant à un hydrocarbure inférieur, par exemple le Skellysolve C, pour précipiter la tétracycline solide sous forme de base, si le bouillon extrait est à un pH alcalin et sous forme de chlorhydrate par exemple si le bouillon a été acidifié avant l'extraction par l'acide chlorhydrique.
La tétracycline -solide ainsi obtenue peut être encorepurifféé en la mettant en suspension dans de l'hydroxyde d'ammonium et également en l'adsorbant à partir d'une solution de la base libre sur un adsorbant chromatographique, (par exemple une silice comme Florisil) suivi de lavage (par exemple acétone ou méthanol) pour éliminer les; impuretés, puis d'élution avec un acide. Le sel acide de tétracyclinepurifféé dans le produit d'élution peut être récupéré par cristallisation, précipitation, lyophilisation ou analogues.
On peut préparer différents sels de tétracycline., le plus sim- plement en agitant l'acide désiré, minéral ou organique, à l'antibiotique dans l'eau jusqu'à ce qu'on obtienne une solution limpide. Les sels solides peuvent être prépares en réglant le pH d'une telle solution d'un sel de tétracycline en point immédiatement inférieure à celui oû l'antibiotique commencerait à se -séparer.La solution peut être ensuite séchée, par exemple en soumettant la solution congelée au vide. Les sels acides de tétra- cycline sont obtenus en évaporant une solution du sel dans l'eau à un pH inférieur. Les acides minéraux qu'on peut utiliser sont l'acide chlorhy- driquep l'acide sulfurique et l'acide phosphorique.
Des acides organiques qu'on peut utiliser sont l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide gluconique etc. Comme la tétracycline est amphotére, des sels de différents éléments métalliques avec l'antibiotique peuvent être préparés et en particulier les sels de métaux alcalins de tétracycline sont formés en traitant une solution aqueuse de l'antibiotique par un hydroxyde alcalin. Les sels de métaux solides de tétracycline sont obtenus par évaporation sous vide d'une solution aqueusa de l'antibiotique au pH voulu.
La tétracycline produite dans des procédés ci-dessus est caractérisée de façon certaine, même lorsqu'elle est contaminée par des produits chimiques organiques semblables., par son "spectre" d'activité( c'est-à-dire son degré de migration ou valeur Rf) en utilisant -une série de solvants dans le procédé connu sous le nom de chromatographique sur bande de papier.
Ce procédé est relativement nouveau, mais déjà bien connu pour l'identification des procédés organiques; comme les maxima dans l'infrarouge, les valeurs Rf dans une série de systèmes solvants constituent une caractéristique unique et reproductible d'un produit chimique déterminé et en quelque sorte ses "empreintes digitales
Le procédé utilisé est le suivant : * On suspend au bord d'une cuvette des bandes de papier filtre dense, exempt de cendres, à;forte capacité de rétention (par exemple le papier 589 Blue Ribbon Spécial de Carl Schleicher & Schnell Co. Keene, N.H.) d'un demi pouce (13 mm) de largeur et de 58 cm de longueur à une température ambiante, constante, dans une zone protégée (par exemple dans un grand bocal).
Le sommet de la bande est en contact avec une réserve d'un système solvant particulier (également appelé la phase de développement) contenu dans la cuvette. La partie inférieure de la bande pend librement et n'atteint pas la quantité de systéme solvant ( ou de ses éléments volatils) placée en dessous des bandes suspendues pour faciliter la saturation de l'air par le solvant choisi.
Le produit à examiner (qui peut être un bouillon de fermentation ou un solide isolé) est placé sur un point marqué à la partie supérieure
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de la portion de la bande qui pend librement dans l'air. Dans le cas d'un solide ,on le dissout dans un solvant utilisable quelconque. Les quantités utilisées sont celles qui donnent une zone de grandeur pratique lors de 1-lest sai final et on peut les déterminer par des expériences simples. Par exemple une quantité utile est 5 microlitres (0,005 cm3) d'une solution contenant 1 mg de tétracycline par cm3 de solvant pour l'essai sur B. subtilis. La bande est séchée, puis placée en position dans la cuvette qui contient le système solvant choisi.
On laisse migrer le solvant vers le bas, c'est-à-dire développer la bande jusqu'à ce que le front du solvant atteigne la partie inférieure de la bande. Il faut pour cela environ 15 heures; l'atmosphère environnante est maintenue à une température constante, sans courant d'air, et saturée de la vapeur du solvant placé au fond du bocal.
La bande est ensuite retirée, séchée à l'air et placée sur une plaque d'agar à un pH déterminé (6,2 dans le cas précédent), inoculé par un organisme d'essai, dans ce cas le B. subtilis. Après un séjour jusqu'au len- demain dans un réfrigérateur, les bandes sont enlevées et les plateaux marqués pour identifier les bandes incubés jusqu'au lendemain, puis relevés direc- tement ou photographiés pour obtenir un document permanent.
La silhouette de la bande toute entière est loisible. La situation de chaque agent antibiotique sur la bande est marquée par une .zone claire qui contraste avec la zone trouble où l'organisme d'essai s'est développé. La bande représentée sur la photographie est divisée en zones représentant 5' 10, 10, 10, 10, 109 10, 10; 10, 15 % de la distance entre le point de 1'application de l'échantillon et la partie inférieure de la bande et ces zones sont décri- tes comme possédant des valeurs Rf de 1 à 10 inclus.
Une petite tache au cen- tre exact de la bande aurait donc une valeur Rf6, tandis qu'une tache plus grande s'étendrait dans les zones adjacentes et aurait des valeurs Rf5, 6, 7 en comptant la zone toute entière.
Suivant ce procédé le spectre, de valeurs Rf de la tétracycline est le suivant, en utilisant 5 microlitres d'une solution de l'antibiotique à 1 mg/cm3 comme échantillon et en effectuant l'essai avec le B. subtilis dans de l'agar au pH 6,2 dans les douze systèmes solvants ci-dessous :
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<tb>
<tb> Système
<tb> solvant <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> G <SEP> H <SEP> J <SEP> K <SEP> L
<tb> Valeurs
<tb> Rf <SEP> 6,7 <SEP> 5,6 <SEP> 4,5 <SEP> 4,5,6 <SEP> 1 <SEP> 8,9,10 <SEP> 6,7 <SEP> 8 <SEP> 5 <SEP> 9,10 <SEP> 6,7,8 <SEP> 3,4,
5
<tb>
La composition de ces systèmes solvants s'établit comme suit
A - Eau
B - Citrate de sodium en solution aqueuse à 10 %
C - Citrate de sodium eh solution aquse à 40 %
D - Butanol saturé d'eau
E - Méthyl-isobutyl-cétone anhydre
F - Mélange de 100 parties de méthanol à 80 % et de 10,5 parties de pipéridine, réglé au pH 9,5 par l'acide acétique.
G - Mélange en volume de 80 parties de méthanol, 5 parties d'aci- de acétique glacial et 15 parties d'eau.
H - Butanol saturé d'eau et contenant 2 % diacide p-toluène-sul- fonique.
I - Mélange de 100 cm3 de butanol saturé d'eau et de 5 cm3 d'acide acétique glacial.
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J - Butanol saturé d'eau et contenant 2 % d'acide p-toluènesulfonique ét 2 % de pipéridine.
K - 100 parties de butanol saturé d'eau et 2 g d'acide p-toluène- sulfonique plus 2 cm3 de pipéridine plus 2 g d'acide laurique
L - Mélange de 2 parties d'alcool isoanylique et de 1 partie de tétrachlorure de carbone sature d'une solution aqueuse de citrate de sodium à 10 %. Dans ce cas, avant - application de 1-'échantillon , les bandes sont saturées d'une solution aqueuse de citrate de sodium à la % réglée au pH 5,7 à l'aide diacide citrique et séchées.
Les propriétés de la tétracycline sont décrites dans le Journal of the Américain Chemical Society., volume 75, pages 462l-23, 1953 On attri-
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bue à la tétracyclin (I), à loxytétracycline (II) et â la chlorotétracy-
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cline (III) les structures : OH 1 3 I. Rl= H; R2= H ReR2 TI. R1. 1 CI. 2 - R - .El. TT OH III.
RI= , 2 OH 1- coin2 2
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Un échantillon de base libre de la acyclins9 préparé suivant les indications de la littérature à partir de chlorotétracyclineg fond à 170- 175 0 et contient 0,971 % de chlore, ce qui indique une JC"OJI1tâmin-atm1 par environ 10 % de chlorotétracycline n'ayant pas réagir Cet échantillon est iden- tique à un échantillon de tétracycline produit par fermentation., et toutes les impuretés sont distinguées par examen de ces échantillons et déchantil- lons de chlorotétracycline et d'oxytétracycline, seules et en mélange par chromatographie sur bande de papier (particulièrement avec les systémes solvants D et L).
La tétracycline perd environ 28 % de son activité en 48 heures
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dans un tampon au pH 8aD à 37 oc à une concentration d'environ 09? cm3 ; la chlorotétracycline perd environ ,E3 % de son activité en? 14 heures et 1?oxytétracyclme environ 50 % de son activité en 26 heures dans les mêmes conditions.
En outrar la tétracycline est clairement différenttléli> de la chlorotétracycline et de 1 JI oxytétracycline par un essai sur agar au pH 8,po où la chlorotétracycline et l'oxyttracycline sont braucoup moins actives que la tétracycline., et par un essai simultané sur agar au pH 6,2.
La tétracycline peut être débarrassée des quantités contaminantes de chlorotétracycline et oxytétracycline en maintenant une solution a-
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queuse au pH 80 environ jusqu'à, ce que toute la cbl orotétracycline ou oxy- tétracycline soit décomposée,puis en isolant la tétracycline purifiée. Cette opération est grandement facilitée par un procédé tel que celui de la présen te invention qui maintient la quantité de chlorotétracycline présente au minimum.
Les sels suivants sont utiles comme .agents d'inhibition de la chloration de fermentation dans la présente invention., lorsqu'on les utilise en quantités assez réduites pour qu'ils ne soient pas toxiques ; acétate de
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sodium aluminate de sodium., fluorure de sodium et d'aluminium, tris3.7.ica.t de sodium et d'aluminium, sulfate de sodium et d'aluminium, phosphate de sodium et d9ammoniu% pyroatrtimonat.
de sodium, orthoarséniate de sodium, azide de sodium, benzène suifonate de sodium, benzoate de sodium9 métaborate de sodium$ tétraborate de sodium., perborate de sodium, bromate de sodium, bromoaurate de sodium? bromoplatinate de sodiu% cacodylate de sodium, sulfate de sodium et calcium, d-camphorate de sodium, carbonate de sodium,
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chromate de sodium., bichromate de sodium,;
' cinnamate de sodium, citrate de so-
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douma ouprocyanure de sodium, cyanate de sodium, cyanure de sodium, énanthate de sodium, ét4Jylsúlfate de sodium, ferricyanure de sodium, ferrite de so- dium, ferrocyanure de sodium, fluantimonate de sodium, fluophosphate de sodium, fluorure de sodium, fluosilicate de sodium, formiate de sodium, méta-
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germanate de sodiumg-glycérophosphate de sodium, iodate de sodium, métapério- date de sodium,, oxalate de sodium et de fer, isocyanate de sodium, lactate de sodium,sulfate de sodium et de magnésium manganatè de sodium permanga-
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nate de sodium, mo1.ybdate de sodium, nitrate de sodium, hyponitrite de so- dium, nitrite de sodium, nitroprussiate de sodium, oléate de sodium, oxalate de sodium, hypophosphate de sodium, orthophosphate de sodium,
pyrophosphate de sodium,hexamétaphosphate de sodium, hypophosphite de sodium, orthophosphite de sodium, phtalate de sodium, picrate de sodium, métaplombate
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de sodiums sa1.isylate de sodium, sélénate de sodium, sélénite de sodium, métasilicate de sodium, stannate de sodium, stéarate de sodium, succinate de sodium, sulfanilate de sodium, sulfate de sodium, sulfate acide de so- dium, pyrosulfate de sodium, monosulfure de sodium, sulfure de sodiu% hy- posulfite de sodium, tellurate de sodium, tellurite de sodium, thioanti- monate de sodium, thiocarbonate de sodium, dithionate de sodium, thiosulfate de sodium, xanthate de sodium, acétate de sodium, zinc-uranyle, fluorure de sodium et de zirconium, et d'autres sels métalliques de ces anions et de potassium, de calcium, de baryum,
de strontium, de zinc, de fer, et de magnésium, par exemple ainsi que Ses sels d'ammonium et d'ammonium substitue et des acides libres correspondants.
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INDICATIONS
1.- procède de production de tétracycline caractérisé en ce qu'on cultivedans des conditions aérobies une culture d'une: espéce de Streptomyces produisant de la chlorotétracycline dans une solution aqueuse d'hydrate de carbone contenant un élément nutritif azoté dans des conditions aérobies submergées en présence d'un agent d'inhibition de la chloration de fermentation jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne appréciable soit communiquée à cette solution.
20- Procédé de production de tétracycline caractérisé en ce qu'on cultive dans des conditions aérobies une culture d'une espèce de
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étreptonyaes produisant de la chlorotetracycline dans une solution qqueuse d'hydrate de carbone contenant un élément nutritif azoté dans des conditions aérobies submergées en présence d'un agent d'inhibition de la cbloration de fermentation jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne apprécia-
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ble soit communiquée à cette solutioh, puis on sépare la tétracycline ainsi formée du bouillon de fermentation.
3.- Procédé de produetibn de tétracycline caractérisé en ce qu'on cultive dans des conditions aérobies une culture d'une espèce de Strep-
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tomyces produisant de la cblorotétrabycline dans une solution aqueuse d'hydra- te de carbone contenant un élément nutritif azoté dans des conditions aérobies submergées en présence de quantités ajoutées d'un élément choisi dans le groupe formé par les ions bromure, iodure et thiocyanate, jusqu'à ce qu'une activité anti-bactérienne appréciable soit communiquée à cette solution.
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